ES2323725T3 - Procedimiento para la deteccion de oligomeros de amiloide beta en fluidos corporales. - Google Patents
Procedimiento para la deteccion de oligomeros de amiloide beta en fluidos corporales. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la detección del péptido amiloide Beta en fluidos corporales que comprende las etapas siguientes: a) proporcionar una muestra de un fluido corporal para su análisis con respecto a la presencia de oligómeros del péptido amiloide a; b) desenmascarar los epítopos responsables de la unión a anticuerpos en dichos oligómeros del péptido amiloide beta mediante la eliminación de las proteínas fijadas a dichos oligómeros del péptido amiloide beta; c) poner en contacto dicha muestra, después de la etapa de desenmascaramiento, con un anticuerpo que comprende una población de anticuerpos que se unen a un epítopo en dicho oligómero del péptido amiloide beta estando una parte de la población de anticuerpos marcada con un primer marcador fluorescente y estando la otra parte de la población de anticuerpos marcada con un segundo marcador fluorescente, o poniendo en contacto dicha muestra, después de la etapa de desenmascaramiento, con al menos dos anticuerpos que se unen a al menos dos epítopos diferentes en dichos oligómeros del péptido amiloide beta estando el primer anticuerpo marcado con un primer marcador fluorescente y estando el, al menos, segundo anticuerpo marcado con un segundo marcador fluorescente, en que dicho primer marcador fluorescente actúa como donante, transfiriendo su energía a dicho segundo marcador fluorescente que actúa como aceptor; d) determinar la intensidad de la señal de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia emitida por dicha muestra marcada por fluorescencia para detectar los oligómeros del péptido amiloide beta presentes en dicha muestra corporal.
Description
Procedimiento para la detección de oligómeros de
amiloide \beta en fluidos corporales.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de un marcador de la enfermedad de
Alzheimer, concretamente los oligómeros de amiloide \beta, en el
líquido cefalorraquídeo (LCR) y en otros fluidos corporales
humanos.
La enfermedad de Alzheimer (EA) es la demencia
neurodegenerativa más común, con un pronóstico medio de muerte de 7
años^{1}. Los estudios clínicos en marcha señalan posibilidades
prometedoras para el tratamiento de esta enfermedad^{2}. Sin
embargo, disponer de una herramienta de diagnóstico para la
detección temprana de la EA es un prerrequisito para una terapia
ideal y para la conservación temporal de las funciones cognitivas
esenciales.
Algunos trabajos recientes muestran que los
ensamblajes oligoméricos de amiloide \beta (A\beta) son
neurotóxicos en cultivos celulares e in vivo, ya que son
capaces de inhibir la potenciación a largo plazo^{3,4}. Se ha
demostrado también que estos oligómeros de A\beta de bajo peso
molecular inducen deficiencias transitorias en la función
cognitiva^{5}. Para poder demostrar adicionalmente el efecto
adverso de los oligómeros en la función de las células nerviosas,
se ha usado con éxito la inmunoterapia para neutralizar los
oligómeros de A\beta, restaurando así la plasticidad sináptica
in vivo^{6}. Otra evidencia que señala que los oligómeros
de A\beta son la especie neurotóxica en la EA es que estas
estructuras se han encontrado también en el cerebro humano, donde
su concentración es hasta 70 veces superior en los pacientes de EA
en comparación con los controles sin
demencia^{7-9}.
De este modo, ha podido demostrarse que la
gravedad de la enfermedad se correlaciona con la concentración de
los oligómeros, más que con el número de
placas^{10-12} y se ha sugerido que la presencia
de oligómeros globulares de A\beta en el cerebro es un suceso
patológico temprano en la EA^{13}. Por consiguiente, la búsqueda
de oligómeros de A\beta se ha extendido al LCR humano y el trabajo
de investigación reciente ha demostrado también la presencia de
bajas cantidades de oligómeros estables de A\beta en este fluido
corporal^{14-17}. Dado que la concentración de
oligómeros fue consistentemente más elevada en el LCR de los
pacientes de AE en comparación con los controles sin demencia de
edades similares, esto señala una correlación entre los niveles de
oligómeros y el estado de la enfermedad^{17}, haciendo de estos un
posible biomarcador y una diana adecuada para la detección temprana
de la AE.
Por lo tanto, se requiere un procedimiento
sensible para la detección y la cuantificación precisa de los
oligómeros de A\beta. Uno de estos procedimientos es el ensayo de
biocódigo de barras descrito recientemente para la medida de los
ligandos difusibles derivados de amiloide \beta (ADDL) en el
LCR^{17}. Aún siendo bastante sensible, este procedimiento
incluye un número relativamente elevado de etapas críticas que
pueden afectar al rendimiento general del ensayo.
El documento D1: BACSKAI BRIAN J Y COL.:
"Fluorescence resonance energy transfer determinations using
multiphoton fluorescence lifetime imaging microscopy to
characterize amyloid-beta plaques." JOURNAL OF
BIOMEDICAL OPTICS. JUL 2003, vol. 8, nº 3, julio de 2003
(2003-07), págs. 368-375,
XP002405820 ISSN: 1083-3668, describe el uso de
medidas de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia
(FRET) en microscopía de imágenes de vida media de fluorescencia
multifotónica para caracterizar placas de amiloide \beta.
El documento D2: US 2005/069935 A1 describe un
procedimiento para caracterizar asociaciones y agregados como los
oligómeros de amiloide beta mediante un separador celular activado
por fluorescencia.
El documento D3: WO 99/15903 A describe un
procedimiento para medir la asociación de subestructuras de
depósitos de proteínas patológicas como los oligómeros del péptido
amiloide beta mediante procedimientos de medida de espectroscopía
de correlación de fluorescencia (FCS).
Por lo tanto, un objetivo de la invención es
proporcionar un procedimiento de alta sensibilidad para la detección
y la cuantificación precisa de los oligómeros de A\beta que
comprenda solamente un número de etapas pequeño y limitado, que
pueda ser controlado fácilmente por el experimentador, por un lado,
y que, por otro lado, proporcione resultados de alta fiabilidad y
reproducibilidad a un coste razonable con el fin de usarlo
comercialmente.
La invención proporciona un procedimiento para
la detección de oligómeros del péptido amiloide \beta (A\beta)
en los fluidos corporales que comprende las etapas siguientes:
a) proporcionar una muestra de un fluido
corporal para su análisis con respecto a la presencia de oligómeros
del péptido amiloide \beta;
b) desenmascarar los epítopos responsables de la
unión a anticuerpos de dichos oligómeros del péptido amiloide
\beta, mediante la eliminación de las proteínas fijadas a dichos
oligómeros del péptido amiloide \beta;
c) poner en contacto dicha muestra, después de
la etapa de desenmascaramiento, con un anticuerpo que comprende una
población de anticuerpos que se unen a un epítopo en dicho oligómero
del péptido amiloide \beta, estando una parte de la población de
anticuerpos marcada con un primer marcador fluorescente y estando la
otra parte de la población de anticuerpos marcada con un segundo
marcador fluorescente, o poniendo en contacto dicha muestra,
después de la etapa de desenmascaramiento, con al menos dos
anticuerpos que se unen a al menos dos epítopos diferentes en
dichos oligómeros del péptido amiloide \beta, estando el primer
anticuerpo marcado con un primer marcador fluorescente y estando
el, al menos, segundo anticuerpo marcado con un segundo marcador
fluorescente, en que dicho primer marcador fluorescente actúa como
donante, transfiriendo su energía a dicho segundo marcador
fluorescente que actúa como aceptor;
d) determinar la intensidad de la señal de
transferencia de energía por resonancia de fluorescencia emitida
por dicha muestra marcada por fluorescencia para detectar los
oligómeros del péptido amiloide \beta presentes en dicha muestra
corporal.
Las realizaciones y ventajas preferidas
resultarán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente
que incluye la sección experimental, los dibujos y las
reivindicaciones.
Figura 1. Principio del ensayo. (a) Los
oligómeros de amiloide \beta se detectan usando dos anticuerpos
monoclonales (mAb) específicos antiamiloide \beta y la tecnología
de FRET. El anticuerpo donante es el clon 4G8 marcado con Alexa
Fluor 488 y el anticuerpo aceptor es el clon 6E10 marcado con Alexa
Fluor 594. (b) El ensayo consta de una etapa: la dilución de la
muestra de LCR en el tampón de detección que contiene los
anticuerpos marcados. Después de la incubación en la oscuridad, los
oligómeros de amiloide \beta se detectan por citometría de
flujo.
Figura 2. Sensibilidad del ensayo. La
sensibilidad del ensayo se determinó por valoración de las fibrillas
de A\beta ensambladas in vitro en el intervalo de
concentración de 1 nM hasta 0,0 nM. En este intervalo el ensayo es
lineal. Dado que la concentración de las fibrillas se estimó a
partir de la concentración del monómero de partida usada para el
ensamblaje en fibrillas y una fibrilla corresponde a
100-1.000 monómeros, la concentración real de las
fibrillas medidas es muy inferior, haciendo que el límite de
detección esté en el intervalo femtomolar.
Figura 3. Los monómeros de A\beta no se
detectan por citometría de flujo. Para determinar si los monómeros
de A\beta pueden detectarse por citometría de flujo se incubó 1 nM
de monómero de A\beta 1-42 (Bachem), tratado
según lo descrito por Dahlgren y col., con el par de anticuerpos
donante:aceptor y se realizó un análisis por citometría de flujo.
No se detectaron señales en ningún caso (diagramas de puntos FSC
frente a SC; FL1 frente a FL3; a, b). En contraste con el monómero
de A\beta, al emplear 1 nM de fibrillas de A\beta ensambladas
in vitro (el amiloide (1-42) sin semilla se
disolvió en DMSO (Sigma-Aldrich) a 100 \muM, se
diluyó en PBS hasta 0,5 \muM y se incubó durante 72 horas a 37ºC
y la concentración de fibrillas usada se basó en la concentración
de monómero de partida) se detectaron sucesos de FRET (FSC frente a
SCC; FL1 frente a FL3; c, d), lo que demuestra que con el ensayo es
posible discriminar entre A\beta monomérico (no es posible la
detección) y A\beta oligomerizado.
Figura 4. Desenmascaramiento de los oligómeros
de amiloide \beta en el LCR. El uso de la disolución 1 y la
disolución 2 desenmascara eficientemente los oligómeros de amiloide,
permitiendo una detección efectiva por citometría de flujo.
Figura 5. Optimización del tampón de detección.
La disolución 1 en una concentración de 0,5x es óptima para la
detección de los oligómeros.
Figura 6. Validación del ensayo. (a) Cuando se
incuba una muestra de LCR con el anticuerpo donante (4G8 Alexa
Fluor 488) solo se detectan sucesos en el canal de FL1. (b) Al
incubar con el par de anticuerpos donante:aceptor, se detectan
sucesos de FRET (FL1 y FL3). (c) Un análisis de histograma muestra
el desplazamiento de los sucesos detectados (sucesos sin FL3; curva
verde) en el canal de FL3 (sucesos con FL3); curva roja). (d) Al
analizar un agrupamiento de muestras de LCR sometidas a separación
mediante inmunotransferencia en condiciones no reductoras se
detectaron oligómeros de A\beta (carril 2). En 20 \mul de LCR no
sometido a separación no se detectaron oligómeros (carril 3). Como
control de la masa molecular de las bandas detectadas se cargaron 50
pg de monómero de amiloide \beta (Bachem, Suiza; carril 1). (e)
Un ensayo de transferencia de puntos de LCR sometido a separación
con el anticuerpo específico antioligómero A11 confirma
adicionalmente la presencia de oligómeros en el LCR (carril 3).
Como control para la transferencia de puntos se cargaron 5 \mul de
homogeneizado de cerebro de un individuo sano (carril 1) o de un
paciente de EA (carril 2).
Figura 7. Rendimiento clínico del ensayo. El
análisis de 174 muestras de LCR de individuos sin demencia mostró
una correlación positiva entre la edad y las cantidades de
oligómeros de A\beta detectados. Diagrama de dispersión de los
oligómeros de A\beta (sucesos de FRET) frente a la edad. El
análisis de 174 muestras de LCR de individuos de control sin
demencia revela una correlación positiva (rho = 0,22; p = 0,0036)
entre la edad y la concentración de oligómeros de A\beta. Todos
los valores son valores medios de dos medidas independientes. La
regresión lineal y los intervalos de confianza del 95% se
representan como líneas continuas.
Figura 8. Estabilidad de los oligómeros
naturales de A\beta, reproducibilidad y rendimiento clínico del
ensayo. (a) Efecto de ciclos de congelación y descongelación sobre
la detección de oligómeros naturales de A\beta en LCR. La
concentración de los oligómeros de A\beta detectados en un
agrupamiento de muestras de LCR no se alteró por la aplicación de
tres ciclos de congelación y descongelación. (b) Análisis de siete
muestras diferentes de LCR por citometría de flujo. Todas las
muestras se analizaron por duplicado y los valores se representan
como valores medios y desviaciones típicas. (c) Inmunotransferencia
de las muestras de LCR analizadas en b. No existe correlación entre
las cantidades de A\beta según se detectan por inmunotransferencia
y el contenido de oligómeros.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se dirige a un procedimiento para
la detección de oligómeros del péptido amiloide \beta en fluidos
corporales. La expresión "fluidos corporales" cubre todo tipo
de fluidos que se presentan en el cuerpo de un vertebrado. Los
ejemplos típicos son sangre, orina, lágrimas, saliva y líquido
cefalorraquídeo, que se prefiere en particular. Todos los demás
tipos de fluidos corporales pueden usarse también para analizarlos
con respecto a la presencia de péptidos de amiloide \beta
oligoméricos.
Preferentemente el fluido corporal se toma de
humanos. Sin embargo, cualquier otro tipo de animal vertebrado
puede analizarse según el procedimiento presente, incluyendo ganado
vacuno, caballos, perros, gatos y roedores como ratones, ratas y
conejos. En particular pueden analizarse todos los humanos que
muestren una primera incidencia de EA o de otras enfermedades
neurodegenerativas.
En una segunda etapa, se ha encontrado que es
decisivo eliminar todas las proteínas fijadas a los oligómeros de
los péptidos de amiloide \beta de dichos péptidos antes de
ponerlos en contacto con los anticuerpos. La eliminación de las
proteínas fijadas a la A\beta se denomina
"desenmascaramiento". Para obtener un resultado fiable en el
ensayo han de eliminarse al menos todas las proteínas fijadas a los
epítopos de A\beta. Preferentemente se eliminan todas las
proteínas extrañas fijadas.
La etapa de desenmascaramiento se realiza
preferentemente poniendo los fluidos corporales en contacto con un
detergente, preferentemente un detergente aniónico o una combinación
de detergentes. Algunos ejemplos típicos de detergentes aniónicos
son SDS (dodecilsulfato de sodio), Triton, por ejemplo Triton
X-100
(t-oct-C_{6}H_{4}-(OCH_{2}CH_{2})xOH:
t-octilfenoxipolietoxi-etanol),
NP-40 (Nonidet P-40,
etilfenilpolietilenglicol), desoxicolatos, en particular sus sales
de sodio. También es posible usar otros detergentes como detergentes
catiónicos, no iónicos y anfóteros. En otra realización se usan
otros agentes de desenmascaramiento capaces de desnaturalizar
proteínas. Algunos ejemplos son reactivos básicos o ácidos. Sin
embargo, una desventaja de usar, por ejemplo, reactivos básicos es
que han de eliminarse antes de añadir el anticuerpo monoclonal.
Generalmente puede aplicarse cualquier tipo de detergentes, siempre
que estos eliminen todas las proteínas del A\beta, en particular
las proteínas fijadas a los epítopos, por ejemplo, albúmina,
apolipoproteína E. En otra realización se usan mezclas de
detergentes.
Típicamente, los fluidos corporales se diluyen
en un tampón que contiene, por ejemplo, Hepes, cloruro de sodio y/o
Tris-HCl. El experimentador puede ajustar la
concentración de los ingredientes del tampón. Típicamente, la
concentración del detergente se halla en el intervalo del 0,1 al 1,0
por ciento en peso, preferentemente del 0,2 al 0,7 por ciento en
peso. Preferentemente a las disoluciones de desenmascaramiento se
añaden inhibidores de proteasas; en aún otra realización, la
disolución que contiene el anticuerpo también comprende inhibidores
de proteasas; esto se cumple particularmente en la realización de
mayor preferencia, en la que las etapas de desenmascaramiento y de
incubación con el anticuerpo se llevan a cabo en una sola etapa
(preparación). Algunos ejemplos de inhibidores de proteasas son
aprotinina, bestatina, EDTA, PMSF, leupeptina. Las concentraciones
preferidas de los ingredientes en las disoluciones tampón se
describen a continuación. Sin embargo, ha de hacerse hincapié en
que las personas expertas en la materia son capaces de adaptar el
tipo de ingredientes del tampón, así como la concentración de los
ingredientes según las particularidades del procedimiento de
ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
La disolución 1 es:
- NP-40 al 0,4-0,6%, preferentemente al 0,5% en peso desoxicolato de sodio al 0,2-0,3%, preferentemente al 0,25% en peso
- SDS al 0,01-0,5%, preferentemente al 0,05% en peso
- NaCl 100-200 mM, preferentemente 150 mM
- Hepes 20-100 mM, preferentemente 50 mM
\newpage
La disolución 2 es:
- Tris-HCl pH 8, 10-50 mM, preferentemente 25 mM
- Triton X-100 al 0,4-0,6%, preferentemente al 0,5% en peso
- NP-40 al 0,4-0,6%, preferentemente al 0,5% en peso.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inhibidores de proteasas han de añadirse
según las necesidades experimentales.
Algunos ejemplos de detergentes y de otros
agentes de desenmascaramiento son detergentes aniónicos, por
ejemplo, SDS, desoxicolato de Na; detergentes no iónicos, por
ejemplo, Triton X-100, Tween 20, Nonidet
P-40; detergentes anfóteros, por ejemplo, CHAPS, y
detergentes catiónicos, por ejemplo, bromuro de
tetradeciltrimetilamonio (TTAB), y/u otros agentes
desnaturalizantes de desenmascaramiento, preferentemente reactivos
básicos o ácidos, por ejemplo, ácido fórmico, clorhidrato de
guanidina o urea o hidróxidos alcalinos.
La disolución tampón que contiene los
detergentes y el fluido corporal se incuba durante aproximadamente
15 min a 3 h, preferentemente durante 30-90 min a
una temperatura de aproximadamente 10-40ºC,
preferentemente de 15-37ºC, aún más preferentemente
de 17-30ºC. El experto en la técnica puede ajustar
el tiempo de incubación, al igual que la temperatura, según el
ensayo particular que ha de realizarse, por ejemplo, con respecto al
fluido corporal que ha de analizarse, el detergente que se usa,
etc.
Como concentración preferida para el detergente
se sugiere aproximadamente el 0,01-2 por ciento en
peso, como concentración particularmente preferida, el
0,02-1 por ciento en peso. La concentración es
inferior a la concentración micelar crítica
(0,5-5%).
Después de dicha etapa de desenmascaramiento, la
muestra se pone en contacto con uno o más anticuerpos que se unen a
los epítopos característicos del péptido A\beta. En una
realización preferida la etapa de desenmascaramiento (b) y la etapa
de puesta en contacto (c) se llevan a cabo en una etapa (en una
preparación).
Los anticuerpos típicos para usar son
anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos en el extremo amino
del péptido A\beta, preferentemente entre las posiciones de
aminoácidos (aa) 1-24. Los epítopos particularmente
preferidos comprenden los aminoácidos (aa) 4-13 ó
17-24. Sin embargo, también pueden usarse otros
epítopos característicos del péptido A\beta que se extienden a
regiones de dicho péptido A\beta fuera del extremo amino. Algunos
ejemplos son el epítopo en los aa 1-5; el epítopo en
los aa 1-11; el epítopo en los aa
1-7; el epítopo en los aa 15-24; el
epítopo en los aa 3-9; el epítopo en los aa
11-26; el epítopo en los aa 4-10;
el epítopo en los aa 13-28; el epítopo en los aa
1-10; el epítopo en los aa 31-40; el
epítopo en los aa 8-17; el epítopo en los aa
15-30; el epítopo en los aa 17-24;
el epítopo en los aa 1-28; el epítopo en los aa
12-28; el epítopo en los aa 17-42;
el epítopo en los aa 20-40; el epítopo en los aa
37-42; el epítopo en los aa 8-17;
el epítopo en los aa 11-28; el epítopo en los aa
1-6; el epítopo en los aa 8-17; el
epítopo en los aa 12-28; el epítopo en los aa
25-35; el epítopo en los aa 15-30;
el epítopo en los aa 17-26; el epítopo en los aa
1-12; el epítopo en los aa 32-40;
el epítopo en los aa 33-42.
Mientras que particularmente se prefiere usar
dos anticuerpos, que preferentemente cubran las posiciones de los
aminoácidos 4-13 y 17-24, en otras
realizaciones de la invención pueden usarse también más de dos, por
ejemplo tres o cuatro anticuerpos o solo un anticuerpo.
Si se usa un anticuerpo, una parte de la
población de anticuerpos se marca con un primer marcador
fluorescente, mientras que la otra parte de la población de
anticuerpos se marca con un segundo marcador fluorescente. Los
marcadores actúan como donante y aceptor con el fin de satisfacer
los criterios de la tecnología de FRET. Dado que un oligómero de
A\beta proporciona el mismo epítopo varias veces, es posible usar
la tecnología de FRET. Ha de entenderse que el término "un
anticuerpo" cubre una población homogénea, es decir, idéntica,
de anticuerpos monoclonales.
En otra realización más se usan dos o más de dos
anticuerpos y cada anticuerpo se marca con un marcador fluorescente
diferente o solo con dos marcadores fluorescentes.
Los anticuerpos usados se marcan específicamente
con marcadores fluorescentes. Los anticuerpos marcados por
fluorescencia son bien conocidos en la técnica y pueden adquirirse
comercialmente. La tinción fluorescente de proteínas es bien
conocida en la técnica y los recursos para detectar anticuerpos
marcados por fluorescencia son conocidos. Típicamente, los
colorantes fluorescentes se unen a la proteína mediante
interacciones covalentes o no covalentes. Según la invención puede
usarse cualquier colorante fluorescente que sea capaz de unirse a
los anticuerpos monoclonales de la presente invención y que pueda
detectarse por procedimientos citométricos o fotométricos, por
ejemplo, por citometría de flujo; particularmente se prefieren los
colorantes fluorescentes que puedan usarse en la tecnología de
FRET.
En una realización particularmente preferida, el
procedimiento de la presente invención utiliza citometría de flujo,
combinada con transferencia de energía por resonancia de
fluorescencia (FRET). La tecnología de FRET es una herramienta
excelente para determinar distancias y la organización
supramolecular de las biomoléculas (figura 1a). FRET es un fenómeno
especial en la espectroscopía de fluorescencia durante el cual la
energía se transfiere desde una molécula excitada donante a una
molécula aceptora en condiciones espectrales y espaciales
favorables^{19}. Para detectar el A\beta se marca un epítopo con
un donante y el otro epítopo con un aceptor. El par de FRET más
popular para su uso práctico está formado por CFP e YFP. Ambas son
variantes cromáticas de la proteína fluorescente verde, GFP. Cuando
el donante y el aceptor están a bastante distancia entre sí, la
emisión del donante se detecta en la excitación de dicho donante,
mientras que, por otro lado, cuando el donante y el aceptor están
muy próximos, debido a la interacción del donante y el aceptor, la
emisión del aceptor se observa predominantemente por la FRET
intermolecular desde el donante al aceptor. Para el efecto
combinado de FRET, el pico de emisión del donante debe superponerse
al pico de excitación del aceptor. En la tecnología de FRET se
añade energía luminosa a la frecuencia de excitación para el
fluorocromo donante que transfiere parte de su energía al aceptor,
el cual entonces vuelve a emitir la luz en sus propias longitudes
de onda de emisión. El resultado neto es que el donante emite menos
energía que la que produce normalmente (ya que parte de la energía
se transfiere en cambio al aceptor), mientras que el aceptor emite
más energía luminosa en su frecuencia de excitación (porque recibe
un aporte extra de energía del fluorocromo donante).
La ventaja de la tecnología de FRET es su
excelente resolución. FRET solo tiene lugar cuando los dos
fluorocromos están a 2-10 nm entre sí, lo que
significa que los fluorocromos han de estar enfrentados por una
distancia espacial muy pequeña. Si los fluorocromos están a más de
20 nm de distancia, no se observará ninguna señal. Por lo tanto, la
selección de epítopos en el A\beta es importante si se utiliza el
efecto de FRET en combinación con citometría de flujo.
En una realización típica de la invención, dos
anticuerpos monoclonales anti-A\beta que reconocen
epítopos distintos de la secuencia del péptido A\beta se marcan
con los colorantes fluorescentes Alexa Fluor 488 (mAb 4G8;
producido contra A\beta 17-24) y Alexa Fluor 594
(mAb6E10; producido contra A\beta 4-13). Otros
colorantes fluorescentes como ATTO o Cy pueden ser adecuados. Por lo
general, pueden usarse todos los colorantes fluorescentes conocidos
si son capaces de proporcionar el efecto de FRET como moléculas
donantes o aceptoras. Por ejemplo, el mAb 4G8-Alexa
Fluor corresponde a la molécula donante y el mAb
6E10-Alexa Fluor 594 funciona como la molécula
aceptora (Figura 1a). Con esta combinación de donante y aceptor, los
monómeros de A\beta no pueden detectarse en la actualidad, lo que
se debe a la baja cantidad de fluorocromos que pueden unirse a
dichos monómeros de A\beta (un máximo de dos anticuerpos por
monómero) y la muy baja intensidad resultante de la fluorescencia
emitida y de la señal de FRET (figura 3). En contraste, las
estructuras oligoméricas de A\beta pueden unirse a cantidades
suficientes de moléculas de anticuerpo y dar lugar así a una señal
fluorescente con la suficiente intensidad para ser detectada por
citometría de flujo (figura 3). El contenido de información de la
señal fluorescente se incrementa por FRET, ya que esta técnica
permite una diferenciación de la unión inespecífica del mAb 4G8 a
otras moléculas. Por consiguiente, las señales del anticuerpo
6E10-Alexa Fluor 594 solo se observan si la
distancia entre ambos anticuerpos es inferior a 10 nm, la distancia
de Förster que permite la transferencia de energía entre los
fluorocromos donante y aceptor.
En la última etapa, la señal de transferencia de
energía por resonancia de fluorescencia emitida por la muestra
marcada por fluorescencia se detecta entonces mediante los recursos
bien conocidos. Algunos ejemplos son citometría de flujo o
procedimientos fotométricos. Pueden aplicarse todo tipo de
procedimientos y recursos para detectar la señal de
fluorescencia.
A continuación se describen las realizaciones
preferidas de la invención con respecto a los ejemplos. Ha de
considerarse que la aplicación no se limita a estas realizaciones
descritas a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Recogida de líquido cefalorraquídeo. Se
obtuvo LCR de 174 pacientes neurológicos (media de edad 49,3 años;
intervalo 8-89) con diagnósticos como esclerosis
múltiple. Todas las muestras se obtuvieron por punción lumbar, se
congelaron en menos de 2 h y se almacenaron a -85ºC antes de su
análisis; se evitaron ciclos repetidos de congelación y
descongelación.
Marcaje de anticuerpos por fluorescencia.
Los anticuerpos anti-A\beta 4G8 y 6E10 (Chemicon
International) se marcaron con los colorantes fluorescentes Alexa
Fluor 488 o Alexa Fluor 594 según las instrucciones del fabricante
(aplicando los kits de marcaje para anticuerpos monoclonales
respectivos; Invitrogen).
Preparación de las muestras. Se diluyeron
200 \mul de LCR con 200 \mul de la disolución 1 1x (la
disolución 1 5x contiene HEPES 250 mM; NaCl 750 mM, SDS al 0,25%,
desoxicolato de Na al 1,25%, alternativo de NP-40
(Calbiochem) al 2,5% y un comprimido del cóctel de inhibidores de
proteasas Complete^{TM} Mini (Roche Applied Science) por cada 2
ml de disolución 1 5x). Después se añadieron los anticuerpos
marcados por fluorescencia a concentraciones de 2 nM y 8 nM para el
anticuerpo donante (4G8, marcado con Alexa Fluor 488) y el
anticuerpo aceptor (6E10, marcado con Alexa Fluor 594),
respectivamente. Después de la incubación (90 minutos a temperatura
ambiente, protegido de la luz) las muestras se analizaron en un
aparato FACS Calibur (BD Biosciences) como se describe a
continuación.
Citometría de flujo. Para la detección de
los oligómeros de A\beta se usó un citómetro de flujo FACS Calibur
equipado con un láser de iones de argón enfriado por aire de 15 mW
y 488 nm (BD Biosciences). Las partículas oligoméricas se
seleccionaron en diagramas de puntos logarítmicos de dispersión
frontal y lateral (FSC frente a SSC). La fluorescencia verde o roja
de los colorantes Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 594 se detectó por
medio de los correspondientes fotomultiplicadores FL1 y FL3 (escala
logarítmica) a través de filtros de paso de banda 530/30 ó 670LP,
respectivamente. Para evitar diferencias en la medición debidas a la
variación en las muestras de LCR, todas las muestras se midieron en
tubos TruCount (BD Biosciences) y el análisis se detuvo después de
haber contado 28.000 perlas.
Separación. La separación de la región
específica de los oligómeros se realizó en un separador celular FACS
Vantage (BD Biosciences), aplicando un umbral al canal de FL1. La
población de interés se seleccionó en un diagrama de puntos de FL1
frente a FL3 y solamente se separaron sucesos con una señal de
FRET.
Inmunotransferencia. Se aplicaron 20
\mul de una muestra de LCR o 25 \mul de LCR sometido a
separación en geles de tricina al 16% (Invitrogen), se corrieron
durante 2 horas y se transfirieron a membranas de tPVDF. Las
membranas se hirvieron durante 5 min en PBS y se bloquearon durante
2 horas en leche en polvo desnatada al 5% en TBS-T
(Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 con NaCl 150 mM y Tween 20
al 0,1%). Entonces se aplicó el anticuerpo monoclonal
anti-A\beta 6E10 y se incubó hasta el día
siguiente. Después de lavar las membranas en TBS-T,
el anticuerpo unido se visualizó usando un anticuerpo secundario
antirratón conjugado con HRP y detección por ECL (sustrato
SuperSignal West Femto, Pierce).
Transferencia de puntos. Para el análisis
de transferencia de puntos las muestras se aplicaron directamente
sobre la membrana de nitrocelulosa y se secaron al aire. La membrana
se procesó después para determinar la presencia de oligómeros de
A\beta mediante el anticuerpo específico antioligómero
A-11 (Biosource) según el protocolo del
fabricante.
Aislamiento de oligómeros de amiloide\betaa partir de homogeneizado de cerebro de pacientes con
EA. El banco de cerebros alemán suministró amablemente tejido
cerebral frontotemporal de personas de control y de pacientes de
EA. Los oligómeros se aislaron de los cerebros de control y de
pacientes de AE según Wiltfang y col.^{19}.
Análisis estadístico. El análisis
estadístico se realizó usando el software MedCalc y el coeficiente
de correlación de Spearman.
Preparación de A\beta(1-42) sin semilla. El A\beta
(1-42) se adquirió de Bachem, se trató sin semilla
según lo descrito por Dahlgren y col. (Dahlgren, K.N. y col.
Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta
peptides differentially affect neuronal viability. J. Biol. Chem.
277, 32046-32035 (2002)), se purificó posteriormente
por RP-HPLC (columna: Source 5RPC 4,6/150 ST
Amersham; disolvente A: NH_{4}OH (25%) al 0,1% en H_{2}O, pH
9,0; disolvente B: 60% de acetonitrilo, 40% de disolvente A;
gradiente: 25-56% de disolvente B en 31 min, tasa
de flujo: 1,0 ml/min) y se liofilizó.
Generación de fibrillas in vitro. El
A\beta (1-42) sin semilla se disolvió en DMSO
(Sigma-Aldrich) a 1 mM, se diluyó hasta 100 \muM
en HCl 10mM y se incubó durante 24 horas a 37ºC (Dahlgren y col.,
2002). Para su almacenamiento, las preparaciones de fibrillas se
diluyeron a 5 \muM en Hepes 100 mM, DTT 2,5 mM, EDTA 5 mM, NaCl
250 mM, glicerina al 2%, pH 7,6 y se congelaron a -80ºC.
La sensibilidad del ensayo se determinó por
valoración de las fibrillas de A\beta ensambladas in vitro
en el intervalo de concentración de 1 nM hasta 0,0025 nM. En este
intervalo el ensayo es lineal. Dado que la concentración de las
fibrillas se estimó a partir de la concentración de monómero de
partida usada para el ensamblaje en fibrillas y una fibrilla
corresponde a 100-1.000 monómeros, la concentración
real de las fibrillas medida es muy inferior, haciendo que el
límite de detección esté en el intervalo femtomolar (figura 2).
Para determinar si los monómeros de A\beta
pueden detectarse por citometría de flujo se incubó 1 nM de
monómero de A\beta 1-42 (Bachem), tratado según lo
descrito por Dahlgren y col.^{15}, con el par de anticuerpos
donante:aceptor y se realizó un análisis por citometría de flujo. No
se detectaron señales en ningún caso (diagramas de puntos FSC
frente a SSC; FL1 frente a FL3; figura 3a,b). En contraste con el
monómero de A\beta, al emplear 1 nM de fibrillas de A\beta
ensambladas in vitro (el amiloide (1-42) sin
semilla se disolvió en DMSO (Sigma-Aldrich) a 100
\muM, se diluyó en PBS hasta 0,5 \muM y se incubó durante 72
horas a 37ºC y la concentración de fibrillas usada se basó en la
concentración de monómero de partida) se detectaron sucesos de FRET
(FSC frente a SSC; FL1 frente a FL3), lo que demuestra que con el
ensayo es posible discriminar entre A\beta monomérico (no es
posible la detección) y A\beta oligomerizado (figura
3c, d).
3c, d).
Para las medidas de citometría de flujo se
diluyó LCR en diferentes disoluciones tampón. Solamente la dilución
del LCR en un tampón con las cantidades específicas de varios
detergentes permite una detección óptima de los oligómeros de
amiloide \beta (disolución 1 y disolución 2). Por lo tanto, el
procedimiento de pretratamiento es una etapa esencial y muy crítica
para la medida de los oligómeros de amiloide \beta. Como se
muestra en la figura 4, el uso de agua o de tampones comunes (PBS,
HEPES) para la dilución del LCR solo permite la detección de una
fracción mínima de los oligómeros presentes en la muestra. La razón
de esta ineficiente detección de los oligómeros es el denominado
enmascaramiento de epítopos que compite con la unión de los
anticuerpos.
Como resulta obvio del ejemplo 3, la disolución
1 es mejor para la detección de los oligómeros de amiloide \beta
en LCR. Por lo tanto, esta disolución tampón se seleccionó para las
medidas posteriores y se optimizó su concentración. Como se muestra
en la figura 5 (arriba), si se usa como una disolución de
concentración 1x, la disolución 1 aumenta el valor de fondo de las
medidas (flecha). Un resultado similar se obtiene cuando la
concentración del tampón se reduce a 0,25x - entonces la mayor parte
de la señal detectada es señal de fondo inespecífica (figura 5,
abajo). Sin embargo, una disolución 1 con una concentración 0,5x
desenmascara satisfactoriamente los oligómeros sin incrementar la
señal de fondo inespecífica (figura 5, medio). Así, este ejemplo
demuestra que la detección de oligómeros en LCR depende
esencialmente del pretratamiento de la muestra (es decir, de la
selección de una mezcla de detergentes apropiada) y, por lo tanto,
de las condiciones del tampón.
En el planteamiento actual se diluyen 200 \mul
de LCR con 200 \mul de la disolución 1, seguido de la incubación
con la mezcla de anticuerpos para FRET. Aunque se usaron 200 \mul
de cada muestra de LCR, este volumen no es limitante y puede
aumentarse si se requiere una mayor sensibilidad. Para visualizar
mejor el efecto de FRET, primeramente se incubó LCR humano con el
anticuerpo 4G8-Alexa Fluor 488 solo. En el análisis
de citometría de flujo subsiguiente se detectó una población
específica de oligómeros que solamente mostraba sucesos en el canal
de fluorescencia 1 (figura 6a; FL1-H). La adición
del anticuerpo receptor para FRET, 6E10-Alexa Fluor
594 indujo entonces una señal de fluorescencia adicional en el canal
de fluorescencia 3 (figura 6b-c;
FL3-H). Esta ganancia de una emisión específica de
Alexa Fluor 594 demuestra la unión de los dos anticuerpos muy
próximos entre sí (<10 nm), permitiendo la transferencia de
energía desde el fluorocromo donante Alexa Fluor 488 al aceptor
Alexa Fluor 594. Aunque la sensibilidad para la señal detectada
aumenta con la adición del anticuerpo aceptor, el número total de
sucesos específicos disminuye simultáneamente, posiblemente debido
a la competencia estérica de ambos anticuerpos por sus epítopos
respectivos, así como a una extinción de la fluorescencia inducida
por FRET de los fluorocromos aceptores. Dado que la probabilidad de
una unión inespecífica de ambos anticuerpos a una distancia
inferior a 10 nm es extremadamente baja, estos datos sugieren que
los sucesos detectados son realmente oligómeros de A\beta. Para
validar adicionalmente esta asunción se preparó un agrupamiento de
muestras de LCR (6 ml) y se analizó como se ha descrito
anteriormente. Sin embargo, los sucesos detectados en la región de
interés se separaron con un separador celular FACS Vantage y se
analizaron subsiguientemente mediante inmunotransferencia y
transferencia de puntos. Como se muestra en la figura 6d, mediante
inmunotransferencia pudieron detectarse ensamblajes desde monómeros
a pentámeros, lo que confirma que las partículas separadas están
compuestas del péptido A\beta (figura 6d, carril 2). La
comparación de la muestra derivada de la separación con una muestra
de LCR cargada directamente en el gel muestra que las formas de
mayor peso molecular pueden detectarse solamente en la muestra
enriquecida por separación (figura 6d, carriles
2-3). Dado que el ensayo no detecta monómeros de
A\beta (figura 3), esto indica que la banda de monómero del
material separado se origina a partir de estructuras oligoméricas.
Por lo tanto, puede sugerirse que la mayoría de los oligómeros
encontrados en el LCR no están reticulados covalentemente ni son
resistentes a SDS. Se consiguieron pruebas adicionales de los
oligómeros de A\beta detectados mediante análisis de transferencia
de puntos de la población separada, resultando una señal positiva
al usar el anticuerpo específico para el oligómero
A-11 (figura 6e).
Finalmente, para analizar el rendimiento clínico
del ensayo, se extendió el análisis del LCR a muestras obtenidas de
174 individuos sin demencia, con diversos trastornos neurológicos
(figura 7). La evaluación de los datos muestra una gran variación
en la concentración de los oligómeros detectados. Sin embargo, se
encontró una correlación entre la edad de los individuos y las
cantidades de oligómeros de A\beta (rho = 0,22; p = 0,0036), lo
que demuestra por primera vez que la concentración del oligómero
A\beta aumenta con la edad. Este resultado apoya la asunción de
que el equilibrio entre a\beta soluble a insoluble se altera con
la edad y proporciona una explicación para la disminución
dependiente de la edad que se observa para el A\beta monomérico
en LCR, concretamente, la formación de oligómeros.
Se sabe que los ciclos repetidos de congelación
y descongelación del LCR conducen a una disminución de la
concentración de monómeros de A\beta^{20}. Sin embargo, la
ausencia de un procedimiento de detección fiable hacía imposibles
estos estudios para oligómeros. Por lo tanto, se examinó el efecto
de ciclos de congelación y descongelación usando un agrupamiento de
muestras de LCR que había sido congelado a -80ºC y descongelado
consecutivamente tres veces. El primer valor se midió antes de la
congelación y se estableció como el 100%. En contraste con la
situación observada para los monómeros de A\beta^{20}, no se
observó un efecto significativo en la cantidad total de oligómeros
para todos los ciclos de congelación y descongelación aplicados
(figura 8).
Se investigó además la reproducibilidad del
ensayo, ejemplificada para siete muestras diferentes de LCR en la
figura 8b. La desviación típica para estas muestras es de 3,5 \pm
2,1% (figura 8b) e inferior al 5% para el ensayo en total. Como
puede observarse también en esta figura, dos de las muestras de LCR
fueron negativas para oligómeros de A\beta, aunque todas las
muestras contenían cantidades aproximadamente iguales de monómeros,
según se detectó por inmunotransferencia (figura 8c). Esto demuestra
de nuevo que no existe una correlación entre el contenido de
oligómeros y la concentración de A\beta, según se detecta por
inmunotransferencia o ELISA^{21} y subraya la ventaja del ensayo
respecto a otros procedimientos, es decir, la especificidad para
oligómeros, un volumen de muestra escalable y, por lo tanto, un
aumento de la sensibilidad.
Dado que la citometría de flujo es un
procedimiento común en los diagnósticos de rutina, el uso de nuestro
ensayo podría ser una alternativa de bajo coste frente a otros
procedimientos, en particular porque permite un alto rendimiento de
muestras y la automatización.
1. Fitzpatricka, A.L., Kullerb,
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forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
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Claims (10)
1. Procedimiento para la detección del péptido
amiloide \beta en fluidos corporales que comprende las etapas
siguientes:
a) proporcionar una muestra de un fluido
corporal para su análisis con respecto a la presencia de oligómeros
del péptido amiloide \beta;
b) desenmascarar los epítopos responsables de la
unión a anticuerpos en dichos oligómeros del péptido amiloide
\beta, mediante la eliminación de las proteínas fijadas a dichos
oligómeros del péptido amiloide \beta;
c) poner en contacto dicha muestra, después de
la etapa de desenmascaramiento, con un anticuerpo que comprende una
población de anticuerpos que se unen a un epítopo en dicho oligómero
del péptido amiloide \beta, estando una parte de la población de
anticuerpos marcada con un primer marcador fluorescente y estando la
otra parte de la población de anticuerpos marcada con un segundo
marcador fluorescente, o poniendo en contacto dicha muestra,
después de la etapa de desenmascaramiento, con al menos dos
anticuerpos que se unen a al menos dos epítopos diferentes en
dichos oligómeros del péptido amiloide \beta, estando el primer
anticuerpo marcado con un primer marcador fluorescente y estando
el, al menos, segundo anticuerpo marcado con un segundo marcador
fluorescente, en que dicho primer marcador fluorescente actúa como
donante, transfiriendo su energía a dicho segundo marcador
fluorescente que actúa como aceptor;
d) determinar la intensidad de la señal de
transferencia de energía por resonancia de fluorescencia emitida
por dicha muestra marcada por fluorescencia para detectar los
oligómeros del péptido amiloide \beta presentes en dicha muestra
corporal.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho fluido corporal es un fluido corporal de vertebrados,
preferentemente de humanos, ganado bovino, caballos, perros, gatos y
roedores.
3. Procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en
el que dichos epítopos se localizan preferentemente entre las
posiciones de aminoácidos 1-24 en el extremo amino y
en el que los epítopos se seleccionan preferentemente del grupo
formado por epítopo en los aa 4-13, el epítopo en
los aa 17-24; el epítopo en los aa
1-5; el epítopo en los aa 1-11; el
epítopo en los aa 1-7; el epítopo en los aa
15-24; el epítopo en los aa 3-9; el
epítopo en los aa 11-26; el epítopo en los aa
4-10; el epítopo en los aa 13-28; el
epítopo en los aa 1-10; el epítopo en los aa
31-40; el epítopo en los aa 8-17; el
epítopo en los aa 15-30; el epítopo en los aa
17-24; el epítopo en los aa 1-28;
el epítopo en los aa 12-28; el epítopo en los aa
17-42; el epítopo en los aa 20-40;
el epítopo en los aa 37-42; el epítopo en los aa
8-17; el epítopo en los aa 11-28; el
epítopo en los aa 1-6; el epítopo en los aa
8-17; el epítopo en los aa 12-28; el
epítopo en los aa 25-35; el epítopo en los aa
15-30; el epítopo en los aa 17-26;
el epítopo en los aa 1-12; el epítopo en los aa
32-40; el epítopo en los aa
33-42.
4. Procedimiento según una o más de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho desenmascaramiento se
realiza mediante la adición de uno o más detergentes,
preferentemente detergentes aniónicos, por ejemplo, SDS,
desoxicolato de Na; detergentes no iónicos, por ejemplo, Triton
X-100, Tween 20, Nonidet P-40;
detergentes anfóteros, por ejemplo, CHAPS y detergentes catiónicos,
por ejemplo, bromuro de tetradeciltrimetilamonio (TTAB) y/o otros
agentes desnaturalizantes de desenmascaramiento, preferentemente
reactivos básicos o ácidos, por ejemplo, ácido fórmico, clorhidrato
de guanidina o urea o hidróxidos alcalinos.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que dicho detergente se usa en una concentración inferior a la
concentración micelar crítica, preferentemente a aproximadamente el
0,01-2%, preferentemente el 0,02-1%
en peso.
6. Procedimiento según una o más de las
reivindicaciones anteriores, en el que la temperatura de dicha etapa
de desenmascaramiento b) y/o de dicha etapa de puesta en contacto
c) se halla en el intervalo de aproximadamente
15ºC-40ºC, preferentemente de
17ºC-30ºC y en el que, preferentemente, la
incubación con dichos agentes de desenmascaramiento y/o dichos
anticuerpos tiene lugar durante aproximadamente
30-90 min.
7. Procedimiento según una o más de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho fluido corporal se
selecciona del grupo formado por líquido cefalorraquídeo, sangre,
urina, lágrimas y saliva.
8. Procedimiento según una o más de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha intensidad de dicha
señal de transferencia de energía por resonancia de florescencia se
determina por citometría de flujo o procedimientos fotométricos.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las etapas (b) y (c) se llevan a cabo simultáneamente en una
sola preparación.
10. Procedimiento según una o más de las
reivindicaciones anteriores en el que se añaden inhibidores de
proteasas a la disolución de desenmascaramiento y/o a la disolución
que contiene los anticuerpos.
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