ES2351454A1 - Kit y metodo de detección pre mortem de la enfermedad de alzheimer in vitro. - Google Patents
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Abstract
Kit y método de detección premortem de la enfermedad de Alzheimer in vitro. La invención se refiere a un kit de detección de la enfermedad de Alzheimer mediante la identificación in vitro de la presencia de biomarcadores en los restos desechados tras una extracción de los fragmentos de los agregados proteicos en la intervención de cataratas. El kit permite la detección premortem de la enfermedad, incluso antes de la aparición de sintomatología clínica. Entre los biomarcadores resulta de elección el péptido beta-amiloide y para ello se pueden utilizar distintos métodos tanto para procesar las muestras como para marcar la presencia del biomarcador. La invención también incluye un método de detección premortem e in vitro de la enfermedad de Alzheimer mediante la utilización de los fragmentos de los agregados proteicos extraídos en la intervención de cataratas.
Description
Kit y método de detección premortem de la
enfermedad de Alzheimer in vitro.
La presente invención se refiere a la detección
precoz de la enfermedad de Alzheimer (EA) a través de los restos
desechados de las intervenciones quirúrgicas de cristalino. Hasta el
momento, el único método de diagnóstico fiable de esta enfermedad
consiste en el análisis del tejido cerebral del paciente tras su
muerte. Esta invención plantea detectar tempranamente a los
pacientes de Enfermedad de Alzheimer, preferentemente antes que
muestren signos de la neuropatía.
La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad
neurodegenerativa, que se manifiesta con deterioro cognitivo y
trastornos conductuales. Se caracteriza en su forma típica por una
pérdida progresiva de la memoria y de otras capacidades mentales, a
medida que las neuronas mueren y diferentes zonas del cerebro se
atrofian.
La repercusión de esta enfermedad es tal que se
calcula entre 18 y 22 millones de personas las afectadas a nivel
mundial, con una prevalencia media del 3-15% y una
incidencia anual entre 0,3-0,7%. La prevalencia es
variable, pero se calcula que entre un 1-5% de la
población mayor de 65 años y entre un 20-40% de la
población mayor de 85 años padece la enfermedad. De hecho, su
prevalencia se duplica cada cinco años después de los 65 años y
constituye del 50 al 60% de los síndromes demenciales en estudios
post mórtem. (J. Vilalta-Franch, S.
López-Pousa, J. Garre-Olmo, A. Turón
Estrada e I. Pericot-Nierga. Heterogeneidad clínica
de la enfermedad de Alzheimer según la edad de inicio. Revista de
Neurología 2007; 45:67-72).
Aunque actualmente no existe cura para esta
enfermedad, los medicamentos ahora disponibles para tratar el
Alzheimer pueden ayudar a mantener las capacidades mentales de los
pacientes durante meses o años, aunque no cambien el curso
fundamental de la enfermedad. En este sentido, el diagnóstico precoz
de la enfermedad aumenta las perspectivas de un tratamiento con
éxito.
Sin embargo, actualmente no existe un método de
diagnóstico específico y determinante para esta enfermedad, sino que
se basa, primero, en la historia del paciente y en la observación
clínica de características neurológicas y psicológicas, tanto por
parte del profesional de la salud como por parte de los familiares.
En segundo lugar, se realizan pruebas de imagen cerebral utilizando
diferentes técnicas entre las que podemos señalar la Tomografía
Axial Computarizada (TAC), Resonancia Magnética (RMN), Tomografía
por Emisión de Positrones (TEP) o la Tomografía Computarizada por
Emisión de Fotón Único (SPECT); sin embargo, estas técnicas pueden
mostrar diferentes signos de que existe algún tipo de demencia, sin
determinar el diagnóstico definitivo. (Manuela Neumann, Deepak M.
Sampathu, Linda K. Kwong. Ubiquitinated TDP-43 in
frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.
Science 2006; 314:130-133).
El diagnóstico de la enfermedad basado en la
observación clínica del paciente, en las pruebas neurológicas y
neuropsicológicas, así como en la ausencia de un diagnóstico
alternativo y apoyado en el escáner cerebral, ha conseguido
aproximar la certeza del diagnóstico a un 85% pero el diagnóstico
definitivo debe hacerse con pruebas histológicas sobre tejido
cerebral obtenidas en la autopsia, es decir, se trata siempre de un
diagnóstico post mórtem.
Los estudios post mórtem demuestran que
la enfermedad de Alzheimer se manifiesta en dos lesiones cerebrales.
Una de ellas es la formación de un depósito proteico que conforma
las placas seniles o neuríticas de péptido
\beta-amiloide (A\beta) y la otra consiste en
un enmarañamiento de las fibrillas de las neuronas, conocido como
ovillos neurofibrilares.
Las placas seniles de la enfermedad de Alzheimer
están formadas por un centro proteico rodeado de neuronas
degeneradas, así como de células de glía y microglía. El péptido
A\beta se produce normalmente en forma monomérica soluble y
circula en concentraciones bajas en el líquido cefalorraquídeo y la
sangre. A pesar del papel aparentemente negativo que presenta en
esta neuropatía, este péptido participa en funciones celulares
normales, esto es:
- Ejerce una función autocrina y estimula la
proliferación celular.
- Promueve la adhesión celular y protege a las
neuronas contra el daño oxidativo.
- En concentraciones fisiológicas puede actuar
como factor neurotrófico y neuroprotector.
- Es un regulador fisiológico de la actividad de
los canales iónicos de potasio (K) y calcio (Ca) en neuronas y es
secretado por algunas de estas células en respuesta a la actividad
neuronal para regular negativamente la transmisión sináptica
excitatoria.
- Sus depósitos pueden atrapar iones metálicos
potencialmente peligrosos. (Selkoe DJ. Cell biology of the amyloid
\beta-protein precursor and the mechanism of
Alzheimer's disease. Annu Rev Cell Biol (1994);
10:373-40).
Los ovillos neurofibrilares son restos de
microtúbulos dañados (los microtúbulos forman la estructura que
permite el flujo de nutrientes a través de la neurona). La formación
de estos ovillos se inicia en la región del hipocampo en la que
reside la función de la gestión de la memoria y la ruptura del
sistema microtubular origina defectos en el transporte axonal y
probablemente degeneración celular, lo que ha sido observado en las
neuronas afectadas por la enfermedad de Alzheimer. En este proceso
están implicadas las proteínas tau, que pertenecen a la familia de
las "Proteínas asociadas a los microtúbulos" o MAP, por lo que
muchas veces las enfermedades en las que se observa la formación de
neurofibrillas se denominan taupatías. (Castaño, E.M; Frangione.
Biology of disease: Human amyloidosis, Alzheimer's disease and
related disorders. Laboratory Investigation (1998) 58:122).
En el citoplasma, la proteína tau está
normalmente fosforilada, es decir que tiene grupos fosfato unidos,
los cuales son muy importantes en la regulación de la función de la
proteína. Esta fosforilación permite la movilidad de las proteínas
tau dentro de los axones de las neuronas en dirección centrífuga.
Los filamentos helicoidales están compuestos por agregados de tau
que, a diferencia de la proteína normal, contiene un número elevado
de fosfatos por lo cual se dice que tau se halla hiperfosforilada
(Wang H. Y., LiW., Benedetti N. J. and Lee D. H. Alpha 7 nicotinic
acetylcholine receptors mediate beta-amyloid
peptide-induced tau protein phosphorylation. J.
Biol. Chem. (2003) 278, 31 547-31 553).
En la enfermedad de Alzheimer y otras taupatías
se produce un fenómeno de hiperfosforilización y/o de
fosforilización anormal. Se ha demostrado que ni la forma soluble de
tau hiperfosforilada ni la que forma los filamentos tienen capacidad
de promover la formación de microtúbulos ni de estabilizar los
microtúbulos formados previamente. Más aún, esta forma de tau inhibe
el ensamblado de la tubulina en los microtúbulos y puede desarmar
aquellos formados con la proteína normal.
Desde hace varios años se estudia la detección
de diferentes biomarcadores (marcadores biológicos) en varios
fluidos corporales, fundamentalmente en líquido cefalorraquídeo,
sangre y orina, como base de futuras pruebas diagnósticas para la
detección de la EA, sin embargo, por el momento, los expertos en el
área no han podido establecer ningún protocolo de utilización de un
biomarcador en el diagnóstico premortem de la EA en este tipo
de muestras (H.M. Schipper. The role of biologic markers in the
diagnosis of Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia
(2007) 3:325-332). En este sentido, el péptido
A\beta y la proteína tau son los principales biomarcadores para el
diagnóstico in vitro de la EA.
La patente EP1420830A1 describe un método de
diagnóstico ocular in vivo de la EA mediante el uso de
compuestos o marcadores que se unen al péptido A\beta presente en
tejidos oculares de los enfermos. Los marcadores son, normalmente,
compuestos fluoróforos que, al unirse al péptido A\beta permiten
detectar y cuantificar el A\beta presente mediante mediciones de
fluorescencia, lo que pondría en evidencia la existencia o no de la
enfermedad en el paciente. El procedimiento divulgado consiste en
aplicar dichos marcadores en el ojo en forma de líquido o gel. La
lipofilia de estos compuestos facilita la penetración de los mismos
en el tejido ocular, donde se unen al péptido A\beta.
Posteriormente, tras un periodo de tiempo que asegure la penetración
de los compuestos en el tejido ocular y la unión de los mismos al
péptido A\beta, se lleva a cabo la medición de fluorescencia
directamente en los ojos del paciente. Se trata, por tanto, de un
diagnóstico de la EA premortem, in vivo y no invasivo.
Por otra parte, la patente EP1913866A1 divulga
una nueva forma no invasiva de detectar marcadores biológicos de EA
en el cristalino y en otros tejidos oculares usando dispersión de
luz quasi-elástica, espectroscopia Raman,
fluorometría u otras técnicas ópticas. Estas técnicas permiten la
detección y monitorización de deposición de péptido A\beta en el
ojo para el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas como es
la EA.
Sin embargo, a pesar de los esfuerzos y los
avances que se acaban de describir, el diagnóstico definitivo de la
EA, por el momento, sigue realizándose sólo post mórtem.
Sigue siendo fundamental, por lo tanto, desarrollar nuevas
herramientas para la detección temprana y preferentemente
preclínica, de la EA, que permitan instaurar el tratamiento adecuado
en los estadios tempranos de la enfermedad, de manera que se pueda
retrasar el desarrollo de los síntomas de la misma.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un kit de detección de la EA mediante la utilización de los restos
desechados en intervenciones quirúrgicas de cristalino donde se
extraen los desechos oculares de la cirugía de cristalino. Sobre
esos desechos se analiza la presencia de un biomarcador de la EA,
preferentemente el péptido A\beta, que, además de depositarse en
el cerebro de los enfermos de Alzheimer dando lugar a las placas
seniles o neuríticas, también lo hace en el cristalino.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de los restos de desecho de las operaciones de cristalino en la
elaboración de un método para la detección de la EA mediante la
detección de un biomarcador, por ejemplo mediante la detección de
péptido A\beta.
En medicina oftalmológica, la opacificación
total o parcial del cristalino se llama cataratas. Hoy en día, la
intervención quirúrgica de cristalino más frecuente es la operación
de cataratas. La catarata es una enfermedad crónica asociada al
proceso de envejecimiento y el paulatino aumento de la esperanza de
vida ha provocado un aumento sustancial de la prevalencia de
cataratas que afecta a una proporción creciente de la población. Las
cataratas se pueden desarrollar por varios motivos, sin embargo, la
catarata adquirida es el tipo más frecuente y es la principal causa
de pérdida de visión entre los mayores de 55 años, por lo que la
operación de cataratas es una intervención muy frecuente en el rango
de edades susceptibles de padecer la enfermedad de Alzheimer. De
hecho, en personas menores de 50-55 años la
prevalencia de las cataratas es baja, del orden del 0,2% al 7%; en
grupos de edades intermedias, entre 55 y 65 años aproximadamente,
las cataratas afectan a alrededor del 20% de la población de tal
edad; y, a partir de los 70-75 años, las cataratas
afectan a entre el 40% y más del 60% de la población. Aún sin llegar
a producir problemas graves de visión que obliguen a la intervención
quirúrgica, más del 75% de las personas mayores de 60 años y el 95%
de las mayores de 75 presentan ya algún grado de opacidad en el
cristalino.
De las intervenciones quirúrgicas realizadas
para la eliminación de cataratas, la más difundida actualmente es la
cirugía extracapsular, ya que tiene menos complicaciones que otras
técnicas y permite el empleo de una lente intraocular. Mediante esta
cirugía se extrae sólo la porción opaca de la catarata y se deja la
porción posterior de la cápsula, que sirve de soporte para una lente
intraocular que ocupa el mismo lugar que el cristalino extraído. La
cirugía extracapsular se realiza generalmente mediante una técnica
denominada facoemulsificación en la que se hace una incisión pequeña
en el tejido ocular, seguida de la destrucción de las lentes opacas
del paciente aplicando ondas ultrasónicas que producen una vibración
de entre 30000 y 60000 veces por segundo. Esta vibración rompe la
catarata en fragmentos suficientemente pequeños para ser
emulsionados y aspirados suavemente. Los aparatos de facoemulsión
constan de un sistema de circulación de suero con irrigación y
aspiración, conectado al propio terminal de ultrasonido. Este
sistema permite aspirar los fragmentos emulsificados al mismo tiempo
que mantiene el terminal del emulsificador refrigerado para evitar
quemaduras. Los fragmentos de cristalino opaco aspirados se recogen
junto con el suero en un recipiente y constituyen los restos
desechados en las operaciones de cristalino. Para finalizar la
operación, se inserta una lente en el lugar que ocupaba el
cristalino del paciente (Olitsky SE, Hug D, Smith LP. Abnormalities
of the Lens. In: Kliegman RM, Behrman RE, Jenson HB, Stanton BF,
eds. Nelson Textbook of Pediatrics. 18^{va} ed.
Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2007: cap. 627).
El kit de detección de la EA de la invención
incluye dos componentes. En primer lugar, consta de un elemento
contenedor donde se recogen los restos de la operación de
cristalino. Estos restos se encuentran en un líquido que suele ser
suero fisiológico. En segundo lugar, el kit contiene un elemento de
mareaje que se une al biomarcador de EA presente en el conjunto de
los restos del cristalino. En caso necesario, el kit incluye un
sistema de detección del elemento de mareaje unido al biomarcador,
que permite comprobar la presencia o no de dicho biomarcador y, por
lo tanto, de la EA en el paciente.
Adicionalmente, el kit puede contener un sistema
para separar la parte sólida y la parte líquida de la mezcla de
restos obtenida como resultado de la operación. Se trata
generalmente de una centrifugadora, la cual imprime a la mezcla un
movimiento rotatorio con una fuerza de mayor intensidad que la
gravedad, provocando la sedimentación de los restos sólidos en
cuestión.
Los restos desechados de las intervenciones
quirúrgicas de cristalino que se incluyen en el kit, permiten
detectar el contenido de biomarcador que se encuentra en el
cristalino del paciente como consecuencia de la aparición y
desarrollo de la EA. La presente invención también se refiere al
método de detección in vitro de un biomarcador de EA en el
cristalino y este método incluye, en primer lugar, la recogida, en
un elemento contenedor, de los restos de cristalino extraídos
durante la operación de catarata junto con el suero utilizado en la
misma. Esta mezcla puede ser tratada directamente con elementos de
mareaje que se unen al biomarcador, o bien, puede ser centrifugada
para separar la parte líquida de la mezcla, correspondiente al
suero, de la parte sólida, correspondiente a las células
fragmentadas. Una vez separada, la parte sólida se procesa para
proceder al mareaje del biomarcador de EA seleccionado para detectar
la enfermedad en el paciente. Este paso varía en función de la
técnica seleccionada para la detección del biomarcador. La técnica
puede caracterizarse por la inclusión de la muestra en bloques de
parafina de los que posteriormente se obtienen cortes o láminas
sobre los que se aplica el elemento de mareaje del biomarcador de EA
seleccionado. Estos bloques también pueden obtenerse por congelación
rápida de la parte sólida de la muestra. Otra opción es separar las
proteínas del resto de elementos de la parte sólida mediante
cualquiera de las técnicas habituales (sonicación, tratamiento con
detergentes suaves, etc.) y, posteriormente, detectar la presencia o
ausencia del biomarcador en la mezcla de proteínas por medio de
cualquiera de las técnicas utilizadas por los expertos en la materia
(Western blot, ensayos inmunoenzimáticos tipo ELISA, microarrays de
proteínas, etc.) y utilizando para ello el elemento de mareaje
oportuno.
En la presente invención por "elemento de
mareaje" se entiende cualquier compuesto que pone de manifiesto
específicamente la presencia de un determinado componente de una
mezcla heterogénea y, más concretamente, cuando dicho componente es
un biomarcador; y por "biomarcador" se entiende una sustancia,
cuya presencia es objetivamente mensurable y evaluable, utilizada
como indicadora de la existencia de la EA bien por su propia
presencia o bien por modificaciones en su cantidad o
concentración.
El biomarcador utilizado en esta invención puede
ser cualquiera de los biomarcadores de EA. Preferentemente, se
utiliza el péptido A\beta, entendiéndose por péptido A\beta las
proteínas o péptidos que forman parte de las placas neuríticas o
seniles, tanto la proteína amiloide como la proteína precursora de
\beta-amiloide (APP) como cualquiera de las
isoformas de entre 39 y 42 residuos aminoacídicos generados por el
proceso proteolítico natural que da lugar a varios los péptidos
(A\beta_{1-40}, A\beta_{2-40},
A\beta_{1-42}) a partir de la APP.
\newpage
El elemento de mareaje seleccionado varía en
función de la técnica elegida para detectar la presencia de EA.
Frecuentemente, estos marcadores ya conocidos en el estado de la
técnica son compuestos fluoróforos, es decir, compuestos que emiten
fluorescencia una vez unidos al biomarcador, lo que permite detectar
fácilmente la presencia de dicho biomarcador en la muestra en
cuestión. Por ejemplo, un fluoróforo ampliamente utilizado para la
detección de beta-amiloide es el Rojo Congo o
derivados del mismo, que da lugar a la aparición de depósitos de
amiloide teñidos en un tono entre fucsia y anaranjado fácilmente
identificables. Al igual que el uso de otros fluoróforos, la
evidencia de placas puede realizarse con otros compuestos como
tioflavina, el cristal violeta, o la plata metenamina. También se
pueden utilizar como elementos de mareaje anticuerpos específicos
anti-biomarcador mediante técnicas
convencionales.
El kit y el método de la invención suponen un
beneficio para el paciente, ya que su uso permite la detección de un
biomarcador de la EA in vitro y no directamente sobre el
propio ojo, por lo que no es necesario aplicar ningún gel o pomada
con los elementos de mareaje de A\beta sobre el ojo del paciente
ni hacer medidas directamente sobre el mismo, como ocurre con alguna
de las últimas invenciones conocidas para detectar A\beta
(EP1420830A1), evitando así cualquier efecto secundario, como las
reacciones anafilácticas. Por otra parte, en la elaboración del
método y en el kit de detección de la EA se aprovechan los restos
que se extraen en las operaciones de cristalino y que son
sistemáticamente desechados dándoles una utilidad para analizar la
presencia de A\beta u otros bioindicadores de la EA. Dado que las
operaciones de cristalino en que se obtienen restos de cristalino y
otros fluidos oculares se realizan en personas de edades similares o
incluso anteriores a la aparición de los primeros síntomas clínicos
de la EA, la presente invención proporciona herramientas para la
detección precoz de esta enfermedad de forma que se puedan instaurar
de manera temprana tratamientos que mitiguen o retrasen el avance de
la enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos que se acompañan ayudan
a comprender mejor la invención y se presentan con carácter
ilustrativo y no limitativo de ésta.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron los desechos extraídos en cirugía
de cristalino realizadas a 42 pacientes, de edades comprendidas
entre 68 y 88 años, mediante facoemulsión. Dichos restos se habían
recogido en bolsas de plástico de desechos, habituales en este tipo
de intervenciones quirúrgicas y, cada una de ellas, contenía los
restos de cristalino y otros restos de fluidos oculares de una
operación junto con el suero fisiológico utilizado en la misma. Las
muestras se mantuvieron a 4ºC hasta el momento de su procesado.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar, se extrajo de la bolsa la
disolución de restos celulares y suero fisiológico y se dejó en un
vaso de precipitados durante 24 h para que se produjera una
precipitación natural de los restos sólidos, transcurrido este
tiempo, se retiró todo el sobrenadante posible y se procedió a la
centrifugación del sobrenadante. Se extrajo un volumen de 15 ml del
sobrenadante de esta primera centrifugación, que denominamos
disolución M1, y, en un tubo de ensayo, se centrifugó durante 15
minutos a 5000 revoluciones por minuto. Esta operación proporcionó
una masa de restos sólidos y una disolución que se denominó M2.
De esta nueva disolución M2 se extrajo un
volumen de 5 ml y se centrifugó en un tubo Eppendorf durante 10
minutos a 5000 revoluciones por minuto. Esta operación proporcionó
una masa de restos sólidos y una disolución que se denominó M3.
De esta nueva disolución M3 se extrajo un
volumen de 5 ml y se centrifugó en un tubo Eppendorf durante 5
minutos a 5000 revoluciones por minuto. Esta operación proporcionó
una masa de restos sólidos y una disolución que se denominó M4.
Y por último se extrajo de la disolución M4 un
volumen de 5 ml y se centrifugó en un tubo Eppendorf durante 5
minutos a 5000 revoluciones por minuto. Esta operación proporcionó
una masa de restos sólidos y un sobrenadante que se desechó.
Se unió toda la masa de restos sólidos obtenida
mediante las diferentes centrifugaciones y se procedió a realizar
una última centrifugación para eliminar todo el sobrenadante posible
de la masa de restos sólidos, obteniendo una masa compacta.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez obtenida la masa de restos sólidos se
incluyó en un "pocillo" al que se taparon los dos extremos con
una tela fina o media. Se colocaron los "pocillos" en un
recipiente con agua corriente y el grifo abierto para proceder a su
lavado durante un tiempo de 2 a 4 horas. Una vez realizado el lavado
se procedió a deshidratar la masa en alcohol.
Se extrajo la muestra de los "pocillos", se
secó con una gasa esterilizada y se procedió a incluirla en alcohol
al 30% durante 30 minutos. Una vez trascurrido ese tiempo, se secó
la muestra con una gasa esterilizada y se procedió a incluirla en
alcohol al 50% durante 25 minutos. Trascurridos los 25 minutos de
inclusión en alcohol de 50%, se procedió al secado de la muestra y
posterior inclusión en alcohol de 70% durante 24 horas.
Se secó la muestra con una gasa estéril y se
procedió a incluirla en alcohol de 96%. Esta inclusión se realizó en
dos pasos de 25 minutos cada uno. Se procedió al secado de la
muestra con gasas estériles y se incluyó en alcohol de 100%. Esta
inclusión se realizó en tres pasos, dos de ellos de 25 minutos y el
último de 1 h y 30 minutos. Se secó la muestra y se procedió a su
inclusión en xileno durante 40 minutos.
Se preparó una disolución de parafina líquida y
xileno con una proporción 1:1 y se incluyó la muestra en dicha
disolución durante 30 minutos en una estufa a 50ºC. Trascurrido ese
tiempo se incluyó la muestra en parafina líquida en tres pasos, dos
de ellos de 45 minutos y un paso final de 1 h y 30 minutos, durante
esta fase los recipientes con parafina se encontraban dentro de una
estufa a temperatura de 50ºC.
Una vez terminado este proceso de deshidratación
se comenzó con el montaje de los bloques de parafina. Para montar
los bloques de parafina se disponía de parafina líquida a una
temperatura de 50ºC, barras de Leuckart y un mechero Bunsen. Se
colocaron las barras de Leuckart sobre una superficie metálica, se
vertió la parafina, se colocó la identificación de la muestra y se
procedió a incluir la muestra en el bloque aún líquido. Una vez
realizada esta operación se introdujo el bloque en un cristalizador
con agua corriendo hasta que solidificó totalmente con lo cual se
obtuvo el bloque de parafina con la muestra incluida.
Mediante la utilización de un microtomo se
obtuvieron secciones del bloque de parafina de 10 \mum de grosor.
Una vez obtenida una serie de cortes, se depositaron sobre agua a
40ºC para que los cortes se estirasen. A continuación, se recogieron
los cortes con portaobjetos que se colocaron en estufa a 37ºC
durante toda la noche para fijarlos.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez realizado el corte, se procedió a
rehidratarlo para permitir su coloración, siguiendo el proceso
inverso a la deshidratación descrita en el ejemplo 3, es decir,
utilizando alcohol cada vez de menor concentración hasta dejar los
cortes en agua desionizada.
Posteriormente se procedió a la tinción en
solución de hematoxilina de Mayer durante 10 minutos, se aclaró
durante 5 minutos con agua del grifo y se dejó en solución de
cloruro sódico alcalina durante 20 minutos. A continuación se tiñó
con solución de rojo congo alcalina (SIGMA-ALDRICH)
durante 20 minutos, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Mediante la tinción con Rojo Congo y utilizando
un microscopio de luz doblemente polarizada, la aparición de una
coloración se utilizó como criterio para determinar la presencia de
péptido A\beta en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó como el Ejemplo 4 pero, en vez de
hematoxilina de Mayer, se utilizó hematoxilina de Gill Nº 3 y se
tiñó durante 3 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez realizado el corte, se procedió a
rehidratarlo para permitir su coloración, siguiendo el proceso
inverso a la deshidratación descrita en el ejemplo 3, es decir,
utilizando alcohol cada vez de menor concentración hasta dejar los
cortes en agua desionizada.
Los cortes ya desparafinados e hidratados fueron
incubados en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 2 horas
con el suero antipéptido. Posteriormente se incubaron con una mezcla
de IgG anti IgG de conejo conjugado con Alexa-594
diluido 1:500 y tioflavina T 10 \muM, preparados ambos en albúmina
sérica bovina (BSA) 1% (p/v) en tampón PBS 1X pH 7,4; durante 4
horas en oscuridad. Luego los cortes se lavaron 3 veces por 5
minutos en PBS 1X/ Tween 20 0.05% (p/v).
Los cortes se montaron en medio para
fluorescencia y fueron observados en microscopio de epifluorescencia
usando filtros para rodamina (594 nm) y FITC (488 nm) para
visualizar la fluorescencia roja del Alexa-594 y
verde de la tioflavina T.
\vskip1.000000\baselineskip
Luego de la coloración, se deshidrató el corte y
se procedió a la aclaración y montaje definitivo. La deshidratación
se realizó con alcoholes de graduaciones crecientes.
La aclaración se realizó con xilol. El objetivo
de este paso es impregnar el corte con el disolvente Bálsamo de
Canadá, que al mismo tiempo le confiere un índice de refracción
semejante al del vidrio.
Para el montaje se limpió el portaobjeto
alrededor del corte y se depositó sobre el mismo una gota de Bálsamo
de Canadá disuelto en xilol y se cubrió con un cubreobjeto. Se dejó
secar unas horas antes de su observación al microscopio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó Monoclonal Mouse
Anti-Human Beta-Amyloid (Dako), en
diluciones de 1:50 y se aplicó a secciones, incluidas en parafina y
fijadas en formol, utilizando 10 minutos de recuperación de epítopo
por calor y 30 minutos de incubación a temperatura ambiente con el
anticuerpo primario.
Para la recuperación del epítopo los cortes de
tejido se desparafinaron y rehidrataron como se describe en el
ejemplo 4, y se sumergieron los cortes, que se encontraban a
temperatura ambiente, en una solución precalentada y diluida 1:10
con agua desionizada de Dako Target Retrieval Solution, High pH
concentración 10x, en un baño de agua a 95ºC. Se incubaron durante
30 minutos. Se retiró el contenedor con los portaobjetos del baño de
agua.
Una vez enfriada la muestra durante unos 20
minutos a temperatura ambiente se decantó la solución Target
Retrieval Solution, High pH y se aclararon los cortes tres veces con
tampón pH 8,0 que contenía 5,0 M guanidinaHCl y 50 mM trisHCl, a
temperatura ambiente.
El control negativo se realizó con
DakoCytomation Mouse IgG1, diluido a la misma concentración de IgG
murina que el anticuerpo primario.
\vskip1.000000\baselineskip
Los niveles de péptido A\beta se cuantificaron
mediante sándwich ELISA utilizando un kit comercial, Innotest
A \beta1-42, (Innogenetics, Bélgica), que detecta el fragmento \beta1-42 de amiloide.
A \beta1-42, (Innogenetics, Bélgica), que detecta el fragmento \beta1-42 de amiloide.
La muestra obtenida según el ejemplo 2 fue
solubilizada en una solución tampón enfriada en hielo que contenía
5,0 M guanidinaHCl y 50 mM trisHCl, pH 8,0; las muestras estuvieron
en incubación por 3 a 4 horas y luego se diluyeron 1:10 en solución
tampón enfriada en hielo con caseína al 0,25%, azida de sodio 0,05%,
20 \mug/ml de aprotinina, 5 mM EDTA, pH 8,0, 10 \mug/ml de
leupeptina en PBS. Se centrifugaron a 16.000 g por 20 minutos a
4ºC.
Se utilizaron pocillos impregnados del
anticuerpo primario (anti-A\beta) que se incubaron
durante 1 hora a 37º con otro anticuerpo
anti-A\beta biotinilado, las muestras
correspondientes, estreptavidina conjugada con peroxidasa y una
solución cromógena (tetrametilbenzidina disuelta en dimetil
sulfóxido). La reacción se paró con ácido sulfúrico 1N y se leyó la
absorbancia de cada pocillo con un lector a una longitud de onda de
450 nm.
Se realizó una curva estándar entre 100 y 2.000
pg/ml que permitió establecer la ecuación y transformar los datos de
absorbancia en concentración de proteína (pg/ml). Para cada muestra
se duplicó la determinación y se tomó como resultado final la media
de ambas. Aquellas muestras en las que la diferencia de
determinación entre los dos pocillos fue mayor de un 20% se
descartaron.
Claims (22)
1. Método in vitro de detección de la
enfermedad de Alzheimer que comprende:
a) la apertura de la cápsula de la catarata, la
fragmentación del agregado proteico que la forma, la extracción de
los fragmentos y la recuperación de los restos de desecho de la
intervención quirúrgica de cataratas en individuos vivos;
b) la detección de un biomarcador de la
enfermedad de Alzheimer en los restos recuperados.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método in vitro según la
reivindicación 1 que incluye un paso adicional c) entre el paso a) y
el paso b) y en el que dicho paso adicional c) comprende marcar el
biomarcador de la enfermedad de Alzheimer con un proceso de
identificación.
3. Método in vitro según cualquiera de
las reivindicaciones 1 y 2 que incluye un paso adicional d) entre el
paso a) y el paso b) o bien entre el paso a) y el paso c) y en el
que dicho paso adicional d) comprende separar la parte sólida y la
parte líquida de los restos de desecho recuperados.
4. Método in vitro según cualquiera de
las reivindicaciones 1-3, en el que el biomarcador
es el péptido beta-amiloide.
5. Método in vitro según cualquiera de
las reivindicaciones 2-4, en el que el mareaje del
paso c) se realiza con un compuesto fluorescente.
6. Método in vitro según la
reivindicación 5, en el que el compuesto fluorescente es Rojo
Congo.
7. Método in vitro según la
reivindicación 5, en el que el compuesto fluorescente es tioflavina
T.
8. Método in vitro según cualquiera de
las reivindicaciones 2-4, en el que el mareaje del
paso c) se realiza con un anticuerpo.
9. Método in vitro según la
reivindicación 8, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal anti-beta-amiloide.
10. Método in vitro según cualquiera de
las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 8 y 9, en que el sistema de
detección se basa en una técnica inmunológica.
11. Método in vitro según la
reivindicación 10, en que la técnica inmunológica se selecciona
entre ELISA tipo sándwich, ELISA competitivo, ELISA directo, ELISA
indirecto y Western Blot.
12. Kit de detección de la enfermedad de
Alzheimer que comprende:
a) un elemento contenedor donde se recogen los
fragmentos de los agregados proteicos extraídos durante la cirugía
de cataratas de un individuo vivo.
b) un elemento de mareaje que se une a un
biomarcador de la enfermedad de Alzheimer que esté presente en los
fragmentos de los agregados proteicos extraídos en cirugía de
cataratas recogidos en el elemento contenedor.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Kit de detección de la enfermedad de
Alzheimer, según la reivindicación 12, que comprende, además, un
sistema de detección del elemento de mareaje unido al
biomarcador.
14. Kit de detección de la enfermedad de
Alzheimer, según cualquiera de las reivindicaciones 12 y 13, que
comprende adicionalmente una centrifugadora y/o un vaso de
precipitados para realizar la separación de la parte sólida y la
parte líquida del contenido del elemento contenedor mediante
centrifugación y/o precipitación.
15. Kit de detección de la enfermedad de
Alzheimer, según cualquiera de las reivindicaciones
12-14, en el que el biomarcador es el péptido
\beta-amiloide.
16. Kit de detección de la enfermedad de
Alzheimer, según cualquiera de las reivindicaciones
12-15, en el que el elemento de mareaje es un
compuesto fluorescente.
17. Kit de detección de la enfermedad de
Alzheimer, según la reivindicación 16, en el que el compuesto
fluorescente es Rojo Congo.
18. Kit de detección de la enfermedad de
Alzheimer, según la reivindicación 16, en el que el compuesto
fluorescente es tioflavina T.
19. Kit de detección de la enfermedad de
Alzheimer, según cualquiera de las reivindicaciones
12-15, en el que el elemento de mareaje es un
anticuerpo.
20. Kit de detección de la enfermedad de
Alzheimer, según la reivindicación 19, en que el anticuerpo es un
anticuerpo monoclonal
anti-beta-amiloide.
21. Kit de detección de la enfermedad de
Alzheimer, según cualquiera de las reivindicaciones 12, 13, 14, 15,
19 y 20, en el que el sistema de detección se basa en una técnica
inmunológica.
22. Kit de detección de la enfermedad de
Alzheimer, según la reivindicación 21, en el que la técnica
inmunológica se selecciona entre ELISA tipo sándwich, ELISA
competitivo, ELISA directo, ELISA indirecto y Western Blot.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FC2A | Grant refused |
Effective date: 20130304 |