KR101679438B1 - 알츠하이머병의 검출을 위한 광학적 방법 - Google Patents

알츠하이머병의 검출을 위한 광학적 방법 Download PDF

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마야 코로뇨
키스 엘. 블랙
마이클 슈워츠
대니얼 엘. 파카스
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세다르스-신나이 메디칼 센터
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Abstract

본 발명의 대상은 알츠하이머병 (AD)에 대해 특이적인 초기 병리학적 이벤트, 예컨대 아밀로이드 플라크의 발달, 양 및 위치를 모니터링하기 위한 비-칩습성 광학 영상화 방법에 관한 것이다. 이같은 이벤트를 모니터링하는 능력은, 특히, AD 진단, 예후 및 가능한 치료법의 평가를 위한 기초를 제공한다. 또한, 본 발명의 대상은 AD 및 AD와 관련된 망막 질병을 치료하기 위한 신규 방법을 소개한다. 살아 있는 뇌에서의 Aβ-플라크 검출은, 특히 고해상도에서, 매우 제한된다: 따라서, 본 발명은 뇌-유래 조직에 대한 대안으로서 눈에 초점을 맞추는 연구를 기초로 하고, 이는 직접적으로, 반복적으로 및 비-침습성으로 영상화될 수 있다.

Description

알츠하이머병의 검출을 위한 광학적 방법{OPTICAL METHOD FOR THE DETECTION OF ALZHEIMER'S DISEASE}
본 발명의 대상은 알츠하이머병에 대해 특이적인 초기 병리학적 이벤트를 비-침습성으로 모니터링하는 방법에 관한 것이고, 따라서 AD의 진단, 치료, 예후 및 치료에 대한 응답 평가를 위한 방법 및 시스템을 포함한다.
본원의 모든 간행물은 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 출원이 참고로 포함되는 것으로 명확하게, 그리고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 참고로 포함된다. 하기의 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 이는 본원에서 제공된 임의의 정보가 종래 기술이거나 본원에서 청구되는 발명에 관련된다는 것 또는 구체적으로 또는 암시적으로 언급된 임의의 간행물이 종래 기술이라는 것을 시인하지 않는다.
알츠하이머병 (AD)은 통상적이고 파괴적인 연령-의존적 신경변성 질환이다. AD 뇌 병리학은 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 단백질분해성 생성물인 아밀로이드-β 펩티드 (Aβ)의 전형적인 축적을 특징으로 하고, 이는 Aβ 플라크로 명명된 세포외 응집물을 형성한다. 이러한 플라크는 파괴된 세포 활성 및 뇌에서의 소통에 기여하여, 신경독성 염증 및 뉴런 사망에 이르는 것으로 생각된다 [2,3]. 살아 있는 대상체에서 병리학적 프로세스의 비-침습성 모니터링을 허용하는 분자 영상화는 질환 및 약물 효과의 검출 및 이해를 강화하는 잠재력을 지닌다. 따라서, 살아 있는 AD 환자 및 동물 모델의 두개골을 지나서 아밀로이드 플라크를 비-침습성으로 검출하는 것을 가능하게 하는 도구를 개발하는 것이 주로 시도되었다 [4-9]; 그러나, 아밀로이드 플라크의 비-침습성 모니터링은 여전히 임상적으로 어렵고, 고해상도에서의 이용가능성이 제한된다 [10-12]. 두개골 창을 통해 마우스 뇌 내의 Aβ 플라크를 영상화하기 위해 다광자 현미경검사법을 사용하여 최근에 실연된 바와 같이, 광학 영상화는 생체내 영상화를 위한 강력하고, 고해상도이며 특이적인 도구를 구성한다 [13]. 본 발명의 대상은 광학적 양식에 의해 AD 환자의 망막을 영상화하기 위한 인간에서의 별법적이고 비-침습성인 접근법을 제시하고, 단 Aβ 플라크가 이러한 환자의 망막에서 발달되고 뇌에서의 것들과 유사한 성질을 공유한다.
APP는 중추 신경계 (CNS)의 증식물인 망막 신경절 세포 (RGC)에서 광범위하게 발현되고, 시각 신경을 통해 축삭 형질막 및 신경 말단으로 수송된다 [14]. 망막에서의 플라크 형성은, 특히 2개의 관련된 신경변성 장애에서, 최근 연구 중이다: 연령-관련 황반 변성 (AMD) 및 녹내장 [50-53]. Aβ-플라크가 초기 단계 또는 후기 단계의 AD 환자의 망막에서 발견되는지 여부는 불명확하였다. 녹내장 및 AMD 환자 및 이의 설치류 모델의 망막 내의 Aβ-플라크의 존재가 과거에 입증되었다. 예를 들어, RGC 층에서의 Aβ 침착이 녹내장 환자에서 보고되었다 [50, 51]. 녹내장의 실험 모델에서, RGC의 세포자멸사가 Aβ-펩티드의 축적과 관련되었고, 이의 형성을 표적으로 하는 작용제가 신경보호 활성을 발휘하는 것으로 나타났다 [52]. AMD 환자에서, Aβ 침착물이 변성 중인 광수용체 및 망막 색소 상피 세포의 위치와 상호관련된 드루젠(drusen)에서 발견되었다 [53].
AD의 드로소필라(Drosophila) 트랜스제닉(transgenic) 모델에서, 돌연변이된 인간 APP 및 프레세닐린 (PS) 유전자의 표적화된 발현을 기초로, Aβ 면역반응성이 겹눈에서, 그리고 망막 광수용체 변성과 관련하여 발견되었다 [15]. 최근의 연구에서, 질환의 진행된 단계에 있는 AD 트랜스제닉 마우스 (10개월령 초과)에서 망막 신경 섬유층 (NFL) 및 신경절 세포층 (GCL) 내의 Aβ 침착물이 실연되었다. Aβ 침착물이 RGC의 신경변성 및 미세아교 활성화와 추가로 상호관련되었다 [16].
이러한 고무적인 연구에도 불구하고, AD의 진단, 예후 및 치료를 위한 시스템 및 방법이 당업계에서 여전히 요구된다. 본 발명의 대상은 AD 환자의 사후 안구의 망막 내에서 Aβ 플라크의 존재를 발견함으로써 이러한 요구를 충족시킨다. 돌연변이된 형태의 인간 APP 및 PS1 유전자를 발현하는 마우스 (APPswe/PS1dE9, 본원에서 AD-Tg 마우스로 지칭됨)를 사용함으로써, 본 발명의 대상은 뇌에서 명백해지기 전에 망막에서의 Aβ 플라크의 초기 형성을 개시하는 증거를 또한 제공한다. 또한, 본 발명의 주제에서 AD-Tg 마우스의 마우스 뇌 및 망막에서 Aβ 플라크를 감소시키는데 효과적인, 수지상 세포 상에 로딩된 미엘린-유래 펩티드의 약한 효능제 [17, 18]를 사용하는 면역-기반 치료법이 확인된다. 마지막으로, 본 발명의 주제에서, Aβ 플라크에 결합하여 이를 표지하는 천연 화합물 [19, 20]인 쿠르쿠민 (디페룰로일메탄)의 살아 있는 동물 내로의 전신 주사가 망막 내의 Aβ 플라크의 특이적인 비-침습성 고해상도 가시화를 허용한다는 것이 실연되었다. 본 발명의 주제는, 최초로, Aβ 플라크가 개수 및 위치에 의해 검출되게 하고, AD 동물의 망막에서 실시간으로 반복적으로 계수 및 모니터링되도록 하는 방법을 교시한다.
예시적인 실시양태들이 참조 도면들에서 설명된다. 본원에 개시된 실시양태 및 도면은 제한적이기보다는 설명적인 것으로 간주되도록 의도된다.
도 1은 쿠르쿠민에 의해 가시화된 AD-Tg 마우스의 망막 내의 망막 Aβ 침착을 도해한다. 도 1a - 1f는 생체 외에서 항-인간 Aβ 항체 및 쿠르쿠민으로 염색된 9개월령 AD-Tg 마우스 (도 1a - 1e) 및 비-Tg 마우스 (wt) (도 1f)로부터의 뇌 냉동절편의 영상을 도해하고, 이는 양쪽 검출 방법에 의한 Aβ 플라크의 공동-국소화를 가리킨다. 도 1d 및 1e는 각각의 채널에 대해 제시된 플라크 염색 패턴의 더 높은 배율의 영상을 도해한다. 도 1f는 비-Tg (wt) 마우스에서 이중-양성 항-인간 Aβ플라크 및 쿠르쿠민에 대한 증거가 없음을 나타낸다. 세포핵이 DAPI (청색)으로 표지되었다. 축척 막대 = 100 ㎛. 도 1g - 1j는 생체 외에서 항-Aβ 항체 및 쿠르쿠민으로 염색된 10개월령 AD-Tg 마우스 (n=27) 및 비-Tg (wt) 마우스 (n=18)로부터의 망막 온조직 표본 (whole-mount)의 대표적인 영상이다. Aβ 플라크의 형성 (적색 및 녹색 채널이 중첩된 황색 반점)이 여러 상이한 망막 층에서 실연된다: 도 1g는 IPL (내망상층)을 도해하고, 도 1h는 INL (내핵층)/OPL (외망상층)을 도해하며, 도 1i는 ONL (외핵층)을 도해한다. 도 1J는 비-Tg (wt) 마우스에서 Aβ 플라크가 본질적으로 부재하였음을 나타낸다. (도 1g 및 1j, 아랫줄). 개별적인 채널들에 대한 더 높은 배율의 영상에서 양쪽 절차로의 플라크-염색 패턴이 실연된다. 축척 막대 = 5 ㎛. 도 1k - 1n은 생체 내에서 쿠르쿠민으로 염색된 후, 생체 외에서 항-인간 Aβ 항체 및 DAPI로 염색된 전체 눈 시상 냉동절편을 도해한다. 도 1k - 1m에서, Aβ 플라크가 10개월령 AD-Tg에서 대부분의 망막 층 및 맥락막에서 검출되었다. 도 1n에서, 비-Tg (wt) 마우스의 망막 및 맥락막에서 Aβ 플라크가 검출가능하지 않았다. 축척 막대 = 20 ㎛.
도 2는 인간 알츠하이머병 환자의 망막 내의 Aβ 플라크를 도해한다. 도 2a 및 2b는 수단 블랙(Sudan Black) B로 염색하여 비-특이적 자가형광 신호를 제거하고 나서, 쿠르쿠민으로 생체 외에서 염색된 후의 87세 AD 환자의 인간 온조직 표본 망막의 대표적인 영상이다 (쿠르쿠민으로 표지된 플라크가 백색 화살표로 지시됨). 축척 막대 = 10 ㎛. 세포핵은 DAPI (청색)로 표지된다. 도 2c 및 2d는 수단 블랙 B 염색 (수단 염색에 대해 흑색 반점)에 이어서 쿠르쿠민으로 염색된 후의 65세 AD 환자의 인간 온조직 표본 망막의 더 높은 배율의 영상을 나타낸다 (쿠르쿠민으로 표지된 플라크가 백색 화살표로 지시됨). 축척 막대 = 5 ㎛. 도 2e - 2g는 일련의 65세 내지 90세 인간 AD 환자의 망막 내의 쿠르쿠민-양성 플라크의 추가적인 예를 제공한다. 도 2h - 2j는 여러 망막 깊이 (RGC 및 IPL 포함)의 항-인간 Aβ 항체로 염색된 후 수단 블랙 B로 처리된 65세 및 87세 인간 AD 환자의 인간 온조직 표본 망막의 대표적인 영상이다. 도 2i는 망막 플라크의 더 높은 배율의 영상을 나타낸다. Aβ 플라크 형태학이 마우스 망막 및 뇌에서 발견된 것과 유사하였다. 축척 막대 = 5 ㎛. 도 2k - 2m은 이어지는 동일한 인간 망막의 쿠르쿠민으로의 염색을 나타내고, 이는 플라크가 선택적으로 인간 Aβ 항체 및 쿠르쿠민으로 공동-표지되었음을 드러냈다 (개별적인 채널들에 대한 아랫줄 영상). 도 2n은 사후 비-AD 인간 망막 온조직 표본에서의 인간 Aβ 항체 및 쿠르쿠민으로의 이중 염색을 도해하고, 이는 Aβ 플라크의 징후를 나타내지 않는다 (개별적인 채널들에 대한 아랫줄 영상). 축척 막대 = 5 ㎛.
도 3은 증상전 초기 단계에서의 마우스 망막 Aβ 플라크 형성 및 질환 진행 동안의 축적을 도해한다. 꼬리 정맥 내로의 정맥내 쿠르쿠민 주사 후, Aβ 플라크가 AD-Tg 마우스 망막 및 뇌에서 가시적이었다. 도 3a - 3n은 다양한 나이의 AD-Tg 마우스(n=18) 및 비-Tg 마우스 (wt; n=10)의 온조직 표본 망막의 대표적인 z-축 투사 영상이다; 도 3a - 3d는 2.5개월령 AD-Tg 마우스를 도해하고, 이때 도 3a는 망막 내의 플라크의 존재를 나타내고, 도 3b는 동일한 위치에서의 생체 외에서 특이적 항-인간 항체를 사용한 Aβ 플라크 염색의 확인을 나타낸다 (황색의 쿠르쿠민 및 Aβ 항체의 공동-국소화). 축척 막대 =10 ㎛. 도 3c 및 3d는 뇌 해마 및 피질에서 플라크가 검출되지 않았음을 나타낸다. 축척 막대 = 100 ㎛. 도 3e - 3h는 5개월령 AD-Tg 마우스를 도해하고, 이때 도 3e는 망막 내의 플라크의 존재를 도해하고, 도 3f는 이어지는 생체 외에서의 특이적 Aβ 항체 염색을 도해한다. 축척 막대 =10 ㎛. 도 3g 및 3h는 뇌에서의 플라크의 검출을 나타낸다. 축척 막대 = 50 ㎛. 도 3i - 3k는 9개월령 AD-Tg 마우스를 도해하고, 이때 도 3i는 망막 내의 다중 플라크를 나타내고, 도 3j 및 3k는 뇌 내의 플라크를 나타낸다. 축척 막대 (i) = 10 ㎛ 및 (j,k) = 50 ㎛. 도 3l - 3n은 17개월령 AD-Tg 마우스를 도해하고, 이때 도 3l은 망막 내의 수많은 플라크를 나타내고, 도 3m 및 3n은 뇌 내의 플라크를 나타낸다. 축척 막대 (i) = 10 ㎛ 및 (m,n) =100 ㎛. 도 3o - 3q는 9개월령 비-Tg (wt) 마우스를 도해하고, 이때 도 3o는 망막 내의 플라크를 나타내지 않았고, 도 3p 및 3q는 뇌 내의 플라크를 나타내지 않았다. 축척 막대 (o) = 10 ㎛ 및 (p,q) =100 ㎛.
도 4는 수지상세포-기반 백신접종 후의 AD-Tg 마우스의 망막 내의 감소된 Aβ 플라크를 도해한다. 도 4a - 4g는 10개월령 마우스로부터의 온조직 표본 망막의 대표적인 z-축 투사 영상이고, 도 4a - 4c는 PBS-처리 AD-Tg 마우스 대조군을 나타내고, 도 4d - 4f는 백신접종된 AD-Tg 마우스를 나타내며, 도 4g는 비-Tg (wt) 마우스를 나타낸다 (생체 외에서 쿠르쿠민 및 항-인간 Aβ 항체로 염색됨). 도 4b 및 4c, 및 도 4e 및 4f는 망막에서의 쿠르쿠민 및 항-Aβ 항체 표지화에 대한 개별적인 채널 영상을 도해한다. 축척 막대 = 10 ㎛. 도 4h는 망막 온조직 표본 내의 플라크의 정량적 분석에 포함된 면적을 나타내는 시신경 유두 주변의 12개의 영역 (사각형 1-12로 지시됨)의 도해이다 (n= 군 당 마우스 4 마리; 마우스 당 2개의 망막). 축척 막대 = 200 ㎛. 도 4i는 PBS-처리 대조군에 비해 면역-기반 백신접종으로 처리된 AD-Tg 마우스의 망막에서 관찰된, 플라크 개수에서의 감소를 도해한다 (스 튜던트 ( Student ) t-테스트; P=0.0028). 도 4j는 대조군에 비해 백신접종된 AD-Tg 마우스의 망막에서 관찰된, 평균 플라크 면적에서의 감소를 도해한다 (스튜던트 t-테스트 P=0.0002). 도 4k는 플라크로 덮인 전체 면적에서의 유의한 감소가 면역-기반 백신접종 후 동일한 마우스의 뇌 해마 및 피질에서 또한 검출되었음을 나타낸다 (스튜던트 t-테스트 P=0.0085). 각각의 패널에서의 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 5는 AD-Tg 마우스 망막 내의 쿠르쿠민-표지 플라크의 생체내 영상화를 도해한다. 도 5a - 5c는 생체 내에서 정맥내 쿠르쿠민 또는 PBS 투여 후 비-관류 AD-Tg 마우스 대 비-Tg (wt) 마우스 (10개월령)의 망막 온조직 표본으로부터 취해진 대표적인 z-축 투사 영상이다 (혈관이 적색 화살표로 지시됨). 도 5a는 쿠르쿠민의 정맥내 주사 후 AD-Tg 마우스 망막에서 Aβ 플라크가 가시적이었음 (백색 화살표로 지시됨)을 나타낸다 (n=6). 도 5b는 PBS의 정맥내 주사 후 AD-Tg 마우스 망막에서 플라크가 검출가능하지 않았음을 나타낸다 (n=5). 도 5c는 쿠르쿠민의 정맥내 주사 후 비-Tg (wt) 마우스의 망막에서 플라크가 검출가능하지 않았음을 나타낸다 (n=5). 도 5d는 AD-Tg 마우스 망막 온조직 표본의 실질 내 및 혈관 내부의 항-인간 Aβ 항체로 염색된 Aβ 플라크 (혈관 내부의 플라크가 백색 화살표로 지시됨)를 실연하는, 3개의 채널 및 시상/관상 가상 절편을 사용한 대표적인 공초점 z-축 투사 영상이다. 도 5e 및 5f는 AOTF-기반 스펙트럼 영상화 시스템으로 형광 현미경을 사용하여 포착되고, 분할 및 분류 소프트웨어에 의해 분석 및 가시화된 영상을 도해한다. 도 5e에서, Aβ 플라크 (백색) 및 혈관 (화살표로 지시됨)이 쿠르쿠민으로 생체 내에서 염색되고 단일 채널 (여기 562/40 nm; 방출 624/40 nm)에서 영상화된 망막 온조직 표본에서 가시적이었다. 도 5f는 동일한 망막 온조직 표본 및 영역 내의 쿠르쿠민으로 염색된 Aβ 플라크에 대해 특이적인 광학적 서명 (OS)을 사용한, 스펙트럼으로 분류된 영상을 도해한다. Aβ 플라크가 모조색상 (백색 화살표로 지시됨)으로 제시되고, 모든 비-플라크 조직은 녹색 모조색상이다. 축척 막대 = 10 ㎛. 도 5g - 5j는 쿠르쿠민의 단일 주사 후의 영상이고, 이때 플라크 (백색 화살표로 지시됨)가 스펙트럼으로 제어되는 광원 (546/15 nm의 파장)의 여기 후의 빛의 방출에 의해 살아 있는 AD-Tg 마우스 망막 (n=4)에서 가시적이었다. 도 5i 및 5j는 더 높은 배율의 영상이고, 이때 플라크가 시신경 유두에 가까운 영역에서 대부분 검출되었고, 평균 플라크 크기가 온조직 표본 망막 (생체외)에서 관찰된 것과 양립성이었다. 도 5k는 쿠르쿠민이 정맥내 주사된 비-Tg (wt) 마우스 (n=4)에서 플라크가 검출되지 않았음을 나타낸다. 축척 막대 (g, k) = 100 ㎛, 및 (h-j) = 10 ㎛. 23.
도 6은 본 발명의 실시양태에 따라 Aβ 플라크를 진단, 예후, 및 분석하기 위한 스펙트럼 영상화 시스템의 순서도를 도해한다.
도 7은 본 발명의 실시양태에 따라 Aβ 플라크를 진단, 예후, 및 분석하기 위한 스펙트럼 영상화 시스템의 순서도를 도해한다.
도 8은 내인성 마우스 APP 유전자로부터 유래되는 것으로 확인된 소형 망막 플라크 (대부분 직경 <1 ㎛)의 고해상도 영상을 도해한다. 영상들은 10개월령 비-Tg (wt) 마우스 망막의 영상이다.
도 9는 살아 있는 AD-Tg 마우스 및 비-Tg (wt) 마우스 망막의 영상이고, AD-Tg 망막 내의 쿠르쿠민으로 염색된 플라크 및 비-Tg (wt) 마우스에서의 쿠르쿠민으로 염색된 플라크 결핍을 나타낸다.
본원에서 언급된 모든 간행물은 그 전문이 참고로 완전하게 기재된 것과 같이 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 의미가 동일하다. [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2001)]; [March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 5th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2001)]; 및 [Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2001)]가 본 출원에서 사용된 용어들 중 다수에 대한 일반적인 지침을 당업자에게 제공한다.
당업자는 본 발명의 실행에서 사용될 수 있는, 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 다수의 방법 및 물질을 인지할 것이다. 실제로, 본 발명은 기술된 방법 및 물질에 어떠한 방식으로도 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 "투여하는" 및/또는 "투여하다"는 제약 조성물을 환자에게 전달하기 위한 임의의 경로를 지칭한다. 전달 경로에는 비-침습성 경구 경로 (입을 통하는 경로), 국소 경로 (피부), 경점막 경로 (비강, 볼/설하, 질, 안구 및 직장) 및 흡입 경로, 뿐만 아니라 비경구 경로, 및 당업계에 공지된 기타 방법이 포함될 수 있다. 비경구는 안와내, 주입, 동맥내, 경동맥내, 피막내, 심장내, 피내, 근육내, 복강내, 폐내, 척주내, 흉골내, 수막강내, 자궁내, 정맥내, 지주막하, 피막하, 피하, 경점막, 또는 경기관이 포함되는, 주사와 일반적으로 결합되는 투여 경로를 지칭한다. 비경구 경로를 통해, 조성물은 주입 또는 주사를 위한 용액 또는 현탁액의 형태이거나, 또는 동결건조 분말로서 존재할 수 있다.
본원에서 사용된 "알츠하이머병"은 변성 및 말기 인지 장애로서 확인되는, 모든 형태의 치매를 지칭한다. 알츠하이머병은 정적이거나, 독특한 포괄적인 뇌 손상의 결과이거나, 또는 진행성일 수 있어서, 정상적인 노화로부터 예상될 수 있는 것을 넘어서는 신체 손상 또는 질환으로 인한 인지 기능에서의 장기적인 쇠퇴를 초래한다.
본원에서 사용된 "연령-관련 황반 변성"은 망막에 대한 손상으로 인한 시야의 중심 (황반)에서의 시력 손실을 초래하는 노인에서의 의학적 상태를 지칭한다.
본원에서 사용된 "백내장"은 약간의 불투명에서 완전한 불투명까지 정도가 다양하고 빛의 통과를 차단하는, 눈의 수정체 또는 이의 외피에서 발달되는 혼탁을 지칭한다. 연령-관련 백내장의 발달 초기에, 수정체의 능력이 증가되어 근시를 야기할 수 있고, 수정체의 점진적인 황색화 및 불투명화가 청색의 인지를 감소시킬 수 있다. 백내장은 전형적으로 천천히 진행되어 시력 소실을 야기하고, 치료되지 않으면 잠재적으로 눈을 멀게 한다.
본원에서 사용된 "형광 마커"는 화합물을 또 다른 분자, 예컨대 단백질 또는 핵산에 부착시키기 위한 형광단을 함유하는 임의의 모든 화합물을 지칭한다. 일반적으로 이는 표적 분자 내에 함유된 관능기에 선택적으로 결합하는 형광단의 반응성 유도체를 사용하여 달성된다.
본원에서 사용된 "녹내장"은 시각 신경에 영향을 미치고 특징적인 패턴의 망막 신경절 세포 손실을 수반하는 질환 군을 지칭한다. 녹내장은 일종의 시각 신경병증으로 분류된다.
본원에서 사용된 "포유동물"은 인간 및 비-인간 영장류 예컨대 침팬지, 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 애완 포유동물 예컨대 개 및 고양이; 마우스, 래트 및 기니피그와 같은 설치류가 포함되는 실험용 동물 등이 비제한적으로 포함되는, 포유류 강의 임의의 구성원을 지칭한다. 이러한 용어는 특정 연령 또는 성별을 표시하지 않는다. 따라서, 성체 및 신생 대상체, 뿐만 아니라 태아가, 남성 또는 여성 여부와 관계없이, 이러한 용어의 범주 내에 포함되도록 의도된다.
본원에서 사용된 "치료 유효량"은 치료되는 포유동물에서 이로운 결과를 달성할 수 있는 양을 지칭한다. 치료 유효량은 개별적인 기준으로 결정될 수 있고, 적어도 부분적으로, 포유동물의 생리학적 특징의 고려사항, 사용된 전달 시스템 또는 치료 기술의 유형, 및 치료될 질환, 장애 또는 상태의 진행에 관련되는 투여 시간을 기초로 한다.
본원에서 사용된 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 치료적 처치 및 예방 또는 방지 수단 양쪽 모두를 포함하고, 이때 궁극적으로 치료가 실패하더라도 표적으로 하는 병리학적 상태, 질환 또는 장애를 방지하거나 둔화 (약화)시키는 것을 목적으로 한다. 치료를 필요로 하는 대상체에는 이미 장애가 있는 대상, 뿐만 아니라 장애에 걸리기 쉬운 대상체 또는 장애를 방지하려는 대상체가 포함될 수 있다.
β-아밀로이드 침착은 AD 신경병증에 중심이 되고, 알츠하이머병의 주요 특징이다. 그러나, 살아있는 알츠하이머병 환자 및 동물의 뇌 내의 Aβ 플라크를 모니터링하는 것은 MRI 및 PET의 현행 해상도 및 특수성에 의해 제한되고, 알츠하이머병 또는 Aβ 플라크의 형성을 특징으로 하는 기타 질병 또는 상태의 명확한 진단은 플라크 및 탱글(tangle)의 개수 및 분포를 모니터링함으로써 뇌조직 부검 후에만 가능하다. 따라서, 생체 내에서 플라크를 확인하는 수단의 개발이 진단, 뿐만 아니라 치료법에 응답하여 질환이 진행되는 것의 평가에 필수적이다.
본 발명의 대상은 포유류에서의 망막 Aβ 플라크의 형성을 확립하고, 망막 Aβ 플라크를 확인, 정량 및 영상화하는 방법을 교시한다. 본 발명의 대상은 알츠하이머병, 치매, 및 Aβ 플라크의 형성을 특징으로 하는 기타 임상 상태 및 질병에 걸린 환자에 대해 구체화될 수 있다. 또한, 본 발명의 대상은 AD 환자의 망막에서의 Aβ 플라크의 형성이 이의 뇌에서의 출현에 선행한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 대상은 망막 내의 Aβ 펩티드를 염색하기 위해 환자에게 형광 마커를 투여하는 단계, 및 환자의 망막을 광학 영상화 시스템으로 영상화하여 염색된 Aβ 펩티드를 확인하는 단계를 포함하는, 포유동물에서의 AD의 조기 진단 방법을 개시한다.
본 발명의 주제의 또 다른 실시양태는 치료 전 및 후에 환자의 망막 내의 Aβ 플라크의 증가 또는 감소를 측정함으로써 포유동물에서 AD를 예후하는 방법을 교시한다. 이러한 예후 방법은 망막 내의 Aβ 펩티드를 염색하기 위해 환자에게 형광 마커를 투여하는 단계 및 환자의 망막을 광학 영상화 시스템으로 영상화하여 염색된 Aβ 펩티드를 확인하는 단계에 이어서 환자에게 AD 치료제를 투여하는 단계 및 AD 치료제가 효과를 나타내도록 적당한 기간을 허용하는 단계를 포함한다. 그리고, AD 치료 후 망막 내의 Aβ 플라크를 염색하기 위해 환자에게 형광 마커를 재투여하는 단계 및 환자의 망막을 광학 영상화 시스템으로 영상화하여 염색된 Aβ 펩티드에서의 증가 또는 감소를 확인하는 단계.
추가적인 실시양태에서, 본 발명의 대상은 Aβ 플라크의 형성을 감소시키거나 존재하는 Aβ 플라크를 용해시키기 위해 치료 유효량의 미엘린-유래 펩티드 및/또는 미엘린-유래 펩티드의 효능제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 환자에서 AD를 치료하는 방법을 개시한다.
본 발명의 대상은 치료 유효량의 미엘린-유래 펩티드 및/또는 미엘린-유래 펩티드의 효능제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 망막 Aβ 플라크를 함유하는 포유류 환자에서 시력을 개선하는 방법을 개시하는 것에서 또한 유용성이 발견된다. 시력 개선 방법은 AD, 치매, 또는 Aβ 플라크의 형성을 특징으로 하는 기타 임상 상태 및 질병, 예컨대 연령-관련 황반 변성 (AMD), 및 녹내장에 걸린 환자에게 적용가능할 수 있다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명의 대상은 Aβ 플라크가 포유동물의 망막 내에 존재하고, 망막 Aβ 플라크를 특징으로 하는 다수의 기타 임상 상태 및 질병을 분석, 예후 및 진단하는데 활용될 수 있다는 것을 기술한다. 대표적인 임상 상태 및 질병은 AMD 및 녹내장을 포함할 수 있다.
본 발명의 주제에서 확인되는 추가적인 발견에는 비-인간 포유류 및 인간 환자의 망막에서 생체 내에서 Aβ 플라크를 가시화하기 위한 광학 영상화 시스템이 포함된다. 광학 영상화 시스템에는 형광 현미경, 수은 및 제논 아크 램프, CCD 카메라, AOTF (음향 광학 변조 필터)-기반 스펙트럼 영상 획득 기구, 및 사후 분석 영상화 소프트웨어의 사용이 통합된다. 염색된 Aβ 플라크의 망막 영상을 제공하는 상기의 도구가 광학 영상화 시스템에 통합되어, 미가공(raw) 영상으로부터 추출된 스펙트럼 서명의 가시적인 모조색상 표현을 제공하고, 이는 Aβ 플라크 물체의 크기 및 위치를 나타낸다.
별법적인 실시양태에서, 더 높은 해상도에서 형광 및 산란 신호를 가시화하도록 조정되는 입체현미경을 사용하는 것이 광학 영상화 시스템에 통합된다. 입체현미경에 폴리크롬(Polychrome) V 가변 파장 광원이 설비될 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 배율 및 영상 세부묘사를 개선하도록 마이크로파이어(MicroFire) 컬러 디지털 카메라 및 하나 이상의 확대 렌즈가 광학 영상화 시스템에 통합될 수 있다. 영상화 소프트웨어를 사용한 사후 분석 영상 분할 및 분류에 의해 영상 획득이 달성되고 완성된다.
추가적인 실시양태에서, 포유동물에서 Aβ 플라크를 진단, 예후 및 치료하는 방법에 광학 영상화 시스템이 통합될 수 있다. 또한, 급속하게 변하는 광학적 왜곡의 효과를 감소시킴으로써 광학 영상화 시스템의 성능을 개선하기 위해 사용되는 적응 과학으로 광학 영상화 시스템이 증대될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 대상은 약물 개발 및 테스트에 활용될 수 있다. 신속하게 반복적인 비-침습성 영상화 방법이 다양한 약물 및 다양한 약물 투여량의 연속적인 비교를 가능하게 할 것이기 때문에, 본 발명의 대상은 약물 개발 및 테스트에서 유리한 유용성을 발견할 것이다.
기존의 보고서에서, AD 환자의 수정체 내의 Aβ 축적을 발견한 것을 기초로 하는, 뇌에서의 Aβ 병리학이 확인되었다 [31]. 현재의 연구는 쿠르쿠민에 의해 특이적으로 가시화될 수 있는 AD 환자의 망막 내의 Aβ 플라크의 존재에 대한 증거를 제공한다. Aβ 플라크가 모든 검사된 AD 환자의 망막에서 발견된 반면, 비-AD 대조군에서는 검출될 수 없었다. 어린 AD 마우스, 뿐만 아니라 노령 AD 마우스 양쪽 모두에서, 망막 Aβ 플라크와 뇌 Aβ 플라크 병리학 간의 양호한 상관관계가 관찰되었다; 플라크가 질환 진행 동안 연령-의존적 방식으로 축적되었고, 망막 및 뇌 양쪽 모두가 동일한 치료 양식에 응답하여 Aβ 플라크 감소를 나타냈다. 종합적으로, 뇌와 다수의 유사성을 공유하는 망막 조직이 AD의 진단 및 모니터링에 잠재적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 연구에서, AD 환자의 망막 내의 Aβ 플라크는 대부분 RGC 층 내에서 검출되었다. AD 마우스의 눈에서, 대부분의 망막 층 및 맥락막에서 플라크가 보였다. NFL에서 ONL까지 플라크가 현저하였고, Aβ 플라크 클러스터(cluster)가 망막의 내층에서 더욱 빈번하게 보였으며, 이는 살아 있는 대상체의 눈을 통한 플라크 영상화의 가능성을 의미한다. AD 마우스의 망막은 뇌에서 관찰되는 플라크의 연령-의존적 축적과 유사한, 개수 및 크기 양쪽 모두의 면에서의 Aβ 플라크 부하의 연령-의존적 증가를 겪는다. 망막 플라크 병리학을 나타내는 본 발명가들의 결과는 성체 및 노화 AD-Tg 마우스에서의 망막 염증 및 변성과 상관되는 망막 Aβ 침착을 밝히는 최근의 보고와 일관된다 [16]. 본 발명의 대상은 망막 플라크 병리학과 뇌 플라크 병리학 간의 연관을 지지하는 증거를 제공할 뿐만 아니라, 어린 AD-Tg 마우스에서, 뇌에서의 Aβ 플라크 검출 전에 Aβ 플라크가 망막에서 검출가능하다는 것을 또한 나타낸다. 본 발명가들은 미엘린-유래 펩티드로의 백신접종 후 AD-Tg 마우스의 망막에서의 Aβ 플라크의 유의한 감소를 추가로 나타낼 수 있었다; 이러한 치료, 뿐만 아니라 관련된 치료는 뇌 내의 Aβ 플라크 부하를 감소시키는데 효과적인 것으로 발견되었다 [17, 24, 25]. 이러한 발견들은 망막 플라크의 평가가 플라크-감소 치료법에 대한 응답을 평가하는데 사용될 수 있다는 것과 망막 플라크가 뇌에서의 Aβ 플라크 감소에 효과적인 것과 동일한 치료에 응답할 수 있다는 것을 제공한다.
중요하게, 플라크가 5 ㎛를 초과하는 크기에 도달하여 인간 눈 내의 GCL에서 보였다는 사실은 망막을 통한 알츠하이머 환자의 영상화를, 약간의 변형, 심지어 인간 눈 영상화를 위한 현재 이용가능한 도구, 예컨대 적응 광학 검안경 [32]과 함께, 실현가능한 접근법으로 만든다. 살아 있는 마우스에서, 시판되는 동공확대 망막 카메라가 안저 사진들을 기록하는데 효과적이어서 망막 신경절 세포의 장기적인 변화의 평가를 가능하게 하는 것으로 발견되었다 [33]. 청록색 형광 단백질을 가시화하도록 변형된 청색광 공초점 주사 레이저 검안경 (bCSLO) 시스템이 살아 있는 마우스 망막 내의 RGC를 가시화하기 위한 비-침습성 접근법을 또한 제공한다 [34]. 여기서, 개념 증명을 위해, 본 발명가들은 폴리크롬 V 스펙트럼 광원 및 이중 볼록 렌즈가 장착된 입체현미경 (라이카(Leica) S6E)을 사용하여 살아 있는 마우스에서 쿠르쿠민-표지 플라크를 검출할 수 있었다. 또한, AOTF 시스템을 사용하여, 본 발명가들은 강한 배경 자가형광 신호 (적혈구로부터의 신호)를 제거하면서 쿠르쿠민에 의해 망막 Aβ 플라크를 검출할 수 있었다.
본 발명의 연구에서, 7.5 mg/kg의 단일 용량으로 전신 투여되었을 때 또는 경구 제공되었을 때 쿠르쿠민이 망막 Aβ 플라크를 검출하는데 효과적이었다. 쿠르쿠민은 유용한 플라크 조영제에 대한 필요요건인, 혈액-뇌 및 혈액-망막 장벽을 가로지르는 능력을 나타냈다. 안전성 면에서, 암에 걸린 환자에서 쿠르쿠민을 사용한 I상 및 II상 시험에서, 고용량 (12 g/일)에서도, 그리고 장기간에 걸쳐 제공되었을 때 인간에서의 쿠르쿠민의 낮은 독성이 증명되었다 [35]. 망막 플라크 가시화를 위해 마우스에서 인간 (1 g 미만)으로 정맥내 또는 경구 제공된 쿠르쿠민 용량을 번역하는 것은 여전히 보고된 안전성 수준 이내일 것으로 예상된다. 또한, 최근의 연구들이 인간에서의 쿠르쿠민 안정성 및 생체이용률을 유의하게 증가시키기 위한 다양한 접근법들을 보고하였다 [36].
AD 환자의 망막 내의 Aβ 플라크의 확인은 고해상도의 민감한 영상화 방법을 개발할 새로운 기회를 제공하고, 이는 생체 내에서의 검출을 허용할 것이다. 이러한 결과는 AD 환자에서 발견된 초기 시각 기능장애 [37, 38], 및 AD 환자에서 보고된 GCL 내의 세포 손실 및 NFL 위축과 같은 망막 이상에 대한 증거 [39-44]와 일치할 수 있다. Aβ 플라크가 초기 또는 후기 단계의 AD의 망막에서 발견되는지 여부가 불명확하지만, 상이한 연령의 이러한 환자들의 망막에서 Aβ 플라크가 현재 발견되는 것 및 이러한 플라크들이 AD-Tg 마우스에서 질환의 극초기 증상전 단계에서 검출가능하다는 사실은 눈을 통해 보이는 쿠르쿠민-표지 플라크가 AD의 조기 진단에 사용될 수 있는 가능성을 강화한다. 중요하게, 플라크의 독특한 크기 및 망막 내에서의 분포를 기초로, AD 환자에서 관찰된 플라크가 결국 감별 진단에 사용될 수 있다: 연령-관련 황반 변성에서 검출된 플라크는 드루젠 내의 망막 색소 상피에 국소적으로 제한되고, 크기 면에서 더 작게 나타난다 [45-47]. AD 환자에서 나타나는 망막 이상의 관점에서, 플라크-감소 치료법, 예컨대 현재의 DC 백신접종이 시각 기능장애들 중 일부를 개선하는 것을 또한 도울 수 있는 것이 가능하고, 심지어 시력이 개선된다.
세계 인구가 노화되고 AD 유행이 증가함에 따라, 위험을 평가하고, 새로운 치료법을 평가하며, 일단 AD가 발병되었으면 조기 개입으로 AD를 치료하기 위해 AD의 조기 검출이 더욱 더 중요해진다. 증상이 나타나고 임의의 실질적인 신경변성이 발생하기 수년 전에 아밀로이드 플라크 및 신경섬유 탱글이 포함되는 AD 병리학이 나타나는 것으로 여겨진다. 여전히 인지적으로 정상인 대상체에서 뇌 병리학 및 인지 저하의 발달을 예측할 수 있는, AD에 대해 특이적인 조기에 측정가능한 마커, 예컨대 망막 내의 Aβ-플라크의 발견이 특히 필요하다. 마우스 AD 모델에서의 본 발명가들의 발견은 쿠르쿠민으로 생체 내에서 표지된 망막 플라크의 영상화를 AD 병리학 및 치료적 개입에 대한 응답의 조기 지시를 위한 비-침습성 도구로서 사용하는 것을 지지한다.
또한, 본 발명의 대상은 AD 환자에서의 눈 및 시력 변성과 종종 관련되는 망막 내의 Aβ-플라크를 감소시키고/시키거나 제거하기 위한 백신접종 치료법을 소개한다. 미엘린-유래 펩티드 또는 미엘린-유래 펩티드의 약한 효능제를 사용하여, 효과적으로 신경보호를 유도하고 망막 내의 플라크 형성을 감소시킬 수 있었다.
요약하면, 본 발명가들은 인간 망막 내의 Aβ 플라크를 확인하였고, 인간에서 안전한 것으로 증명된 전신 투여 화합물을 사용하여 망막 내의 Aβ 플라크를 영상화함으로써, 뇌에서보다 더 조기에, 그리고 더 쉽게 알츠하이머의 플라크 병리학을 검출 및 모니터링하기 위한 새로운 접근법을 기술하였다. 이는 유의한 기능 결핍이 나타나기 전에 여전히 인지적으로 정상이고 건강한 대상체에서 뇌 병리학 및 인지 저하의 발달을 예측할 수 있다. 이러한 발견은 망막의 광학 영상화가 AD 진행 및 치료적 개입에 대한 응답을 모니터링하기 위한 비-침습성 접근법으로서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다 [48].
실시예
하기의 실시예들은 청구된 발명을 더 잘 설명하기 위해 제공되고, 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 특정 물질이 언급된다는 점에서, 이는 단지 설명을 목적으로 하고, 발명을 한정하도록 의도되지 않는다. 당업자는 독창적인 역량을 행사하지 않으면서, 그리고 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 등가의 수단 또는 반응물을 개발할 수 있다.
실시예 1
결과
AD 마우스 망막 내의 Aβ 침착물이 쿠르쿠민을 사용하여 가시화될 수 있다
인간 APPswe 및 PS1dE9 트랜스진(transgenes)을 보유하는 AD-Tg 마우스를 사용하여, 눈에서 Aβ 플라크를 검출하기 위한 비-침습성 도구의 개발 가능성을 평가하였다. 먼저, 쿠르쿠민이 AD-Tg 마우스의 해마 내에서 인간 Aβ에 대해 특이적인 항체에 의해 검출된 것과 동일한 플라크에 대한 친화력이 있음을 증명하였다 (도 1a; 개별적인 채널 도 1b 및 1c). 더 높은 배율에서, 영상들은 각각의 절차 후 수득된 특이적 염색 패턴을 나타냈다 (도 1d 및 1e). 비-Tg 한배새끼 야생형 (wt) 마우스의 뇌에서는 인간 Aβ-플라크가 검출가능하지 않았다 (도 1f). 그후, AD-Tg 마우스의 눈 내의 Aβ 플라크가 쿠르쿠민에 또한 결합할 수 있는지 여부를 테스트하였다. 고해상도에서의 검사에서, AD-Tg 마우스의 망막에서 쿠르쿠민 및 항-인간 Aβ-항체 양쪽 모두로 표지된 Aβ 플라크의 존재가 밝혀졌지만 (도 1g - 1i, 망막 온조직 표본; 도 1k - 1m, 단면도), 비-Tg (wt) 마우스의 망막에서는 그렇지 않았다 (도 1j 및 1n). 대표적인 영상들이 내망상층 (IPL; 도 1g), 내핵층 (INL) / 외망상층 (OPL; 도 1h), 및 외핵층 (ONL; 도 1i)이 포함되는 다양한 깊이 (80 ㎛ 깊이의 초점면에서의 연속적인 획득)의 망막 온조직 표본에서의 Aβ 플라크의 위치를 디스플레이한다. 단면도의 분석에서, 심부 망막층 및 맥락막 내의 Aβ 플라크 침착이 추가로 증명되었고, 이때 신경절 세포층 (GCL) 및 IPL을 지나 OPL 층에서 명백히 우세하였다 (도 1k - 1m). 인간-Aβ 플라크가 비-Tg (wt) 한배새끼에서 부재하였지만 (도 1j 및 1n), 가끔의 소형 쿠르쿠민-양성 플라크가 검출되었다. wt 마우스에서 쿠르쿠민 염색에 의해 검출된 이러한 희박한 소형 플라크의 성질을 결정하기 위해, 10개월령 wt 마우스의 온조직 표본 망막에서 쿠르쿠민 및 마우스-Aβ에 대해 특이적인 항체를 사용하는 이중-염색 실험을 수행하였다. 실제로, wt 망막에서 쿠르쿠민에 의해 검출된 소형 플라크가 항-마우스 Aβ 항체와 공동-표지되는 것으로 발견되었고, 따라서 이들의 신원이 내인성으로 형성된 마우스-Aβ 침착물로서 확증되었다 (도 8a - 8d).
실시예 2
결과
Aβ 플라크가 AD 환자의 망막에서 형성되고, 쿠르쿠민에 의해 가시화될 수 있다
다음으로, AD로 명확하게 진단된 환자 (n=9; 48세 내지 94세 범위의 연령; 신경병리학 보고서를 기초로 분류된, 상이한 질환 중증도)의 사후 눈, 및 비슷한 연령의 정상 대조군 (n=4; 66세 내지 92세; 인간 기증자 눈 기록 참조)의 사후 눈에서 Aβ 플라크의 존재를 시험하였다 (표 1 참조). 360-710 nm 범위의 여기 하에 관찰되고 리포푸신/지질 침착물 및/또는 포르말린으로의 장기 고정 [21, 22]과 관련된, 고정된 인간 눈의 자가형광 및 비-특이적 신호를 수단 블랙 B 염색에 의해 제거하였다 (도 2). 쿠르쿠민 염색을 위해, 먼저 인간 온조직 표본 망막에 수단 블랙 B를 함침시킨 후 (도 2a 및 2c; 플라크가 관찰되지 않았음), 쿠르쿠민에 노출시켰다 (도 2b 및 2d; 대표적인 영상이 동일한 조직 위치 내의 플라크를 디스플레이함). 크기가 1 내지 10 ㎛ 범위 (전형적으로 약 5 ㎛)인, 쿠르쿠민에 의해 검출된 플라크가 GCL, IPL 및 INL 망막 층 (도 2a 및 2g)에 상응하는 다양한 초점 깊이에서, 그리고 뇌에서의 보고된 플라크 병리학에 명백하게 상관되면서, 검사된 모든 AD 환자의 눈에서 발견되었다. 인간 망막을 인간 Aβ에 대해 지시된 항체로 또한 분석하였다. AD 환자에서 Aβ 플라크가 확인되었고, 이의 구조가 마우스 망막 및 뇌에서 발견된 것과 유사하였음을 발견하였다 [도 2h 및 2i는 플라크가 쉽게 검출되는 가장 안쪽의 망막 층 (즉 GCL)을 나타내고; 도 2i는 망막 Aβ 플라크의 더 높은 배율의 영상이며; 도 2j는 더 깊은 연속적인 초점면들 (즉 IPL)을 나타낸다]. 2차 항체만 사용되었을 때는 플라크를 검출할 수 없었다 (데이터는 제시되지 않음). Aβ에 대한 면역표지 후 인간 망막을 쿠르쿠민에 노출시켰을 때, 이들의 공동-국소화가 확인되었다 (도 2k - 2m). 비-AD 인간이 눈에서는, Aβ 플라크가 검출되지 않았다 (도 2n).
Figure 112011019425692-pct00001
실시예 3
결과
쿠르쿠민에 의해 생체 내에서 염색된, AD 마우스 내의 Aβ 플라크가
뇌에서보다 조기에 망막에서 검출되고, 질환 진행 동안 축적된다
망막 내의 플라크를 영상화하기 위해 쿠르쿠민을 사용하는 것을 확립하기 위해, 전신 투여되었을 때의 쿠르쿠민의 눈으로의 생체이용률을 테스트하였다. 이를 위해, 마우스에게 쿠르쿠민을 정맥내 주사하였다. 쿠르쿠민 투여 후 표지된 플라크를 AD-Tg 마우스의 망막 및 뇌에서 검출할 수 있었지만, 비-Tg (wt) 대조군에서는 그렇지 않았다 (도 3). 이러한 발견은 쿠르쿠민이 혈액-뇌 장벽을 가로지른다는 것을 확증하였고, 쿠르쿠민이 혈액-망막 장벽을 또한 가로지르고 생체 내에서 Aβ 플라크에 대한 높은 친화력을 지닌다는 것을 시사한다. 중요하게, 쿠르쿠민-표지 플라크를 단일 쿠르쿠민 주사 후 또는 다중 주사 후 검출할 수 있었다. 2.5, 5, 9 및 17개월령의 AD-Tg 마우스의 망막 및 뇌 해마 및 피질 영상의 대표적인 z-축 투사에서, 망막 및 뇌에서의 플라크 침착 간에 연령-의존적 상관관계, 및 질환 진행 과정에 걸쳐 증가된 축적이 실연되었다 (도 3a - n). 중요하게, 생체내 쿠르쿠민 투여 후 AD-Tg 마우스에서 2.5개월령 만큼 조기에 플라크가 망막에서는 검출되었지만 (도 3a 및 3b), 뇌에서는 그렇지 않았고 (도 3c 및 3d), 이는 망막 내의 Aβ 플라크가 뇌 병리학을 선행한다는 것을 실연한다. 이러한 쿠르쿠민-표지 플라크가 생체 외에서 항-인간 Aβ 항체 염색과 공동-국소화되었음이 추가로 확증되었다 (도 3b 및 3f). Aβ 플라크는 5개월령의 뇌에서 최초로 검출가능하였고 (도 3g 및 3h), 이는 이러한 계통의 AD-Tg 마우스에서의 질환 개시 및 진행의 기존의 설명 [23]과 일맥상통한다. wt 마우스에서는, Aβ 플라크가 9개월령에 망막 (도 3o) 및 뇌 (도 3p 및 3q) 양쪽 모두에서 검출가능하지 않았다.
실시예 4
결과
백신접종 치료법 후 망막에서 Aβ 플라크 부하가 감소된다
AD-Tg 마우스에서 관찰된 망막 플라크의 운명이 동일한 치료에 응답하여 뇌 Aβ 플라크의 운명과 유사한지 여부를 추가로 연구하였다. 미엘린-유래 펩티드 또는 미엘린-유래 펩티드의 약한 효능제는 효과적으로 신경보호를 유도하고 플라크 형성을 감소시키는 것으로 나타났다 [24-26]. 자가면역 뇌척수염을 유발하는 위험 없이 백신접종의 이로운 효과를 확실히 하기 위해, 담체로서의 수지상세포 (DC) 및 애쥬번트를 사용하여 변형된 미엘린-유래 펩티드 (MOG 35-5527,28로부터 유래된 MOG45D)를 AD-Tg 마우스에게 백신접종하였다. MOG45D-로딩 DC 또는 PBS가 주사된 10개월령 AD-Tg 마우스의 온조직 표본 망막, 및 wt 한배새끼의 온조직 표본 망막 (군 당 4마리의 마우스/8개의 망막)을 쿠르쿠민 및 항-Aβ 항체 양쪽 모두를 사용하여 생체 외에서 Aβ 플라크에 대해 표지하였다 (도 4). 대표적인 축 (z-스택(stack)) 투사 영상에서, PBS-처리 대조군에 비해 백신접종 AD-Tg 마우스에서 Aβ 플라크 개수의 실질적인 감소가 실연되었다 (각각 도 4a - 4c 대 도 4d 및 4f;도 4b 및 4c, 및 도 4e 및 4f에서 개별적인 채널). wt 마우스에서 Aβ 플라크 (쿠르쿠민 및 항-인간 Aβ 항체로 이중 염색)가 검출되지 않았다 (도 4g). 고해상도 영상에서, 소형 망막 플라크 (대부분 직경 <1 ㎛)가 종종 검출되었고, 이는 내인성 마우스 APP 유전자로부터 유래되는 것으로 확인되었다 (도 8). 이러한 소형 플라크들은 3가지 실험 군 모두에서 쿠르쿠민으로는 염색되었지만 항-인간 Aβ로는 염색되지 않았다 (도 4a, 4d 및 4g). 시신경 유두 주변의 12개의 영역 (총 약 0.45 ㎟)을 포착함으로써 플라크 개수 및 크기를 추가로 정량하였고, 각각의 영역에서 60-㎛ 스캐닝 깊이에 걸쳐 플라크를 정량하였다 (도 4h; 각각의 영역이 사각형 1-12로 지시됨). 쿠르쿠민 염색에 의해 검출된 플라크 개수에서의 유의한 감소가 PBS-처리 대조군에 비해 백신접종 AD-Tg 마우스의 망막에서 발견되었다 (도 4i; P=0.0028). PBS-처리 AD-Tg 마우스에 비해 백신접종 마우스에서 망막 플라크로 덮인 평균 면적에서 유의한 감소가 또한 관찰되었다 (도 3j; P=0.0002). 현저하게, PBS-처리 마우스에 비해, 전체 플라크 면적에서의 유의한 감소가 동일한 백신접종 마우스의 뇌로부터의 해마 및 피질에서 또한 관찰되었다 (도 4k; P=0.0085).
실시예 5
결과
전신 주사된 쿠르쿠민을 사용하는 눈 내의 Aβ 플라크의 생체내 영상화
살아 있는 동물의 눈에서 쿠르쿠민에 의해 Aβ 플라크를 가시화하는 것의 가능성을 추가로 연구하기 위해, 본 발명가들은 더욱 생리학적인 환경인, 안구적출 전에 관류되지 않은 마우스의 온조직 표본 망막 내의 Aβ 플라크를 확인하는 본 발명가들의 능력을 먼저 테스트하였다. 대표적인 축 투사 영상에서, 혈관 내의 적혈구로부터의 배경 신호를 포함한 이러한 조건 하에서도, 쿠르쿠민이 앞서 정맥내 주사된 AD-Tg 마우스의 망막에서 플라크가 확인될 수 있음이 실연되었다 (도 5a). 중요하게, 쿠르쿠민의 부재 하에, PBS가 정맥내 주사된 AD-Tg 마우스에서 플라크가 검출가능하지 않았고 (도 5b), 이는 이러한 영상화 양식을 사용할 때, 플라크가 오직 자신의 자가형광 신호에 의해서만은 망막 내에서 거의 검출가능하지 않다는 것을 시사한다. 예상대로, 쿠르쿠민이 주사된 비-Tg(wt) 마우스에서, 플라크가 또한 검출되지 않았다 (도 5c). 생체 외에서 항-인간 Aβ 항체로 플라크를 추가적으로 표지하는 것에서, 쿠르쿠민 염색의 Aβ 특이성이 확증되었다 (데이터는 제시되지 않음). 항-Aβ 항체로 표지된 ADTg 마우스의 온조직 표본 망막 내의 Aβ 플라크가 혈관 내부, 뿐만 아니라 실질 부근에서 발견되었다 (도 5d; 공초점 가상 단면). 혈관으로부터의 배경 신호를 감소시키면서 Aβ 플라크를 검출하는 것이 가능할지 여부를 추가로 평가하였다. 이를 위해, 특이적 광학적 서명을 음향 광학 변조 필터 (AOTF)로의 스펙트럼 영상화 [29] 및 게이트 카메라를 사용하는 형광 수명 영상화로 구성된 멀티-스펙트럼 영상화 기술을 포함하는 형광 현미경 (Nikon TE2000)을 사용하여 모니터링하였다; 영상 획득에 본 발명가들이 개발한 소프트웨어 [30]를 사용한 사후 분석 영상 분할 및 분류가 이어졌다. 단일 파장 채널의 AOTF가 장착된 현미경을 사용하여 영상화된 쿠르쿠민-표지 플라크가 AD-Tg 마우스 망막에서 관찰되었다 (도 5e). AOTF-기반 영상화의 적용, 쿠르쿠민-표지 플라크의 스펙트럼 서명 포착, 및 색-분류 디지털 영상으로의 사후 번역에 의해, 혈관에 의해 생성된 자가형광 노이즈를 제거하면서 Aβ 플라크의 특이적 광학적 서명을 "진짜" 신호로서 확인할 수 있었다 (도 5f). 비-침습성 플라크 검출을 위한 본 발명가들의 접근법의 실행가능성을 연구하기 위해, 디지털 카메라 및 파장-제어 광원이 있는 변형 입체현미경 (Leica S6E)을 사용하여 살아 있는 마우스에서 망막의 생체내 영상화를 수행하였다. 영상화 2시간 전의 쿠르쿠민 (7.5 mg/kg)의 단일 주사 후, 쿠르쿠민-표지 플라크가 546/15 nm의 여기 파장에서 특이적으로 AD-Tg 마우스 망막에서 가시적이었다 (도 5g - 5j). 플라크들은 시신경 유두에 가까운 영역에서 대부분 검출되었다. 평균 플라크 크기는 온조직 표본 망막 (생체외)에서 관찰된 것과 양립성이었다. 쿠르쿠민이 정맥내 주사된 비-Tg (wt) 마우스 (도 5k) 또는 쿠르쿠민 주사가 제공되지 않은 AD-Tg 마우스 (데이터는 제시되지 않음)에서는 플라크가 검출되지 않았다. 변형 입체현미경에 의해 포착된 신호가 플라크로부터 유래되었음을 입증하기 위해, 마우스를 안락사시켰고, 쿠르쿠민-표지 플라크의 존재가 온조직 표본 망막 상에서 확증되었다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 6
마우스
키메라 마우스/인간 APP (APPswe) 및 돌연변이체 인간 프레세닐린 1 (엑손 9에서의 결실 - PSEN1△E9) 유전자를 보유하는 이중-트랜스제닉 마우스 (동일한 마릿수의 암컷 및 수컷) 및 이들의 비슷한 나이의 비-Tg 한배새끼를 <Jackson Laboratories> (Bar Harbour, ME) (품종 #4462)로부터 구입하여, <Cedars-Sinai Medical Center> (Los Angeles, CA)의 비교 의학 동물 센터에서 사육하고 유지시켰다. 모든 실험은 <Cedars-Sinai Institutional Animal Care and Use Committee>에 의해 고안된 규칙에 따라 인가되고 수행되었다.
실시예 7
유전자형결정
게놈 DNA를 DNA 추출 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 0.5 cm 꼬리 끝부분에서 추출하였다. 이러한 연구에 사용된 마우스에서, 기존에 기술된 바와 같이 PCR에 의해 트랜스진의 존재에 대해 유전자형을 결정하였다 ([Jankowsky, 2004, Ref. #120]).
실시예 8
백신접종 제제
뇌염생성 펩티드 MOG(35-55)로부터 변형된 미엘린-유래 펩티드 (MOG45D)가 유래된다 ([Koehler, 2002, Ref. #285]; [Shao, 2002, Ref. #283]; [Zhong, 2002, Ref. #284]; [Hauben, 2001, Ref. #28]; 및 [Hauben, 2001, Ref. #35]). 백신접종을 위해, MOG45D (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 비-Tg 한배새끼의 도너 마우스로부터의 골수-유래 수지상세포에 첨가하였다. 백신접종을 위한 수지상세포의 제조는 기존에 기술되어 있었다 ([Hauben, 2003, Ref. #34]).
실시예 9
백신접종을 위한 실험 계획
7개월령의 AD-Tg 마우스에게 DC-MOG45 (동물 당 1×PBS 내의 0.5×106개의 세포/200 ㎖)를 3개월 동안 한 달에 한 번씩 주사하였다. 7개월령 AD-Tg 마우스의 대조군에게는 상응하는 계획에 따라 1×PBS를 주사하였다. 연구 말기에, 모든 마우스에게 마취 하에 1×PBS에 이어서 2.5％ 파라포름알데하이드 ("PFA") (Sigma)를 관류시키고, 뇌 및 눈을 추가적인 연구를 위해 수집하였다.
실시예 10
동물 조직
마우스를 마취시키고, 4％ 빙냉 완충 PFA를 관류시켰으며, 일군의 마우스는 관류시키지 않았다. 마우스의 눈을 적출하고, 즉각적으로 신선한 4％ PFA에서 하룻밤 동안 고정시켰다. 온조직 표본 망막을 위해, 눈을 절개하고, 전방 부분을 제거하였다. 아이컵(eyecup)을 10분 동안 히알루로니다제 (I-S 유형) (0.07 ㎎/㎖) (Sigma)에 함침시켜, 액화시키고 유리체 잔류물을 제거한 후, 10분 동안 PBS에서 3회 세정하고, 온조직 표본 망막을 수집하였다. 전체 눈 절편화를 위해, 눈을 4％ PFA 내의 30％ 수크로스 내에 2시간 동안 놓고, 15분 동안 PBS에서 3회 세정하였다. 눈을 O.C.T에 매립하고, 드라이 아이스 상에서 천천히 동결시킨 후, 냉동미세절단기로 시상 절편화하였다 (7 ㎛). 뇌를 수집하고, 즉각적으로 신선한 4％ PFA에서 하룻밤 동안 고정시켰다. 뇌를 30％ 수크로스 (4％ PFA 내) 구배 내에 놓았다. 뇌를 15분 동안 PBS에서 3회 세정하고 나서, O.C.T에 매립하고, 드라이 아이스 상에서 천천히 동결시킨 후, 냉동미세절단기로 관상 절편화하였다 (30 ㎛).
실시예 11
인간의 부검용 눈
알츠하이머 환자로부터의 부검용 눈을 <Alzheimer's Disease Research Center, Department of Pathology, University of Southern California> (Los Angeles, CA)로부터 IRB 프로토콜 99491 및 3201 하에 조달하였다. 건강한 기증자의 눈은 <National Disease Research Interchange> (NDRI, Philadelphia, PA)로부터 구입하였다. NDRI에는 관리 위원회에 의해 인가되고 <National Institutes of Health>의 감독을 받는 인간 조직 수집 프로토콜이 있다. 질환 눈 및 정상 눈을 고정시키고, 10％ 중성 완충 포르말린에서 보관하였다. 또한, 고정 없이 동결되고 -80℃에서 보관된 2개의 건강한 눈이 사용되었다. 이러한 눈들로부터 온조직 표본 망막을 제조하고, 면역조직화학에 의해 추가로 연구하였다.
실시예 12
쿠르쿠민의 꼬리 정맥 주사
생체내 Aβ-플라크 영상화를 위해, AD-Tg 및 비-Tg 야생형 마우스에게 PBS 내의 쿠르쿠민 (7.5 ㎎/㎏/일, 연속 7일) 또는 PBS를 꼬리에 정맥내 주사하였다. 이어서, 뇌 및 눈을 냉동절편화하거나, 또는 온조직 표본 망막용으로 제조하였다. 별법적인 실시양태에서, 쿠르쿠민을 환자에게 경구 투여할 수 있다.
실시예 13
면역조직화학
뇌 냉동절편 (30 ㎛ 두께), 망막 횡단 절편 (냉동절편) (7 ㎛ 두께) 및 온조직 표본 망막을 20％ 말 혈청 (Invitrogen) 및 0.01-0.1％ 트리톤(Triton) X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 함유하는 투과/차단 용액으로 처리하였다. 절편들을 하룻밤 동안 4℃에서 10％ 차단 용액을 함유하는 PBS 내의 하기의 1차 항체들의 특정 조합물로 염색하였다: 마우스 항-Aβ [인간 아미노산 잔기 1-17; 클론 6E10 (1:100; Milipore, Temecula, CA)]. 절편들을 1시간 동안 실온에서 2차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 1×PBS로 3회 세정하고, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드 (DAPI, Vector Laboratories, Peterborough, UK)를 함유하거나 함유하지 않는 벡터쉴드(Vectorshield)를 사용하여 마운팅하였다. 1×PBS 내의 2차 항체 용액은 Cy-5-접합 당나귀 항-마우스 항체 (1:200; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)를 함유하였다. 1차 항체를 생략하면서 동일한 프로토콜로 음성 대조군을 프로세싱하여, 비-특이적 표지화를 평가하였다. 현미경 분석을 위해, 짜이스(Zeiss)의 아포톰(ApoTome) 형광을 사용하였다.
실시예 14
쿠르쿠민 염색
쿠르쿠민 (Sigma-Aldrich)을 0.5 M NaOH (pH=7.9)에 용해시킨 후, 즉각적으로 1×PBS에서 희석함으로써 0.1 ㎎/㎖의 쿠르쿠민 용액을 제조하였다. 뇌 및 망막 조직 냉동절편 (각각 30 ㎛ 및 7 ㎛ 두께) 및 온조직 표본 망막을 쿠르쿠민 용액으로 10분 동인 실온에서 염색한 후, 1×PBS에서 각각 15분 동안 3회 헹궜다. 샘플을 GVA 마운팅 배지 (Zymed)로 덮었다.
티오플라빈 S 및 T 및 일부 유도체, 콩고 레드(Congo Red) 및 유도체, 메톡시-X04, 피츠버그 화합물(Pittsburgh Compound)-B (PiB), DDNP, 크리사민-G 및 몇몇 가지가 포함되는, 생체 내에서 아밀로이드 플라크를 염색/표지화할 수 있는 추가적인 화합물들이 당업계에 공지되어 있다. 그러나, 하기의 장점으로 인해, 쿠르쿠민 및 이의 유도체가 동물 모델, 뿐만 아니라 인간에서의 아밀로이드 플라크의 생체내 광학 영상화에 매우 매력적이다. 쿠르쿠민은 통상적으로 사용되는 광학 스펙트럼에서 특이적이고 매우 밝은 신호를 생성하고, 매우 낮은 비용으로 시판된다. 쿠르쿠민에 관한 안전성 문제가 최소이고 (높은 투여량에서도), 심지어 항산화제로서 환자의 건강에 이로운 것으로 간주될 수 있다. 쿠르쿠민은 Aβ에 대한 시험관내 및 생체내 결합 특성이 매우 양호한 효과적인 리간드이고, 양호한 초기 뇌 흡수 및 뇌로부터의 배설률 (생체내 조영제에 대해 중요한 성질)을 제공한다.
실시예 15
정량
염색된 조직의 현미경사진을 액시오 이미저(Axio Imager) Z1 아포톰-장착 현미경 (전동식 Z-드라이브) + 액시오캠(AxioCam) MRm 모노크롬 카메라 버젼 3.0 (1388×1040 픽셀의 해상도, 6.45 ㎛×6.45 ㎛ 픽셀 크기, 동작 범위 >1:2200, 펠티어(Peltier)-냉각 센서로 인해 저-노이즈 영상을 전달함) 상에서 수득하였다. Aβ 플라크 개수 및 면적 (βm2)의 정량적 분석을 마우스 당 2개의 온조직 표본 망막으로부터 수행하였다 (n = 군 당 4마리의 마우스). 0.28 βm의 해상도로 40× 대물렌즈에서 포착된 각각의 영상은 0.04 ㎟의 영역, 및 스캐닝 깊이 60 ㎛ 이내의 시신경 유두 주변의 총 12개의 사각형 영역을 포함하였다 (전동식 스캐닝 스테이지를 사용하는 연속적인 초점면에서의 다중 가상 절편 영상). 평균 플라크 반경의 측정 (쿠르쿠민 염색 후)을 각각의 동물 군에 대해 완료한 후, 각각의 동물 군에서의 평균 플라크 면적을 계산하였다. 획득을 위해, 모든 영상에 대해 유사한 노출 시간 (약 75 ms) 및 동일한 게인(gain) 값 (0)을 사용하였다. 영상 후처리를 수행하지 않았다. 쿠르쿠민으로 염색된 Aβ플라크로부터의 방출 신호를 망막 조직 내의 배경 신호와 비교하여, 신호 대 배경 비율을 결정하였다. 영상들로부터의 계산된 신호 대 배경 노이즈 비율이 높았고, 3:1 내지 10:1 범위 내였다. 뇌 내의 Aβ 플라크 개수 및 면적 (βm2)의 정량적 분석을 해마 및 피질 영역을 포함하는 면적에 걸쳐 450 ㎛ 간격으로 마우스 당 3개의 관상 절편 (각각 2개의 반구)으로부터 결정하였다. 검사물의 각각의 시역으로부터의 광학 절편을 NIH 이미지(Image) J 프로그램 (National Institutes of Health) 내로 이입하였다. 흑백으로의 전환을 수행하여, 면역반응성 영역과 배경 영역을 구별하였다. 전체 면적 및 면역반응성의 정량적 수준을 표준화된 맞춤식 막대그래프-기반 역치 기술을 사용하여 결정한 후, 입자 분석을 적용하였다.
실시예 16
스펙트럼 및 멀티스펙트럼 영상화
스펙트럼 영상화는 모든 픽셀에서 정확한 광학적 서명을 생성시키는 다수의 순차적인 파장에서 물체의 디지털 영상을 제공한다. 쿠르쿠민으로 생체 내에서 표지된 Aβ 플라크의 형광 스펙트럼 서명을 하기의 설비를 사용하는 본 발명가들의 스펙트럼 영상화 시스템에 의해 포착하였다: 니콘(Nikon) 형광 현미경 (E800 및 TE2000), 수은 및 제논 아크 램프, CCD 카메라, AOTF (음향 광학 변조 필터)-기반 스펙트럼 영상 획득 시스템 (ChromoDynamics, Inc) [29] 및 사후분석 영상화 소프트웨어 (본 발명가들의 <Minimally Invasive Surgical Technologies Institute>에서 개발됨) [30]. 최종 영상은 분석된 물체의 크기 및 위치를 나타내는, 미가공 영상으로부터 추출된 스펙트럼 서명의 시각적인 모조색상 표현을 제공하였다. 멀티스펙트럼 영상화에서, 펄스(pulse) 레이저 및 라비젼(LaVision)의 피코스타(PicoStar) HR 게이트 카메라로 수행된 형광 수명 영상화가 스펙트럼 획득을 보충하였다.
도 6은 본 발명의 실시양태에 따라 생체 내에서 Aβ 플라크를 진단, 예후, 및 분석하기 위한 스펙트럼 영상화 시스템 100의 순서도를 도해한다. 대상체 망막 110이 Aβ 플라크를 표지하도록 형광 마커로 염색된다. 그 직후에, 염색된 망막 110이 더 높은 해상도에서 형광 및 산란 신호를 가시화하도록 조정되는 영상화 장치 120에 의해 영상화된다. 영상화 장치 120에 폴리크롬 V 가변 스펙트럼 광원 130이 설비될 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 스펙트럼 영상화 시스템 100에 배율 및 영상 세부묘사를 개선하도록 컬러 디지털 카메라 140 (예를 들어, 마이크로파이어) 및 하나 이상의 확대 렌즈가 통합될 수 있다. 영상화 소프트웨어 160을 사용한 사후 분석 영상 분할 및 분류에 의해 영상 획득 170이 달성된다.
도 7은 본 발명의 실시양태에 따라 Aβ 플라크를 진단, 예후, 및 분석하기 위한 스펙트럼 영상화 시스템 200의 순서도를 도해한다. 대상체 망막 210이 Aβ 플라크를 표지하도록 형광 마커로 염색된다. 그 직후에, 염색된 망막 210이 영상화 장치 220을 사용하여 영상화된다. 영상화 장치 220에 음향 광학 변조 필터 (AOTF) 230으로의 스펙트럼 영상화 및 게이트 카메라 240을 사용하는 형광 수명 영상화로 구성된 멀티-스펙트럼 영상화 기술이 설비될 수 있다. 영상화 소프트웨어 250을 사용한 사후 분석 영상 분할 및 분류에 의해 영상 획득 260이 달성된다.
실시예 17
마우스 망막의 생체내 영상화
AD-Tg 및 wt 마우스 망막을 쿠르쿠민 정맥내 주사 2시간 후에 영상화하였다. 마우스를 케타민 100 ㎎/㎖/㎏ 및 자일라진 20 ㎎/㎖/㎏으로 마취시켰다. 마우스 동공을 0.5％ 트로피카미드 안과용 용액 (Mydral; Bausch & Lomb)과 조합된 0.5％ 페닐에프린 하이드로클로라이드 안과용 용액 (Bausch & Lomb)으로 약 2 ㎜ 직경으로 확대시켰다. 영상화 프로세스 동안, 마우스를 입체현미경의 스테이지 상에 놓고, 칼슘 및 마그네슘이 보충된 PBS 한 방울로 눈을 덮었으며, 이는 눈 표면과 영상화 렌즈 사이의 광학적 커플링 매질 역할을 하였다. 더 높은 해상도에서 형광 및 산란 신호를 가시화하도록 조정된 변형 입체현미경 (라이카 S6E)을 사용하여 영상들을 포착하였다 (노출 시간 750 ms. 게인 4). 이러한 변형 입체현미경은 폴리크롬 V (Till Photonics) 가변 파장 광원, 마이크로파이어 컬러 디지털 카메라 (Optronics), 및 추가적인 6× (이중 볼록) 확대 렌즈를 포함하도록 조립되었고, 이때 초점 길이는 10 ㎝였다. 더 큰 시역을 가시화하고 비-특이적 반사 신호를 제거하기 위해, 여러 상이한 각도에서 영상들을 반복적으로 포착하였다.
실시예 18
통계 분석
2-군 비교의 p 값에 대해 한쪽 꼬리 언페어드(unpaired) 스튜던트 t 테스트에 의해 결과를 분석하였다. 결과는 평균 ± SD로 표현된다.
본 발명의 주제의 다양한 실시양태들이 상세한 설명에서 상기에 기술된다. 이러한 설명들이 상기 실시양태들을 직접적으로 기술하지만, 당업자가 본원에서 제시되고 기술된 구체적인 실시양태들에 대한 변형 및/또는 변경을 생각할 수 있음이 이해된다. 이러한 설명의 범위 내에 속하는 임의의 이같은 변형 또는 변경이 또한 본원에 포함되는 것으로 의도된다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본 발명가들은 적용가능한 기술분야(들)의 당업자에게 통상적이고 익숙한 의미가 명세서 및 청구항 내의 단어 및 구절에 주어지는 것을 의도한다.
본 출원의 출원 시점에 출원인에게 알려진 본 발명의 주제의 다양한 실시양태들의 상기의 설명이 제시되었고, 이는 실례 및 설명의 목적으로 의도된다. 본 명세서는 철저하거나 본 발명의 주제를 개시된 정확한 형태로 한정하도록 의도되지 않으며, 다수의 변형 및 변경이 상기 교시내용의 견지에서 가능하다. 기술된 실시양태들은 본 발명의 주제의 원리 및 이의 실제적인 적용을 설명하고 당업자가 본 발명의 주제를 다양한 실시양태에서, 그리고 구현된 특정 용도에 적합하게 다양하게 변형하면서 활용할 수 있도록 하는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 주제가 이를 수행하기 위해 개시된 특정 실시양태에 한정되지 않도록 의도된다.
본 발명의 대상의 특정 실시양태들이 제시되고 기술되었지만, 본원의 교시내용을 기초로, 이러한 대상 및 이의 더 넓은 측면을 벗어나지 않으면서 변화 및 변형이 이루어질 수 있고, 따라서 첨부된 청구항이 모든 이같은 변화 및 변형을 이러한 주제의 진정한 취지 및 범주 내에 있는 바와 같이 자신의 범주 내에 포함한다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용된 용어는 "개방형" 용어로서 일반적으로 의도된다는 것이 당업자에게 이해될 것이다 (예를 들어, 용어 "포함하는(including)"은 "포함하지만 제한되지는 않음(including but not limited to)"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는(having)"은 "적어도 갖는(having at least)"으로 해석되어야 하며, 용어 "포함하다(includes)"는 "포함하지만 제한되지는 않는다(includes but is not limited to)"로 해석되어야 하는 것 등이다).
참조문헌
Figure 112011019425692-pct00002
Figure 112011019425692-pct00003
Figure 112011019425692-pct00004
Figure 112011019425692-pct00005
Figure 112011019425692-pct00006

Claims (28)

  1. 형광 마커로 염색된 포유동물의 망막의 영상으로부터 염색된 Aβ 펩티드의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하며, 여기서 형광 마커는 쿠르쿠민이고, 상기 영상은 광학 영상화 시스템을 이용하여 생성된 것이며, 상기 영상에서 염색된 Aβ 펩티드가 존재하는 경우 포유동물이 알츠하이머병에 걸린 것을 나타내는 것인, 포유동물에서 알츠하이머병을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 광학 영상화 시스템이 분광계, 형광 현미경, 입체현미경, 수은 아크 램프, 가변 파장 광원, 제논 아크 램프, CCD 게이트(gated) 카메라, 컬러 디지털 카메라, 음향 광학 변조 필터-기반 스펙트럼 영상 획득 시스템, 적응 광학, 영상화 소프트웨어, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 염색을 위해 사용된 쿠르쿠민의 양이 12.0 g 미만 및 7.5 mg 초과인 방법.
  6. 형광 마커로 염색된 대상체의 망막의 영상으로부터 염색된 Aβ 펩티드의 존재를 검출하는 단계이며, 여기서 형광 마커는 쿠르쿠민이고, 상기 영상은 광학 영상화 시스템을 이용하여 생성된 것인 단계; 및
    기존의 진단과 비교하여, 대상체의 망막 내의 염색된 Aβ 펩티드의 증가 또는 감소를 정량하는 단계
    를 포함하며, 여기서 대상체의 망막 내의 염색된 Aβ 펩티드의 수준의 증가는 불량한 예후를 나타내는 것인, 포유동물에서 알츠하이머병을 예후하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제6항에 있어서, 광학 영상화 시스템이 분광계, 형광 현미경, 입체현미경, 수은 아크 램프, 가변 파장 광원, 제논 아크 램프, CCD 게이트 카메라, 컬러 디지털 카메라, 음향 광학 변조 필터-기반 스펙트럼 영상 획득 시스템, 적응 광학, 영상화 소프트웨어, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제6항에 있어서, 염색을 위해 사용된 쿠르쿠민의 양이 12.0 g 미만 및 7.5 mg 초과인 방법.
  11. 형광 마커로 염색된 포유동물의 망막의 영상으로부터 염색된 Aβ 펩티드의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하며, 여기서 형광 마커는 쿠르쿠민이고, 상기 영상은 광학 영상화 시스템을 이용하여 생성된 것인, 포유동물의 망막 내에서 Aβ 펩티드의 존재를 확인하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제11항에 있어서, 광학 영상화 시스템이 분광계, 형광 현미경, 입체현미경, 수은 아크 램프, 가변 파장 광원, 제논 아크 램프, CCD 게이트 카메라, 컬러 디지털 카메라, 음향 광학 변조 필터-기반 스펙트럼 영상 획득 시스템, 적응 광학, 영상화 소프트웨어, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 염색을 위해 사용된 쿠르쿠민의 양이 12.0 g 미만 및 7.5 mg 초과인 방법.
  16. 치료 유효량의 MOG45D를 포함하는, 포유동물에서 알츠하이머병을 치료하기 위한 제약 조성물.
  17. 형광 마커로 염색된 포유동물의 망막의 영상으로부터 염색된 Aβ 펩티드의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하며, 여기서 형광 마커는 쿠르쿠민이고, 상기 영상은 광학 영상화 시스템을 이용하여 생성된 것이며, 포유동물의 망막 내에서 염색된 Aβ 펩티드의 수준이 감소된 경우 알츠하이머병 치료가 유효한 것을 나타내는 것인, 포유동물에서 알츠하이머병 치료의 유효성을 평가하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제17항에 있어서, 광학 영상화 시스템이 분광계, 형광 현미경, 입체현미경, 수은 아크 램프, 가변 파장 광원, 제논 아크 램프, CCD 게이트 카메라, 컬러 디지털 카메라, 음향 광학 변조 필터-기반 스펙트럼 영상 획득 시스템, 적응 광학, 영상화 소프트웨어, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 제17항에 있어서, 염색을 위해 사용된 쿠르쿠민의 양이 12.0 g 미만 및 7.5 mg 초과인 방법.
  22. 치료 유효량의 MOG45D를 포함하는, 포유동물에서 Aβ 펩티드와 관련된 망막 질병을 치료하기 위한 제약 조성물이며, 여기서 Aβ 펩티드와 관련된 망막 질병이 시력 소실, 백내장, 녹내장, 연령-관련 황반 변성, 아밀로이드 플라크가 망막 내에 축적되는 신경변성 상태, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  23. 형광 마커로 염색된 포유동물의 망막의 영상으로부터 염색된 Aβ 펩티드의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하며, 여기서 형광 마커는 쿠르쿠민이고, 상기 영상은 광학 영상화 시스템을 이용하여 생성된 것이며, 포유동물의 망막 내에서 염색된 Aβ 펩티드의 수준이 감소된 경우 Aβ 펩티드와 관련된 망막 질병에 대한 치료가 유효한 것을 나타내는 것인, 포유동물에서 Aβ 펩티드와 관련된 망막 질병의 치료의 유효성을 평가하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 망막 질병이 시력 소실, 백내장, 녹내장, 연령-관련 황반 변성, 아밀로이드 플라크가 망막 내에 축적되는 신경변성 상태, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 제23항에 있어서, 광학 영상화 시스템이 분광계, 형광 현미경, 입체현미경, 수은 아크 램프, 가변 파장 광원, 제논 아크 램프, CCD 게이트 카메라, 컬러 디지털 카메라, 음향 광학 변조 필터-기반 스펙트럼 영상 획득 시스템, 적응 광학, 영상화 소프트웨어, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제23항에 있어서, 염색을 위해 사용된 쿠르쿠민의 양이 12.0 g 미만 및 7.5 mg 초과인 방법.
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