CN102666577A - 诊断阿尔茨海默病或轻度认知损害的新的诊断方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用淀粉样蛋白β的片段的寡聚状态作为生物标记检测和诊断阿尔茨海默病，及进一步涉及确定生物学样品中淀粉样蛋白β的片段的寡聚状态的新方法。

Description

诊断阿尔茨海默病或轻度认知损害的新的诊断方法

发明领域

本发明涉及使用淀粉样蛋白β的片段的寡聚状态作为生物标记检测和诊断阿尔茨海默病，进一步涉及确定生物学样品中淀粉样蛋白β的片段的寡聚状态的新方法。

发明背景

阿尔茨海默病是最常见形式的痴呆，其占所有痴呆性疾病的大约65-70%(Blennow et al.,2006)。作为预期寿命增加的结果，这种疾病在高度发达的工业化国家如日本和中国以及在美国和欧洲已经成为特别关注的问题。据估计阿尔茨海默病患者人数将从2001年的2千4百万增加至2040年的8千1百万(Ferri et al.,2005)。目前在世界范围内治疗和护理AD患者的花费每年为大约2500亿美元。

所述疾病散发形式的进展相对缓慢，且阿尔茨海默病通常在第一个症状出现之后持续大约10-12年。目前非常难以对AD进行可靠及早期诊断并将之与其它形式痴呆区分。可靠性超过90%的良好诊断仅在该疾病的晚期才可行。先前仅能推测可能或大概是阿尔茨海默病；诊断依赖于使用Knopman et al.,2001、Waldemar et al.,2007或Dubois et al.,2007所述的某些标准。然而，在注意到第一个临床症状之前20-30年已经开始发生神经变性(Blennow et al.,2006;Jellinger KA,2007)。临床发病期通常特征在于所谓的“轻度认知损害”(MCI)，患者示出可测的认知缺陷，这不足以能以明确方式诊断痴呆(Petersen et al.,1999;Chetkow et al.,2008)。许多MCI患者具有AD典型的神经病理学改变，这意味着可能是早期阶段AD，但不确定(Scheff et al.,2006;Markesbery et al.,2006;Bouwman et al.,2007)。然而，许多MCI病例不进展为阿尔茨海默病，在这些情况中，其它因素造成认知缺陷(Saito et al.,2007;Jicha et al.,2006和Petersen et al.,2006)。虽然一些MCI患者未示出其病症的任何恶化或者甚至一些改善，但是对于大多数MCI患者而言，认知缺陷将持续进展为临床痴呆。每年这种转变率为大约10-19%(Gauthier et al.,2006;Fischer et al.,2007)。目前有一种组合的临床、神经心理学和成像方法，其能区分轻度认知损害的各种亚型(Devanand et al.,2007;Rossi et al.,2007;Whitwell et al.,2007;Panza et al.,2007)。然而，在这些亚型之间关于痴呆的进一步进展无明显差异(Fischer et al.,2007)。因此，最重要的是开发一种能明确及可靠地在早期阶段、适当地在其发病或MCI期间诊断阿尔茨海默病的方法。

现有技术生物标记

阿尔茨海默病的生物标记已经在现有技术中描述。与熟知的心理学测试如ADAS-cog、MMSE、DemTect、SKT或画钟测试（Clock Drawing test）一起，推测生物标记可改善首次诊断以及监测疾病进展的灵敏性和特异性。关于目前AD/MCI的生物标记的开发状况，已提议将所述疾病的将来与其它诊断标准相关联(Whitwell et al.,2007;Panza et al.,2007;Hyman SE,2007)。推测生物标记在将来会支持传统的神经-心理学测试。通常认为它们将是开发抗阿尔茨海默病药物的非常重要的替代标记(Blennow K,2004;Blennow K,2005;Hampel et al.,2006;Lewczuk et al.,2006;Irizarry MC,2004)。

结构性生物标记

“磁共振成像”(MRI)是一种可以检测脑部退行性萎缩的成像方法(Barnes J et al.,2007;Vemuri et al.,2008)。因此，内侧颞叶(MTA)的萎缩对在老年患者脑部海马区退行性改变敏感；这可以通过MRI非常明确地观测，但是非特异于阿尔茨海默病。轻度MTA在其它痴呆中不更常见(Barkhof etal.,2007)，但是其与MCI相关(Mevel et al.,2007)。由于这个原因而不能单独从MRI数据确定神经变性是阿尔茨海默病还是阿尔茨海默病早期阶段。另一种成像方法是正电子发射计算机断层扫描(PET)，其观测淀粉样沉积物上检测分子(PIB)的积聚。通过硫黄素T-类似物(¹¹C)PIB越来越多地分别积聚在MCI和轻度阿尔茨海默病患者脑部的某些区域中而可以进行检测(Kemppainen et al.,2007;Klunk et al.,2004;Rowe et al.,2007)；遗憾的是这在不具有痴呆的对象中也可检测出(Pike et al.,2007)。这大概示出通过PET检测淀粉样沉积物使得可以检测临床前阶段的阿尔茨海默病，然而，这需要通过进一步的研究证实。除了最常使用的方法MRI和PET之外，还有另外的AD结构性生物标记：CBF-SPECT，CMRg1-PET (葡萄糖代谢质子光谱分析(H-1MRS)，高场强功能性MRI，基于体素的形态测量学(voxel-basedmorphometry)，内侧基底颞叶的增强激活(经用于检测小神经胶质细胞的fMRI,(R)-[(¹¹)C]PK11195PET检测(Huang et al.,2007;Kantarci et al.,2007;Petrella et al.,2007;Hamalainen et al.,2007;Kircher et al.,2007;Kropholler etal.,2007)。

CSF生物标记

老年斑(Senile plaques)是阿尔茨海默病的病理学特征之一。这些斑主要由Aβ(1-42)肽组成(Attems J,2005)。在一些研究中，可以示出在MCI患者的CSF中低水平的Aβ(1-42)与阿尔茨海默病进程中的进一步发展特别相关(Blennow and Hampel,2003;Hansson et al.,2006和2007)。CSF减少可能是由于脑中Aβ(1-42)增强的积聚所致(Fagan et al.,2006;Prince et al.,2004;Strozyk et al.,2003)。另一种可能是半溶解的Aβ(1-42)寡聚体的出现(Walsh etal.,2005)，其可以导致CSF中较低水平的检测。特别是在阿尔茨海默病早期阶段中，检测到Aβ(1-42)浓度降低，同时可以检测到CSF中Tau蛋白和磷酸-tau蛋白量分别增加(Ewers et al.,2007;Lewczuk et al.,2004)。为了提供更好的生物标记可预测性，通常尝试使用Tau/Aβ(1-42)比率，并使其与不具有痴呆的老年人(Fagan et al.,2007;Gustafson et al.,2007;Hansson et al.,2007;Li et al.,2007;Stomrud et al.,2007)以及MCI患者(Hampel et al.,2004;Maccioni et al.，2006;

et al.,2007)中的认知缺陷预测相关联。脑中Aβ(1-42)、Tau、磷酸-Tau-Thr231的死前CSF水平与死后组织病理学改变之间的进一步相关性可以在AD患者中检测到(Clark et al.,2003;Buergeret al.,2006)。然而，在其它研究中，可以检测到在尸检后CSF生物标记和Aβ(1-42)、总Tau及磷酸-Tau与APOEε4-等位基因、斑和缠结负载（tangleload）无相关性(Engelborghs et al.,2007;Buerger et al.,2007)。在多中心研究中检测到令人感兴趣的方面。其示出总Tau和磷酸-Tau(181)的水平增加与Aβ(1-42)/Aβ(1-40)比率降低相关，但是与单独的Aβ(1-42)不相关(Wiltfang etal.,2007)。然而，在其它的CNS疾病如Creutzfeldt-Jakob病、脑梗塞和脑血管性痴呆中也检测到CSF Tau水平增加，其与神经元丧失均相关(Buergeret al.,2006(2);Bibl et al.,2008)。另一种可能的生物标记是CSF中BACE1活性增加作为MCI的指征(Zhong et al.,2007)。该研究还论述了增加的BACE1活性将导致Aβ产生增加及因此所述肽的聚集增加。阿尔茨海默病伴随神经炎症过程。CSF抗小胶质细胞抗体因此是AD中这些炎症过程的可能的生物标记(McRea et al.,2007)。

尽管推测许多生物标记能早期诊断阿尔茨海默病，但是无一种生物标记保证可靠且明确诊断。这通常是由于大多数研究使用各自的生物标记和临床诊断对比。更好的方法是使生物标记与阿尔茨海默病的病理学因素相关联。

一种可能的方法是重复分析经明确鉴别及定义的神经病理学痴呆疾病的免疫沉淀的CSF样品以澄清Aβ(1-40)和Aβ(1-42)是否是合适的神经化学性痴呆标记(Jellinger et al.,2008)。为了揭示新的迄今为止未知的阿尔茨海默病的生物标记，通常通过对比性蛋白质组分析分析CSF样品，这样可以增强的灵敏性诊断AD，也能与其它退行性痴呆疾病区分(Finehout et al.,2007;Castano et al.,2006;Zhang et al.,2005;Simonsen et al.,2007;Lescuyer et al.,2004;Abdi et al.,2006)。在蛋白质组分析之后，应详细分析潜在的新的生物标记的适合性及与病理学因素的相关性。通过蛋白质组分析发现的生物标记的一个典型实例是截短的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C，其作为多发性硬化症的生物标记；这个生物标记随后被证实是储存假象（storage artefact）(Iraniet al.,2006;Hansson et al.,2007(2))。

血浆生物标记

除了常用的血浆生物标记即Aβ肽之外，另外的炎症性血浆标记也用于痴呆的早期诊断(Ravaglia et al.,2007;Engelhart et al.,2004)，特别用于阿尔茨海默病的诊断(Motta et al.,2007)。所有这些标记仍处于讨论中。通过来自AD患者和健康对照的血浆的对比性蛋白质组分析也发现了其它可能的生物标记(German et al.,2007;Ray et al.,2007)。未来还将示出这些生物分子是否确实特异于阿尔茨海默病及是否适合作为生物标记。还没有确信或合适的数据示出上述任何生物标记的特异性或适合性。

与分析CSF中淀粉样蛋白β相反，迄今为止关于血浆中合适的Aβ生物标记的结果不可靠或者不明确。在一些研究中，发现血浆中Aβ(1-42)/Aβ(1-40)比率降低与认知功能正常人向MCI或阿尔茨海默病患者转化增强之间的相关性((Graff-Radford et al.,2007;van Oijen et al.,2006;Sundelof et al.,2008)。然而，其它研究检测到Aβ(1-42)血浆水平降低更可能是从MCI转变为AD的标记(Song et al.,2007)，不适合作为阿尔茨海默病的神经变性目的的标记(Pesaresi et al.,2006)。然而，大多数研究未示出健康对照个体与散发性阿尔茨海默病患者之间Aβ血浆水平中的差异(Fukumoto etal.,2003;Kosaka et al.,1997;Scheuner et al.,1996;Sobow et al.,2005;Tamaoka et al.,1996;Vanderstichele et al.,2000)。一些研究还示出血浆中Aβ水平与在脑中的水平不相关(Fagan et al.,2006;Freeman et al.,2007)，与在CSF中的水平也不相关(Mehta et al.,2001;Vanderstichele et al.,2000)。在最近的研究中，检测到CSF和血浆之间Aβ(1-40)与Aβ(1-42)的相关性，但是只是在健康对照中。这种相关性在MCI和AD中不可检测到，这通过由于Aβ沉积在脑中导致CSF与血浆Aβ之间平衡被破坏而解释(Giedraitis et al.,2007)。通常，假设血浆Aβ(1-42)水平不是MCI或AD的可靠生物标记(Blaskoet al.,2008;Mehta et al.,2000;Brettschneider et al.,2005)，而血浆Aβ(1-38)/Aβ(1-40)比率降低被认为是血管性痴呆的生物标记，且有可能成为预测CSF标记(Bibl et al.,2007)。

迄今为止，未考虑Aβ寡聚体作为阿尔茨海默病的生物标记，然而推测其在起动神经变性进程中起决定性作用(Walsh & Selkoe,2007)。在一些研究中，示出8kDa的Aβ二聚体对于100kDa以上的初原纤维点（point ofprotofbrils）的神经毒性作用(Lambert et al.,1998;Walsh et al,2002;Keayedet al.,2004;Cleary et al.,2005)。此外，这种Aβ寡聚体在人体液中发现(Pitschke et al.,1998;Santos et al.,2007;Klyubin et al.,2008)。除了其神经毒性之外，寡聚体对确定人样品中Aβ浓度也有影响。寡聚体化导致Aβ肽的C末端表位被掩蔽(Roher et al.,2000)，导致通过C末端特异性ELISA检测到的Aβ水平被低估(Stenh et al.,2005)。因此，样品中Aβ寡聚体的存在导致ELISA信号降低。这对于精确确定Aβ浓度是一个问题，然而，这个事实也提供了测量生物学样品中寡聚体的量和寡聚体化水平的机会。本文展示的数据令人惊奇地证实Aβ寡聚体的含量可以通过在所述寡聚体解聚之前和之后测量ELISA信号而间接确定。这两个数值的比率反映出人血浆中可溶Aβ寡聚体的浓度与寡聚体化水平。与本发明无关，最近公布了一种相似的方法(Englund et al.,2009)。他们通过在非变性条件下通过ELISA及在变性条件下使用SDS-PAGE及随后的Western印迹分析测量Aβ1-42浓度确定人CSF样品中Aβ1-42寡聚体比率。然而，这种间接确定寡聚体水平的方法具有一些关键问题：

1.SDS-PAGE不能完全解聚Aβ1-42。我们的经验也示出SDS凝胶上的反映Aβ三聚体和四聚体的条带。

2.通过ELISA和通过Western印迹对比Aβ浓度是有缺陷的。

另一种更常见的方法是直接测定Aβ寡聚体。然而，这种方法、特别是用寡聚体血浆Aβ作为生物标记，由于Aβ肽是极其疏水性的，因此这种方法非常难以建立。目前描述的测定系统使用在ELISA系统中Aβ寡聚体特异性抗体(Englund et al.,2007;Schupf et al,2008)。然而，基于这种寡聚体特异性抗体的ELISA的使用具有与传统的AβELISA系统相同的问题。所述方法仅达到非常不令人满意的分析灵敏性，且遇到与分析物与基质即血浆之间非常复杂的相互作用的严重问题。通常，ELISA或ELISA-型系统(Multiplex)用于量化血浆中Aβ，及最近也用于量化Aβ寡聚体。这种检测系统的说明书通常仅被不令人满意地分析或者被完全忽视。例如，关键项目如回收速率未被分析或者在出版物中未提及。然而，回收速率是提供血浆中存在的这些Aβ肽或寡聚体的完整图像的决定性因素。研究之间的差异也可以得自这些速率中的差异。ELISA或多元系统的另一重要特征是其线性。因此，确定的血浆中分析物的浓度应仅非常低程度或者根本不依赖于测量中使用的稀释度。然而，这对于量化血浆中Aβ的ELISA是不可能的，对于多元系统也是不可能的。因此，计算的稀释1-20倍的血浆Aβ(1-42)浓度之间的差异比稀释1-2倍的相同样品高3倍(Hansson et al.,2008)。这个实例单独示出在一些研究中使用不同稀释度的血浆样品使得不可以进行对比。

因此，本发明的一个目的是提供可以高可靠性地确定、特别是血浆中的寡聚Aβ的新方法。本发明也使用Aβ寡聚体的间接测量法，然而与现有技术相反，使用Aβ特异性ELISA确定这两个值(在变性和非变性条件下)，以保证可对比性。由于分离单体及寡聚体形式的Aβ肽的最开始的免疫沉淀步骤，随后是我们的新解聚方法，因此随后的ELISA不受回收和/或线性问题的限制。

此外，本发明目的在于提供诊断标记，其可用可靠方法确定并且可用于阿尔茨海默病的可靠及明确的预测。

发明概述

根据本发明的第一方面，提供了一种诊断或监测神经变性疾病如阿尔茨海默病和轻度认知损害的方法，所述方法包括确定来自检测对象的生物学样品中靶淀粉样β肽(Abeta或Aβ)的寡聚状态，特征在于所述方法包括如下步骤：

(a)确定生物学样品中靶Aβ肽的第一浓度(c_a)；

(b)解聚来自步骤(a)的靶Aβ肽；

(c)确定解聚的Aβ肽的第二浓度(c_d)；及

(d)确定c_d/c_a比率，其中将第二浓度(c_d)的值除以第一浓度c_a的值；其中c_d/c_a比率低于1.5是神经变性疾病的阳性诊断的指征。

根据本发明的第二方面，提供了一种确定生物学样品中靶淀粉样β肽(Abeta或Aβ)的寡聚状态的方法，所述方法包括如下步骤：

(a)确定生物学样品中靶Aβ肽的第一浓度(c_a)；

(b)解聚来自步骤(a)的靶Aβ肽；

(c)确定解聚的Aβ肽的第二浓度(c_d)；及

(d)确定c_d/c_a比率，其中将第二浓度(c_d)的值除以第一浓度c_a的值；其中c_d/c_a比率超过1是存在寡聚Aβ的指征。

定义

如本文所用，“寡聚”是指限定数目的聚集的Aβ肽单体单位。举例的这种寡聚体包括二聚体、三聚体和四聚体。术语“解聚”是指寡聚形式的Aβ肽转变为单体形式Aβ肽的过程。

在本申请中“捕获抗体”是指涵盖结合靶Aβ肽的那些抗体。

所述捕获抗体适当地以高亲和性结合所述靶Aβ肽。在本发明中，高亲和性是指亲和性的K_D值为10^-7M或更好，如K_D值为10^-8M或更好，甚至更特别地K_D值为10^-9M至10^-12M。

术语“抗体”以其最广泛的含义使用，特别涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及呈现出希望的生物学活性的抗体片段。所述抗体可以例如是IgM、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgD、IgA或IgE。然而适当地，所述抗体不是IgM抗体。所述“希望的生物学活性”是指结合靶Aβ肽。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。举例的抗体片段包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段：双抗体，单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自一群基本上均质抗体的抗体，即所述抗体群中包含的各个抗体除了可能以少量存在的可能天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体是高特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的“多克隆抗体”制备物相反，每个单克隆抗体均针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体通常是有利的，因为其通过杂交瘤培养合成，不被其它免疫球蛋白污染。“单克隆”是指得自基本上均质抗体群的抗体的特征，且不需要通过任何特别方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由

et al.,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过通常熟知的重组DNA方法产生。“单克隆抗体”也可以分离自噬菌体抗体文库，使用如Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks etal.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述技术进行。

本文的单克隆抗体特别包括嵌合抗体(免疫球蛋白)以及这种抗体的呈现希望的生物学活性的片段，其中嵌合抗体的重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。

“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或者抗体的其它抗原结合子序列)，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自该受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的具有希望的特异性、亲和性和容量(capacity)的CDR的残基置换。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基由相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体及在输入的CDR或构架序列中未发现的残基。

进行这些修饰以进一步改善和优化抗体性能。通常，人源化抗体包含基本上所有的至少一个及典型两个可变结构域，其中所有或者基本上所有CDR区相应于非人免疫球蛋白的那些区域及所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些区域。人源化抗体最佳还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型为人免疫球蛋白的。进一步的详细描述见Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)、Reichmann et al,Nature.332:323-329(1988)及Presta,Curr.Op.Struct.Biel.,2:593-596(1992)。人源化抗体包括Primatized^TM抗体，其中所述抗体的抗原结合区衍生自通过用感兴趣的抗原免疫恒河猴产生的抗体或者“骆驼源化(camelized)”抗体。

“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链内。通常，Fv多肽进一步包含在V_H与V_L结构域之间的多肽接头，其使得sFv形成希望的结构以进行抗原结合。关于sFv的综述见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。

术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含重链可变结构域(V_H)，其在同一多肽链中与轻链可变结构域(V_D)连接(V_H-V_D)。通过使用太短以至于不能使同一链上两个结构域之间配对的接头，使得所述结构域与另一链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双抗体在Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sol.USA,90:6444-6448(1993)中更详细地描述。

“分离的”抗体是已经从其天然环境成分中被鉴别及分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是干扰所述抗体的诊断或治疗应用的材料，可包括酶、激素及其它蛋白质样或非蛋白质样溶质。在合适的实施方案中，所述抗体被纯化为：(1)通过Lowry方法确定，大于抗体的95%重量，及更特别大于99%重量，(2)足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，通过使用旋转杯测序仪分析，或者(3)通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下均质，使用考马斯蓝或者适当地银染色进行。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为不存在所述抗体的天然环境的至少一种成分。然而，通常分离的抗体是通过至少一个纯化步骤制备的。

如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”及“细胞培养物”可互换使用，且这些命名均包括后代。因此，用语“转化体”和“转化细胞”包括最初的目标细胞及衍生自其的培养物，而无关乎转化次数。也应理解所有后代在DNA含量方面由于有意或无意的突变而可以不完全相同。包括在原始的转化细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的突变后代。在进行确切命名的情况中将更加清晰。

如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，定义为是指由通过肽键连接的氨基酸组成的生物分子。

如本文所用，术语“一个”和“所述”被定义为是指“一或多个”，及还包括多个，除非语境不当。

“淀粉样蛋白β、Aβ或β淀粉样蛋白”是本领域公认术语，指淀粉样β蛋白和肽，淀粉样β前体蛋白(APP)以及其修饰物、片段及任何功能等价物。特别地，如本文所用，淀粉样蛋白β是指通过APP的蛋白酶解产生的任何片段，但特别是参与或者与淀粉样病变相关的那些片段，包括但不限于SEQ ID NO.3的Aβ(1-38)，SEQ ID NO.2的Aβ(1-40)及SEQ ID NO.1的Aβ(1-42)。

在本发明中，“淀粉样蛋白β的片段”是所有淀粉样β肽，包括SEQ IDNO.13的核心淀粉样蛋白β片段Aβ.(3-38)，对于本发明更合适的是所有淀粉样β肽，其包含SEQ ID NO.19的核心淀粉样蛋白β片段Aβ_(11-38)。这种Aβ.片段包含SEQ ID NO.19的Aβ.(11-38)的氨基酸序列，特别是Aβ._(x-y)片段，其已经示出由于神经变性疾病如阿尔茨海默病和轻度认知损害的结果而积聚在对象体内。

其中：

x定义为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的整数，

优选地，x是选自1、2、3和11的整数。

更优选地，x是1。

甚至更优选地，x是11。

y定义为选自38、39、40、41、42和43的整数。

优选地，y是38、40或42，如40或42。

更优选地，y是40.

甚至更优选地，y是38。

关于Aβ.(x-y)片段的合适实例是：

Aβ.(1-38)(SEQ ID NO.3)

Aβ.(1-39)(SEQ ID NO.4)

Aβ.(1-40)(SEQ ID NO.2)

Aβ.(1-41)(SEQ ID NO.5)

Aβ.(1-42)(SEQ ID NO.1)

Aβ.(1-43)(SEQ ID NO.6)

Aβ.(2-38)(SEQ ID NO.7)

Aβ.(2-39)(SEQ ID NO.8)

Aβ.(2-40)(SEQ ID NO.9)

Aβ.(2-41)(SEQ ID NO.10)

Aβ.(2-42)(SEQ ID NO.11)

Aβ.(2-43)(SEQ ID NO.12)

Aβ.(3-38)(SEQ ID NO.13)

Aβ.(3-39)(SEQ ID NO.14)

Aβ.(3-40)(SEQ ID NO.15)

Aβ.(3-41)(SEQ ID NO.16)

Aβ.(3-42)(SEQ ID NO.17)

Aβ.(3-43)(SEQ ID NO.18)

Aβ._(11-38)(SEQ ID NO.19)

Aβ.(11-39)(SEQ ID NO.20)

Aβ.(11-40)(SEQ ID NO.21)

Aβ.(11-41)(SEQ ID NO.22)

Aβ.(11-42)(SEQ ID NO.23)，及

Aβ.(11-43)(SEQ ID NO.24)。

“功能等价物”涵盖Aβ.(x-y)的所有那些突变体或变体，其可以是在已经被选择进行本发明所述的检测方法或诊断方法的患者群中天然发生的。更特别地，在本文中“功能等价物”是指Aβ(x-y)的功能等价物是其突变体或变体且已经示出积聚在阿尔茨海默病中。所述功能等价物与各自的Aβ.(x-y)肽相比具有不超过30个，如20个、例如10个、特别是5个及更特别是2个或仅1个突变。功能等价物还涵盖突变的变体，其包含例如以氨基酸Asp-Ala-Glu开始及分别以Gly-Val-Val和Val-Ile Ala结束的所有Aβ.肽。

在本发明中特别有用的等价物是Aβ.(1-40)(SEQ ID NO.2)和Aβ.(1-42)(SEQ ID NO.1)的那些等价物，其是由Irie et al.,2005描述的那些，即Aβ.的Tottori、Flemish、Dutch、Italian、Arctic和Iowa突变。功能等价物还包含衍生自淀粉样蛋白前体蛋白的Aβ肽，其携带紧邻β..-或γ-分泌酶裂解位点的突变，如Swedish、Austrian、French、German、Florida、London、Indiana和Australian改变(Irie et al.,2005)。

“修饰的淀粉样蛋白β、Aβ或者β淀粉样蛋白”涵盖在的淀粉样β蛋白质和肽、淀粉样蛋白β前体蛋白(APP)、其片段和功能等价物中各个氨基酸位置的所有修饰。可用于本发明中的是在所述淀粉样β蛋白和肽、淀粉样β前体蛋白(APP)、片段和功能等价物的N和/或C末端氨基酸的修饰。特别有用的是在谷氨酰胺和谷氨酸残基的修饰，如N末端谷氨酰胺或谷氨酸残基环化为焦谷氨酸。本发明适当的实例是SEQ ID No.13-24的淀粉样β肽，其在N末端以谷氨酸残基开始，其中所述N末端谷氨酸残基被修饰为焦谷氨酸。更有用的是在天冬氨酸残基的修饰，如天冬氨酸转变为异天冬氨酸。本发明适当的实例是SEQ ID No.1-6的淀粉样β肽，其中在氨基酸位置1和/或7的天冬氨酸残基转变为异天冬氨酸。进一步适当的实例是SEQID No.7-12的淀粉样β肽，其中在氨基酸位置6的天冬氨酸残基转变为异天冬氨酸。此外，适当的实例是SEQ ID No.13-18的淀粉样β肽，其中在氨基酸位置5的天冬氨酸残基转变为异天冬氨酸。

“夹心ELISA”通常包括使用两种抗体，每种抗体均能结合被检测的蛋白质的不同的免疫原性部分或者表位。在夹心测定中，检测样品分析物由固定在固体支持物上的第一抗体结合，之后第二抗体结合该分析物，因此形成不溶的三部分复合物。第二抗体自身可用可检测部分标记(直接夹心测定)或者可以使用用可检测部分标记的抗免疫球蛋白抗体测量(间接夹心测定)。例如，一种合适类型的夹心测定是ELISA测定，其中所述可检测部分是酶。

附图简述

图1：二价免疫沉淀系统改善捕获效率

(A)通过使用不同抗体组合从Cyp18溶液和人血浆回收Aβ1-40。

(B)二价捕获系统示意图(阴影：4G8抗体；灰色：x-40抗体；黑色：与磁珠缀合的抗小鼠抗体)。

图2：确定衍生自人血浆的Aβ肽的寡聚状态

在解聚之后确定的浓度与未解聚确定的浓度的比率反映Aβ(1-40/42)的寡聚状态。

图3：DemTect测试

通过DemTect评分获得的在AD患者和健康对象中分类差异结果的平均值(平均值±SD)(I组：18–30岁，II组：31-45岁；III组：46-65岁)。

图4：简易精神状态测试(Mini-Mental-State Test)

通过简易精神状态测试获得的在AD患者和健康对象中分类差异结果的平均值(平均值±SD)(I组：18–30岁，II组：31-45岁；III组：46-65岁)。

图5：画钟测试(Clock-Drawing Test)

通过画钟测试获得的在AD患者和健康对象中分类差异结果的平均值(平均值±SD)(I组：18–30岁，II组：31-45岁；III组：46-65岁)。

图6：寡聚状态的平均值，AD组对比对照组的T-检验。

**T-检验,p<0.01；***T-检验,p<0.001

图7：反映血浆中总体寡聚量的Aβ(1-40)+Aβ(1-42)的寡聚状态。

发明详述

根据本发明的第一个方面，提供了一种诊断或监测神经变性疾病如阿尔茨海默病和轻度认知损害的方法，所述方法包括确定来自检测对象的生物学样品中靶淀粉样β肽(Abeta或Aβ)的寡聚状态，其特征在于所述方法包括如下步骤：

(a)确定生物学样品中靶Aβ肽的第一浓度(c_a)；

(b)解聚来自步骤(a)的靶Aβ肽；

(c)确定解聚的Aβ肽的第二浓度(c_d)；及

(d)确定c_d/c_a比率，其中将第二浓度(c_d)的值除以第一浓度c_a的值；其中c_d/c_a比率低于1.5是神经变性疾病的阳性诊断结果的指征。

本文呈现的数据令人惊奇地证实当与对照患者相比时在阿尔茨海默病患者中Aβ的寡聚状态显著降低。因此，Aβ的寡聚状态看起来可以可靠及明确的预测阿尔茨海默病。(c_d/c_a)的比率为1.0提示在样品中无寡聚体。较高比率的c_d/c_a(即比率>1.0)反映出样品中存在较多量的寡聚体或者更紧密的寡聚体(表位可及性较低)。已经发现c_d/c_a的比率低于1.5(即比率在1.0-1.5之间)，如低于1.4、低于1.3、低于1.2、低于1.1或者低于1.05是神经变性疾病如阿尔茨海默病的阳性诊断结果的指征。

在本发明的另一实施方案中，提供了诊断或监测神经变性疾病如阿尔茨海默病和轻度认知损害的方法，所述方法包括确定来自检测对象的生物学样品中靶淀粉样Aβ肽(Abeta或Aβ)的寡聚状态，其特征在于所述方法包括如下步骤：

(a)确定生物学样品中靶Aβ肽的第一浓度(c_a)；

(b)解聚来自步骤(a)的靶Aβ肽；

(c)确定解聚的Aβ肽的第二浓度(c_d)；及

(d)将c_d和c_a的值相加，其中c_d与c_a的和低于3.0是神经变性疾病的阳性诊断结果的指征。

已经发现c_d与c_a的和低于2.9、低于2.8、低于2.7、低于2.6、低于2.5、低于2.4或者低于2.3是神经变性疾病如阿尔茨海默病的阳性诊断结果的指征。

在几乎所有研究中，通过由捕获抗体和检测抗体组成的夹心ELISA系统确定步骤(a)和(c)中靶Aβ肽的浓度。与抗体(150kDa)的大小相比，Aβ肽(4.5kDa)作为单体是非常小的。由于肽的聚集倾向，它们趋于形成寡聚体，初原纤维形成原纤维点。在这种聚集物内，Aβ单体紧密填充，结果是由于位阻或表位不可及性而导致不是所有单体均可以由检测抗体结合。检测的寡聚体Aβ浓度低于单体的。这将导致在血浆和CSF中低估的Aβ水平。测量的浓度与真实的浓度之间的矛盾取决于寡聚体的量及其密集性。相反，Aβ聚集物的量或者更精确地负荷表位（burden epitopes）的量可以通过对比在存在寡聚体条件下检测的浓度与在寡聚体完全解聚为单体之后的浓度而确定。该方法的原理在图2中示出。

在一个实施方案中，解聚步骤(b)包括使用碱。在另一个实施方案中，用于步骤(b)中解聚的碱是氢氧化钠，如500mM氢氧化钠。使用碱及特别是强碱如氢氧化钠的优势是实现更有效的解聚。例如，获得较高比率的单体，无可观测数量的二聚体、三聚体或者四聚体。

在一个实施方案中，解聚步骤(b)另外包括使用合适的溶剂，如甲醇，例如50%(v/v)甲醇。

在一个实施方案中，解聚步骤(b)包括保温步骤。在另一个实施方案中，保温步骤包括在室温保温至少2分钟。在另一个实施方案中，所述保温步骤包括在室温保温至少10分钟。

在通过β-和γ-分泌酶相继裂解之后，Aβ肽从淀粉样蛋白前体蛋白(APP)中释出。γ分泌酶裂解导致主要的Aβ(1-40)和Aβ(1-42)肽产生，但是显然在位置38或43结束，其在C末端不同，且呈现出不同的聚集、原纤维形成及神经毒性等效力。同样，β-分泌酶释放可产生不同的N末端及随后由肽酶及其它酶修饰，获得主要种类，如在如2、3、4和11位置开始的Aβ肽，而在谷氨酸3和11位置开始的种类可以被转化为焦谷氨酸，使得这些肽是特别疏水性的并且具有快速聚集的倾向(Schilling et al,2004;Piccini et al.,2005;Schilling et al,2006;Schlenzig et al,2009)。Aβ的这种C-和N-末端变体可作为Aβ(1-40)和Aβ(1-42)肽的功能等价物。

本发明因此提供了确定Aβ(x-y)肽的寡聚状态的方法，其中x和y如上文定义。

因此，根据上述方法的一个实施方案，被确定的靶Aβ肽的寡聚状态选自如下组中：

Aβ.(1-38)(SEQ ID NO.3)，

Aβ.(1-39)(SEQ ID NO.4)，

Aβ.(1-40)(SEQ ID NO.2)，

Aβ.(1-41)(SEQ ID NO.5)，

Aβ.(1-42)(SEQ ID NO.1)，

Aβ.(1-43)(SEQ ID NO.6)，

Aβ.(2-38)(SEQ ID NO.7)，

Aβ.(2-39)(SEQ ID NO.8)，

Aβ.(2-40)(SEQ ID NO.9)，

Aβ.(2-41)(SEQ ID NO.10)，

Aβ.(2-42)(SEQ ID NO.11)，

Aβ.(2-43)(SEQ ID NO.12)，

Aβ.(3-38)(SEQ ID NO.13)，

Aβ.(3-39)(SEQ ID NO.14)，

Aβ.(3-40)(SEQ ID NO.15)，

Aβ.(3-41)(SEQ ID NO.16)，

Aβ.(3-42)(SEQ ID NO.17)，

Aβ.(3-43)(SEQ ID NO.18)，

Aβ_11-38)(SEQ ID NO.19)，

Aβ.(11-39)(SEQ ID NO.20)，

Aβ.(11-40)(SEQ ID NO.21)，

Aβ.(11-41)(SEQ ID NO.22)，

Aβ.(11-42)(SEQ ID NO.23)，及

Aβ.(11-43)(SEQ ID NO.24)。

在一个特殊的实施方案中，被检测的靶Aβ肽的寡聚状态是Aβ(1-40)(SEQ ID No:2)。

在一个特殊的实施方案中，被检测的靶Aβ肽的寡聚状态是Aβ(1-42)(SEQ ID No:1)。

在一个特殊的实施方案中，被检测的靶Aβ肽的寡聚状态是Aβ(1-40)(SEQ ID No:2)和Aβ(1-42)(SEQ ID No:1)。本文呈现的数据证实Aβ(1-40)与Aβ(1-42)肽总和的适合性，其中已经示出这两种寡聚状态的总和改善诊断的显著性。

在一个特殊的实施方案中，被检测的靶Aβ肽的寡聚状态是选自SEQ IDNO:13-24的至少一种Aβ肽，其以在N末端的谷氨酸残基起始。

在一个特殊的实施方案中，被检测的靶Aβ肽的寡聚状态是Aβ(3-38)(SEQ ID No:13)。

在一个特殊的实施方案中，被检测的靶Aβ肽的寡聚状态是Aβ(11-38)(SEQ ID No:19)。

在另一个特殊的实施方案中，被检测的靶Aβ肽的寡聚状态是选自SEQID NO:13-24的至少一种Aβ肽，其中在这些肽N末端的谷氨酸残基被环化为焦谷氨酸。

在另一个特殊的实施方案中，被检测的靶Aβ肽的寡聚状态是选自SEQID No.1-6的至少一种Aβ肽，其中在氨基酸位置1和/或7的天冬氨酸残基被转变为异天冬氨酸。

更特别地，被检测的靶Aβ肽的寡聚状态是选自SEQ ID No.7-12的至少一种Aβ肽，其中在氨基酸位置6的天冬氨酸残基被转变为异天冬氨酸。

更特别地，被检测的靶Aβ肽的寡聚状态是选自SEQ ID No.13-18的至少一种Aβ肽，其中在氨基酸位置5的天冬氨酸残基被转变为异天冬氨酸。

应意识到确定Aβ的寡聚状态的方法构成了本发明的另一方面，其涉及新的及有创造性的测定，其非必需限于诊断神经变性疾病如阿尔茨海默病。因此，根据本发明的第二个方面，提供了一种确定生物学样品中靶淀粉样β肽(Abeta或Aβ)的寡聚状态的方法，所述方法包括如下步骤：

(a)确定生物学样品中靶Aβ肽的第一浓度(c_a)；

(b)解聚来自步骤(a)的靶Aβ肽；

(c)确定解聚的Aβ肽的第二浓度(c_d)；及

(d)确定c_d/c_a比率，其中将第二浓度(c_d)的值除以第一浓度c_a的值；其中c_d/c_a比率超过1是存在寡聚Aβ的指征。

在一个实施方案中，解聚步骤(b)包括使用如前文定义的碱。

在一个实施方案中，在步骤(a)和(c)中确定靶Aβ肽的第一浓度和第二浓度的方法包括：

i)将生物学样品与至少两种捕获抗体接触，

ii)检测所得免疫复合物，

iii)破坏所述免疫复合物，及

iv)量化捕获的Aβ肽。

在一个实施方案中，量化步骤(iv)包括在Aβ特异性ELISA中分析。在另一个实施方案中，所述Aβ特异性ELISA是夹心-ELISA。在一个实施方案中，步骤(a)和(c)均包含用Aβ特异性ELISA分析。这个实施方案提供了使得可以对比在步骤(a)和(c)中获得的第一浓度和第二浓度的优势。

在一个实施方案中，生物学样品选自血液、血清、尿液、脑脊液(CSF)、血浆、淋巴、唾液、汗液、胸膜液、滑膜液、泪液、胆汁和胰腺分泌物。在另一个实施方案中，生物学样品是血浆。

生物学样品可以本领域技术人员熟知的方式得自患者。特别地，血液样品可得自对象，且血液样品可通过常规方法分离成血清和血浆。从中获得生物学样品的对象怀疑患有阿尔茨海默病，处于发生阿尔茨海默病的风险中和/或处于其它类型痴呆风险中或具有其它类型痴呆。

特别地，所述对象是怀疑患有轻度认知损害(MCI)和/或处于早期阿尔茨海默病的对象。

本发明的方法具有优于本领域已知方法的几个优势，即本发明的方法可用于检测阿尔茨海默病早期阶段以及在疾病发生和进展的早期区分阿尔茨海默病与其它类型痴呆。一种可能的早期阶段是轻度认知损害(MCI)。使用本领域目前已知的方法还不能明确及可靠地诊断早期阿尔茨海默病，及特别不能在所述早期阶段区分阿尔茨海默病的发生与其它形式痴呆。这种方法特别用于患有MCI的患者。

相反，本发明提供的方法适于区分性诊断阿尔茨海默病。特别地，本发明提供了一种方法，其中可以在得自任何上述对象的生物学样品中以高度可再现形式检测靶Aβ肽的寡聚状态。本发明方法的高度可再现性通过在最初的免疫沉淀步骤(步骤(a))中使用至少两种不同的捕获抗体实现，所述免疫沉淀步骤与在随后步骤(c)中使用的方法相同。在一个实施方案中，有至少两种不同的捕获抗体针对靶Aβ肽的不同表位。

在一个实施方案中，生物学样品是血浆。

上述“靶Aβ肽”涵盖如前文定义的Aβ(x-y)。

本发明必须克服的一个特殊问题是使用的生物标记在阿尔茨海默病早期阶段中例如在轻度认知损害期间是被改变的。本发明人已经示出可以可靠方式确定靶Aβ肽的寡聚状态，且也首次更明确地指出事实上Aβ(x-y)的寡聚状态特别适于诊断早期发作的阿尔茨海默病。

在步骤(a)和(c)中确定靶Aβ肽的第一浓度和第二浓度的方法特别包括如下步骤：

i)在免疫沉淀步骤中将生物学样品与至少两种不同的捕获抗体接触。

在将生物学样品与前述至少两种不同的捕获抗体接触之后，在所述至少两种不同的捕获抗体与靶Aβ肽之间形成免疫复合物。这个步骤不特异性分离全长Aβ(x-y)，其中x是1，而是捕获和分离所有Aβ种类，特别是在38、40和/或42位置结束的。

ii)然后通过二抗检测这个复合物。适当地，将所述二抗固定在磁珠上。使用磁性分离器，可容易地将所述免疫复合物与磁珠一起与体液(血浆/血清、CSF等)分离。

iii)将所述免疫复合物从所述珠中洗脱。适当地，洗脱步骤通过将携带所述免疫复合物的珠在包含50%甲醇/0.5%甲酸的溶液中在室温保温1小时。从而所有分子间相互作用被破坏，分离自生物学样品的所有Aβ肽分子从溶液中的珠中释出。

iv)将释出的分离的Aβ肽在随后的步骤中量化，例如通过夹心ELISA量化，其特异性检测全长(x-y)，其中这个步骤中全长Aβ(x-y)最适当地是指Aβ(1-40)和Aβ(1-42)。

适用于本发明中的进行免疫沉淀的可能抗体是如下抗体，但是本发明不限于这些特别的实例：

3D6，表位:1-5(Elan Pharmaceuticals，Innogenetics)

pAb-EL16，表位:1-7

2H4，表位:1-8(Covance)

1E11，表位:1-8(Covance)

20.1，表位:1-10(Covance，Santa Cruz Biotechnology)

兔抗-Aβ多克隆抗体，表位:1-14(Abcam)

AB10，表位:1-16(Chemicon/Upstate-part of Millipore)

82E1，表位:1-16(IBL)

pAb 1-42，表位:1-11

NAB228，表位:1-11(Covance，Sigma-Aldrich，Cell Signaling，Santa CruzBiotechnology，Zymed/Invitrogen)

DE2，表位:1-16(Chemicon/Upstate-part of Millipore)

DE2B4，表位:1-17(Novus Biologicals，Abcam，Accurate，AbD Serotec)

6E10，表位:1-17(Signet Covance，Sigma-Aldrich)

10D5，表位:3-7(Elan Pharmaceuticals)

WO-2，表位:4-10(The Genetics Company)

1A3，表位5-9(Abbiotec)

pAb-EL21，表位5-11

310-03，表位5-16(Abcam，Santa Cruz Biotechnology)

鸡抗-人Aβ多克隆抗体，表位12-28(Abcam)

鸡抗-人Aβ多克隆抗体，表位25-35(Abcam)

兔抗-人Aβ多克隆抗体，表位:N-terminal(ABR)

兔抗-人Aβ多克隆抗体(Anaspec)

12C3，表位10-16(Abbiotec，Santa Cruz Biotechnology)

16C9，表位10-16(Abbiotec，Santa Cruz Biotechnology)

19B8，表位9-10(Abbiotec，Santa Cruz Biotechnology)

pAb-EL26，表位:11-26

BAM90.1，表位:13-28(Sigma-Aldrich)

兔抗-β-淀粉样蛋白(pan)多克隆抗体，表位:15-30(MBL)

22D12，表位:18-21(Santa Cruz Biotechnology)

266，表位:16-24(Elan Pharmaceuticals)

pAb-EL17;表位:15-24

4G8，表位:17-24(Covance)

兔抗-Aβ多克隆抗体，表位:22-35(Abcam)

G2-10，表位:31-40(The Genetics Company)

兔抗-Aβ，aa 32-40多克隆抗体(GenScript Corporation)

EP 1876Y，表位:x-40(Novus Biologicals)

G2-11，表位:33-42(The Genetics Company)

16C11，表位:33-42(Santa Cruz Biotechnology)

21F12，表位:34-42(Elan Pharmaceuticals，Innogenetics)

1A10，表位:35-40(IBL)

D-17山羊抗-Aβ抗体，表位:C-末端(Santa Cruz Biotechnology)

对于免疫沉淀特别的抗体是：3D6(Elan)、BAN50(Takeda)、82E1(IBL)、6E10(Covance)、WO-2(The Genetics Company)、266(Elan)、BAM90.1(Sigma)、4G8(Covance)、G2-10(The Genetics Company)、1A10(IBL)、BA27(Takeda)、11A5-B10(Millipore)、12F4(Millipore)、21F12(Elan)。

举例的AβN3pE特异性抗体是：

-Pyro-Glu Abeta抗体Aβ5-5-6(保藏号DSM ACC 2923)，Aβ6-1-6(保藏号DSM ACC 2924)，Aβ17-4-3(保藏号DSM ACC 2925)及Aβ24-2-3(保藏号DSM ACC 2926)，这些抗体在PCT/EP2009/058803(单克隆，小鼠)，Probiodrug AG中描述；

-Pyro-Glu Abeta抗体克隆2-48(单克隆，小鼠)；Synaptic Systems

-Pyro-Glu Abeta抗体(多克隆，兔)；Synaptic Systems

-Pyro-Glu Abeta抗体克隆8E1(单克隆，小鼠)；Anawa

-Pyro-Glu Abeta抗体克隆8E1(单克隆，小鼠)；Biotrend

-抗-人淀粉样蛋白β(N3pE)兔IgG(多克隆，兔)；IBL

-抗-人AβN3pE(8E1)小鼠IgG Fab(单克隆，小鼠)；IBL

举例的AβisoAsp 1特异性抗体是：

-抗-人AβisoAsp 1抗体(多克隆，兔)；在Saido TC,et al.,NeurosciLett.(1996)13;215(3):173-6中揭示。

特别用于免疫沉淀的抗体对是：

4G8与11A5-B10，3D6与4G8，6E10与4G8，82E1与4G8，4G8与12F4，4G8与21F12，3D6与21F12，6E10与21F12，BAN50与4G8，3D6与11A5-B10，3D6与1A10，3D6与BA27，6E10与11A5-B10，6E10与1A10，6E10与BA27，4G8与11A5-B10，4G8与1A10，4G8与BA27，4G8与12F4，4G8与21F12。

举例的AβN3pE特异性抗体是：

-Pyro-Glu Abeta抗体Aβ5-5-6(保藏号DSM ACC 2923)，Aβ6-1-6(保藏号DSM ACC 2924)，Aβ17-4-3(保藏号DSM ACC 2925)及Aβ24-2-3(保藏号DSM ACC 2926)，这些抗体在PCT/EP2009/058803(单克隆，小鼠)，Probiodrug AG中描述；

-Pyro-Glu Abeta抗体克隆2-48(单克隆，小鼠)；Synaptic Systems

-Pyro-Glu Abeta抗体(多克隆，兔)；Synaptic Systems

-Pyro-Glu Abeta抗体克隆8E1(单克隆，小鼠)；Anawa

-Pyro-Glu Abeta抗体克隆8E1(单克隆，小鼠)；Biotrend

-抗-人淀粉样蛋白β(N3pE)兔IgG(多克隆，兔)；IBL

-抗-人AβN3pE(8E1)小鼠IgG Fab(单克隆，小鼠)；IBL。

举例的AβisoAsp 1特异性抗体是：

-抗-人AβisoAsp 1抗体(多克隆，兔)；Saido et al.,1996)。

除了上述抗体之外，适于进行免疫沉淀的所有其它淀粉样蛋白β特异性抗体(单克隆及多克隆)均可用于浓度确定方法中(其它合适的抗体可例如来自www.alzforum.org)。良好捕获效率的决定因素是使用具有不同表位的两、三或多种不同抗体。使用一种以上的抗体类型进行Aβ肽的免疫沉淀提供了协同及令人惊奇的协同结合作用(亲和力)，最终可以实现极高的捕获效率(见图1)。

步骤ii)中的二抗特异性抗宿主捕获抗体的抗体类型。合适的二抗是抗小鼠抗体和抗兔抗体。

在步骤iii)中将所述复合物与磁珠保温之后，用洗涤缓冲液洗涤该珠(见本发明实施例)。含有洗涤剂或者防止非特异性结合的其它添加剂的洗涤缓冲液可用于这个步骤。非限制性的洗涤缓冲液的实例是：

-含有10mg/ml亲环蛋白18(Cyp 18)和0.05%Tween-20的D-PBS，

-PBS+0.05%Tween-20，

-TBS+0.05%Tween-20，

-PBS+1%(w/v)BSA+0.05%Tween-20，

-TBS+1%(w/v)BSA+0.05%Tween-20，以及

-Pierce ELISA Blocker(with Tween-20)。

在步骤iv)中将所述免疫复合物与所述珠洗脱之后，将溶液在稀释缓冲液中稀释。任何可以防止与表面以及固定化的第一ELISA抗体非特异性相互作用的稀释缓冲液均可用于这个步骤。非限制性的稀释缓冲液的实例是：

-EIA缓冲液(IBL 1-40(N)ELISA试剂盒的稀释缓冲液)，

-PBS+1%(w/v)BSA+0.05%Tween-20，

-TBS+1%(w/v)BSA+0.05%Tween-20，及

-Pierce ELISA Blocker(及Tween-20)。

能定量全长Aβ(1-40)的ELISA-试剂盒可商购。在本发明方法中用于定量Aβ(1-40)的合适的ELISA试剂盒是例如：淀粉样蛋白β(1-40)(N)ELISA(IBL,JP27714)；Aβ[1-40]人ELISA试剂盒(Invitrogen)；人淀粉样蛋白β(Amyloid-β),aa 1-40ELISA试剂盒(Wako Chemicals USA,Inc.)；淀粉样蛋白β1-40ELISA试剂盒(The Genetics Company)。

能定量全长Aβ(1-42)的ELISA-试剂盒也可商购。在本发明方法中用于定量Aβ(1-42)的合适的ELISA-试剂盒是例如：淀粉样蛋白β(1-42)(N)ELISA(IBL,JP27712)；Aβ[1-42]人ELISA试剂盒(Invitrogen)，人淀粉样蛋白β(Amyloid-β),aa 1-42ELISA试剂盒(Wako Chemicals USA,Inc.)，淀粉样蛋白β1-40ELISA试剂盒(The Genetics Company)，

β-AMYLOID(1-42)(Innogenetics)。

所述浓度确定方法不限于举例的前述可商购的Aβ(1-40)或Aβ(1-42)的ELISA试剂盒。全长Aβ(1-40)或Aβ(1-42)的许多其它夹心ELISA可以在现有技术领域中获得或者可以由技术人员开发。所有这些全长Aβ1-40或Aβ1-42夹心ELISA应也包含在所述浓度确定方法中，并且应典型包含一对合适的捕获抗体和检测抗体，其分别特异于Aβ(1-40)和/或Aβ(1-42)的完整N末端及在氨基酸位置40或42结束的C末端。

这种全长Aβ(1-40)夹心ELISA可包含第一固定化抗体，其特异性识别Aβ(1-40)的C末端，及包含第二标记的检测抗体，其特异性识别Aβ(1-40)的完整N末端。

全长Aβ(1-42)夹心ELISA可包含第一固定化抗体，其特异性识别Aβ(1-42)的C末端，及包含第二标记的检测抗体，其特异性识别Aβ(1-42)的完整N末端。

全长Aβ(1-40)夹心ELISA也可包含第一固定化抗体，其特异性识别Aβ(1-40)的完整N末端，及包含第二标记的检测抗体，其特异性识别Aβ(1-40)的C末端。

全长Aβ(1-42)夹心ELISA也可包含第一固定化抗体，其特异性识别Aβ(1-42)的完整N末端，及包含第二标记的检测抗体，其特异性识别Aβ(1-42)的C末端。

用于所述浓度确定方法中的合适的Aβ(1-40/42)N-末端特异性抗体例如是3D6(Elan)、WO-2(The Genetics Company)、82E1(IBL)、BAN-50(Takeda)。许多其它Aβ(1-40/42)N-末端特异性抗体在现有技术领域中可获得或者可以由技术人员开发。所有这些Aβ(1-40/42)N-末端特异性抗体也预期用于浓度确定方法中。

合适的Aβ(1-40)C-末端特异性抗体例如是G2-10(The GeneticsCompany)、11A5-B10(Millipore)、1A10(IBL)、BA27(Takeda)、EP1876Y(Novus Biologicals)。许多其它Aβ(1-40)C-末端特异性抗体可以在现有技术领域中获得或者由技术人员开发。所有这些Aβ(1-40)C-末端特异性抗体也预期用于浓度确定方法中。

合适的Aβ(1-42)C-末端特异性抗体例如是G2-11(The GeneticsCompany)、12F4(Millipore)、抗人Aβ(38-42)兔IgG(IBL)、21F12(Elan)、BC05(Takeda)、16C11(Santa Cruz Biotechnology)。许多其它Aβ(1-42)C-末端特异性抗体可以在现有技术领域中获得或者由技术人员开发。所有这些Aβ(1-42)C-末端特异性抗体也预期用于浓度确定方法中。

根据一个实施方案，所述检测抗体是标记的。

对于诊断性应用，检测抗体典型地由可检测部分标记。可利用许多标记，其通常可被分为如下类别：

(a)放射性同位素，如³⁵S、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I。所述抗体可以用所述放射性同位素标记，使用如在Current Protocols in Immunology，Volumes 1and 2,Gütigen et al.,Ed.,Wiley-Interscience.New York,New York.Pubs.,(1991)中所述技术进行，放射性可以通过使用闪烁计数法测量。

(b)荧光标记，如可利用稀土元素螯合物(铕螯合物)或者荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，Lissamine，藻红蛋白和Texas Red。所述荧光标记可以与抗体缀合，使用如在如前述Current Protocols in Immunology中所述技术进行。荧光可以通过使用荧光计量化。

(c)可利用各种酶-底物标记。所述酶通常催化生色底物的化学改变，可以使用各种技术测量。例如，酶可以催化底物颜色改变，这可以通过分光光度法测量。或者，酶可以改变底物的荧光或者化学发光。量化荧光改变的技术在上文描述。化学发光底物通过化学反应变为电激发状态，然后可以发射可测量的光(例如使用化学发光测量仪)或者将能量供给荧光受体。举例的酶标记包括萤光素酶(如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，苹果酸脱氢酶，脲酶，过氧化物酶，如辣根过氧化物酶(HRPO)，碱性磷酸酶，O-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶)，乳过氧化物酶，微过氧化物酶等。使酶与抗体缀合的技术在O'Sullivan et al.,Methods for thePreparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，in Methods in Enzym.(ed Langone & H.Van Vunakis),Academic Press,NewYork,73:147-166(1981)中描述。

举例的酶-底物组合包括例如：

(i)辣根过氧化物酶(HRPO)与过氧化氢酶作为底物，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或者3,3',5,5'-四甲基盐酸联苯胺(TMB))；

(ii)碱性磷酸酶(AP)与对硝基苯基磷酸酯(para-Nitrophenyl phosphate)作为生色底物；以及

(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或者生荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶。

本领域技术人员可利用许多其它酶-底物组合。

(d)检测抗体的另一可能的标记是短核苷酸序列。然后通过RT-PCR系统确定浓度(Imperacer^TM,Chimera Biotech)。

有时所述标记与抗体间接缀合。技术人员已知实现这个目的的各种技术。例如，抗体可以与生物素缀合，及上述任何三种广义类别的标记可以与抗生素蛋白缀合，或者反之亦然。生物素选择性结合抗生物素蛋白，因此所述标记可以这种间接方式与抗体缀合。或者，为了实现标记与抗体的间接缀合，将抗体与小的半抗原(如地高辛)缀合，及将上述不同类型的标记之一与抗-半抗原抗体(如抗-地高辛抗体)缀合。因此，可以实现标记与抗体的间接缀合。

用于本发明中的抗体可用于任何已知测定方法中，如竞争性结合测定，直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定。Zola,Monoclonal Antibodies AManual of Techniques,pp.147-158(CRC Press.Inc.,1987)。

竞争性结合测定依赖于标记的标准物与检测样品分析物竞争结合限量抗体的能力。检测样品中Aβ肽的量与结合抗体的标准物的量成反比。为了便于确定结合的标准物的量，通常抗体在竞争之前或之后是不溶的，以便与所述抗体结合的标准物和分析物可方便地与保持未结合的标准物和分析物分离。

对于在人体内分析Aβ(1-40)浓度，所有如下体液均可以使用：血液、脑脊液(CSF)、尿液、淋巴、唾液、汗液、胸膜液、滑膜液、水相液体、泪液、胆汁以及胰腺分泌物。

所述新方法由本发明人使用血液样品确立(见本发明实施例)。然而本发明的方法不限于血液样品。所述方法也可以相同方式使用CSF、脑提取物和尿液样品，以及其它人体体液，如上述体液。特别的样品包括血浆样品。

对于免疫组织化学分析，组织样品可以是新鲜或者冷冻的或者可以包埋于石蜡中及用防腐剂如福尔马林固定。

可以意识到尽管夹心ELISA系统包含本发明步骤(a)和(c)中确定Aβ浓度的一个特殊实施方案，但是可以使用其它浓度确定方法。

确定Aβ浓度的其它合适方法是：

1.淀粉样蛋白β1-40 测定(CisBio Bioassays):

这个测定原理基于TR-FRET，其是时间分辨荧光免疫分析与共振能量转移的组合。与通常夹心ELISA相似，Aβ(1-40)由两种抗体结合；然而所述抗体在此不结合表面，在溶液中发生相互作用。这两种抗体均用荧光团标记。当这两种荧光团通过生物分子相互作用聚在一起时，在激发期间由供体荧光团捕获的一部分能量通过FRET转移至受体荧光团，结果其被激发。测量受体荧光团的荧光。测量信号与FRET的量相关，因此确定溶液中Aβ(1-40)的量。

相似地，基于相当原理，可以使用Lilly的Alphascreen^TM测定。

2.多元测定系统

多元测定系统可得自一些厂商，且为本领域技术人员熟知及广泛使用。用于本发明方法中的合适实例是INNO-BIA血浆Aβ形式测定(Innogenetics)。这个测定是非常标准化的多参数基于珠的免疫测定，同时量化血浆中人β-淀粉样肽形式Aβ(1-42)和Aβ(1-40)或者Aβ(X-42)和Aβ(X-40)，使用

技术进行(xMAP是Luminex Corp.的注册商标)。

这个测定能同时量化直至100个不同分析物。这种方法的基础是小球形聚苯乙烯颗粒，称作微球或珠。与ELISA和Western印迹相似，这些珠作为生物化学检测的固相。这些珠以颜色编码，由此可以区分100个不同类别的珠。每个类别的珠具有一个特异性抗体(例如抗Aβ(1-40))固定在微球体表面上。如果Aβ(1-40)浓度增加，则更多的肽分子将由这个类别的珠结合。检测分析物的结合通过二抗抗-Aβ(1-40)抗体进行，其用另一种荧光染料标记，发射绿光。类似于FACS分析处理样品。通过流体力聚焦使微球单一化（singularized），并通过基于激光的检测系统分析，这样可以基于绿色荧光进行量化及通过珠的特殊颜色鉴别结合的分析物。因此，可以在一个样品中确定多个分析物的浓度。

3.通过质谱分析进行量化

-对于量化Aβ(1-40)，也可使用SELDI-TOF质谱分析术(Simonsen et al.,2007(2))。

-使用免疫沉淀与MALDI-TOF质谱分析术量化分析Aβ肽。¹⁵N标记的标准Aβ肽用于校准(Gelfanova et al.,2007)。

4.Western印迹分析

2D-凝胶电泳结合Western印迹分析可以是量化Aβ肽的合适方法(Sergeant et al.,2003;Casas et al.,2004)。

诊断试剂盒

为方便起见，本发明方法中使用的抗体可以在试剂盒中提供，即包装的预定量的试剂组合，附带进行诊断测定的说明书。

因此，根据本发明的另一方面，提供了诊断神经变性疾病如阿尔茨海默病的试剂盒，所述试剂盒包含合适的碱及根据本发明所述方法使用该试剂盒的说明书。

在一个实施方案中，所述试剂盒另外包含如本文定义的至少两种不同的捕获抗体。

在抗体用酶标记的情况中，所述试剂盒还包括所述酶需要的底物和辅因子(例如底物前体，其提供可检测的生色团或荧光团)。此外，可以包括其它添加剂，如稳定剂、缓冲液(例如阻断缓冲液或者裂解缓冲液)等等。各种试剂的相对量可以大大不同，以提供基本上最佳化测定灵敏性的试剂溶液浓度。特别地，所述试剂可以干粉形式提供，通常是冻干的，包括赋形剂，当其溶解时提供具有适当浓度的试剂溶液。

本发明的诊断试剂盒特别用于检测和诊断神经变性疾病，如淀粉样蛋白相关疾病和病症，例如阿尔茨海默病。

应用

本发明的方法首次可以以可靠方式检测和量化寡聚的靶Aβ肽，特别是Aβ(1-40)、Aβ(1-42)、Aβ(3-38)和/或Aβ(11-38)或者其功能等价物。特别地，本发明提供了寡聚Aβ(1-40)、Aβ(1-42)、Aβ(3-38)和/或Aβ(11-38)作为血浆生物标记，其适用于区分性诊断阿尔茨海默病，特别是在疾病的早期阶段。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及使用确定淀粉样β肽的寡聚状态的方法诊断阿尔茨海默病，如区分性诊断阿尔茨海默病，特别是在疾病的早期阶段。适当地，阿尔茨海默病的早期阶段是轻度认知损害。

在另一个实施方案中，本发明涉及使用寡聚靶Aβ肽诊断阿尔茨海默病，如区分性诊断阿尔茨海默病，特别是在疾病的早期阶段。适当地，阿尔茨海默病的早期阶段是轻度认知损害。

特别地，使用本发明的方法检测和量化寡聚靶Aβ肽，其用于诊断阿尔茨海默病。

在另一个实施方案中，所述靶Aβ肽是如前文定义的Aβ(x-y)或者其功能等价物。

本发明的方法还具有工业实用性以监测对于神经变性疾病如阿尔茨海默病给予的治疗的效力。因此，根据本发明的另一方面，提供了一种监测在对象中的治疗效力的方法，所述对象患有、怀疑患有或者倾向于患有神经变性疾病如阿尔茨海默病，所述方法包括确定取自检测对象的生物学样品中如本文定义的靶淀粉样β肽(Abeta或Aβ)的寡聚状态。

在一个实施方案中，生物学样品在两或多个时间点取自检测对象。在另一个实施方案中，所述方法另外包括对比在两或多个时间点取自检测对象的生物学样品中存在的靶淀粉样β肽(Abeta或Aβ)的寡聚状态的水平。在一个实施方案中，所述方法另外包括将检测样品中存在的靶淀粉样β肽(Abeta或Aβ)的寡聚状态的水平与在开始治疗之前取自所述对象的一或多个样品和/或在治疗早期取自所述对象的一或多个样品中存在的量进行对比。在一个实施方案中，所述方法另外包括将靶淀粉样β肽(Abeta或Aβ)的寡聚状态的水平与一或多种对照进行对比。

本发明通过如下实施例得以进一步描述，然而所述实施例不以任何方式限制本发明，本发明的范围由所附权利要求书定义。

本发明的实施例

1.材料和方法

1.1患者和健康对照

经临床诊断为AD的患者及健康对照由CRO(GALMED GmbH)招募。在预实验检测中，通过一些心理测试检测研究的所有参加者的神经心里学功能(DemTect，简易精神状态测试，画钟测试)。

DemTect测试

DemTect评分是简便的痴呆筛选方法，包括五个短的子测试(10字表重复、数字译码（number transcoding）、语义流畅任务（semantic word fluencytask）、反向数字广度（backward digit span）、延迟字表回忆（delayed word listrecall））(Kessler et al.,2000)。原始评分被转化以给出不依赖于年龄和教育程度的评分，分类为“疑似痴呆”(评分≤8)，“轻度认知损害”(评分为9-12)和“年龄相适”（评分为13-18)。

MMSE

简易精神状态检查（The Mini-Mental State Examination，MMSE)或Folstein测试是简短的30道题问卷测试，其用于评估认知（见表1）。其在医学中通常用于筛选痴呆。在大约10分钟时长内，其抽样调查各种功能，包括计算、记忆和方向。其由Folstein et al.,1975引入，并经小改变而广泛使用。MMSE包括在一些领域的简单问题：测试的时间和地点、重复单词表、计算、语言运用和理解以及基本的运动技能。例如，一个问题是要求重复画两个五边形（见下表）。（30之中）任何超过27的评分是有效正常的。低于此评分，20-26表示轻度痴呆；10-19为中度痴呆，低于10为严重痴呆。正常值也根据教育程度和年龄校正。低到极低评分与痴呆存在密切相关，尽管其它精神疾病也可以导致MMST测试中的异常发现。

表1：简易精神状态检查

画钟测试

钟的评分是根据修改的Shulmann et al.,1986所用的规格。所有圆圈预先画好，对对象的指令是“设定时间为11点10分”。评分系统（见表2）范围为从1到6分，分越高反映错误越多并且损害越多。这个评分系统是凭经验衍生的并且基于临床实践修改。需要时，其留出显著范围供个体判断，但是其足够简单而具有高水平的测试者之间的可靠性。我们的研究自己增添3种主要成分的分析。它们包括画钟测试与其它认知功能测量之间的横向比较；画钟测试随时间的纵向描述，以及画钟测试劣化和送专门机构的决定之间的关系。

在预研究测试之后，在2周后用从所有参与者中抽取的血液开始研究。间隔3个月的一年以上的时间内，所有参与者均参观心理测试和血液样品抽取中心。所述研究由

Sachsen-Anhalt”伦理道德委员会许可。所有患者(或者其最亲密的亲属)及对照对象提供同意参加这项研究的同意书。

表2：画钟测试

1.2血液样品

为了分析人体中Aβ1-40和/或Aβ1-42浓度，可以使用所有如下体液：血液、脑脊液、尿液、淋巴、唾液、汗液、胸膜液、滑膜液、水相液体、泪液、胆汁和胰腺分泌物。

所述新方法使用血液样品建立，并可用于CSF、脑提取物和尿液样品，及所有其它人体体液。

将用于确定AD生物标记的血液样品收集在三个聚丙烯试管中：

1.对于EDTA血浆，含有钾-EDTA(Sarstedt Monovette,02.1066.001)，

2.对于肝素血浆，含有Li-肝素(Sartstedt Monovette,02.1065.001)，

3.对于血清，是空白的(Sarstedt Monovette,02.1063.001)。

通过静脉穿刺或者通过从插入前臂静脉内置导管中重复抽取而收集所有样品。根据时间表(如上文1.1章节所述)收集血液。将其在1550g(3000rpm)在4°C离心10分钟以提供血浆。抽吸出血浆或血清，装入一个5ml聚丙烯冻存管(cryo-tube)(Carl-Roth,E295.1)中，在-80°C贮存，在抽取血液后1小时内对样品进行离心。根据研究方案对血浆或血清试管进行适当标记是CRO的职责。

1.3实验方法

除了野生型Aβ1-40之外，也可以通过这种方法量化突变的变体。突变的变体包含所有淀粉样β肽，以氨基酸Asp-Ala-Glu开始并以氨基酸Gly-Val-Val结束。突变的Aβ1-40的例子是：Tottori,Flemish,Dutch,Italian,Arctic,Iowa(Irie et al.,2005)。

Aβ1-40测定也可用于其它家族性阿尔茨海默病，其提供除了产生野生型Aβ1-40的Aβ1-40序列之外的突变。如下家族性阿尔茨海默病的例子也适于所述测定：Swedish,Austrian,French,German,Florida,London,Indiana,Australian(Irie et al.,2005)。

除了野生型Aβ1-42之外，通过这种方法也可以量化突变的变体。突变的变体包含所有淀粉样β肽，以氨基酸Asp-Ala-Glu开始并以氨基酸Val-Ile-Ala结束。突变的Aβ1-42例子是：Tottori,Flemish,Dutch,Italian,Arctic,Iowa(Irie et al.,2005)。

Aβ1-42测定也可用于其它家族性阿尔茨海默病，其提供除了产生野生型Aβ1-42的Aβ1-42序列之外的突变。如下家族性阿尔茨海默病的例子也适于所述测定：Swedish,Austrian,French,German,Florida,London,Indiana,Australian(Irie et al.,2005)。

免疫沉淀

将EDTA血浆样品(含有4ml血浆)(肝素血浆，血清也可以)解冻，以1ml等份于2ml聚丙烯试管(Eppendorf，0030120.094)中。将1丸蛋白酶抑制剂(Roche,Complete mini Protease inhibitor cocktail,11836153001)溶解于1mlD-PBS(Invitrogen,14190-094)中。将25μl蛋白酶抑制剂溶液加入1ml EDTA血浆中。除了每个样品的一个试管之外，将所有等份冷冻并再次在-80°C贮存。将这些血浆试管掺入（spiked）10ul的10%Tween-20。在每个试管中，加入2.5μg抗淀粉样β肽(17-24)抗体4G8(Millipore,MAB1561)、2.5μg抗淀粉样β肽(x-42)抗体12F4(Millipore,05-831)及2.5μg抗淀粉样β肽(x-40)抗体11A5-B10(Millipore,05-799)。

进行免疫沉淀的其它可能抗体如前文定义。除了这些列出的抗体之外，适于免疫沉淀的所有其它淀粉样蛋白β特异性抗体(单克隆和多克隆抗体)均可用于这种方法(也见于www.alzforum.org)。对于良好捕获效率起决定作用的是使用两、三或多种具有不同表位的不同抗体。使用一种类型以上的抗体进行Aβ肽免疫沉淀提供协同结合作用(亲合力)，其产生极高的捕获效率(见图1)。

将所有血浆试管在4°C在高架摇床中保温过夜。为了固定淀粉样蛋白β-抗体复合物，将100μl抗小鼠磁珠(Invitrogen,112-02D)用于1ml血浆样品。除了缀合在磁珠上的这些特殊的抗小鼠抗体之外，可以使用所有其它抗小鼠抗体或抗宿主抗体(宿主：上述一抗的来源)。这些抗体可以通过不同的缀合策略固定在一些基质上(柱基质和珠基质)，例如生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用，甲苯磺酰基-激活的表面，环氧基-激活的表面，胺-表面，羧基-表面。在使用之前，从最初的瓶中抽吸100μl珠置于2ml试管中，用1mlPBS洗涤3次。在洗涤之后，将所述珠重悬浮于200μl PBS中。将血浆试管在2000×g离心30秒。将上清转移至含有抗小鼠磁珠的试管中。将该试管在高架摇床中在4°C保温过夜。

次日，将试管置于磁性分离器中，以使得所述珠被吸往试管壁。在大约1分钟之后，小心除去上清，将珠用含10mg/ml亲环蛋白18和0.05%Tween-20的500μl D-PBS洗涤两次。

含有洗涤剂或者防止非特异性结合的其它添加剂的其它洗涤缓冲液可用于这个步骤。举例的洗涤缓冲液是：

-PBS+0.05%Tween-20

-TBS+0.05%Tween-20

-Pierce ELISA Blocker (具有Tween-20)。

捕获的淀粉样蛋白β的洗脱与解聚

在最后的洗涤步骤之后，抽出溶液，从磁性分离器中取出试管，在每个试管中加入100μl 50%(v/v)甲醇/0.5%(v/v)甲酸，将所述珠通过轻轻摇动重悬。将所有试管均在室温保温1小时。之后，将试管再次置于磁性分离器中，将每个试管的40μl洗脱液与440μl EIA缓冲液(IBL 1-40/42(N)ELISA试剂盒的稀释缓冲液)混合。将稀释的样品的pH用16μl 400mM Na₂HPO₄、400mM KH₂PO₄pH8.0调节。从这些样品中确定未解聚的浓度。为了进行解聚，将每个试管的50μl洗脱液转移至新试管中，每个试管与20μl 50%(v/v)甲醇/500mM NaOH混合。在室温进行10分钟解聚。之后，将每个解聚试管的40μl与440μl EIA缓冲液(IBL 1-40/42(N)ELISA试剂盒的稀释缓冲液)混合。稀释的样品的pH用10μl 0.85%(v/v)H₃PO₄调节。从这些样品中，确定解聚之后的浓度。

除了来自厂商IBL的特殊ELISA稀释缓冲液之外，可以防止与表面和捕获抗体非特异性相互作用的所有其它稀释缓冲液均可用于这个步骤。举例的稀释缓冲液是：

-PBS+1%(w/v)BSA+0.05%Tween-20

-TBS+1%(w/v)BSA+0.05%Tween-20，

-Pierce ELISA Blocker(具有Tween-20)。

洗脱的淀粉样β肽的量化

使用IBL 1-40(N)ELISA试剂盒(IBL,JP27714)及IBL 1-42(N)ELISA试剂盒(IBL,JP27712)确定肽浓度(分别为解聚及未解聚的)。

除了这种特殊的Aβ1-40ELISA之外，可以使用所有其它可商购的能检测全长Aβ1-40的ELISA。

举例的商购ELISA-试剂盒是：

Human Abeta,aa 1-40ELISA Kit    Invitrogen

Human Amyloid beta(Amyloid-b),        Wako Chemicals USA,Inc.

(aa 1-40ELISA Kit)

Amyloid Beta 1-40ELISA Kit            The Genetics Company

自制的Aβ1-40ELISA包含一对捕获和检测抗体，其特异于Aβ1-40的完整N末端及在氨基酸位置40结束的C末端。

可能的N末端特异性抗体是：

3D6(Elan Pharmaceuticals)

WO-2(The Genetics Company)

1-40(N)检测抗体(IBL)

BAN50(Takeda Chemicals Industries)

可能的C末端特异性抗体是：

G2-10(The Genetics Company)

11A5-B 10(Millipore)

1A10(IBL)

兔抗β-淀粉样蛋白，aa 32-40多克隆抗体(GenScript Corporation)

EP1876Y，Epitope:x-40(Novus Biologicals)。

这种自制全长Aβ1-40夹心ELISA可包含第一固定化抗体，其特异性识别Aβ1-40的C末端，及包含第二标记的检测抗体，其特异性识别Aβ1-40的完整N末端。全长Aβ1-40夹心ELISA也可包含第一固定化抗体，其特异性识别Aβ1-40的完整N末端，及包含第二标记的检测抗体，其特异性识别Aβ1-40的C末端，这种类型的Aβ1-40夹心ELISA是特别优选的。

除了这种特殊的Aβ1-42ELISA之外，可以使用所有其它可商购的能检测全长Aβ1-42的ELISA。

举例的商购ELISA-试剂盒是：

Human Abeta,aa 1-40ELISA试剂盒        Invitrogen

Human Amyloid beta(Amyloid-b),        Wako Chemicals USA,Inc.

(aa 1-42ELISA试剂盒)

Amyloid Beta 1-42ELISA试剂盒          The Genetics Company

beta-Amyloid 1-42ELISA试剂盒(SIGNET)  Covance

β-AMYLOID(1-42)        Innogenetics

自制Aβ1-40ELISA包含一对捕获和检测抗体，其特异于Aβ1-42的完整N末端及在氨基酸位置40结束的C末端。

可能的N末端特异性抗体是：

3D6(Elan Pharmaceuticals)

WO-2(The Genetics Company)

1-40(N)检测抗体(IBL)

BAN50(Takeda Chemicals Industries)

可能的C末端特异性抗体是：

G2-11(The Genetics Company)

16C11(Santa Cruz Biotechnology)

21F12(Elan Pharmaceuticals,Innogenetics)

BC05(Takeda Chemicals Industries)

这种自制全长Aβ1-42夹心ELISA可包含第一固定化抗体，其特异性识别Aβ1-42的C末端，及包含第二标记的检测抗体，其特异性识别Aβ1-42的完整N末端。全长Aβ1-42夹心ELISA也可以包含第一固定化抗体，其特异性识别Aβ1-42的完整N末端，及包含第二标记的检测抗体，其特异性识别Aβ1-42的C末端，这种类型的Aβ1-42夹心ELISA特别优选。

将稀释的样品(分别为解聚及未解聚的)应用于ELISA平板(100μl/孔，重复确定)。从试剂盒中取ELISA标准物，根据厂商指导方案溶解和稀释。在应用所有样品和浓度标准物之后，将该ELISA平板在4°C保温18小时。次日，根据厂商指导方案进行ELISA。

在结束比色反应之后，使用平板读器(TECAN Sunrise)确定在450nm每个孔中的吸光度，通过在550nm吸光度校准。

通过绘制校准的在450nm的吸光度对相应标准肽浓度的图完成标准曲线的确定。使用Origin 7.0(Microcal)，用四参数方程(方程1)拟合所述曲线。

方程1，

$y=\frac{A1-A2}{1+{\left(\frac{x}{x_0}\right)}^p}+A2,$

其中y表示测量的吸光度，x表示相应浓度。

使用方程2，基于吸光度值完成每个样品ELISA上Aβ(1-40)和Aβ(1-42)

浓度的计算。

方程2

$x=x_0\&CenterDot;p\sqrt{\frac{A1-y}{y-A2}}$

为确定血浆样品中的浓度，未解聚确定的计算的浓度通过EIA缓冲稀释液(包括pH调节)校准，因子12.4，及免疫沉淀的浓度效应(1ml-100μl)因子0.1。为确定血浆样品中的浓度，将解聚确定的计算的浓度通过EIA缓冲稀释液(包括pH调节)校准，因子12.25，通过在洗脱的样品中加入20μl50%(v/v)甲醇/500mM NaOH稀释，因子1.4，免疫沉淀的浓度效应(1ml-100μl)因子0.1。确定的血浆Aβ(1-40/42)浓度(分别为解聚和未解聚的)以pg/ml表示。

计算及统计学分析

对于每个血浆样品，确定4个参数：

1.Aβ(1-40)浓度(解聚)

2.Aβ(1-40)浓度(未解聚)

3.Aβ(1-42)浓度(解聚)

4.Aβ(1-42)浓度(未解聚)

从这些数据中，计算如下比率值：

寡聚状态Aβ(1-40)=Aβ1-40(解聚)/Aβ1-40(未解聚)，

寡聚状态Aβ(1-42)=Aβ1-42(解聚)/Aβ1-42(未解聚)。

使用Students t-检验，检查Aβ(1-40)和Aβ(1-42)的血浆寡聚状态与存在阿尔茨海默病阳性临床诊断的关联性。

2.结果

2.1人口统计学特征

共45人参与这项研究，30个健康对照对象和15个AD患者。为了观测年龄对于血浆Aβ的可能影响，在大范围年龄选择对照人员并分成三组，I组包含年龄18-30岁，II组年龄31-45岁，III组年龄46-65岁。人口统计学特征结果示于表3。

表3：人口统计学特征

2.2心理测试

为了评估神经心理学功能，所有参与者均进行DemTect、简易精神状态测试和画钟测试。这些测试在研究前、开始研究后3个月、6个月、9个月和12个月进行。

DemTect测试

原始评分被转化以给出不依赖于年龄和教育程度的评分，分类为“疑似痴呆”(评分≤8)，“轻度认知损害”(评分为9–12)和“年龄相适”（评分为13–18)。所有访问的测试结果示于图3。图3结果证实与患者相比，三组健康对象之间有明显差异。

简易精神状态测试

（30之中）任何超过27的评分是有效正常的。低于此评分，20-26表示轻度痴呆；10-19为中度痴呆，低于10为严重痴呆。正常值也根据教育程度和年龄校正。低到极低评分与痴呆存在密切相关，尽管其它精神疾病也可以导致MMST测试中的异常发现。测试结果示于图4。图4结果证实与患者相比，3组健康对象之间有明显差异。

画钟测试

评分系统评分范围为从1到6，评分越高反映错误越多并且损害越多。这个评分系统是凭经验衍生的并且基于临床实践修改。需要时，其留出显著范围供个体判断，但是其足够简单而具有高水平的测试者之间的可靠性。

我们的研究自己分析3种主要成分。它们包括画钟测试与其它认知功能测量之间的横向比较；画钟测试随时间的纵向描述，以及画钟测试劣化和送专门机构的决定之间的关系。测试结果在图5中示出。图5的结果证实三个健康对象组与患者组之间的明显差异。

2.3Aβ(1-40)和Aβ(1-42)的血浆寡聚状态

在T0+9个月系列的EDTA血浆中确定Aβ(1-40/42)浓度(分别为解聚及非解聚的)。由于两个明显不利的事件，AD患者Nr.34和35迟到，仅13个AD样品由CRO进行研究。使用进一步的T0+9系列样品优化及确立新的免疫沉淀方法。总体而言，最终优化的方法检测11个AD样品和26个对照样品。确定的浓度示于表4。

表4：Aβ(1-40)和Aβ(1-42)(T0+9个月系列)的血浆寡聚状态

计算所有四个组的平均值和标准误差。使用T-检验对比AD组与每个对照组。表4中的寡聚状态值是根据本发明的方法计算，以c_d/c_a比率表示。

关于所有对照组的Aβ(1-42)的寡聚状态，与AD组相比获得显著增加的数值。通过对比Aβ(1-40)的寡聚状态获得相同结果。只有18-30岁年龄组短暂失去显著性。

评估所有对照样品及所有AD组样品的Aβ(1-40)和Aβ(1-42)的寡聚状态(图6)。与健康对照相比，AD患者中Aβ(1-40)和Aβ(1-42)的寡聚状态分别显著降低。对于Aβ(1-40)和Aβ(1-42)的寡聚状态，获得的p值分别为0.0074和0.00067。

使用的方法不能确定样品中Aβ(1-40)或Aβ(1-42)同源寡聚体的量，其示出样品中与单体Aβ(1-40)和Aβ(1-42)相比可溶的聚集体内Aβ(1-40)和Aβ(1-42)肽的量。由于这个事实，Aβ(1-40)和Aβ(1-42)值的总和可以反映出AD患者和健康对照的血浆中Aβ寡聚体的总量(图7)。

尽管样品数量与分别单一评估Aβ(1-40)和Aβ(1-42)相比更少，但是寡聚状态值的总和进一步改良T-检验的p值。

3.讨论

本文呈现的结果示出Aβ1-40和Aβ1-42的寡聚状态降低与阿尔茨海默病的阳性临床诊断相关。这两种寡聚状态的总和(Aβ1-40+Aβ1-42)改善显著性(p=1.41e-4)。迄今为止，在文献中仅有一小部分的相应研究。在一项研究中，示出在已经发生轻度AD的患者随访中通过二次评估发现初原纤维Aβ42的血浆水平降低(Schupf et al.,2008)，这个结果支持了我们的数据。然而，初原纤维Aβ42的血浆水平只在34%的所有参与者(1125名老年人)中可检测。这个事实限制了这项测定的可用性，其使用通过用纤维形式Aβ42免疫小鼠产生的单克隆抗体(克隆13C3)进行。对13C3抗体的鉴定提供了对于初原纤维Aβ42的良好亲和性，然而对单体Aβ42也如此(Schupf et al.,2008;supporting information)，这样可以歪曲确定的初原纤维Aβ42水平。因此，如果检测抗体不单独特异于淀粉样蛋白β的较高分子聚集体，则使用这种基于寡聚体或初原纤维特异性抗体的测定系统是受限的。在另一项研究中(Xia et al.,2009)，夹心ELISA使用相同的捕获和检测抗体检测寡聚Aβ。因此，只有如果Aβ装配含有可以由相同的捕获和检测抗体接近的相同表位的至少两个暴露拷贝才能进行检测(El-Agnaf et al.,2000;Howlett et al.,1999)。Xia及其同事发现寡聚Aβ的血浆水平增加，p-值<0.05，这与本文呈现的结果矛盾。然而，在这项研究中，仅在30%的健康对照和52%的AD患者中可检测寡聚Aβ，这也限制了这项测定的可用性。

这两项研究示出相同的问题，即聚集的淀粉样蛋白β不能在所有样品中检测到。可能是由于通过简便的夹心ELISA不能有效及可靠地回收淀粉样蛋白β的比率所致。在本发明中，二价捕获系统保证了从样品中完全回收所有Aβ分子，这使得本发明的测定更可靠。

最近的出版物提供了一种方法，其也使用间接量化寡聚淀粉样蛋白β的方法(Englund et al.,2009)。这项研究分析CSF样品及量化在变性和非变性条件下的Aβ(1-42)水平以及计算CSF样品Aβ42寡聚比率。他们发现与健康对照相比在AD和MCI样品中增加的比率。然而，这项测定由于使用不同方法量化变性和非变性Aβ42而受到限制。对于非变性条件，Aβ42浓度通过正常夹心ELISA测定。如上所述，这种简便的夹心ELISA可具有回收比率的问题。对于变性条件，Aβ42浓度通过SDS-PAGE及随后的Western印迹分析确定。这种方法的一个关键问题是Aβ(1-42)装配通过2%SDS不能完全解聚为单体。我们的经验示出在SDS-PAGE中三聚体和四聚体Aβ(1-42)也如此。针对这种背景，Aβ(1-42)单体的准确量化非常不确定。此外，这个事实使得与ELISA确定的浓度进行比较及随后计算这两个值的比率是非常有缺陷的。

迄今为止，所有公开的量化淀粉样蛋白β寡聚体或者初原纤维的方法均呈现出关键问题，其仅可有限制地用于分别分析人血浆和CSF。本发明克服了这些问题，示出可以在人血浆中可靠地检测Aβ聚集体。

参考文献

Blennow K,de Leon MJ,Zetterberg H.Alzheimer's disease.Lancet.2006 Jul29;368(9533):387-403

Ferri CP，Prince M,Brayne C,Brodaty H,Fratiglioni L,Ganguli M,Hall K,Hasegawa K,Hendrie H,Huang Y，Jorm A,Mathers C,Menezes PR,Rimmer E,Scazufca M Global prevalence of dementia:a Delphi consensus study.Lancet.2005Dec17;366(9503):2112-7

Knopman DS,DeKosky ST，Cummings JL,Chui H,Corey-Bloom J,Relkin N,Small GW，Miller B,Stevens JC.Practice parameter:diagnosis of dementia(anevidence-based review).Report of the Quality Standards Subcommittee of the AmericanAcademy of Neurology.Neurology.2001 May 8;56(9):1143-53

Waldemar G，Dubois B,Emre M,Georges J,McKeith IG，Rossor M,Scheltens P，Tariska P，Winblad B;EFNS.Recommendations for the diagnosis and management ofAlzheimer's disease and other disorders associated with dementia:EFNS guideline.

Eur J Neurol.2007Jan;14(1):e1-26.

Dubois B,Feldman HH,Jacova C,Dekosky ST,Barberger-Gateau P，Cummings J,Delacourte A,Galasko D,Gauthier S,Jicha G，Meguro K,O'brien J,Pasquier F，RobertP，Rossor M,Salloway S,Stern Y，Visser PJ,Scheltens P.Research criteria for the diagnosisof Alzheimer's disease:revising the NINCDS-ADRDA criteria.Lancet Neurol.2007Aug;6(8):734-46.

Jellinger KA.Alzheimer’s disease.In:Gilman S,editor.Neurobiologiy ofDisease.Amsterdam:Elsevier Academic Press;2007.p.69-82

Petersen RC,Smith GE,Waring SC,Ivnik RJ,Tangalos EG，Kokmen E.Mildcognitive impairment:clinical characterization and outcome.Arch Neurol.1999Mar；56(3):303-8

Chertkow H,Massoud F，Nasreddine Z,Belleville S,Joanette Y，Bocti C,Drolet V，Kirk J,Freedman M,Bergman H.Diagnosis and treatment of dementia:3.Mild cognitiveimpairment and cognitive impairment without dementia.CMAJ.2008May 6;178(10):1273-85

Scheff SW，Price DA,Schmitt FA,Mufson EJ.Hippocampal synaptic loss in earlyAlzheimer's disease and mild cognitive impairment.Neurobiol Aging.2006Oct;27(10):1372-84

Markesbery WR,Schmitt FA,Kryscio RJ,Davis DG，Smith CD,Wekstein DR.Neuropathologic substrate of mild cognitive impairment.Arch Neurol.2006Jan;63(1):38-46.

Bouwman FH,Schoonenboom SN,van der Flier WM,van Elk EJ,Kok A,BarkhofF，Blankenstein MA,Scheltens P.CSF biomarkers and medial temporal lobe atrophy predictdementia in mild cognitive impairment.Neurobiol Aging.2007Jul;28(7):1070-4

Saito Y，Murayama S.Neuropathology of mild cognitiveimpairment.Neuropathology.2007Dec;27(6):578-84

Jicha GA,Parisi JE,Dickson DW，Johnson K,Cha R,Ivnik RJ,Tangalos EG，BoeveBF，Knopman DS,Braak H,Petersen RC.Neuropathologic outcome of mild cognitiveimpairment following progression to clinical dementia.Arch Neurol.2006May;63(5):674-81

Petersen RC,Parisi JE,Dickson DW，Johnson KA,Knopman DS,Boeve BF，JichaGA,Ivnik RJ,Smith GE,Tangalos EG，Braak H,Kokmen E.Neuropathologic features ofamnestic mild cognitive impairment.Arch Neurol.2006May;63(5):665-72

Gauthier S,Reisberg B,Zaudig M,Petersen RC,Ritchie K,Broich K,Belleville S,Brodaty H,Bennett D,Chertkow H,Cummings JL,de Leon M,Feldman H,Ganguli M,Hampel H,Scheltens P，Tierney MC,Whitehouse P，Winblad B;InternationalPsychogeriatric Association Expert Conference on mild cognitive impairment.Mildcognitive impairment.Lancet.2006Apr 15;367(9518):1262-70

Fischer P，Jungwirth S,Zehetmayer S,Weissgram S,Hoenigschnabl S,Gelpi E,Krampla W，Tragl KH.Conversion from subtypes of mild cognitive impairment toAlzheimer dementia.Neurology.2007Jan 23;68(4):288-91

Devanand DP，Pradhaban G，Liu X,Khandji A,De Santi S,Segal S,Rusinek H,Pelton GH,Honig LS,Mayeux R,Stern Y，Tabert MH,de Leon MJ.Hippocampal andentorhinal atrophy in mild cognitive impairment:prediction of Alzheimerdisease.Neurology.2007Mar 13;68(11):828-36

Rossi R,Geroldi C,Bresciani L,Testa C,Binetti G，Zanetti O,Frisoni GB.Clinicaland neuropsychological features associated with structural imaging patterns in patients withmild cognitive impairment.Dement Geriatr Cogn Disord.2007;23(3):175-83

Whitwell JL,Petersen RC,Negash S,Weigand SD,Kantarci K,Ivnik RJ,KnopmanDS,Boeve BF，Smith GE,Jack CR Jr.Patterns of atrophy differ among specific subtypes ofmild cognitive impairment.Arch Neurol.2007Aug;64(8):1130-8

Panza F，Capurso C,D'Introno A,Colacicco AM,Capurso A,Solfrizzi V.Heterogeneity of mild cognitive impairment and other predementia syndromes in progressionto dementia.Neurobiol Aging.2007Oct;28(10):1631-2;discussion 1633-4

Hyman SE.Can neuroscience be integrated into the DSM-V? Nat Rev Neurosci.2007Sep;8(9):725-32

Blennow K.Cerebrospinal fluid protein biomarkers for Alzheimer'sdisease.NeuroRx.2004Apr；1(2):213-25

Blennow K.CSF biomarkers for Alzheimer's disease:use in early diagnosis andevaluation of drug treatment.Expert Rev Mol Diagn.2005Sep;5(5):661-72

Hampel H,Buerger K.Biomarkers in blood and cerebrospinal flid.In:Herholz K,Morris C,Perani D,editors.The Dementias:Early Diagnosis and Evaluation.New York:Taylor& Francis;2006.p.73-107

Lewczuk P，Kornhuber J,Wiltfang J.The German Competence Net Dementias:standard operating procedures for the neurochemical dementia diagnostics.J NeuralTransm.2006Aug;113(8):1075-80

Irizarry MC.Biomarkers of Alzheimer disease in plasma.NeuroRx.2004Apr；1(2):226-34

Barnes J,Foster J,Fox NC.Structural magnetic resonace imigaing-derived biomarkersfor Alzheimer’s disaese.Biomarkers Med.2007;1:79-92

Vemuri P，Gunter JL,Senj em ML,Whitwell JL,Kantarci K,Knopman DS,BoeveBF，Petersen RC,Jack CR Jr.Alzheimer's disease diagnosis in individual subjects usingstructural MR images:validation studies.Neuroimage.2008Feb 1;39(3):1186-97

Barkhof F，Polvikoski TM,van Straaten EC,Kalaria RN,Sulkava R,Aronen HJ,

L,Rastas S,Oinas M,Scheltens P，Erkinj untti T.The significance of medialtemporal lobe atrophy:a postmortem MRI study in the very old.Neurology.2007Oct9;69(15):1521-7

Mevel K,Desgranges B,Baron JC,Landeau B,De la Sayette V，Viader F，EustacheF，Chételat G.Detecting hippocampal hypometabolism in Mild Cognitive Impairment usingautomatic voxel-based approaches.Neuroimage.2007Aug 1;37(1):18-25

Kemppainen NM,Aalto S,Wilson IA,

K,Helin S,Brück A,Oikonen V，

M,Scheinin M,Viitanen M,Parkkola R,Rinne JO.PET amyloid ligand[11C]PIB uptake is increased in mild cognitive impairment.Neurology.2007May8;68(19):1603-6

Klunk WE,Engler H,Nordberg A,Wang Y，Blomqvist G，Holt DP，

M,Savitcheva I,Huang GF，Estrada S,Ausén B,Debnath ML,Barletta J,Price JC,SandellJ,Lopresti BJ,Wall A,Koivisto P，Antoni G，Mathis CA,

B.Imaging brainamyloid in Alzheimer's disease with Pittsburgh Compound-B.Ann Neurol.2004Mar；55(3):306-19

Rowe CC,Ng S,Ackermann U,Gong SJ,Pike K,Savage G，Cowie TF，DickinsonKL,Maruff P，Darby D,Smith C,Woodward M,Merory J,Tochon-Danguy H,O'KeefeG，Klunk WE,Mathis CA,Price JC,Masters CL,Villemagne VL.Imaging beta-amyloidburden in aging and dementia.Neurology.2007May 15;68(20):1718-25

Pike KE,Savage G，Villemagne VL,Ng S,MossSA,Maruff P，Mathis CA,KlunkWE,Masters CL,Rowe CC.Beta-amyloid imaging and memory in non-dementedindividuals:evidence for preclinical Alzheimer's disease.Brain.2007Nov;130(Pt 11):2837-44

Huang C,Eidelberg D,Habeck C,Moeller J,Svensson L,Tarabula T，Julin P.Imaging markers of mild cognitive impairment:multivariate analysis of CBFSPECT.Neurobiol Aging.2007Jul；28(7)：1062-9

Kantarci K，Weigand SD，Petersen RC，Boeve BF，Knopman DS，Gunter J，Reyes D，Shiung M，O′Brien PC，Smith GE，Ivnik RJ，Tangalos EG，Jack CR Jr.Longitudinal 1HMRS changes in mild cognitive impairment and Alzheimer′s disease.Neurobiol Aging.2007Sep；28(9)：1330-9

Petrella JR，Wang L，Krishnan S，Slavin MJ，Prince SE，Tran TT，Doraiswamy PM.Cortical deactivation in mild cognitive  impairment：high-field-strength functional MRimaging.Radiology.2007Oct；245(1)：224-35

A，Tervo S，Grau-Olivares M，Niskanen E，Pennanen C，Huuskonen J，Kivipelto M，

T，Tapiola M，Vanhanen M，Hallikainen M，Helkala EL，NissinenA，Vanninen R，Soininen H.Voxel-based morphometry to detect brain atrophy in progressivemild cognitive impairment.Neuroimage.2007 Oct 1；37(4)：1122-31

Kircher TT，Weis S，Freymann K，Erb M，Jessen F，Grodd W，Heun R，Leube DT.Hippocampal activation in patients with mild cognitive impairment is necessary for successfulmemory encoding.J Neurol Neurosurg Psychiatry.2007Aug；78(8)：812-8

Kropholler MA，Boellaard R，van Berckel BN，Schuitemaker A，Kloet RW，Lubberink MJ，Jonker C，Scheltens P，Lammertsma AA.Evaluation of reference regionsfor(R)-[(11)C]PK11195 studies in Alzheimer′s disease and mild cognitive impairment.JCereb Blood Flow Metab.2007 Dec；27(12)：1965-74

Attems J.Sporadic cerebral amyloid angiopathy：pathology，clinical implications，andpossible pathomechanisms.Acta Neuropathol.2005 Oct；110(4)：345-59

Blennow K，Hampel H.CSF markers for incipient Alzheimer′s disease.LancetNeurol.2003 Oct；2(10)：605-13

Hansson O，Zetterberg H，Buchhave P，Londos E，Blennow K，Minthon L.Association between CSF biomarkers and incipient Alzheimer′s disease in patients with mildcognitive impairment：a follow-up study.Lancet Neurol.2006 Mar；5(3)：228-34

Hansson O，Zetterberg H，Buchhave P，Andresson U，Londos E，Minthon L，Blennow K.Prediction of Alzheimer′s disease using the CSF Abeta42/Abeta40 ratio inpatients with mild cognitive impairment.Dement Geriatr Cogn Disord.2007；23(5)：316-20

Fagan AM，Mintun MA，Mach RH，Lee SY，Dence CS，Shah AR，LaRossa GN，Spinner ML，Klunk WE，Mathis CA，DeKosky ST，Morris JC，Holtzman DM.Inverserelation between in vivo amyloid imaging load and cerebrospinal fluid Abeta42 inhumans.Ann Neurol.2006Mar；59(3):512-9

Prince JA,Zetterberg H,Andreasen N,Marcusson J,Blennow K.APOE epsilon4allele is associated with reduced cerebrospinal fluid levels of Abeta42.Neurology.2004Jun8;62(11):2116-8

Strozyk D,Blennow K,White LR,Launer LJ.CSF Abeta 42levels correlate withamyloid-neuropathology in a population-based autopsy study..Neurology.2003Feb25;60(4):652-6

Walsh DM,Klyubin I,Shankar GM,Townsend M,Fadeeva JV，Betts V，PodlisnyMB,Cleary JP，Ashe KH,Rowan MJ,Selkoe DJ.The role of cell-derived oligomers ofAbeta in Alzheimer's disease and avenues for therapeutic intervention.Biochem SocTrans.2005Nov;33(Pt 5):1087-90

Ewers M,Buerger K,Teipel SJ,Scheltens P，

J,Zinkowski RP，BouwmanFH,

P，Schoonenboom NS,Andreasen N,Wallin A,DeBernardis JF，Kerkman DJ,Heindl B,Blennow K,Hampel H.Multicenter assessment ofCSF-phosphorylated tau  for the prediction of conversion of MCI.Neurology.2007Dec11;69(24):2205-12

Fagan AM,Roe CM,Xiong C,Mintun MA,Morris JC,Holtzman DM.Cerebrospinal  fluid tau/beta-amyloid(42)ratio as a prediction of cognitive decline innondemented older adults.ArchNeurol.2007Mar；64(3):343-9.

Gustafson DR,Skoog I,Rosengren L,Zetterberg H,Blennow K.Cerebrospinal fluidbeta-amyloid 1-42concentration may predict cognitive decline in older women.J NeurolNeurosurg Psychiatry.2007May;78(5):461-4

Li G，Sokal I,Quinn JF，Leverenz JB,Brodey M,Schellenberg GD,Kaye JA,Raskind MA,Zhang J,Peskind ER,Montine TJ.CSF tau/Abeta42ratio for increased riskof mild cognitive impairment:a follow-up study..Neurology.2007Aug 14;69(7):631-9

Stomrud E,Hansson O,Blennow K,Minthon L,Londos E.Cerebrospinal fluidbiomarkers predict decline in subjective cognitive function over 3years in healthyelderly.Dement Geriatr Cogn Disord.2007；24(2):118-24

Hampel H,Teipel SJ,Fuchsberger T，Andreasen N,Wiltfang J,Otto M,Shen Y，Dodel R,Du Y，Farlow M,

HJ,Blennow K,Buerger K.Value of CSF beta-amyloid1-42and tau as predictors of Alzheimer's disease in patients with mild cognitiveimpairment.Mol Psychiatry.2004Jul；9(7):705-10

Maccioni RB,Lavados M,Guillón M,Mujica C,Bosch R,Farías G，Fuentes P.Anomalously phosphorylated tau and Abeta fragments in the CSF correlates with cognitiveimpairment in MCI subjects.Neurobiol Aging.2006Feb;27(2):237-44

P，Pantel J,Kaiser E,Thomann P，

J.Increased tau proteindifferentiates mild cognitive impairment from geriatric depression and predicts conversion todementia.Neurosci Lett.2007Apr6；416(1):39-42

Clark CM,Xie S,Chittams J,Ewbank D,Peskind E,Galasko D,Morris JC,McKeel DW Jr，Farlow M,Weitlauf SL,Quinn J,Kaye J,Knopman D,Arai H,DoodyRS,DeCarli C,Leight S,Lee VM,Troj anowski JQ.Cerebrospinal fluid tau andbeta-amyloid:how well do these biomarkers reflect autopsy-confirmed dementia diagnoses?Arch Neurol.2003Dec;60(12):1696-702

Buerger K,Ewers M,T，Zinkowski R,Alafuzoff I,Teipel SJ,DeBernardis J,Kerkman D,McCulloch C,Soininen H,Hampel H.CSF phosphorylated tau proteincorrelates with neocortical neurofibrillary pathology in Alzheimer's disease.Brain.2006Nov;129(Pt 1l):3035-41

Engelborghs S,Sleegers K,Cras P，Brouwers N,Serneels S,De Leenheir E,MartinJJ,Vanmechelen E,Van Broeckhoven C,De Deyn PP.No association of CSF biomarkerswith APOEepsilon4,plaque and tangle burden in definite Alzheimer's disease.Brain.2007Sep;130(Pt 9):2320-6

Buerger K,Alafuzoff I,Ewers M,

T，Zinkowski R,Hampel H.No correlationbetween CSF tau protein phosphorylated at threonine 181with neocortical neurofibrillarypathology in Alzheimer's disease.Brain.2007Oct;130(Pt 10):e82

Wiltfang J,Esselmann H,Bibl M,Hüll M,Hampel H,Kessler H,

L,

J,Peters O,Jessen F，Luckhaus C,Perneczky R,Jahn H,Fiszer M,Maler JM,Zimmermann R,Bruckmoser R,Kornhuber J,Lewczuk P.Amyloid beta peptide ratio42/40but not A beta 42correlates with phospho-Tau in patients with low-and high-CSF Abeta 40load.J Neurochem.2007May;101(4):1053-9

Zhong Z,Ewers M,Teipel S,Bürger K,Wallin A,Blennow K,He P，McAllister C,Hampel H,Shen Y.Levels of beta-secretase(BACE1)in cerebrospinal fluid as a predictor ofrisk in mild cognitive impairment.Arch Gen Psychiatry.2007Jun；64(6)：718-26

(2)Buerger K，Otto M，Teipel SJ，Zinkowski R，Blennow K，DeBernardis J，Kerkman D，

J，

P，Cepek L，McCulloch C，

HJ，Wiltfang J，Kretzschmar H，Hampel H.Dissociation between CSF total tau and tau proteinphosphorylated at threonine 231 in Creutzfeldt-Jakob disease.Neurobiol Aging.2006Jan；27(1)：10-5

Bibl M，Mollenhauer B，Esselmann H，Schneider M，Lewczuk P，Welge V，Gross M，Falkai P，Kornhuber J，Wiltfang J.Cerebrospinal fluid neurochemical phenotypes invascular dementias：original data and mini-review.Dement Geriatr CognDisord.2008；25(3)：256-65

McRae A，Martins RN，Fonte J，Kransik R，Hirt L，Miklossy J.Cerebrospinal fluidantimicroglial antibodies in Alzheimer disease：a putative marker of an ongoing inflammatoryprocess.Exp Gerontol.2007Apr；42(4)：355-63

Jellinger KA，Janetzky B，Attems J，Kienzl E.Biomarkers for early diagnosis ofAlzheimer disease：′ALZheimer ASsociated gene′--a new blood biomarker?J Cell MolMed.2008Aug；12(4)：1094-117

Finehout EJ，Franck Z，Choe LH，Relkin N，Lee KH.Cerebrospinal fluid proteomicbiomarkers for Alzheimer′s disease.Ann Neurol.2007 Feb；61(2)：120-9

EM，Roher AE，Esh CL，Kokjohn TA，Beach T.Comparative proteomics ofcerebrospinal fluid in neuropathologically-confirmed Alzheimer′s disease and non-dementedelderly subjects.Neurol Res.2006 Mar；28(2)：155-63

Zhang J，Goodlett DR，Quinn JE Peskind E，Kaye JA，Zhou Y，Pan C，Yi E，Eng J，Wang Q，Aebersold RH，Montine TJ.Quantitative proteomics of cerebrospinal fluid frompatients with Alzheimer disease.J Alzheimers Dis.2005 Apr；7(2)：125-33

(1)Simonsen AH，McGuire J，Hansson O，Zetterberg H，Podust VN，Davies HA，waldemar G，Minthon L，Blennow K.Novel panel of cerebrospinal nuid biomarkers for theprediction of progression to Alzheimer dementia in patients with mild cognitiveimpairment.Arch Neurol.2007Mar；64(3)：366-70

Lescuyer P，Allard L，Zimmermann-Ivol CG，Burgess JA，Hughes-Frutiger S，Burkhard PR，Sanchez JC，Hochstrasser DF.Identification of post-mortem cerebrospinalfluid proteins as potential biomarkers of ischemia and neurodegeneration.Proteomics.2004Aug;4(8):2234-41

Abdi F，Quinn JF，Jankovic J,McIntosh M,Leverenz JB,Peskind E,Nixon R,NuttJ,Chung K,Zabetian C,Samii A,Lin M,Hattan S,Pan C,Wang Y，Jin J,Zhu D,Li GJ,Liu Y，Waichunas D,Montine TJ,Zhang J.Detection of biomarkers with a multiplexquantitative proteomic platform in cerebrospinal fluid of patients with neurodegenerativedisorders.J Alzheimers Dis.2006Aug；9(3):293-348

Irani DN,Anderson C,Gundry R,Cotter R,Moore S,Kerr DA,McArthur JC,Sacktor N,Pardo CA,Jones M,Calabresi PA,Nath A.Cleavage of cystatin C in thecerebrospinal fluid of patients with multiple sclerosis.Ann Neurol.2006Feb;59(2):237-47

(2)Hansson SF，Simonsen AH,Zetterberg H,Andersen O,Haghighi S,Fagerberg I,Andréasson U,Westman-Brinkmalm A,Wallin A,Rüetschi U,Blennow K.Cystatin C incerebrospinal fluid and multiple sclerosis.Ann Neurol.2007Aug;62(2):193-6

Ravaglia G，Forti P，Maioli F，Chiappelli M,Montesi F，Tumini E,Mariani E,Licastro F，Patterson C.Blood inflammatory markers and risk of dementia:The ConseliceStudy of Brain Aging.Neurobiol Aging.2007Dec;28(12):1810-20

Engelhart MJ,Geerlings MI,Meijer J,Kiliaan A,Ruitenberg A,van Swieten JC,Stijnen T，Hofman A,Witteman JC,Breteler MM.Inflammatory proteins in plasma andthe risk of dementia:the rotterdam study.Arch Neurol.2004May;61(5):668-72

Motta M,Imbesi R,Di Rosa M,Stivala F，Malaguarnera L.Altered plasma cytokinelevels in Alzheimer's disease:correlation with the disease progression.Immunol Lett.2007Nov30;114(1):46-51

German DC,Gurnani P，Nandi A,Garner HR,Fisher W，Diaz-Arrastia R,O'Suilleabhain P，Rosenblatt KP.Serum biomarkers for Alzheimer's disease:proteomicdiscovery.Biomed Pharmacother.2007Aug;61(7):383-9

Ray S,Britschgi M,Herbert C,Takeda-Uchimura Y，Boxer A,Blennow K,Friedman LF，Galasko DR,Jutel M,Karydas A,Kaye JA,Leszek J,Miller BL,MinthonL,Quinn JF，Rabinovici GD,Robinson WH,Sabbagh MN,So YT，Sparks DL,TabatonM,Tinklenberg J,Yesavage JA,Tibshirani R,Wyss-Coray T.Classification and predictionof clinical Alzheimer's diagnosis based on plasma signaling proteins.Nat Med.2007Nov;13(11):1359-62

Graff-Radford NR,Crook JE,Lucas J,Boeve BF，Knopman DS,Ivnik RJ,SmithGE,Younkin LH,Petersen RC,Younkin SG.Association of low plasma Abeta42/Abeta40ratios with increased imminent risk for mild cognitive impairment and Alzheimerdisease.Arch Neurol.2007Mar；64(3):354-62

van Oijen M,Hofman A,Soares HD,Koudstaal PJ,Breteler MM.Plasma Abeta(1-40)and Abeta(1-42)and the risk of dementia:a prospective case-cohort study.LancetNeurol.2006Aug;5(8):655-60

J,Giedraitis V，Irizarry MC,J,Ingelsson E,E,

J,Gunnarsson MD,Hyman BT，Basun H,Ingelsson M,Lannfelt L,Kilander L.Plasma beta amyloid and the risk of Alzheimer disease and dementia in elderly men:aprospective,population-based cohort study.Arch Neurol.2008Feb;65(2):256-63

Song MS,Mook-Jung I,Lee HJ,Min JY，Park MH.Serum anti-amyloid-betaantibodies and Alzheimer's disease in elderly Korean patients.J Int Med Res.2007May-Jun;35(3):301-6

Pesaresi M,Lovati C,Bertora P，Mailland E,Galimberti D,Scarpini E,Quadri P，Forloni G，Mariani C.Plasma levels of beta-amyloid(1-42)in Alzheimer's disease and mildcognitive impairment.Neurobiol Aging.2006Jun;27(6):904-5

Fukumoto H,Tennis M,Locascio JJ,Hyman BT，Growdon JH,Irizarry MC.Agebut not diagnosis is the main predictor of plasma amyloid beta-protein levels.ArchNeurol.2003Jul；60(7):958-64

Kosaka T，Imagawa M,Seki K,Arai H,Sasaki H,Tsuji S,Asami-Odaka A,Fukushima T，Imai K,Iwatsubo T.The beta APP717Alzheimer mutation increases thepercentage of plasma amyloid-beta protein ending at A beta42(43).Neurology.1997Mar；48(3):741-5

Scheuner D,Eckman C,Jensen M,Song X,Citron M,Suzuki N,Bird TD,Hardy J,Hutton M,Kukull W，Larson E,Levy-Lahad E,Viitanen M,Peskind E,Poorkaj P，Schellenberg G，Tanzi R,Wasco W，Lannfelt L,Selkoe D,Younkin S.Secreted amyloidbeta-protein similar to that in the senile plaques of Alzheimer's disease is increased in vivo bythe presenilin 1and 2and APP mutations linked to familial Alzheimer's disease.Nat Med.1996Aug;2(8):864-70

Sobów T，Flirski M,Kloszewska I,Liberski PP.Plasma levels of alpha beta peptidesare altered in amnestic mild cognitive impairment but not in sporadic Alzheimer'sdisease.Acta Neurobiol Exp(Wars).2005;65(2):117-24

Tamaoka A,Fukushima T，Sawamura N,Ishikawa K,Oguni E,Komatsuzaki Y，Shoji S.Amyloid beta protein in plasma from patients with sporadic Alzheimer's disease.JNeurol Sci.1996Sep 15;141(1-2):65-8

Vanderstichele H,Van Kerschaver E,Hesse C,Davidsson P，Buyse MA,AndreasenN,Minthon L,Wallin A,Blennow K,Vanmechelen E.Standardization of measurement ofbeta-amyloid(1-42)in cerebrospinal fluid and plasma.Amyloid.2000Dec;7(4):245-58

Abdullah L,Paris D,Luis C,Quadros A,Parrish J,Valdes L,Keegan AP，MathuraV，Crawford F，Mullan M.The influence of diagnosis,intra-and inter-person variability onserum and plasma Abeta levels.Neurosci Lett.2007Nov 27;428(2-3):53-8

Freeman SH,Raju S,Hyman BT，Frosch MP，Irizarry MC.Plasma Abeta levels donot reflect brainAbeta levels.J Neuropathol Exp Neurol.2007Apr；66(4):264-71

Mehta PD,Pirttila T，Patrick BA,Barshatzky M,Mehta SP.Amyloid beta protein1-40and 1-42levels in matched cerebrospinal fluid and plasma from patients with Alzheimerdisease.Neurosci Lett.2001May 18;304(1-2):102-6

Giedraitis V，

J,Irizarry MC,

N,Hyman BT，Wahlund LO,Ingelsson M,Lannfelt L.The normal equilibrium between CSF and plasma amyloid betalevels is disrupted in Alzheimer's disease.Neurosci Lett.2007Nov 12;427(3):127-31

Blasko I,Jellinger K,Kemmler G，Krampla W，Jungwirth S,Wichart I,Tragl KH,Fischer P.Conversion from cognitive health to mild cognitive impairment and Alzheimer'sdisease:prediction by plasma amyloid beta 42,medial temporal lobe atrophy andhomocysteine.Neurobiol Aging.2008Jan;29(1):1-11

Mehta PD,

T，Mehta SP，Sersen EA,Aisen PS,Wisniewski HM.Plasma andcerebrospinal fluid levels of amyloid beta proteins 1-40and 1-42in Alzheimer disease.ArchNeurol.2000Jan;57(1):100-5

Brettschneider S,Morgenthaler NG，Teipel SJ,Fischer-Schulz C,Bürger K,DodelR,Du Y，

HJ,Bergmann A,Hampel H.Decreased serum amyloid beta(1-42)autoantibody levels in Alzheimer's disease,determined by a newly developedimmuno-precipitation assay with radiolabeled amyloid beta(1-42)peptide.BiolPsychiatry2005Apr 1;57(7):813-6

Bibl M,Esselmann H,Mollenhauer B,Weniger G，Welge V，Liess M,Lewczuk P，Otto M,Schulz JB,Trenkwalder C,Kornhuber J,Wiltfang J.Blood-based neurochemicaldiagnosis of vascular dementia:a pilot study.J Neurochem.2007Oct;103(2):467-74

Walsh DM,Selkoe DJ.A beta oligomers-a decade of discovery.J Neurochem.2007Jun;101(5):1172-84

Lambert MP，Barlow AK,Chromy BA,Edwards C,Freed R,Liosatos M,MorganTE,Rozovsky I,Trommer B,Viola KL,Wals P，Zhang C,Finch CE,Krafft GA,KleinWL.Diffusible,nonfibrillar ligands derived from Abeta 1-42are potent central nervoussystem neurotoxins.Proc Natl Acad Sci USA.1998May 26；95(11):6448-53.

Walsh DM,Klyubin I,Fadeeva JV，Cullen WK,Anwyl R,Wolfe MS,Rowan MJ,Selkoe DJ.Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampallong-term potentiation in vivo.Nature.2002Apr4;416(6880):535-9.

Kayed R,Sokolov Y，Edmonds B,McIntire TM,Milton SC,Hall JE,Glabe CG.Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of solubleamyloid oligomers in protein misfolding diseases.J Biol Chem.2004Nov 5;279(45):46363-6

Cleary JP，Walsh DM,Hofmeister JJ,Shankar GM,Kuskowski MA,Selkoe DJ,Ashe KH.Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitivefunction.Nat Neurosci.2005Jan;8(1):79-84.

Pitschke M,Prior R,Haupt M,Riesner D.Detection of single amyloid beta-proteinaggregates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's patients by fluorescence correlationspectroscopy.Nat Med.1998Jul；4(7):832-4

Santos AN,Torkler S,Nowak D,SchlittigC,Goerdes M,Lauber T，Trischmann L,Schaupp M,Penz M,Tiller FW，

G.Detection of amyloid-beta oligomers in humancerebrospinal fluid by flow cytometry and fluorescence resonance energy transfer.JAlzheimers Dis.2007Mar；11(1):117-25

Klyubin I,Betts V，Welzel AT，Blennow K,Zetterberg H,Wallin A,Lemere CA,Cullen WK,Peng Y，Wisniewski T，Selkoe DJ,Anwyl R,Walsh DM,Rowan MJ.Amyloidbeta protein dimer-containing human CSF disrupts synaptic plasticity:prevention by systemicpassive immunization.J Neurosci.2008Apr 16；28(16):4231-7

Roher AE,Baudry J,Chaney MO,Kuo YM,Stine WB,Emmerling MR.Oligomerizaiton and fibril asssembly ofthe amyloid-beta protein.Biochim Biophys Acta.2000Jul 26;1502(1):31-43

Stenh C,Englund H,Lord A,Johansson AS,Almeida CG，Gellerfors P，Greengard P，Gouras GK,Lannfelt L,Nilsson LN.Amyloid-beta oligomers are inefficiently measured byenzyme-linked immunosorbent assay.Ann Neurol.2005Jul;58(1):147-50.

Englund H,Sehlin D,Johansson AS,Nilsson LN,Gellerfors P，Paulie S,Lannfelt L,Pettersson FE.Sensitive ELISA detection of amyloid-beta protofibrils in biologicalsamples.J Neurochem.2007Oct;103(1):334-45.

Schupf N,Tang MX,Fukuyama H,Manly J,Andrews H,Mehta P，Ravetch J,Mayeux R.Peripheral Abeta subspecies as risk biomarkers of Alzheimer's disease.Proc NatlAcad Sci USA.2008Sep 16；105(37):14052-7

Englund H,Degerman Gunnarsson M,Brundin RM,Hedlund M,Kilander L,Lannfelt L,Pettersson FE.Oligomerization partially explains the lowering of Abeta42inAlzheimer's disease cerebrospinal fluid.Neurodegener Dis.2009;6(4):139-47.Epub2009Jun12

Hansson O,Zetterberg H,Vanmechelen E,Vanderstichele H,Andreasson U,Londos E,Wallin A,Minthon L,Blennow K.Evaluation of plasma Abeta(40)and Abeta(42)as predictors of conversion to Alzheimer's disease in patients with mild cognitiveimpairment.Neurobiol Aging.2008May 16.[Epub ahead of print]

Kessler J,Calabrese P，Kalbe E,Berger F.Ein neues Screening-Verfahren zurUnterstützung der Demenzdiagnostik.Psycho 26 343-347(2000)

Folstein MF，Folstein SE,McHugh PR."Mini-mental state".A practical method forgrading the cognitive state of patients for the clinician.J Psychiatr Res.1975Nov;12(3):189-98

Shulman KI,Shedletsky R,Silver IL.The challenge of time:Clock-drawing andcognitive function in the elderly.Int J Geriatr Psychiatry 1,135-140(1986)

Irie K,Murakami K,Masuda Y，Morimoto A,Ohigashi H,Ohashi R,Takegoshi K,Nagao M,Shimizu T，Shirasawa T.Structure of beta-amyloid fibrils and its relevance totheir neurotoxicity:implications for the pathogenesis of Alzheimer's disease.J BiosciBioeng.2005May;99(5):437-47

(2)Simonsen AH,Hansson SF，Ruetschi U,McGuire J,Podust VN,Davies HA,Mehta P，Waldemar G，Zetterberg H,Andreasen N,Wallin A,Blennow K.Amyloid beta1-40quantification in CSF:comparison between chromatographic and immunochemicalmethods.Dement Geriatr Cogn Disord.2007;23(4):246-50

Casas C,Sergeant N,Itier JM,Blanchard V，Wirths O,van der Kolk N,VingtdeuxV，van de Steeg E,Ret G，Canton T，Drobecq H,Clark A,Bonici B,Delacourte A,Benavides J,Schmitz C,Tremp G，Bayer TA,Benoit P，Pradier L.Massive CA1/2neuronal loss with intraneuronal and N-terminal truncated Abeta42accumulation in a novelAlzheimer transgenic model.Am J Pathol.2004Oct;165(4):1289-300

Gelfanova V，Higgs RE,Dean RA,Holtzman DM,Farlow MR,Siemers ER,Boodhoo A,Qian YW，He X,Jin Z,Fisher DL,Cox KL,Hale JE.Quantitative analysis ofamyloid-beta peptides in cerebrospinal fluid using immunoprecipitation and MALDI-Tofmass spectrometry.Brief Funct Genomic Proteomic.2007 Jun;6(2):149-58.

Sergeant N,Bombois S,Ghestem A,Drobecq H,Kostanj evecki V，Missiaen C,Wattez A,David JP，Vanmechelen E,Sergheraert C,Delacourte A.Truncatedbeta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for thevaccination approach.J Neurochem.2003Jun;85(6):1581-91

Xia W，Yang T，Shankar G，Smith IM,Shen Y，Walsh DM,Selkoe DJ.A specificenzyme-linked immunosorbent assay for measuring beta-amyloid protein oligomers in humanplasma and brain tissue of patients with Alzheimer disease.Arch Neurol.2009Feb;66(2):190-9.

El-Agnaf OM,Mahil DS,Patel BP，Austen BM.Oligomerization and toxicity ofbeta-amyloid-42implicated in Alzheimer's disease.Biochem Biophys Res Commun.2000Jul14;273(3):1003-7

Howlett DR,Perry AE,Godfrey F，Swatton JE,Jennings KH,Spitzfaden C,Wadsworth H,Wood SJ，Markwell RE.Inhibition of fibril formation in beta-amyloidpeptide by a novel series of benzofurans.Biochem J.1999May 15;340(Pt 1):283-9

Claims (69)

1.诊断或监测神经变性疾病如阿尔茨海默病和轻度认知损害的方法，所述方法包括确定来自检测对象的生物学样品中靶淀粉样β肽(Abeta或Aβ)的寡聚状态，其特征在于所述方法包括如下步骤：

(a)确定生物学样品中靶Aβ肽的第一浓度(c_a)；

(b)解聚来自步骤(a)的靶Aβ肽；

(c)确定解聚的Aβ肽的第二浓度(c_d)；及

(d)确定c_d/c_a比率，其中将第二浓度(c_d)的数值除以第一浓度c_a的数值；其中c_d/c_a的比率低于1.5是神经变性疾病阳性诊断的指征。

2.权利要求1的方法，其中所述解聚步骤(b)包括使用碱。

3.权利要求2的方法，其中用于在步骤(b)中进行解聚的碱是氢氧化钠，如500mM氢氧化钠。

4.权利要求2或3的方法，其中所述解聚步骤(b)另外包括使用合适的溶剂，如甲醇，特别是50%(v/v)甲醇。

5.前述任一权利要求的方法，其中所述解聚步骤(b)包括保温步骤。

6.权利要求5的方法，其中所述解聚步骤(b)包括在室温进行至少2分钟的保温步骤。

7.权利要求6的方法，其中所述解聚步骤(b)包括在室温进行至少10分钟的保温步骤。

8.前述任一权利要求的方法，其中c_d/c_a的比率低于1.4如低于1.3是神经变性疾病阳性诊断的指征。

9.权利要求8的方法，其中c_d/c_a的比率低于1.2如低于1.1是神经变性疾病阳性诊断的指征。

10.前述任一权利要求的方法，其中所述靶Aβ肽包含SEQ ID NO.13的Aβ(3-38)的氨基酸序列。

11.前述任一权利要求的方法，其中所述靶Aβ肽包含SEQ ID NO.19的Aβ(11-38)的氨基酸序列。

12.前述任一权利要求的方法，其中所述靶Aβ肽是Aβ(x-y)，包括其功能等价物，其中x被定义是整数，选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，y被定义是整数，选自38、39、40、41、42和43。

13.权利要求10的方法，其中x是选自1、2、3和11的整数，如1，特别是11。

14.权利要求10的方法，其中y是选自38、40或42的整数，如40，特别是38。

15.前述任一权利要求的方法，其中所述靶Aβ肽选自SEQ ID NO.1-24，包括其功能等价物。

16.前述任一权利要求的方法，其中所述靶Aβ肽是SEQ ID NO:2的Aβ(1-40)，包括其功能等价物。

17.权利要求1-15任一项的方法，其中所述靶Aβ肽是SEQ ID NO:1的Aβ(1-42)，包括其功能等价物。

18.权利要求1-15任一项的方法，其中所述靶Aβ肽包含SEQ ID NO.2的Aβ(1-40)及SEQ ID NO.1的Aβ(1-42)，包括其功能等价物。

19.权利要求1-15任一项的方法，其中所述靶Aβ肽选自SEQ ID NO.13-24，包括其功能等价物。

20.权利要求1-15和19任一项的方法，其中所述靶Aβ肽是SEQ ID NO:13的Aβ(3-38)，包括其功能等价物。

21.权利要求1-15和19任一项的方法，其中所述靶Aβ肽是SEQ ID NO:19的Aβ(11-38)，包括其功能等价物。

22.权利要求19-21任一项的方法，其中在所述靶Aβ肽N末端的谷氨酸残基被环化为焦谷氨酸。

23.权利要求1-15任一项的方法，其中所述靶Aβ肽选自SEQ ID No.1-6，包括其功能等价物，以及其中在氨基酸位置1和/或7的天冬氨酸残基被转变为异天冬氨酸。

24.权利要求1-15任一项的方法，其中所述靶Aβ肽选自SEQ ID No.7-12，包括其功能等价物，以及其中在氨基酸位置6的天冬氨酸残基被转变为异天冬氨酸。

25.权利要求1-15任一项的方法，其中所述靶Aβ肽选自SEQ ID No.13-18，包括其功能等价物，以及其中在氨基酸位置5的天冬氨酸残基被转变为异天冬氨酸。

26.前述任一权利要求的方法，其中所述生物学样品选自血液、血清、尿液、脑脊液(CSF)、血浆、淋巴液、唾液、汗液、胸水、滑膜液、泪液、胆汁和胰腺分泌物。

27.权利要求26的方法，其中所述生物学样品是血浆。

28.前述任一权利要求的方法，其中确定靶Aβ肽浓度的步骤包括：

i)将生物学样品与至少两种不同的捕获抗体接触，

ii)检测所得免疫复合物，

iii)破坏所述免疫复合物，以及

iv)量化捕获的Aβ肽。

29.权利要求28的方法，其中所述至少两种不同的捕获抗体各自特异于Aβ肽上的不同表位。

30.权利要求28或29的方法，其中所述捕获抗体选自：

3D6，表位:1-5，

pAb-EL16，表位:1-7，

2H4，表位:1-8，

1E11，表位:1-8，

20.1，表位:1-10，

兔抗-Aβ多克隆抗体，表位:1-14(Abcam)，

AB10，表位:1-16，

82E1，表位:1-16，

pAb1-42，表位:1-11，

NAB228，表位:1-11，

DE2，表位:1-16，

DE2B4，表位:1-17，

6E10，表位:1-17，

10D5，表位:3-7，

WO-2，表位:4-10，

1A3，表位5-9，

pAb-EL21，表位5-11，

310-03，表位5-16，

鸡抗-人Aβ多克隆抗体，表位12-28(Abcam)，

鸡抗-人Aβ多克隆抗体，表位25-35(Abcam)，

兔抗-人Aβ多克隆抗体，表位:N-末端(ABR)，

兔抗-人Aβ多克隆抗体(Anaspec)，

12C3，表位10-16，

16C9，表位10-16，

19B8，表位9-10，

pAb-EL26，表位:11-26，

BAM90.1，表位:13-28，

兔抗-β-淀粉样蛋白(pan)多克隆抗体，表位:15-30(MBL)，

22D12，表位:18-21，

266，表位:16-24，

pAb-EL17，表位:15-24，

4G8，表位:17-24，

兔抗-Aβ多克隆抗体，表位:22-35(Abcam)，

G2-10，表位:31-40，

兔抗-Aβ，aa 32-40多克隆抗体(GenScript Corporation)，

EP1876Y，表位:x-40，

G2-11，表位:33-42，

16C11，表位:33-42，

21F12，表位:34-42，

1A10，表位:35-40，及

D-17山羊抗-Aβ抗体，表位:C-末端

焦谷氨酸Aβ抗体，Probiodrug AG

Aβ5-5-6，

Aβ6-1-6，

Aβ17-4-3，

Aβ24-2-3，

焦谷氨酸Aβ抗体克隆2-48(单克隆，小鼠)，Synaptic Systems，

焦谷氨酸Aβ抗体(多克隆，兔)，Synaptic Systems，

焦谷氨酸Aβ抗体克隆8E1(单克隆，小鼠)，Anawa，

焦谷氨酸Aβ抗体克隆8E1(单克隆，小鼠)，Biotrend，

抗-人淀粉样蛋白β(N3pE)兔IgG(多克隆，兔)，IBL，

抗-人AβN3pE(8E1)小鼠IgG Fab(单克隆，小鼠)，IBL

isoAsp抗体(T.Saido小组)。

31.权利要求28-30任一项的方法，其中所述捕获抗体选自3D6、BAN50、82E1、6E10、WO-2、266、BAM90.1、4G8、G2-10、1A10、BA27、11A5-B10、12F4和21F12。

32.权利要求28-31任一项的方法，其中如下抗体对用作捕获抗体：

4G8和11A5-B10，

3D6和4G8，

6E10和4G8,

82E1和4G8，

4G8和12F4，

4G8和21F12，

3D6和21F12，

6E10和21F12，

BAN50和4G8，

3D6和11A5-B10，

3D6和1A10，

3D6和BA27，

6E10和11A5-B10，

6E10和1A10，

6E10和BA27，

4G8和11A5-B10，

4G8和1A10，

4G8和BA27，

4G8和12F4，及

4G8和21F12。

33.权利要求30-32任一项的方法，其中所述复合物的检测通过使用与每种捕获抗体特异性反应的二抗进行。

34.权利要求33的方法，其中所述二抗是抗小鼠抗体或抗兔抗体。

35.权利要求33或34的方法，其中所述二抗是标记的。

36.权利要求33-34任一项的方法，其中所述二抗被固定化在磁珠上。

37.权利要求36的方法，其中使用磁性分离器使携带所述免疫复合物的磁珠与生物学样品分离。

38.权利要求30-37任一项的方法，其中所述免疫复合物的破坏是在存在50%(v/v)甲醇/0.5%(v/v)甲酸的条件下进行的。

39.权利要求30-38任一项的方法，其中量化检测的免疫复合物。

40.权利要求30-39任一项的方法，其中捕获的Aβ肽通过选自如下的量化手段量化；夹心ELISA，淀粉样蛋白β1-40

测定，Alphascreen^TM测定，多重测定系统，质谱分析法及Western印迹分析法。

41.权利要求40的方法，其中捕获的Aβ肽通过夹心ELISA作为量化手段进行量化。

42.权利要求41的方法，其中所述夹心ELISA包括第一抗体，其特异于Aβ(x-y)的完整N末端，及包括检测抗体，其特异于以氨基酸y结束的Aβ(x-y)的C末端。

43.权利要求42的方法，其中所述夹心ELISA包含第一抗体，其特异于SEQ ID NO.2的Aβ(1-40)的完整N末端；及包含检测抗体，其特异于在第40位氨基酸结束的SEQ ID NO.2的Aβ(1-40)的C末端。

44.权利要求42的方法，其中所述夹心ELISA包含第一抗体，其特异于SEQ ID NO.1的Aβ(1-42)的完整N末端；及包含检测抗体，其特异于在第42位氨基酸结束的SEQ ID NO.1的Aβ(1-42)的C末端。

45.权利要求42的方法，其中所述夹心ELISA包含第一抗体，其特异于SEQ ID NO.2的Aβ(1-40)的C末端；及包含检测抗体，其特异于以Asp-Ala-Glu开始的SEQ ID NO.2的Aβ(1-40)的完整N末端。

46.权利要求42的方法，其中所述夹心ELISA包含第一抗体，其特异于SEQ ID NO.1的Aβ(1-42)的C末端；及包含检测抗体，其特异于以Asp-Ala-Glu开始的SEQ ID NO.1的Aβ(1-42)的完整N末端。

47.权利要求42的方法，其中所述夹心ELISA包含第一抗体，其特异于选自SEQ ID NO.13-24的Aβ靶肽的完整N末端；及包含检测抗体，其特异于选自SEQ ID NO.13-24的所述Aβ靶肽的C末端。

48.权利要求42的方法，其中所述夹心ELISA包含第一抗体，其特异于SEQ ID NO.13的Aβ(3-38)的完整N末端；及包含检测抗体，其特异于在第38位氨基酸结束的SEQ ID NO.13的Aβ(3-38)的C末端。

49.权利要求42的方法，其中所述夹心ELISA包含第一抗体，其特异于SEQ ID NO.19的Aβ(11-38)的完整N末端；及包含检测抗体，其特异于在第38位氨基酸结束的SEQ ID NO.19的Aβ(11-38)的C末端。

50.权利要求47-49任一项的方法，其中选自SEQ ID NO.13-24的Aβ靶肽的N末端被环化为焦谷氨酸，以及其中所述第一抗体特异性检测焦谷氨酸化形式的选自SEQ ID NO.13-24的所述Aβ靶肽。

51.权利要求42-50任一项的方法，其中所述第一抗体是固定化的。

52.权利要求42-51任一项的方法，其中所述检测抗体是标记的。

53.权利要求42的方法，其中使用ELISA试剂盒量化Aβ(x-y)。

54.权利要求53的方法，其中所述ELISA试剂盒是量化SEQ ID NO.2的Aβ(1-40)的试剂盒，选自：Amyloid-β(1-40)(N)ELISA(IBL,JP27714)，Aβ[1-40]Human ELISA Kit(Invitrogen)，Human Amyloid beta(Amyloid-b)，aa 1-40ELISA Kit(Wako Chemicals USA,Inc.)，以及Amyloid Beta 1-40ELISA Kit(The Genetics Company)。

55.权利要求53的方法，其中所述ELISA试剂盒是量化SEQ ID NO.1的Aβ(1-42)的ELISA试剂盒，选自：Amyloid-β(1-42)(N)ELISA(IBL,JP27712)，Aβ[1-42]Human ELISA Kit(Invitrogen)，Human Amyloid beta(Amyloid-β)，aa 1-42 ELISA Kit(Wako Chemicals USA,Inc.)，Amyloid Beta1-40 ELISA Kit(The Genetics Company)，β-AMYLOID(1-42)(Innogenetics)。

56.前述任一权利要求的方法，用于阿尔茨海默病的鉴别诊断。

57.权利要求1-55任一项的方法，用于早期阿尔茨海默病的诊断。

58.权利要求57的方法，用于轻度认知损害的诊断。

59.权利要求10-25任一项定义的寡聚Aβ肽如靶Aβ肽在诊断阿尔茨海默病中的应用。

60.权利要求59的应用，用于阿尔茨海默病的鉴别诊断。

61.权利要求59或60的应用，用于早期阿尔茨海默病的诊断。

62.权利要求61的应用，用于轻度认知损害的诊断。

63.确定生物学样品中靶淀粉样β肽(Abeta或Aβ)的寡聚状态的方法，包括如下步骤：

(a)确定生物学样品中靶Aβ肽的第一浓度(c_a)，

(b)解聚来自步骤(a)的靶Aβ肽，

(c)确定解聚的Aβ肽的第二浓度(c_d)，及

(d)确定c_d/c_a的比率，其中将第二浓度(c_d)的值除以第一浓度(c_a)的值，其中c_d/c_a比率超过1是存在寡聚Aβ的指征。

64.权利要求65的方法，其中所述解聚步骤(b)包括使用碱。

65.诊断阿尔茨海默病的体外方法，其中使用权利要求63或64的确定淀粉样β肽的寡聚状态的方法。

66.诊断神经变性疾病如阿尔茨海默病的试剂盒，其包括合适的碱及根据权利要求1-55任一项的方法使用所述试剂盒的说明书。

67.监测在患有、怀疑患有或者倾向于患有神经变性疾病如阿尔茨海默病的对象中的治疗效力的方法，包括根据权利要求1-55任一项确定来自检测对象的生物学样品中靶淀粉样β肽(Abeta或者Aβ)的寡聚状态。

68.权利要求1-55或67任一项的诊断或监测方法，其包括确定来自检测对象的取自两个或多个时机的生物学样品中靶淀粉样β肽的寡聚状态。

69.权利要求68的诊断或监测方法，其包括对比取自两个或多个时机的生物学样品中靶淀粉样β肽的寡聚状态水平。

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