CN103776996A - 一种用于免疫复合物缓冲解离剂的cic抗体缓冲液解离剂 - Google Patents

一种用于免疫复合物缓冲解离剂的cic抗体缓冲液解离剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学检测领域，公开了一种用于免疫复合物缓冲解离剂的CIC抗体缓冲液解离剂，每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分：甘氨酸、35%-37%的浓盐酸、氯化钠、液体生物防腐剂、蒸馏水。本发明利用该种免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法，建立了特异性检测CIC中抗体的标准操作流程，这是目前现有CIC检测方法都无法解决的问题。本发明同时具备特异、灵敏、批量高效、重复性好、不受干扰、可定量或定性检测的技术特征。该种免疫复合物缓冲解离剂应用于患有感染性疾病、内分泌代谢性疾病、自身免疫性疾病、部分肿瘤疾病患者的体液标本中CIC的检测。

Description

一种用于免疫复合物缓冲解离剂的CIC抗体缓冲液解离剂
技术领域
本发明涉及医学检测领域，尤其涉及一种用于免疫复合物缓冲解离剂的CIC抗体缓冲液解离剂。
背景技术
细菌、病毒等病原体侵入机体后或致敏物质(抗原，含自身抗原)刺激机体发生免疫应答，进而产生特异性免疫效应细胞或抗体，并与抗原发生特异性结合，所得到的复合物称为免疫复合物(又称抗原抗体复合物，immune complex，IC)，主要有IgG，IgM，IgA，IgE型免疫复合物，其中以IgG和IgM最常见。由于抗原与抗体比例不同，所形成的IC分子大小各异，通常有三种形式：一是抗原抗体比例适当时，形成大分子的不溶性IC(大于19S)，易被吞噬细胞捕获、吞噬和清除。二是抗原量过剩时，形成小分子的可溶性IC(小于6.6S)，易透过肾小球滤过随尿排出体外。三是抗原量稍过剩时，形成中等大小的可溶性IC(8.8-19S)，它既不被吞噬细胞清除，又不能通过肾小球滤过排出，可较长时间游离于血液和其他体液中，又称循环免疫复合物(circulating immuno complex，CIC)。
正常情况下，机体内的游离抗原与相应抗体结合形成IC，可被机体的防御系统清除，作为清除异物抗原的一种方式，对机体有利。但在某些病理情况下，体内形成的IC不能被及时清除，可在局部沉积，通过激活补体，并在血小板、中性粒细胞等参与下，引起一系列连锁反应而导致组织损伤，出现临床症状，称为免疫复合物病(immuno complex disease，ICD)。检查组织内或循环体液中IC的存在有助于某些疾病的诊断、发病机制的研究、预后评估、病情活动观察和疗效判断等。因此，准确、特异、灵敏检测免疫复合物对疾病的诊断、治疗和预后评估具有重要的临床意义，CIC的检测日益受到重视。
世界卫生组织(WHO)曾组织进行CIC检测方法学研究，发现尚无任何一种技术同时具备特异、灵敏、批量高效、重复性好的所有特点。由于方法的复杂性、敏感性和所检测CIC类型的局限性，目前的常用CIC检测技术均受到免疫复合物内免疫球蛋白种类及亚类、复合物大小、抗原与抗体比例、固定补体的能力等因素影响，在临床免疫学实验室应用受到很大限制。
发明内容
本发明针对现有CIC检测技术及检测过程中，不能同时具备特异、灵敏、批量高效、重复性好、不受干扰的技术问题，公开了一种解决了以上技术问题的免疫复合物缓冲解离剂，还公开了该种免疫复合物缓冲解离剂的应用领域。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决。
一种免疫复合物缓冲解离剂，以如下体积比例配比计，各组分及含量为，135-165μl的CIC分离剂、290-315μl的CIC洗涤剂、5-16μl的CIC复溶剂、65-76μl的CIC抗体缓冲液解离剂和65-76μl的CIC抗体缓冲液解离中和剂。以制备的HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例，本发明的试剂配方可以使CIC中的抗体解离率达到37.5%-51.0%(抗体解离率：指CIC解离后检测到的抗体量与实际CIC中抗体量的百分比)。而现有的CIC检测技术因为抗体被破坏或一些干扰因素的存在，无法检测CIC中的抗体。
其中，每1L的CIC分离剂包括以下组分：5.2g-7.7g的硼砂、4.1g-6.1g的硼酸、70g-90g的聚乙二醇、6.2g-9.2g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC分离剂的作用如下：当每1L的CIC分离剂中包括5.2g-7.7g的硼砂、4.1g-6.1g的硼酸、70g-90g的聚乙二醇、6.2g-9.2g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水时，被分离的CIC达到最大量，同时改用氯化钠也可避免了传统沉淀方法中氟化钠残留对后续检测抗体的干扰。本发明采用的聚乙二醇，作为优选选用聚乙二醇6000；本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分：5.2g-7.7g的硼砂、4.1g-6.1g的硼酸、35g-45g的聚乙二醇、8.0g-11.7g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。以上配方的CIC洗涤剂主要针对CIC分离剂的配方进行设计，其作用是洗去体液标本中多余的杂蛋白。本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分：8.0g-9.5g的氯化钠、0.01g-0.03g的氢氧化钠、50μl-500μl的聚乙二醇辛基苯基醚、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC复溶剂针对解离时的缓冲量大小而设计，以上配方的CIC复溶剂对分离CIC的损伤程度最小；采用等渗的聚乙二醇辛基苯基醚，低浓度的聚乙二醇辛基苯基醚协助溶解CIC。本发明所采用的聚乙二醇辛基苯基醚又叫Triton X-100，本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分：3.5-5.5g的甘氨酸、4.0ml-6.0ml质量分数为35%-37%的浓盐酸、4.4g-6.6g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。该组分的CIC抗体缓冲液解离剂使CIC中抗体解离效果较为理想。如以制备的HBsAg-抗-HBs免疫复合物为参照，抗体解离率达到37.5%-51.0%。本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
作为优选，每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分：4.0g-5.0g的甘氨酸、4.5ml-5.5ml质量分数为35.5%-36.5%的浓盐酸、4.8g-6.0g的氯化钠、120μl-450μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。该组分的CIC抗体缓冲液解离剂使CIC中抗体解离效果较为理想。如以制备的HBsAg-抗-HBs免疫复合物为参照，抗体解离率达到40%-51%。本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
作为优选，每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分：4.5g-5.0g的甘氨酸、5.0ml-5.5ml质量分数为36%-36.5%的浓盐酸、5.5g-6.0g的氯化钠、200μl-450μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。该组分的CIC抗体缓冲液解离剂使CIC中抗体解离程度最为理想。如以制备的HBsAg-抗-HBs免疫复合物为参照，抗体解离率达到45%-51%。本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
作为优选，每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分：4.5g的甘氨酸、5.0ml质量分数为36%的浓盐酸、5.5g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。该组分的CIC抗体缓冲液解离剂使CIC中抗体达到最大程度的解离。如以制备的HBsAg-抗-HBs免疫复合物为参照，抗体解离率达到51.0%。本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
每1L的CIC抗体缓冲液解离中和剂包括以下组分：6.8g-10.0g的氨基丁三醇、6.5g-9.6g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。CIC抗体缓冲液解离剂主要是对CIC解离的抗体缓冲液进行中和，使渗透压、pH达到抗体的最适环境，以利于对抗体的检测。本发明中提到的液体生物防腐剂为Proclin-300。
以上提到的该种免疫复合物缓冲解离剂应用于患有感染性疾病、内分泌代谢性疾病、自身免疫性疾病、部分肿瘤疾病患者的血清、胸腹水、尿液、脑脊液、关节腔液中CIC的检测。感染性疾病、内分泌代谢性疾病、自身免疫性疾病、部分肿瘤疾病等患者的血清、胸腹水、尿液、脑脊液、关节腔液等体液标本中是否存在相应CIC，我们可以通过分离CIC，从而推断患者血清、胸腹水、尿液、脑脊液、关节腔液等体液中是否存在相应特异性标志物的CIC以及含量高低，以了解CIC在上述疾病发生发展过程中的病理生理作用及相关性；相关标志物阴性体液标本中若检测到相应CIC中的抗原或抗体(通常情况下，抗原解离率高于抗体解离率)，则能提高该标志物的检出率及对相应疾病的诊断灵敏度。
一种利用以上的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法，检测CIC中抗体的方法，以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例，由下述步骤组成，
A.分离：向2支1ml的离心管分别加入150μl含有CIC的待测样本，再分别加入135μl-165μl的CIC分离剂；混匀后，在37℃放置30min，进行离心，离心结束后弃去上清液；
B.洗涤：向两支离心管中，分别加入290μl-315μl的CIC洗涤剂，离心后，弃去上清液，并将CIC沉淀物沥干；
C.复溶：分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中，加入5μl-16μl的CIC复溶剂，离心管安装于振荡器上，振荡至溶液中无块状沉淀物；
D.空白样品检测：将一支离心管标记为空白样品管，并加入65μl-76μl的抗体缓冲液解离剂和65μl-76μl的抗体缓冲液解离中和剂，混匀后检测抗-HBs，将检测结果作为空白值；
E.CIC抗体解离：将另一支离心管标记为测定样品管，并加入65μl-76μl抗体缓冲液解离剂，在15℃放置30min（在15℃空气孵育放置30min或在15℃℃水浴放置30min），得到解离液；
F.CIC抗体解离中和：向步骤E中得到的解离液中，加入65μl-76μl抗体缓冲液解离中和剂，混匀后检测抗-HBs，将检测结果作为测定值。
HBsAg-抗-HBs免疫复合物解离后抗体检测结果判断标准，如下表所示：
表1HBsAg-抗-HBs免疫复合物解离后抗体检测结果判断标准
Figure BDA0000461139380000051
注：在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法)，Cutoff值=10mIU/ml
该种利用免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法通过分离、洗涤、复溶、解离CIC、中和，然后采用(电)化学发光法、免疫印迹试验、酶联免疫吸附试验等临床免疫学实验室常规方法进行特异灵敏、定量或半定量检测抗体，整个实验流程充分考虑到温度、渗透压、pH环境对CIC、抗原、抗体的影响，建立了特异性检测CIC中抗体(解离后)的标准操作流程，这是目前现有CIC检测方法都无法解决的问题。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明改进了现有技术中，CIC检测技术特异性差的缺点。直接检测CIC中的抗体。
(2)本发明改进了现有技术中，CIC检测技术灵敏度低的缺点，通过免疫复合物缓冲解离剂解离CIC中的抗体，再通过特异性检测CIC中的抗体，使抗体检测结果达到ng/ml和mIU/ml的水平，从而精确地计算CIC含量。
(3)本发明重复性好，适合批量使用，提高了工作效率。重复性与临床免疫学实验室常规检测抗体的变异度相当，一次解离可利用多种方法检测多个项目。
(4)本发明解决了现有CIC检测技术不能同时具备特异、灵敏、批量高效、重复性好的问题。本发明既可以特异灵敏定量检测CIC中的抗体；又可以对多份体液标本中同一种CIC进行批量检测(如同时检测多份血清标本中的HBsAg-抗-HBs免疫复合物)；还可以对同一份体液标本中多种CIC进行高效检测(如对同一份血清标本中的HBsAg-抗-HBs、HBeAg-抗-HBe、HCV-cAg-抗-HCV、HIV-P24-抗-HIV等免疫复合物，或IgM、IgG、IgA型免疫复合物进行同时检测)。此外，本发明不需要特殊的仪器设备，适用于临床免疫学实验室常规的抗体检测项目；真正做到一次解离，同时检测多个项目，重复性(CV值)达到15%-20%以下。
(5)本发明消除了现有CIC检测技术中抗体检测过程中的干扰物质。本发明通过使用CIC抗体缓冲液解离中和剂，保障了抗体检测过程中没有任何物质干扰检测结果。
(6)本发明对游离抗体无论是阴性还是阳性的标本均适用。本发明通过将CIC从体液标本中分离出来，避免了体液标本中游离抗体阳性对分离CIC中的抗体检测的干扰。
(7)本发明避免了渗透压、pH对抗体检测的影响。本发明使检测体系的渗透压、pH值处于抗体的最适环境，从而避免了渗透压、pH对抗体检测的影响。
(8)本发明适用于低浓度CIC的检测。本发明可以通过CIC分离、调整解离体积达到浓缩CIC的目的，从而大大提高了CIC中抗体的检出率。
(9)本发明也涉及利用上述免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法，通过分离、洗涤、复溶、解离CIC、中和，最后检测样品中的CIC。建立了特异性检测CIC中抗体(解离后)的标准操作流程，这是目前现有CIC检测方法都无法解决的问题。
(10)本发明适合在临床免疫学实验室常规检测。标本处理相对简便，是目前现有CIC检测技术中操作比较方便、能在临床实验室普及、对疾病诊断最有价值的方法。
具体实施方式
实施例1
一种免疫复合物缓冲解离剂，以如下体积比例配比计，各组分及含量为，135μl的CIC分离剂、290μl的CIC洗涤剂、5μl的CIC复溶剂、65μl的CIC抗体缓冲液解离剂和65μl的CIC抗体缓冲液解离中和剂。
其中，每1L的CIC分离剂包括以下组分：5.2g的硼砂、4.1g的硼酸、70g的聚乙二醇、6.2g的氯化钠、100μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分：5.2g的硼砂、4.1g的硼酸、35g的聚乙二醇、8.0g的氯化钠、100μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分：8.0g的氯化钠、0.01g的氢氧化钠、50μl的聚乙二醇辛基苯基醚、100μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分：3.5g的甘氨酸、4.0ml质量分数为35%的浓盐酸、4.4g的氯化钠、100μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离中和剂包括以下组分：6.8g的氨基丁三醇、6.5g的氯化钠、100μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
一种利用以上的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法，检测CIC中抗体的方法，以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例，由下述步骤组成，
A.分离：向2支1ml的离心管分别加入150μl待测胸腹水样本，再分别加入135μl的CIC分离剂；混匀后，在37℃放置30min，进行离心，离心结束后弃去上清液；
B.洗涤：向两支离心管中，分别加入290μl的CIC洗涤剂，离心后，弃去上清液，并将CIC沉淀物沥干；
C.复溶：分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中，加入5μl的CIC复溶剂，离心管安装于振荡器上，振荡至溶液中无块状沉淀物；
D.空白样品检测：将一支离心管标记为空白样品管，并加入65μl的抗体缓冲液解离剂和65μl的抗体缓冲液解离中和剂，混匀后检测抗-HBs，将检测结果作为空白值；
E.CIC抗体解离：将另一支离心管标记为测定样品管，并加入65μl抗体缓冲液解离剂，在15℃空气孵育放置30min，得到解离液；
F.CIC抗体解离中和：向步骤E中得到的解离液中，加入65μl抗体缓冲液解离中和剂，混匀后检测抗-HBs，将检测结果作为测定值。
待测胸腹水样本的测试结果：测得的空白值>Cutoff，测定值>Cutoff，且测定值<130%空白值。即待测胸腹水样本中不存在CIC。[注：在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法)，Cutoff值=10mIU/ml]。
实施例2
一种免疫复合物缓冲解离剂，以如下体积比例配比计，各组分及含量为，165μl的CIC分离剂、315μl的CIC洗涤剂、16μl的CIC复溶剂、76μl的CIC抗体缓冲液解离剂和76μl的CIC抗体缓冲液解离中和剂。
其中，每1L的CIC分离剂包括以下组分：7.7g的硼砂、6.1g的硼酸、90g的聚乙二醇、9.2g的氯化钠、500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分：7.7g的硼砂、6.1g的硼酸、45g的聚乙二醇、11.7g的氯化钠、500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分：9.5g的氯化钠、0.03g的氢氧化钠、500μl的聚乙二醇辛基苯基醚、500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分：5.5g的甘氨酸、6.0ml质量分数为37%的浓盐酸、6.6g的氯化钠、500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离中和剂包括以下组分：10.0g的氨基丁三醇、9.6g的氯化钠、500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
一种利用以上的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法，检测CIC中抗体的方法，以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例，由下述步骤组成，
A.分离：向2支1ml的离心管分别加入150μl待测尿液样本，再分别加入165μl的CIC分离剂；混匀后，在37℃放置30min，进行离心，离心结束后弃去上清液；
B.洗涤：向两支离心管中，分别加入315μl的CIC洗涤剂，离心后，弃去上清液，并将CIC沉淀物沥干；
C.复溶：分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中，加入16μl的CIC复溶剂，离心管安装于振荡器上，振荡至溶液中无块状沉淀物；
D.空白样品检测：将一支离心管标记为空白样品管，并加入76μl的抗体缓冲液解离剂和76μl的抗体缓冲液解离中和剂，混匀后检测抗-HBs，将检测结果作为空白值；
E.CIC抗体解离：将另一支离心管标记为测定样品管，并加入76μl抗体缓冲液解离剂，在15℃℃水浴放置30min，得到解离液；
F.CIC抗体解离中和：向步骤E中得到的解离液中，加入76μl抗体缓冲液解离中和剂，混匀后检测抗-HBs，将检测结果作为测定值。
待测尿液样本的测试结果：测得的空白值<Cutoff，测定值>Cutoff。即待测尿液样本中存在CIC。[注：在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法)，Cutoff值=10mIU/ml]。
实施例3
一种免疫复合物缓冲解离剂，以如下体积比例配比计，各组分及含量为，150μl的CIC分离剂、300μl的CIC洗涤剂、10μl的CIC复溶剂、70μl的CIC抗体缓冲液解离剂和70μl的CIC抗体缓冲液解离中和剂。
其中，每1L的CIC分离剂包括以下组分：6.4g的硼砂、5.1g的硼酸、80g的聚乙二醇、7.7g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分：6.4g的硼砂、5.1g的硼酸、40g的聚乙二醇、9.9g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分：9.0g的氯化钠、0.016g的氢氧化钠、300μl的聚乙二醇辛基苯基醚、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分：4.5g的甘氨酸、5.0ml质量分数为36%的浓盐酸、5.5g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离中和剂包括以下组分：8.4g的氨基丁三醇、8.0的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
一种利用以上的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法，检测CIC中抗体的方法，以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例，由下述步骤组成，
A.分离：向2支1ml的离心管分别加入150μl待测脑脊液样本，再分别加入150μl的CIC分离剂；混匀后，在37℃放置30min，进行离心，离心结束后弃去上清液；
B.洗涤：向两支离心管中，分别加入300μl的CIC洗涤剂，离心后，弃去上清液，并将CIC沉淀物沥干；
C.复溶：分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中，加入10μl的CIC复溶剂，离心管安装于振荡器上，振荡至溶液中无块状沉淀物；
D.空白样品检测：将一支离心管标记为空白样品管，并加入70μl的抗体缓冲液解离剂和70μl的抗体缓冲液解离中和剂，混匀后检测抗-HBs，将检测结果作为空白值；
E.CIC抗体解离：将另一支离心管标记为测定样品管，并加入70μl抗体缓冲液解离剂，在15℃空气孵育放置30min，得到解离液；
F.CIC抗体解离中和：向步骤E中得到的解离液中，加入70μl抗体缓冲液解离中和剂，混匀后检测抗-HBs，将检测结果作为测定值。
待测脑脊液样本的测试结果：测得的空白值<Cutoff，测定值<Cutoff。即待测脑脊液样本中不存在CIC。[注：在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法)，Cutoff值=10mIU/ml]。
实施例4
一种免疫复合物缓冲解离剂，以如下体积比例配比计，各组分及含量为，150μl的CIC分离剂、300μl的CIC洗涤剂、10μl的CIC复溶剂、70μl的CIC抗体缓冲液解离剂和70μl的CIC抗体缓冲液解离中和剂。
其中，每1L的CIC分离剂包括以下组分：6.4g的硼砂、5.1g的硼酸、80g的聚乙二醇、7.7g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分：6.4g的硼砂、5.1g的硼酸、40g的聚乙二醇、9.9g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分：9.0g的氯化钠、0.016g的氢氧化钠、300μl的聚乙二醇辛基苯基醚、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分：4.0g的甘氨酸、4.5ml质量分数为35.5%的浓盐酸、4.8g的氯化钠、120μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离中和剂包括以下组分：8.4g的氨基丁三醇、8.0的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
一种利用以上的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法，检测CIC中抗体的方法，以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例，由下述步骤组成，
A.分离：向2支1ml的离心管分别加入150μl待测样本，再分别加入150μl的CIC分离剂；混匀后，在37℃放置30min，进行离心，离心结束后弃去上清液；
B.洗涤：向两支离心管中，分别加入300μl的CIC洗涤剂，离心后，弃去上清液，并将CIC沉淀物沥干；
C.复溶：分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中，加入10μl的CIC复溶剂，离心管安装于振荡器上，振荡至溶液中无块状沉淀物；
D.空白样品检测：将一支离心管标记为空白样品管，并加入70μl的抗体缓冲液解离剂和70μl的抗体缓冲液解离中和剂，混匀后检测抗-HBs，将检测结果作为空白值；
E.CIC抗体解离：将另一支离心管标记为测定样品管，并加入70μl抗体缓冲液解离剂，在15℃放置30min，得到解离液；
F.CIC抗体解离中和：向步骤E中得到的解离液中，加入70μl抗体缓冲液解离中和剂，混匀后检测抗-HBs，将检测结果作为测定值。
待测样本的测试结果：测得的空白值<Cutoff，测定值<Cutoff。即待测样本中不存在CIC。[注：在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法)，Cutoff值=10mIU/ml]。
实施例5
一种免疫复合物缓冲解离剂，以如下体积比例配比计，各组分及含量为，150μl的CIC分离剂、300μl的CIC洗涤剂、10μl的CIC复溶剂、70μl的CIC抗体缓冲液解离剂和70μl的CIC抗体缓冲液解离中和剂。
其中，每1L的CIC分离剂包括以下组分：6.4g的硼砂、5.1g的硼酸、80g的聚乙二醇、7.7g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC洗涤剂包括以下组分：6.4g的硼砂、5.1g的硼酸、40g的聚乙二醇、9.9g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC复溶剂包括以下组分：9.0g的氯化钠、0.016g的氢氧化钠、300μl的聚乙二醇辛基苯基醚、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分：5.0g的甘氨酸、5.5ml质量分数为36.5%的浓盐酸、6.0g的氯化钠、450μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
每1L的CIC抗体缓冲液解离中和剂包括以下组分：8.4g的氨基丁三醇、8.0的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
一种利用以上的免疫复合物缓冲解离剂检测CIC的方法，检测CIC中抗体的方法，以HBsAg-抗-HBs免疫复合物为例，由下述步骤组成，
A.分离：向2支1ml的离心管分别加入150μl待测样本，再分别加入150μl的CIC分离剂；混匀后，在37℃放置30min，进行离心，离心结束后弃去上清液；
B.洗涤：向两支离心管中，分别加入300μl的CIC洗涤剂，离心后，弃去上清液，并将CIC沉淀物沥干；
C.复溶：分别向含有沥干的CIC沉淀物的离心管中，加入10μl的CIC复溶剂，离心管安装于振荡器上，振荡至溶液中无块状沉淀物；
D.空白样品检测：将一支离心管标记为空白样品管，并加入70μl的抗体缓冲液解离剂和70μl的抗体缓冲液解离中和剂，混匀后检测抗-HBs，将检测结果作为空白值；
E.CIC抗体解离：将另一支离心管标记为测定样品管，并加入70μl抗体缓冲液解离剂，在15℃放置30min，得到解离液；
F.CIC抗体解离中和：向步骤E中得到的解离液中，加入70μl抗体缓冲液解离中和剂，混匀后检测抗-HBs，将检测结果作为测定值。
待测样本的测试结果：测得的空白值<Cutoff，测定值<Cutoff。即待测样本中不存在CIC。[注：在美国雅培i2000免疫分析仪上检测(化学发光法)，Cutoff值=10mIU/ml]。
实施例6
1.采用实施例3所述的免疫复合物缓冲解离剂与胃蛋白酶消化法、强酸解离法、表面活性剂活检测自身免疫性疾病CIC中的抗体结果比较
随机收集日常工作中自身免疫性疾病患者(活动期与静止期系统性红斑狼疮SLE，干燥综合症SS，类风湿关节炎RA等)标本各1份，分别采用实施例6所述的免疫复合物缓冲解离剂、胃蛋白酶消化法、强酸解离法和表面活性剂解离法对其血清标本进行解离，然后采用欧蒙免疫印迹试验(WB)检测自身抗体谱，结果见表2。
表2实施例3对自身免疫性疾病患者CIC中的自身抗体检测结果
Figure BDA0000461139380000151
Figure BDA0000461139380000161
注：±、+、++、+++代表阳性程度递增，-代表阴性结果。*因未将CIC分离后进行抗-dsDNA检测，故检测到的抗-dsDNA阳性无法判断该抗体是否来自CIC中的抗体还是游离抗体。
2.采用实施例3所述的免疫复合物缓冲解离剂检测不同体液中CIC中的抗体结果
收集日常工作中长期使用胰岛素治疗的II型糖尿病患者血清15份，类风湿关节炎患者关节腔液7份，采用实施例3对上述体液标本CIC中的抗体进行解离，然后采用ELISA、化学发光法、免疫印迹试验检测相应的抗体，结果见表3。
表3实施例3对不同体液中CIC中的抗体检测结果
病种 标本类型 例数 检测项目 实施方法 阳性率(%)
II型糖尿病 血清 15 胰岛素抗体 实施例3 46.7
类风湿关节炎 关节腔液 7 抗-CCP、抗-RA33 实施例3 100
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种用于免疫复合物缓冲解离剂的CIC抗体缓冲液解离剂，其特征在于：包括CIC抗体缓冲液解离剂；其中，每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分：3.5g-5.5g的甘氨酸、4.0ml-6.0ml质量分数为35%-37%的浓盐酸、4.4g-6.6g的氯化钠、100μl-500μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
2.权利要求1所述的一种用于免疫复合物缓冲解离剂的CIC抗体缓冲液解离剂，其特征在于：每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分：4.0g-5.0g的甘氨酸、4.5ml-5.5ml质量分数为35.5%-36.5%的浓盐酸、4.8g-6.0g的氯化钠、120μl-450μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
3.权利要求1所述的一种用于免疫复合物缓冲解离剂的CIC抗体缓冲液解离剂，其特征在于：每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分：4.5g-5.0g的甘氨酸、5.0ml-5.5ml质量分数为36%-36.5%的浓盐酸、5.5g-6.0g的氯化钠、200μl-450μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
4.权利要求1所述的一种用于免疫复合物缓冲解离剂的CIC抗体缓冲液解离剂，其特征在于：每1L的CIC抗体缓冲液解离剂包括以下组分：4.5g的甘氨酸、5.0ml质量分数为36%的浓盐酸、5.5g的氯化钠、200μl的液体生物防腐剂、余量为蒸馏水。
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CN1396454A (zh) * 2001-07-16 2003-02-12 中国科学院化工冶金研究所 利用固相免疫吸附法制备交联抗体的方法
CN101832999A (zh) * 2010-04-29 2010-09-15 山东莱博生物科技有限公司 一种抗原抗体复合物解离液试剂盒及应用
CN102666577A (zh) * 2009-11-24 2012-09-12 前体生物药物股份公司 诊断阿尔茨海默病或轻度认知损害的新的诊断方法

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成军等: "免疫复合物解离剂研制及实验条件的研究", 《2012年浙江省检验医学学术年会论文集》, 31 December 2012 (2012-12-31), pages 94 - 98 *

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