WO2011009967A1 - Kit y método de detección pre mórtem de ia enfermedad de alzheimer in vitro - Google Patents

Kit y método de detección pre mórtem de ia enfermedad de alzheimer in vitro Download PDF

Info

Publication number
WO2011009967A1
WO2011009967A1 PCT/ES2009/000392 ES2009000392W WO2011009967A1 WO 2011009967 A1 WO2011009967 A1 WO 2011009967A1 ES 2009000392 W ES2009000392 W ES 2009000392W WO 2011009967 A1 WO2011009967 A1 WO 2011009967A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
disease
alzheimer
kit
biomarker
marking
Prior art date
Application number
PCT/ES2009/000392
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Celia Sanchez Ramos
Original Assignee
Universidad Complutense De Madrid
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad Complutense De Madrid filed Critical Universidad Complutense De Madrid
Priority to EP09847515.5A priority Critical patent/EP2458385A4/en
Priority to US13/377,751 priority patent/US20120094308A1/en
Publication of WO2011009967A1 publication Critical patent/WO2011009967A1/es

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the present invention relates to the early detection of Alzheimer's disease (AD) through the discarded remains of lens surgery. So far, the only reliable method of diagnosis of this disease consists in the analysis of the patient's brain tissue after death. This invention raises early detection of Alzheimer's disease patients, preferably before they show signs of neuropathy.
  • AD Alzheimer's disease
  • Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease, which manifests with cognitive impairment and behavioral disorders. It is characterized in its typical form by a progressive loss of memory and other mental abilities, as neurons die and different areas of the brain atrophy. The impact of this disease is such that it is estimated between 18 and 22 million people affected worldwide, with an average prevalence of 3-15% and an annual incidence between 0.3-0.7%. The prevalence is variable, but it is estimated that between 1-5% of the population over 65 and between 20-40% of the population over 85 years of age suffers from the disease. In fact, its prevalence doubles every five years after age 65 and constitutes 50 to 60% of dementia syndromes in post-mortem studies. (J. Vilalta-Franch, S. López-Pousa, J. Garre-Olmo, A. Turón Estrada and I. Pericot-Nierga. Clinical heterogeneity of Alzheimer's disease according to the age of onset. Revista de Neurolog ⁇ a 2007; 45: 67-72)
  • CT Computed Axial Tomography
  • MRI Magnetic Resonance Imaging
  • PET Positron Emission Tomography
  • SPECT Single Photon Emission Computed Tomography
  • Alzheimer's disease manifests itself in two brain lesions.
  • One of them is the formation of a protein deposit that forms the senile or neuritic plaques of ⁇ -amyloid peptide (A ⁇ ) and the other consists of entangling the fibrils of neurons, known as neurofibrillar clews.
  • the senile plaques of Alzheimer's disease are formed by a protein center surrounded by degenerated neurons, as well as glia and microglia cells.
  • the A ⁇ peptide is normally produced in soluble monomeric form and circulates in low concentrations in the cerebrospinal fluid and blood. Despite the apparently negative role it presents in this neuropathy, this peptide participates in normal cellular functions, that is:
  • tau proteins are involved, which belong to the family of "Proteins associated with microtubules" or MAP, so that many times the diseases in which the formation of neurofibrils are observed are called taupatias.
  • the tau protein is normally phosphorylated, that is to say it has bound phosphate groups, which are very important in the regulation of the protein's function. This phosphorylation allows the mobility of tau proteins within the axons of the neurons in the centrifugal direction.
  • the helical filaments are composed of aggregates of tau which, unlike the normal protein, contains a high number of phosphates whereby it is said that tau is hyperphosphorylated (Wang HY, LiW., Benedetti NJ and Lee DH Alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors mediate beta-amyloid peptide-induced tau protein phosphorylation. J. Biol. Chem. (2003) 278, 31 547-31 553).
  • biomarkers biological markers
  • body fluids mainly in cerebrospinal fluid, blood and urine
  • HM Schipper The role of biologic markers in the diagnosis of Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia (2007) 3: 325-332).
  • the A ⁇ peptide and the tau protein are the main biomarkers for the in vitro diagnosis of AD.
  • Patent EP1420830A1 describes a method of in vivo ocular diagnosis of AD through the use of compounds or markers that bind to the A ⁇ peptide present in ocular tissues of patients.
  • the markers are normally fluorophores compounds that, when attached to the A ⁇ peptide, allow the detection and quantification of the A ⁇ present by means of fluorescence measurements, which would highlight the existence or not of the disease in the patient.
  • the disclosed procedure consists in applying said markers in the eye in the form of a liquid or gel. The lipophilicity of these compounds facilitates their penetration into the ocular tissue, where they bind to the A ⁇ peptide.
  • the fluorescence measurement is carried out directly in the patient's eyes. Therefore, it is a diagnosis of premortem, in vivo and non-invasive AD.
  • patent EP1913866A1 discloses a new non-invasive way to detect biological markers of EA in the lens and in other ocular tissues using quasi-elastic light scattering, Raman spectroscopy, fluorometry or other optical techniques. These techniques allow the detection and monitoring of deposition of A ⁇ peptide in the eye for the diagnosis of neurodegenerative diseases such as AD.
  • AD neurodegenerative diseases
  • the definitive diagnosis of AD for the moment, continues to be made only postmortem. It is therefore essential, therefore, to develop new tools for the early and preferably preclinical detection of AD, which allow for the establishment of adequate treatment in the early stages of the disease, so that the development of the symptoms of the disease can be delayed. same.
  • One aspect of the present invention relates to an EA detection kit by means of the use of the discarded remains in surgical interventions.
  • lens where the eye debris from the lens surgery is removed.
  • an EA biomarker is analyzed, preferably the A ⁇ peptide, which, in addition to being deposited in the brain of Alzheimer's patients, giving rise to senile or neuritic plaques, also does so in the lens.
  • Another aspect of the invention relates to the use of waste residues of the lens operations in the elaboration of a method for the detection of EA by means of the detection of a biomarker, for example by means of the detection of A ⁇ peptide.
  • cataracts In ophthalmic medicine, the total or partial opacification of the lens is called cataracts.
  • cataract operation the most frequent lens surgery is the cataract operation.
  • Cataract is a chronic disease associated with the aging process and the gradual increase in life expectancy has caused a substantial increase in the prevalence of cataracts that affects an increasing proportion of the population. Cataracts can develop for several reasons, however, the acquired cataract is the most frequent type and is the main cause of vision loss among those over 55 years of age, which is why the cataract operation is a very frequent intervention in the age range susceptible to Alzheimer's disease.
  • cataracts In fact, in people under 50-55 years the prevalence of cataracts is low, of the order of 0.2% to 7%; in intermediate age groups, between 55 and 65 years approximately, cataracts affect about 20% of the population of that age; and, from 70-75 years, cataracts affect between 40% and more than 60% of the population. Even without producing serious vision problems that require surgery, more than 75% of people over 60 and 95% of those over 75 already have some degree of opacity in the lens.
  • Extracapsular surgery is generally performed by a technique called phacoemulsification in which a small incision is made in the ocular tissue, followed by the destruction of the patient's opaque lenses by applying ultrasonic waves that produce a vibration between 30,000 and 60,000 times per second. This vibration breaks the cataract into fragments small enough to be emulsified and gently aspirated.
  • Phacoemulsion devices consist of a serum circulation system with irrigation and aspiration, connected to the ultrasound terminal itself. This system allows the emulsified fragments to be aspirated while keeping the emulsifier terminal refrigerated to avoid burns.
  • the aspirated opaque lens fragments are collected together with the serum in a container and constitute the remains discarded in the lens operations.
  • a lens is inserted in the place occupied by the patient's lens (Olitsky SE, Hug D, Smith LP. Abnormalities of the Lens. In: Kliegman RM, Behrman RE, Jenson HB, Stanton BF, eds. Nelson Textbook of Pediatrics 18— ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2007: chap. 627).
  • the detection kit of the EA of the invention includes two components. In the first place, it consists of a container element where the remains of the lens operation are collected. These remains are found in a liquid that is usually physiological serum. Secondly, the kit contains a marking element that joins the EA biomarker present in all the crystalline remains. If necessary, the kit includes a detection system for the marking element attached to the biomarker, which allows checking the presence or absence of said biomarker and, therefore, of the EA in the patient.
  • the kit may contain a system to separate the solid part and The liquid part of the mixture of remains obtained as a result of the operation. It is generally a centrifuge, which prints a rotational movement with a force of greater intensity than gravity, causing sedimentation of the solid remains in question.
  • the present invention also relates to the method of in vitro detection of an EA biomarker in the lens and this method includes, first, the collection, in a container element, of the crystalline remains extracted during the cataract operation together with the serum used in it.
  • This mixture can be treated directly with dyeing elements that bind to the biomarker, or it can be centrifuged to separate the liquid part of the mixture, corresponding to the serum, from the solid part, corresponding to the fragmented cells. Once separated, the solid part is processed to proceed to the biomarker of EA selected to detect the disease in the patient.
  • This step varies depending on the technique selected for biomarker detection.
  • the technique can be characterized by the inclusion of the sample in paraffin blocks from which subsequently cuts or sheets are obtained on which the marking element of the selected EA biomarker is applied. These blocks can also be obtained by rapid freezing of the solid part of the sample.
  • Another option is to separate the proteins from the rest of the elements of the solid part by any of the usual techniques (sonication, treatment with mild detergents, etc.) and, subsequently, detect the presence or absence of the biomarker in the protein mixture by means of Any of the techniques used by those skilled in the art (Western blot, ELISA type immunoenzymatic assays, protein microarrays, etc.) and using the appropriate marking element.
  • marking element means any compound that specifically shows the presence of a certain component of a heterogeneous mixture and, more specifically, when said component is a biomarker; and “biomarker” means a substance, whose presence is objectively measurable and evaluable, used as an indicator of the existence of AD either by its own presence or by changes in its quantity or concentration.
  • the biomarker used in this invention can be any of the biomarkers of EA.
  • the A ⁇ peptide is used, the A ⁇ peptide being the proteins or peptides that are part of the neuritic or senile plaques, both the amuoid protein and the ⁇ -amyloid precursor protein (APP) as any of the isoforms of between 39 and 42 amino acid residues generated by the natural proteolytic process that gives rise to several peptides (A ⁇ 1-40 , A ⁇ 2-4 or, A ⁇ 1-42 ) from the APP.
  • APP ⁇ -amyloid precursor protein
  • the selected tide element varies depending on the technique chosen to detect the presence of AD.
  • these markers already known in the state of the art are fluorophores compounds, that is, compounds that emit fluorescence once bound to the biomarker, which allows to easily detect the presence of said biomarker in the sample in question.
  • a fluorophore widely used for the detection of beta-amyloid is Congo Red or derivatives thereof, which results in the appearance of amyloid deposits stained in a tone between fuchsia and orange, easily dentifiable cables.
  • plaque evidence can be performed with other compounds such as thioflavin, violet crystal, or methenamine silver.
  • Specific anti-biomarker antibodies can also be used as marking elements by conventional techniques.
  • the kit and the method of the invention represent a benefit for the patient, since its use allows the detection of a biomarker of EA in vitro and not directly on the eye itself, so it is not necessary to apply any gel or ointment with the A ⁇ tidal elements on the patient's eye or make measurements directly on it, as is the case with any of the latest known inventions to detect A ⁇ ( EP1420830A1), thus avoiding any side effects, such as anaphylactic reactions.
  • the elaboration of the method and in the detection kit of the EA the remains that are extracted in the lens operations are used and that are systematically discarded giving them a utility to analyze the presence of A ⁇ or other bioindicators of the EA .
  • the present invention provides tools for the early detection of this disease so that treatments that mitigate or delay the progression of the disease can be established early.
  • the mass of solid remains was obtained, it was included in a "well” to which the two ends were covered with a fine or medium cloth.
  • the "wells” were placed in a bowl with running water and the tap open for washing for a period of 2 to 4 hours. Once the washing was done, the mass was dehydrated in alcohol.
  • the sample of the "wells” was extracted, dried with a sterile gauze and it was included in 30% alcohol for 30 minutes. After that time, the sample was dried with sterile gauze and it was included in 50% alcohol for 25 minutes. After 25 minutes of inclusion in 50% alcohol, the sample was dried and subsequently included in 70% alcohol for 24 hours.
  • the sample was dried with sterile gauze and it was included in 96% alcohol. This inclusion was done in two steps of 25 minutes each. The sample was dried with sterile gauze and included in 100% alcohol. This inclusion was done in three steps, two of them of 25 minutes and the last one of 1h and 30 minutes. The sample was dried and included in xylene for 40 minutes.
  • a solution of liquid paraffin and xylene with a 1: 1 ratio was prepared and the sample was included in said solution for 30 minutes in an oven at 5O 0 C. After that time the sample was included in liquid paraffin in three steps, two of they of 45 minutes and a final step of 1h and 30 minutes, during this phase the containers with paraffin were inside an oven at a temperature of 5O 0 C.
  • the assembly of the paraffin blocks began.
  • To assemble the paraffin blocks there were liquid paraffin at a temperature of 5O 0 C, Leuckart bars and a Bunsen burner. The Leuckart bars were placed on a metal surface, the paraffin was poured, the identification of the sample was placed and the sample was included in the still liquid block. Once this operation was performed, the block was introduced into a crystallizer with running water until it completely solidified with which the paraffin block was obtained with the sample included.
  • the cut was made, it was rehydrated to allow its coloration, following the inverse process to the dehydration described in example 3, that is, using alcohol with less concentration until leaving the cuts in deionized water.
  • the Mayer hematoxylin solution was stained for 10 minutes, rinsed for 5 minutes with tap water and left in alkaline sodium chloride solution for 20 minutes. It was then stained with alkaline congo red solution (SIGMA-ALDRICH) for 20 minutes, following the manufacturer's instructions.
  • Example 6 Staining with thioflavin T
  • the cut was made, it was rehydrated to allow its coloration, following the inverse process to the dehydration described in example 3, that is, using alcohol with less concentration until leaving the cuts in deionized water.
  • the already dewaxed and hydrated sections were incubated in a humid chamber at room temperature for 2 hours with the antiseptic serum. Subsequently they were incubated with a mixture of rabbit IgG IgG conjugated with Alexa-594 diluted 1: 500 and thioflavin T 10 ⁇ M, both prepared in bovine serum albumin (BSA) 1% (w / v) in 1X PBS buffer pH 7, 4; for 4 hours in darkness. The cuts were then washed 3 times for 5 minutes in 1X PBS / 0.05% Tween 20 (w / v).
  • BSA bovine serum albumin
  • the sections were mounted in fluorescence medium and were observed under an epifluorescence microscope using filters for rhodamine (594 nm) and FITC (488 nm) to visualize the red fluorescence of Alexa-594 and green of thioflavin T.
  • Monoclonal Mouse Anti-Human Beta-Amyloid (Dako) was used, in dilutions of 1: 50 and applied to sections, included in paraffin and fixed in formalin, using 10 minutes of epitope recovery by heat and 30 minutes of temperature incubation environment with the primary antibody.
  • the tissue sections were dewaxed and rehydrated as described in example 4, and the cuts, which were at room temperature, were immersed in a preheated and diluted 1: 10 solution with Dako Target Retrieval dewaxed water.
  • Solution High pH concentration 10x, in a water bath at 95 0 C. They were incubated for 30 minutes. The container with the slides was removed from the water bath. After cooling the sample for about 20 minutes at room temperature, the Target Retrieval Solution, High pH solution was decanted and the sections were rinsed three times with buffer pH 8.0 containing 5.0 M guanidine HCI and 50 mM trisHCI, at room temperature .
  • the negative control was performed with DakoCytomation Mouse IgGI, diluted to the same concentration of murine IgG as the primary antibody.
  • a ⁇ peptide levels were quantified by ELISA sandwich using a commercial kit, lnnotest A ⁇ 1-42, (Innogenetics, Belgium), which detects the amyloid fragment E1-42.
  • the sample obtained according to Example 2 was solubilized in an ice-cold buffer solution containing 5.0 M guanidine HCI and 50 mM trisHCI, pH 8.0; the samples were in incubation for 3 to 4 hours and then diluted 1: 10 in ice-cold buffer solution with 0.25% casein, 0.05% sodium azide, 20 ⁇ g / ml aprotinin, 5 mM EDTA, pH 8.0, 10 ⁇ g / ml of leupeptin in PBS. Centrifuged at 16.00Og for 20 min at 4 0 C.
  • a standard curve was made between 100 and 2,000 pg / ml that allowed to establish the equation and transform the absorbance data into protein concentration (pg / ml). The determination was doubled for each sample and the average of both was taken as the final result. Those samples in which the difference in determination between the two wells was greater than 20% were discarded.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Kit y método de detección premortem de la enfermedad de Alzheimer in vitro. La invención se refiere a un kit de detección de la enfermedad de Alzheimer mediante la identificación in vitro de la presencia de biomarcadores en los restos desechados tras una intervención quirúrgica de cristalino. El kit permite la detección premortem de la enfermedad, incluso antes de la aparición de sintomatología clínica. Entre los biomarcadores resulta de elección el péptido beta-amiloide.

Description

Kit y método de detección pre mórtem de Ia enfermedad de Alzheimer in vitro
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a Ia detección precoz de Ia enfermedad de Alzheimer (EA) a través de los restos desechados de las intervenciones quirúrgicas de cristalino. Hasta el momento, el único método de diagnóstico fiable de esta enfermedad consiste en el análisis del tejido cerebral del paciente tras su muerte. Esta invención plantea detectar tempranamente a los pacientes de Enfermedad de Alzheimer, preferentemente antes que muestren signos de Ia neuropatía.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa, que se manifiesta con deterioro cognitivo y trastornos conductuales. Se caracteriza en su forma típica por una pérdida progresiva de Ia memoria y de otras capacidades mentales, a medida que las neuronas mueren y diferentes zonas del cerebro se atrofian. La repercusión de este enfermedad es tal que se calcula entre 18 y 22 millones de personas las afectadas a nivel mundial, con una prevalencia media del 3- 15% y una incidencia anual entre 0,3- 0,7 %. La prevalencia es variable, pero se calcula que entre un 1-5 % de Ia población mayor de 65 años y entre un 20- 40% de Ia población mayor de 85 años padece Ia enfermedad. De hecho, su prevalencia se duplica cada cinco años después de los 65 años y constituye del 50 al 60 % de los síndromes demenciales en estudios post-mortem. (J. Vilalta- Franch, S. López-Pousa, J. Garre-Olmo, A. Turón Estrada e I. Pericot-Nierga. Heterogeneidad clínica de Ia enfermedad de Alzheimer según Ia edad de inicio. Revista de Neurología 2007; 45:67-72)
Aunque actualmente no existe cura para esta enfermedad, los medicamentos ahora disponibles para tratar el Alzheimer pueden ayudar a mantener las capacidades mentales de los pacientes durante meses o años, aunque no cambien el curso fundamental de Ia enfermedad. En este sentido, el diagnóstico precoz de Ia enfermedad aumenta las perspectivas de un tratamiento con éxito.
Sin embargo, actualmente no existe un método de diagnóstico específico y determinante para esta enfermedad, sino que se basa, primero, en Ia historia del paciente y en Ia observación clínica de características neurológicas y psicológicas, tanto por parte del profesional de Ia salud como por parte de los familiares. En segundo lugar, se realizan pruebas de imagen cerebral utilizando diferentes técnicas entre las que podemos señalar Ia Tomografía Axial Computarizada (TAC), Resonancia Magnética (RMN), Tomografía por Emisión de Positrones (TEP) o Ia Tomografía Computarizada por Emisión de Fotón Único (SPECT); sin embargo, estas técnicas pueden mostrar diferentes signos de que existe algún tipo de demencia, sin determinar el diagnostico definitivo. (Manuela Neumann, Deepak M. Sampathu, Linda K. Kwong. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science 2006; 314:130-133) El diagnóstico de Ia enfermedad basado en Ia observación clínica del paciente, en las pruebas neurológicas y neuropsicológicas, así como en Ia ausencia de un diagnóstico alternativo y apoyado en el escáner cerebral, ha conseguido aproximar Ia certeza del diagnóstico a un 85% pero el diagnóstico definitivo debe hacerse con pruebas histológicas sobre tejido cerebral obtenidas en Ia autopsia, es decir, se trata siempre de un diagnóstico post mórtem.
Los estudios post mórtem demuestran que Ia enfermedad de Alzheimer se manifiesta en dos lesiones cerebrales. Una de ellas es Ia formación de un depósito proteico que conforma las placas seniles o neuríticas de péptido β- amiloide (Aβ) y Ia otra consiste en un enmarañamiento de las fibrillas de las neuronas, conocido como ovillos neurofibrilares. Las placas seniles de Ia enfermedad de Alzheimer están formadas por un centro proteico rodeado de neuronas degeneradas, así como de células de glía y microglía. El péptido Aβ se produce normalmente en forma monomérica soluble y circula en concentraciones bajas en el líquido cefalorraquídeo y Ia sangre. A pesar del papel aparentemente negativo que presenta en esta neuropatía, este péptido participa en funciones celulares normales, esto es:
- Ejerce una función autocrina y estimula Ia proliferación celular.
- Promueve Ia adhesión celular y protege a las neuronas contra el daño oxidativo.
- En concentraciones fisiológicas puede actuar como factor neurotrófico y neuroprotector.
- Es un regulador fisiológico de Ia actividad de los canales iónicos de potasio (K) y calcio (Ca) en neuronas y es secretado por algunas de estas células en respuesta a Ia actividad neuronal para regular negativamente Ia transmisión sináptica excitatoria.
- Sus depósitos pueden atrapar iones metálicos potencialmente peligrosos. (Selkoe DJ. CeII biology of the amyloid β-protein precursor and the mechanism of Alzheimer's disease. Annu Rev CeII Biol (1994); 10:373-40) Los ovillos neurofibrilares son restos de microtúbulos dañados (los microtúbulos forman Ia estructura que permite el flujo de nutrientes a través de Ia neurona). La formación de estos ovillos se inicia en Ia región del hipocampo en Ia que reside Ia función de Ia gestión de Ia memoria y Ia ruptura del sistema microtubular origina defectos en el transporte axonal y probablemente degeneración celular, Io que ha sido observado en las neuronas afectadas por Ia enfermedad de Alzheimer. En este proceso están implicadas Ia proteínas tau, que pertenecen a Ia familia de Ia "Proteínas asociadas a los microtúbulos" o MAP, por Io que muchas veces las enfermedades en las que se observa Ia formación de neurofibrillas se denominan taupatías. (Castaño, E. M; Frangione. Biology of disease: Human amyloidosis, Alzheimer's disease and related disorders. Laboratory Investigation (1998) 58:122). En el citoplasma, Ia proteína tau está normalmente fosforilada, es decir que tiene grupos fosfato unidos, los cuales son muy importantes en Ia regulación de Ia función de Ia proteína. Esta fosforilación permite Ia movilidad de las proteínas tau dentro de los axones de las neuronas en dirección centrífuga. Los filamentos helicoidales están compuestos por agregados de tau que, a diferencia de Ia proteína normal, contiene un número elevado de fosfatos por Io cual se dice que tau se halla hiperfosforilada (Wang H. Y., LiW., Benedetti N. J. and Lee D. H. Alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors medíate beta-amyloid peptide-induced tau protein phosphorylation. J. Biol. Chem. (2003) 278, 31 547-31 553).
En Ia enfermedad de Alzheimer y otras taupatías se produce un fenómeno de hiperfosforilización y/o de fosforilización anormal. Se ha demostrado que ni Ia forma soluble de tau hiperfosforilada ni Ia que forma los filamentos tienen capacidad de promover Ia formación de microtúbulos ni de estabilizar los microtúbulos formados previamente. Más aún, esta forma de tau inhibe el ensamblado de Ia tubulina en los microtúbulos y puede desarmar aquellos formados con Ia proteína normal. Desde hace varios años se estudia Ia detección de diferentes biomarcadores (marcadores biológicos) en varios fluidos corporales, fundamentalmente en líquido cefalorraquídeo, sangre y orina, como base de futuras pruebas diagnósticas para Ia detección de Ia EA, sin embargo, por el momento, los expertos en el área no han podido establecer ningún protocolo de utilización de un biomarcador en el diagnóstico pre mórtem de Ia EA en este tipo de muestras (H. M. Schipper. The role of biologic markers in the diagnosis of Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia (2007) 3:325-332). En este sentido, el péptido Aβ y Ia proteína tau son los principales biomarcadores para el diagnóstico in vitro de Ia EA.
La patente EP1420830A1 describe un método de diagnóstico ocular in vivo de Ia EA mediante el uso de compuestos o marcadores que se unen al péptido Aβ presente en tejidos oculares de los enfermos. Los marcadores son, normalmente, compuestos fluoróforos que, al unirse al péptido Aβ permiten detectar y cuantificar el Aβ presente mediante mediciones de fluorescencia, Io que pondría en evidencia Ia existencia o no de Ia enfermedad en el paciente. El procedimiento divulgado consiste en aplicar dichos marcadores en el ojo en forma de líquido o gel. La lipofilia de estos compuestos facilita Ia penetración de los mismos en el tejido ocular, donde se unen al péptido Aβ. Posteriormente, tras un periodo de tiempo que asegure Ia penetración de los compuestos en el tejido ocular y Ia unión de los mismos al péptido Aβ, se lleva a cabo Ia medición de fluorescencia directamente en los ojos del paciente. Se trata, por tanto, de un diagnóstico Ia EA pre mórtem, in vivo y no invasivo.
Por otra parte, Ia patente EP1913866A1 divulga una nueva forma no invasiva de detectar marcadores biológicos de EA en el cristalino y en otros tejidos oculares usando dispersión de luz quasi-elástica, espectroscopia Raman, fluorometría u otras técnicas ópticas. Estas técnicas permiten Ia detección y monitorización de deposición de péptido Aβ en el ojo para el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas como es Ia EA. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos y los avances que se acaban de describir, el diagnóstico definitivo de Ia EA, por el momento, sigue realizándose sólo post mórtem. Sigue siendo fundamental, por Io tanto, desarrollar nuevas herramientas para Ia detección temprana y preferentemente preclínica, de Ia EA, que permitan instaurar el tratamiento adecuado en los estadios tempranos de Ia enfermedad, de manera que se pueda retrasar el desarrollo de los síntomas de Ia misma.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un aspecto de Ia presente invención se refiere a un kit de detección de Ia EA mediante Ia utilización de los restos desechados en intervenciones quirúrgicas de cristalino donde se extraen los desechos oculares de Ia cirugía de cristalino. Sobre esos desechos se analiza Ia presencia de un biomarcador de Ia EA, preferentemente el péptido Aβ, que, además de depositarse en el cerebro de los enfermos de Alzheimer dando lugar a las placas seniles o neuríticas, también Io hace en el cristalino.
Otro aspecto de Ia invención se refiere al uso de los restos de desecho de las operaciones de cristalino en Ia elaboración de un método para Ia detección de Ia EA mediante Ia detección de un biomarcador, por ejemplo mediante Ia detección de péptido Aβ.
En medicina oftalmológica, Ia opacificación total o parcial del cristalino se llama cataratas. Hoy en día, Ia intervención quirúrgica de cristalino más frecuente es Ia operación de cataratas. La catarata es una enfermedad crónica asociada al proceso de envejecimiento y el paulatino aumento de Ia esperanza de vida ha provocado un aumento sustancial de Ia prevalencia de cataratas que afecta a una proporción creciente de Ia población. Las cataratas se pueden desarrollar por varios motivos, sin embargo, Ia catarata adquirida es el tipo más frecuente y es Ia principal causa de pérdida de visión entre los mayores de 55 años, por Io que Ia operación de cataratas es una intervención muy frecuente en el rango de edades susceptibles de padecer Ia enfermedad de Alzheimer. De hecho, en personas menores de 50-55 años Ia prevalencia de las cataratas es baja, del orden del 0,2% al 7%; en grupos de edades intermedias, entre 55 y 65 años aproximadamente, las cataratas afectan a alrededor del 20% de Ia población de tal edad; y, a partir de los 70-75 años, las cataratas afectan a entre el 40% y más del 60% de Ia población. Aún sin llegar a producir problemas graves de visión que obliguen a Ia intervención quirúrgica, más del 75% de las personas mayores de 60 años y el 95% de las mayores de 75 presentan ya algún grado de opacidad en el cristalino.
De las intervenciones quirúrgicas realizadas para Ia eliminación de cataratas, Ia más difundida actualmente es Ia cirugía extracapsular, ya que tiene menos complicaciones que otras técnicas y permite el empleo de una lente intraocular. Mediante esta cirugía se extrae sólo Ia porción opaca de Ia catarata y se deja Ia porción posterior de Ia cápsula, que sirve de soporte para una lente intraocular que ocupa el mismo lugar que el cristalino extraído. La cirugía extracapsular se realiza generalmente mediante una técnica denominada facoemulsificación en Ia que se hace una incisión pequeña en el tejido ocular, seguida de Ia destrucción de las lentes opacas del paciente aplicando ondas ultrasónicas que producen una vibración de entre 30000 y 60000 veces por segundo. Esta vibración rompe Ia catarata en fragmentos suficientemente pequeños para ser emulsionados y aspirados suavemente. Los aparatos de facoemulsión constan de un sistema de circulación de suero con irrigación y aspiración, conectado al propio terminal de ultrasonido. Este sistema permite aspirar los fragmentos emulsificados al mismo tiempo que mantiene el terminal del emulsificador refrigerado para evitar quemaduras. Los fragmentos de cristalino opaco aspirados se recogen junto con el suero en un recipiente y constituyen los restos desechados en las operaciones de cristalino. Para finalizar Ia operación, se inserta una lente en el lugar que ocupaba el cristalino del paciente (Olitsky SE, Hug D, Smith LP. Abnormalities of the Lens. In: Kliegman RM, Behrman RE, Jenson HB, Stanton BF, eds. Nelson Textbook of Pediatrics. 18— ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2007: cap. 627).
El kit de detección de Ia EA de Ia invención incluye dos componentes. En primer lugar, consta de un elemento contenedor donde se recogen los restos de Ia operación de cristalino. Estos restos se encuentran en un líquido que suele ser suero fisiológico. En segundo lugar, el kit contiene un elemento de mareaje que se une al biomarcador de EA presente en el conjunto de los restos del cristalino. En caso necesario, el kit incluye un sistema de detección del elemento de mareaje unido al biomarcador, que permite comprobar Ia presencia o no de dicho biomarcador y, por Io tanto, de Ia EA en el paciente.
Adicionalmente, el kit puede contener un sistema para separar Ia parte sólida y Ia parte líquida de la mezcla de restos obtenida como resultado de Ia operación. Se trata generalmente de una centrifugadora, Ia cual imprime a Ia mezcla un movimiento rotatorio con una fuerza de mayor intensidad que Ia gravedad, provocando Ia sedimentación de los restos sólidos en cuestión.
Los restos desechados de las intervenciones quirúrgicas de cristalino que se incluyen en el kit, permiten detectar el contenido de biomarcador que se encuentra en el cristalino del paciente como consecuencia de Ia aparición y desarrollo de Ia EA. La presente invención también se refiere al método de detección in vitro de un biomarcador de EA en el cristalino y este método incluye, en primer lugar, Ia recogida, en un elemento contendor, de los restos de cristalino extraídos durante Ia operación de catarata junto con el suero utilizado en Ia misma. Esta mezcla puede ser tratada directamente con elementos de mareaje que se unen al biomarcador, o bien, puede ser centrifugada para separar Ia parte líquida de Ia mezcla, correspondiente al suero, de Ia parte sólida, correspondiente a las células fragmentadas. Una vez separada, Ia parte sólida se procesa para proceder al mareaje del biomarcador de EA seleccionado para detectar Ia enfermedad en el paciente. Este paso varía en función de Ia técnica seleccionada para Ia detección del biomarcador. La técnica puede caracterizarse por Ia inclusión de Ia muestra en bloques de parafina de los que posteriormente se obtienen cortes o láminas sobre los que se aplica el elemento de mareaje del biomarcador de EA seleccionado. Estos bloques también pueden obtenerse por congelación rápida de Ia parte sólida de Ia muestra. Otra opción es separar las proteínas del resto de elementos de Ia parte sólida mediante cualquiera de las técnicas habituales (sonicación, tratamiento con detergentes suaves, etc.) y, posteriormente, detectar Ia presencia o ausencia del biomarcador en Ia mezcla de proteínas por medio de cualquiera de las técnicas utilizadas por los expertos en Ia materia (Western blot, ensayos inmunoenzimáticos tipo ELISA, microarrays de proteínas, etc.) y utilizando para ello el elemento de mareaje oportuno.
En Ia presente invención por "elemento de mareaje" se entiende cualquier compuesto que pone de manifiesto específicamente Ia presencia de un determinado componente de una mezcla heterogénea y, más concretamente, cuando dicho componente es un biomarcador; y por "biomarcador" se entiende una sustancia, cuya presencia es objetivamente mensurable y evaluable, utilizada como indicadora de Ia existencia de Ia EA bien por su propia presencia o bien por modificaciones en su cantidad o concentración.
El biomarcador utilizado en esta invención puede ser cualquiera de los biomarcadores de EA. Preferentemente, se utiliza el péptido Aβ, entendiéndose por péptido Aβ las proteínas o péptidos que forman parte de las placas neuríticas o seniles, tanto Ia proteína amüoide como Ia proteína precursora de β-amiloide (APP) como cualquiera de las isoformas de entre 39 y 42 residuos aminoacídicos generados por el proceso proteolítico natural que da lugar a varios los péptidos (Aβ1-40, Aβ2-4o, Aβ1-42) a partir de Ia APP.
El elemento de mareaje seleccionado varía en función de Ia técnica elegida para detectar Ia presencia de EA. Frecuentemente, estos marcadores ya conocidos en el estado de Ia técnica son compuestos fluoróforos, es decir, compuestos que emiten fluorescencia una vez unidos al biomarcador, Io que permite detectar fácilmente Ia presencia de dicho biomarcador en Ia muestra en cuestión. Por ejemplo, un fluoróforo ampliamente utilizado para Ia detección de beta-amiloide es el Rojo Congo o derivados del mismo, que da lugar a Ia aparición de depósitos de amiloide teñidos en un tono entre fucsia y anaranjado fácilmente ¡dentif ¡cables. Al igual que el uso de otros fluoróforos, Ia evidencia de placas puede realizarse con otros compuestos como tioflavina, el cristal violeta, o Ia plata metenamina También se pueden utilizar como elementos de mareaje anticuerpos específicos anti-biomarcador mediante técnicas convencionales. El kit y el método de Ia invención suponen un beneficio para el paciente, ya que su uso permite Ia detección de un biomarcador de Ia EA in vitro y no directamente sobre el propio ojo, por Io que no es necesario aplicar ningún gel o pomada con los elementos de mareaje de Aβ sobre el ojo del paciente ni hacer medidas directamente sobre el mismo, como ocurre con alguna de las últimas invenciones conocidas para detectar Aβ (EP1420830A1), evitando así cualquier efecto secundario, como las reacciones anafilácticas. Por otra parte, en Ia elaboración del método y en el kit de detección de Ia EA se aprovechan los restos que se extraen en las operaciones de cristalino y que son sistemáticamente desechados dándoles una utilidad para analizar Ia presencia de Aβ u otros bioindicadores de Ia EA. Dado que las operaciones de cristalino en que se obtienen restos de cristalino y otros fluidos oculares se realizan en personas de edades similares o incluso anteriores a Ia aparición de los primeros síntomas clínicos de Ia EA, Ia presente invención proporciona herramientas para Ia detección precoz de esta enfermedad de forma que se puedan instaurar de manera temprana tratamientos que mitiguen o retrasen el avance de Ia enfermedad.
Modo de realización de Ia invención
Los siguientes ejemplos que se acompañan ayudan a comprender mejor Ia invención y se presentan con carácter ilustrativo y no limitativo de ésta.
Ejemplo 1. Obtención de las muestras
Se utilizaron los desechos extraídos en cirugía de cristalino realizadas a 42 pacientes, de edades comprendidas entre 68 y 88 años, mediante facoemulsión. Dichos restos se habían recogido en bolsas de plástico de desechos, habituales en este tipo de intervenciones quirúrgicas y, cada una de ellas, contenía los restos de cristalino y otros restos de fluidos oculares de una operación junto con el suero fisiológico utilizado en Ia misma. Las muestras se mantuvieron a 40C hasta el momento de su procesado. Ejemplo 2. Separación de los restos sólidos del cristalino
En primer lugar, se extrajo de Ia bolsa Ia disolución de restos celulares y suero fisiológico y se dejó en un vaso de precipitados durante 24h para que se produjera una precipitación natural de los restos sólidos, transcurrido este tiempo, se retiró todo el sobrenadante posible y se procedió a Ia centrifugación del sobrenadante. Se extrajo un volumen de 15ml del sobrenadante de esta primera centrifugación, que denominamos disolución M1 , y, en un tubo de ensayo, se centrifugó durante 15 minutos a 5000 revoluciones por minuto. Esta operación proporcionó una masa de restos sólidos y una disolución que se denominó M2.
De esta nueva disolución M2 se extrajo un volumen de 5ml y se centrifugó en un tubo Eppendorf durante 10 minutos a 5000 revoluciones por minuto. Esta operación proporcionó una masa de restos sólidos y una disolución que se denominó M3.
De esta nueva disolución M3 se extrajo un volumen de 5ml y se centrifugó en un tubo Eppendorf durante 5 minutos a 5000 revoluciones por minuto. Esta operación proporcionó una masa de restos sólidos y una disolución que se denominó M4.
Y por último se extrajo de Ia disolución M4 un volumen de 5ml y se centrifugó en un tubo Eppendorf durante 5 minutos a 5000 revoluciones por minuto. Esta operación proporcionó una masa de restos sólidos y un sobrenadante que se desechó.
Se unió toda Ia masa de restos sólidos obtenida mediante las diferentes centrifugaciones y se procedió a realizar una última centrifugación para eliminar todo el sobrenadante posible de Ia masa de restos sólidos, obteniendo una masa compacta. Ejemplo 3. inclusión en parafina de Ia masa de restos sólidos extraída de Ia disolución en suero de fragmentos de cristalino
Una vez obtenida Ia masa de restos sólidos se incluyó en un "pocilio" al que se taparon los dos extremos con una tela fina o media. Se colocaron los "pocilios" en un recipiente con agua corriente y el grifo abierto para proceder a su lavado durante un tiempo de 2 a 4 horas. Una vez realizado el lavado se procedió a deshidratar Ia masa en alcohol. Se extrajo Ia muestra de los "pocilios", se secó con una gasa esterilizada y se procedió a incluirla en alcohol al 30% durante 30 minutos. Una vez trascurrido ese tiempo, se secó Ia muestra con una gasa esterilizada y se procedió a incluirla en alcohol al 50 % durante 25 minutos. Trascurridos los 25 minutos de inclusión en alcohol de 50%, se procedió al secado de Ia muestra y posterior inclusión en alcohol de 70% durante 24 horas.
Se secó Ia muestra con una gasa estéril y se procedió a incluirla en alcohol de 96%. Esta inclusión se realizó en dos pasos de 25 minutos cada uno. Se procedió al secado de Ia muestra con gasas estériles y se incluyó en alcohol de 100%. Esta inclusión se realizó en tres pasos, dos de ellos de 25 minutos y el último de 1h y 30 minutos. Se secó Ia muestra y se procedió a su inclusión en xileno durante 40 minutos.
Se preparó una disolución de parafina líquida y xileno con una proporción 1 :1 y se incluyó Ia muestra en dicha disolución durante 30 minutos en una estufa a 5O0C. Trascurrido ese tiempo se incluyó Ia muestra en parafina líquida en tres pasos, dos de ellos de 45 minutos y un paso final de 1h y 30 minutos, durante esta fase los recipientes con parafina se encontraban dentro de una estufa a temperatura de 5O0C.
Una vez terminado este proceso de deshidratación se comenzó con el montaje de los bloques de parafina. Para montar los bloques de parafina se disponía de parafina líquida a una temperatura de 5O0C, barras de Leuckart y un mechero Bunsen. Se colocaron las barras de Leuckart sobre una superficie metálica, se vertió Ia parafina, se colocó Ia identificación de Ia muestra y se procedió a incluir Ia muestra en el bloque aún líquido. Una vez realizada esta operación se introdujo el bloque en un cristalizador con agua corriendo hasta que solidificó totalmente con Io cual se obtuvo el bloque de parafina con Ia muestra incluida.
Mediante Ia utilización de un microtomo se obtuvieron secciones del bloque de parafina de 10 μm de grosor. Una vez obtenida una serie de cortes, se depositaron sobre agua a 4O0C para que los cortes se estirasen. A continuación, se recogieron los cortes con portaobjetos que se colocaron en estufa a 370C durante toda Ia noche para fijarlos.
Ejemplo 4. Tinción con Rojo Congo en solución de hematoxilina de Maver
Una vez realizado el corte, se procedió a rehidratarlo para permitir su coloración, siguiendo el proceso inverso a Ia deshidratación descrita en el ejemplo 3, es decir, utilizando alcohol cada vez de menor concentración hasta dejar los cortes en agua desionizada.
Posteriormente se procedió a Ia tinción en solución de hematoxilina de Mayer durante 10 minutos, se aclaró durante 5 minutos con agua del grifo y se dejó en solución de cloruro sódico alcalina durante 20 minutos. A continuación se tiñó con solución de rojo congo alcalina (SIGMA-ALDRICH) durante 20 minutos, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Mediante Ia tinción con Rojo Congo y utilizando un microscopio de luz doblemente polarizada, Ia aparición de una coloración se utilizó como criterio para determinar Ia presencia de péptido Aβ en Ia muestra. Ejemplo 5. Tinción con Rojo Congo en hematoxilina de GiII
Se realizó como el Ejemplo 4 pero, en vez de hematoxilina de Mayer, se utilizó hematoxilina de GiII N0 3 y se tiñó durante 3 minutos. Ejemplo 6. Tinción con tioflavina T
Una vez realizado el corte, se procedió a rehidratarlo para permitir su coloración, siguiendo el proceso inverso a Ia deshidratación descrita en el ejemplo 3, es decir, utilizando alcohol cada vez de menor concentración hasta dejar los cortes en agua desionizada.
Los cortes ya desparafinados e hidratados fueron incubados en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 2 horas con el suero antipéptido. Posteriormente se incubaron con una mezcla de IgG anti IgG de conejo conjugado con Alexa-594 diluido 1 :500 y tioflavina T 10 μM, preparados ambos en albúmina sérica bovina (BSA) 1 % (p/v) en tampón PBS 1X pH 7,4; durante 4 horas en oscuridad. Luego los cortes se lavaron 3 veces por 5 minutos en PBS 1X/ Tween 20 0.05% (p/v).
Los cortes se montaron en medio para fluorescencia y fueron observados en microscopio de epifluorescencia usando filtros para rodamina (594 nm) y FITC (488 nm) para visualizar Ia fluorescencia roja del Alexa-594 y verde de Ia tioflavina T.
Ejemplo 7. Montaje
Luego de Ia coloración, se deshidrató el corte y se procedió a Ia aclaración y montaje definitivo. La deshidratación se realizó con alcoholes de graduaciones crecientes.
La aclaración se realizó con xilol. El objetivo de este paso es impregnar el corte con el disolvente Bálsamo de Canadá, que al mismo tiempo Ie confiere un índice de refracción semejante al del vidrio. Para el montaje se limpió el portaobjeto alrededor del corte y se depositó sobre el mismo una gota de Bálsamo de Canadá disuelto en xilol y se cubrió con un cubreobjeto. Se dejó secar unas horas antes de su observación al microscopio. Ejemplo 8. Detección de péptido Aβ en cortes de parafina mediante anticuerpos monoclonales anti-Aβ humano
Se utilizó Monoclonal Mouse Anti-Human Beta-Amyloid (Dako), en diluciones de 1 :50 y se aplicó a secciones, incluidas en parafina y fijadas en formol, utilizando 10 minutos de recuperación de epítopo por calor y 30 minutos de incubación a temperatura ambiente con el anticuerpo primario.
Para Ia recuperación del epítopo los cortes de tejido se desparafinaron y rehidrataron como se describe en el ejemplo 4, y se sumergieron los cortes, que se encontraban a temperatura ambiente, en una solución precalentada y diluida 1 :10 con agua deshinizada de Dako Target Retrieval Solution, High pH concentración 10x, en un baño de agua a 950C. Se incubaron durante 30 minutos. Se retiró el contenedor con los portaobjetos del baño de agua. Una vez enfriada Ia muestra durante unos 20 minutos a temperatura ambiente se decantó Ia solución Target Retrieval Solution, High pH y se aclararon los cortes tres veces con tampón pH 8,0 que contenía 5,0 M guanidinaHCI y 50 mM trisHCI, a temperatura ambiente. El control negativo se realizó con DakoCytomation Mouse IgGI , diluido a Ia misma concentración de IgG murina que el anticuerpo primario.
Ejemplo 9: Detección de péptido Aβ por una técnica inmunoenzimática
Los niveles de péptido Aβ se cuantificaron mediante sandwich ELISA utilizando un kit comercial, lnnotest A β1-42, (Innogenetics, Bélgica), que detecta el fragmento E1-42 de amiloide.
La muestra obtenida según el ejemplo 2 fue solubilizada en una solución tampón enfriada en hielo que contenía 5,0 M guanidinaHCI y 50 mM trisHCI, pH 8,0; las muestras estuvieron en incubación por 3 a 4 horas y luego se diluyeron 1 :10 en solución tampón enfriada en hielo con caseína al 0,25%, azida de sodio 0,05%, 20 μg/ml de aprotinina, 5 mM EDTA, pH 8,0, 10 μg/ml de leupeptina en PBS. Se centrifugaron a 16.00Og por 20 minutos a 40C. Se utilizaron pocilios impregnados del anticuerpo primario (anti-Aβ) que se incubaron durante 1 hora a 37° con otro anticuerpo anti-Aβ biotinilado, las muestras correspondientes, estreptavidina conjugada con peroxidasa y una solución cromógena (tetrametilbenzidina disuelta en dimetil sulfóxido). La reacción se paró con ácido sulfúrico 1 N y se leyó Ia absorbancia de cada pocilio con un lector a una longitud de onda de 450 nm.
Se realizó una curva estándar entre 100 y 2.000 pg/ml que permitió establecer Ia ecuación y transformar los datos de absorbancia en concentración de proteína (pg/ml). Para cada muestra se duplicó Ia determinación y se tomó como resultado final Ia media de ambas. Aquellas muestras en las que Ia diferencia de determinación entre los dos pocilios fue mayor de un 20% se descartaron.

Claims

Reivindicaciones
1. Kit de detección de Ia enfermedad de Alzheimer que comprende:
a) un elemento contenedor donde se recogen los desechos oculares extraídos durante Ia cirugía de cristalino.
b) un elemento de mareaje que se une a un biomarcador de Ia enfermedad de Alzheimer que esté presente en los desechos oculares recogidos en el elemento contenedor;
2. Kit de detección de Ia enfermedad de Alzheimer, según Ia reivindicación 1 , que comprende, además, un sistema de detección del elemento de mareaje unido al biomarcador.
3. Kit de detección de Ia enfermedad de Alzheimer, según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, que comprende adicionalmente los medios necesarios para realizar Ia separación de Ia parte sólida y Ia parte líquida del contenido del elemento contenedor.
4. Kit de detección de Ia enfermedad de Alzheimer, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el biomarcador es el péptido β-amiloide.
5. Kit de detección de Ia enfermedad de Alzheimer, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el elemento de mareaje es un compuesto fluorescente.
6. Kit de detección de Ia enfermedad de Alzheimer, según Ia reivindicación 5, en el que el compuesto fluorescente es Rojo Congo o derivados del mismo.
7. Kit de detección de Ia enfermedad de Alzheimer, según Ia reivindicación 5, en el que el compuesto fluorescente es tioflavina T.
8. Kit de detección de Ia enfermedad de Alzheimer, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el elemento de mareaje es un anticuerpo.
9. Kit de detección de Ia enfermedad de Alzheimer, según Ia reivindicación 8, en que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-beta-amiloide.
10. Kit de detección de Ia enfermedad de Alzheimer, según cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4, 8 y 9, en el que el sistema de detección se basa en una técnica inmunológica.
11. Kit de detección de Ia enfermedad de Alzheimer, según Ia reivindicación 10, en el que Ia técnica inmunológica se selecciona entre ELISA tipo sandwich, ELISA competitivo, ELISA directo, ELISA indirecto y Western Blot.
12. Método in vitro de detección de Ia enfermedad de Alzheimer que comprende:
a) recuperar los restos desechados de una operación quirúrgica de cristalino; b) detectar un biomarcador de Ia enfermedad de Alzheimer en los restos recuperados.
13. Método in vitro según Ia reivindicación 12 que incluye un paso adicional c) entre el paso a) y el paso b) y en el que dicho paso adicional c) comprende marcar el biomarcador de Ia enfermedad de Alzheimer con un elemento de mareaje.
14. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 12 y 13 que incluye un paso adicional d) entre el paso a) y el paso b) o bien entre el paso a) y el paso c) y en el que dicho paso adicional d) comprende separar Ia parte sólida y Ia parte líquida de los restos de desecho recuperados.
15. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que el biomarcador es el péptido beta-amiloide.
16. Método ¡n vitro según cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en el que el mareaje del paso c) se realiza con un compuesto fluorescente.
17. Método in vitro según Ia reivindicación 16, en el que el compuesto fluorescente es Rojo Congo o derivados del mismo.
18. Método in vitro según Ia reivindicación 16, en el que el compuesto fluorescente es tioflavina T.
19. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en el que el mareaje del paso c) se realiza con un anticuerpo.
20. Método in vitro según Ia reivindicación 19, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-beta-amiloide.
21. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 12, 13, 14, 15, 19 y 20, en que el sistema de detección se basa en una técnica inmunológica.
22. Método in vitro según Ia reivindicación 21 , en que Ia técnica inmunológica se selecciona entre ELISA tipo sandwich, ELISA competitivo, ELISA directo,
ELISA indirecto y Western Blot.
23. Uso de los restos de desecho de las intervenciones de cristalino en Ia elaboración de un método de diagnóstico in vitro de Ia enfermedad de Alzheimer.
24. Uso según Ia reivindicación 23 en el que el método de diagnóstico in vitro comprende:
a) recuperar los restos desechados de una operación quirúrgica de cristalino; b) detectar Ia presencia o ausencia de un biomarcador de Ia enfermedad de Alzheimer en los restos recuperados.
25. Uso según Ia reivindicación 24 en el que el método de diagnóstico in vitro incluye un paso adicional c) entre el paso a) y el paso b) y en el que dicho paso adicional c) comprende marcar el biomarcador de Ia enfermedad de Alzheimer con un elemento de mareaje.
26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 y 25 en el que el método de diagnóstico in vitro incluye un paso adicional d) entre el paso a) y el paso b) o bien entre el paso a) y el paso c) y en el que dicho paso adicional d) comprende separar Ia parte sólida y Ia parte líquida de los restos de desecho recuperados.
27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24-26, en el que el biomarcador es el péptido beta-amiloide.
28. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23-27, en el que el mareaje del paso c) se realiza con un compuesto fluorescente.
29. Uso según reivindicación 28, en el que el compuesto fluorescente es Rojo Congo o derivados del mismo.
30. Uso según reivindicación 28, en el que el compuesto fluorescente es tioflavina T.
31. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23-27, en el que el mareaje del paso c) se realiza con un anticuerpo.
32. Uso según Ia reivindicación 31 , en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-beta-amiloide.
33. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24, 25, 26, 27, 31 y 32, en que el sistema de detección se basa en una técnica inmunológica.
34. Uso según Ia reivindicación 33, en que Ia técnica inmunológica se selecciona entre ELISA tipo sandwich, ELISA competitivo, ELISA directo, ELISA indirecto y Western Blot.
PCT/ES2009/000392 2009-07-23 2009-07-23 Kit y método de detección pre mórtem de ia enfermedad de alzheimer in vitro WO2011009967A1 (es)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09847515.5A EP2458385A4 (en) 2009-07-23 2009-07-23 KIT AND PREMORTEM DETECTION METHOD OF ALZHEIMER IN VITRO DISEASE
US13/377,751 US20120094308A1 (en) 2009-07-23 2009-07-23 Kit and method for the premortem in vitro detection of alzheimer's disease

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP200901632 2009-07-23
ES200901632A ES2351454A1 (es) 2009-07-23 2009-07-23 Kit y metodo de detección pre mortem de la enfermedad de alzheimer in vitro.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011009967A1 true WO2011009967A1 (es) 2011-01-27

Family

ID=43480391

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2009/000392 WO2011009967A1 (es) 2009-07-23 2009-07-23 Kit y método de detección pre mórtem de ia enfermedad de alzheimer in vitro

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20120094308A1 (es)
EP (1) EP2458385A4 (es)
ES (1) ES2351454A1 (es)
WO (1) WO2011009967A1 (es)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013111045A1 (en) * 2012-01-26 2013-08-01 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Use of waste products for detecting amyloidogenic proteinaceous material in living mammals

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9588129B2 (en) 2013-03-15 2017-03-07 Amira Medical Technologies Inc. Methods for analyzing blood to detect diseases associated with abnormal protein aggregation

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1420830A1 (en) 2001-04-27 2004-05-26 The General Hospital Corporation Ocular diagnosis of alzheimer's disease
EP1913866A1 (en) 2000-08-21 2008-04-23 The General Hospital Corporation Methods for diagnosing a neurodegenerative condition
WO2008115197A2 (en) * 2006-06-29 2008-09-25 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Methods of identifying disease biomarkers in the lense of the eye

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7189703B2 (en) * 1998-01-09 2007-03-13 Intracell, Llc Treatment and diagnosis of alzheimer's disease
EP1322959A1 (en) * 2000-08-21 2003-07-02 The General Hospital Corporation Methods for diagnosing a neurodegenerative condition
EP2323697A2 (en) * 2008-07-24 2011-05-25 Siemens Medical Solutions USA, Inc. Imaging agents useful for identifying ad pathology
US9839699B2 (en) * 2008-09-18 2017-12-12 Yeda Research And Development Co., Ltd. Optical method for detecting Alzheimer's disease by systemic administration of curcumin

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1913866A1 (en) 2000-08-21 2008-04-23 The General Hospital Corporation Methods for diagnosing a neurodegenerative condition
EP1420830A1 (en) 2001-04-27 2004-05-26 The General Hospital Corporation Ocular diagnosis of alzheimer's disease
WO2008115197A2 (en) * 2006-06-29 2008-09-25 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Methods of identifying disease biomarkers in the lense of the eye

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CASTANO, E.M, FRANGIONE. BIOLOGY OF DISEASE: HUMAN AMYLOIDOSIS, vol. 58, 1998, pages 122
GOLDSTEIN L. E. ET AL.: "Cytosolic beta-amyloid deposition and supranuclear cataracts in lenses from people with Alzheimer's disease.", THE LANCET., vol. 361, 12 April 2003 (2003-04-12), pages 1258 - 1265, XP004782463 *
H.M. SCHIPPER: "The role of biologic markers in the diagnosis of Alzheimer's disease", ALZHEIMER'S & DEMENTIA, vol. 3, 2007, pages 325 - 332
J. VILALTA-FRANCH; S. L6PEZ-POUSA; J. GARRE-OLMO; A. TURON ESTRADA E I. PERICOT-NIERGA: "Heterogeneidad clinica de la enfermedad de Alzheimer segun la edad de inicio", REVISTA DE NEUROLOGIA, vol. 45, 2007, pages 67 - 72
MANUELA NEUMANN; DEEPAK M. SAMPATHU; LINDA K. KWONG: "Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis", SCIENCE, vol. 314, 2006, pages 130 - 133, XP002534603, DOI: doi:10.1126/SCIENCE.1134108
OLITSKY SE; HUG D; SMITH LP: "Nelson Textbook of Pediatrics", 2007, ELSEVIER, article "Abnormalities of the Lens", pages: 627
See also references of EP2458385A4
SELKOE DJ.: "Cell biology of the amyloid p-protein precursor and the mechanism of Alzheimer's disease", ANNU REV CELL BIOL, vol. 10, 1994, pages 373 - 40
WANG H. Y.; LI W.; BENEDETTI N. J.; LEE D. H.: "Alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors mediate beta-amyloid peptide-induced tau protein phosphorylation", J. BIOL. CHEM., vol. 278, no. 31, 2003, pages 547 - 31 553

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013111045A1 (en) * 2012-01-26 2013-08-01 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Use of waste products for detecting amyloidogenic proteinaceous material in living mammals

Also Published As

Publication number Publication date
EP2458385A1 (en) 2012-05-30
ES2351454A1 (es) 2011-02-04
EP2458385A4 (en) 2013-05-01
US20120094308A1 (en) 2012-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Calvo-Rodriguez et al. Increased mitochondrial calcium levels associated with neuronal death in a mouse model of Alzheimer’s disease
Mancino et al. Glaucoma and Alzheimer disease: one age-related neurodegenerative disease of the brain
Edwards III et al. Traumatic brain injury induces tau aggregation and spreading
Chiasseu et al. Tau accumulation in the retina promotes early neuronal dysfunction and precedes brain pathology in a mouse model of Alzheimer’s disease
Pomilio et al. Microglial autophagy is impaired by prolonged exposure to β-amyloid peptides: evidence from experimental models and Alzheimer’s disease patients
ES2953855T3 (es) Detección de proteínas mal plegadas
ES2323725T3 (es) Procedimiento para la deteccion de oligomeros de amiloide beta en fluidos corporales.
Ho et al. Beta‐Amyloid, Phospho‐Tau and Alpha‐Synuclein Deposits Similar to Those in the Brain Are Not Identified in the Eyes of A lzheimer's and P arkinson's Disease Patients
Jonson et al. Aggregated Aβ1-42 is selectively toxic for neurons, whereas glial cells produce mature fibrils with low toxicity in Drosophila
Bjorkli et al. Bridging the gap between fluid biomarkers for Alzheimer’s disease, model systems, and patients
Takamura et al. Sortilin is required for toxic action of Aβ oligomers (AβOs): extracellular AβOs trigger apoptosis, and intraneuronal AβOs impair degradation pathways
WO2014207049A2 (de) Verfahren zur ermittlung von indikatoren zur bestimmung von krankheiten
Latina et al. Systemic delivery of a specific antibody targeting the pathological N-terminal truncated tau peptide reduces retinal degeneration in a mouse model of Alzheimer’s Disease
ITRM20100320A1 (it) Metodo per la diagnostica e il trattamento delle taupatie
Fan et al. NPAS4 facilitates the autophagic clearance of endogenous Tau in rat cortical neurons
Walkiewicz et al. Primary retinal tauopathy: A tauopathy with a distinct molecular pattern
Bac et al. The TgF344-AD rat: behavioral and proteomic changes associated with aging and protein expression in a transgenic rat model of Alzheimer's disease
WO2011009967A1 (es) Kit y método de detección pre mórtem de ia enfermedad de alzheimer in vitro
Ali et al. Peptide aptamer targeting Aβ–PrP–Fyn axis reduces Alzheimer’s disease pathologies in 5XFAD transgenic mouse model
Carlson et al. Differential regional responses in soluble monomeric alpha synuclein abundance following traumatic brain injury
Ferrer‐Raventós et al. Amyloid precursor protein 𝛽CTF accumulates in synapses in sporadic and genetic forms of Alzheimer's disease
Panayi et al. Traumatic brain injury in mice generates early-stage Alzheimer’s disease related protein pathology that correlates with neurobehavioral deficits
Martorana Alzheimer's disease and the routine clinical use of CSF biomarkers
Sandoval-Pistorius UBQLN2 Function and Dysfunction in the Central Nervous System and Synucleinopathies
Akerman Early biomarker detection & potential novel pathogenic pathways of Alzheimer disease involving Aβ and Tau

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09847515

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13377751

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009847515

Country of ref document: EP