BG107498A - Ранна диагностика на конформационни заболявания - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до метод за диагностика или определяне на конформационни заболявания чрез анализиране на маркер (патогенна конформационна форма) за такива заболявания в проба. Методът включвасистема за циклична амплификация, с помощта на която се увеличават нивата на патогенната конформационна форма, причиняваща тези заболявания. По-специално, такива трансмисибилни конформационни заболявания могат да бъдат прионни енцефалопатии. Изобретението се отнася също да анализи, до диагностични китове и до апаратури на базата на посочените методи.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящето изобретение се отнася до метод за диагностика или определяне на конформационни заболявания, чрез анализиране на маркер (т.е. на патогенна конформационна форма) за заболявания в проба, който метод включва система за циклична амплификация с цел увеличаване нивата на патогенната конформационна форма. По-специално, такива конформационни заболявания могат да бъдат прионни енцефалопатии.

ПРЕДШЕСТВАЩО НИВО НА ТЕХНИКАТА

Конформационните заболявания са група от нарушения, очевидно несходни едно с друго, но притежаващи много общи характеристики в клиничните картини, които отразяват техните общи молекулни механизми, като иницииране на самосъбиране, с последващо депозиране в тъканта и увреждане.

Структурният интерес се дължи на факта, че тези разнообразни заболявания, всяко от които се получава, чрез аберантен конформационен преход на определен белтък, се характеризира с това че води до агрегация на протеина и отлагането му в тъканите. От медицинска гледна точка, представянето на тези конформационни заболявания, отразява този молекулен механизъм, като типична бавна, вътрешна атака,

2<

• . .::··· ..................

появяваща се по време на прехода на нормалният белтък. Два примера за специфична значимост на такива конформационни заболявания са трансмисибилните спонгиозни енцефалопатии и Алцхаймеровата деменция, заболяване, което представлява заплаха за системата на здравеопазването в развиващия се свят (за общ преглед виж Carrell et al., 1997).

Трансмисибилните спонгиозни енцефалопатии (TSE), също известни като прионни заболявания, са група от невродегенеративни заболявания, които засягат хора и животни. При хората това са болестта на Кройцфелд-Якоб (CJD), kuru, болестта на Герцман-Щтраслер-Шейкер (GSS) и фаталното заболяване семейна инсомния (FFS) а при животни - скрап и спонгиозната енцефалопатия при говедата (BSE) също спадат към TSE заболявания (Prusiner, 1991).

Въпреки, че тези заболявания са относително рядко срещани при хора, властите на общественото здравеопазване и научната общественост обръщат внимание за риска от верижно предаване на BSE в хората, чрез храната (Cousens et al., 1997, Bruce et al, 1997).

Тези заболявания се характеризират с изключително дълъг инкубационен период, последван от кратко и неизменно фатално клинично заболяване (Roos et al., 1973). Засега не е известно лечение.

Ключова характеристика на заболяването е образуване на ненормална форма на белтъка, наречен PrP^Sc, който е продукт на пост-транслационна модификация на нормалния белтък PrP^c (Cohen and Prusiner, 1998). Не са открити разлики в химизма между РгР изоформите (Stahl et al., 1993) и конверсията изглежда, че включва конформационна промяна, при която алфа-спиралното съдържание на нормалния белтък намалява и количеството на бета-листовидната структура се увеличава (Pan et al., 1993). Структурните промени са последвани от промени в биохимичните свойства: РгР е

SC разтворим в не-денатуриращи детергенти, РгР е частично устойчив, което води до образуване на скъсен N-краен фрагмент, известен като “PrPres” (Bladwin et al., 1995; Cohen and

Presiner, 1998), “PrP 27-30 ” (27-30 kDa) или “РК-резистентна форма” (форма, резистентна на действието на протеиназа К).

Понастоящем, няма точна диагностика за TSE (WHO

Report, 1998, Budka et al., 1995, Weber et al., 1997). Опитите за развиване на диагностичен тест за прионни заболявания са възпрепятствани от очевидната липса на имунен отговор към PrP^Sc. Клиничното диагностициране на CJD понастоящем се базира на комбинацията от суб-остра прогресивна деменция (по-малко от 2 години), миоклонус и мултифокална неврологична дисфункция, свързани с характерна периодична електроенцефалограма (EEG) (WHO Report, 1998, Weber et al., 1997). Вариант на CJD (vCJD), обаче, повечето от ятрогенните форми на CJD и до 40% от спорадичните случаи не се характеризират с абнормални EEG (Steinhoff et al., 1996). Средно, точността на клиничните диагнози е около 60% за CJD и варира силно при другите прион-отнасящи се заболявания. Клиничната диагностика е по-точна само в късният етап от заболяването, когато се развиват ясни симптоми (Weber et al., 1997).

Генетични анализи се използват за диагностиката на наследствени прионни заболявания, но те представляват само 15% от случаите. Неврообрази се използват само за да се изключат други състояния на бърза прогресивна деменция, която се дължи на структурни лезии на мозъка (Weber et al., • · · • · · • ·♦ • · · · · •· • · · ··

• < · · · · • ·· • · · • ·· • · ·· • · · ·

1997). Откритията, получени от образите на мозъка чрез компютърна томография (СТ) и образ от магнитен резонанс (MRI), зависят главно от етапа на заболяването. СТ е по-малко чувствителна и в ранните фази не се наблюдават атрофии при 80 % от случаите (Galvez and Cartier, 1983). MRI хиперинтензивните сигнали се наблюдават в базалната ганглия близо до атрофията (Onofrji et al., 1993). Подобни промени се наблюдават чрез СТ, като тези промени в никакъв случай не са специфични.

Последни данни показват, покачване на нивото на някои невронални, астроцитни и глиални протеини при CJD (Jimi et al., 1992) . Белтъкът S-100, неврон-специфичен изоензим и убиквитина, значително се повишават в цереброспиналната течност (CSF) в ранните фази на заболяването, с покачване на концентрациите при напредване на забоялавнето (Jimi et al., 1992). Маркерът за невронална смърт, белтъкът 14-3-3, предлага специфичен тест за спорадично CJD (Hsieh et al., 1996). Обаче, не е използваем за диагностика на vCJD и е малко специфичен за генетични форми. Тъй като 14-3-3 белтъкът, може да присъства в пациенти е CSF при други състояния, тестът не се препоръчва от WHO за общ скрининг на CJD и се запазва като потвърдителен в клиничната диагностика (WHO Report, 1998).

Чрез комбиниране на клинични данни с биохимични маркери, се постига голям успех в диагностиката. Обаче, що се отнася до оперативната диагностика, която се използва понастоящем в European Surveillance of CJ[D, дефинитивната диагностика е установена само за невропатологично изследване и определяне на PrP^Sc чрез имунохистохимия, хистоблот или уестерн блот (Weber et al., 1997, Budka et al., 1995).

• · · • · · ·

• · · ·

Образуването на PrP^Sc не е само най-вероятната причина за заболяването, но също така е най-известния маркер. Определяне на PrP^Sc в тъканите и клетките, силно съответства на заболяването и с присъствието на TSE инфекция и леченията които са свързани с инактивиране или елиминиране на TSE инфекцията също елиминират PrP^Sc (Prusiner, 1991). Идентифицирането на PrP^Sc в човешки или животински тъкани се счита като ключ за TSE диагностиката (WHO Report, 1998).

A^t:

Едно важно ограничение на този подход, е чувствителността, тъй като количеството на PrP^Sc се повишава (достатъчно за определяне с конвенционалните методи) само в CNS в късните етапи на заболяването. Показано е обаче, че ранните етапи на заболяването имат общо разпределение на PrP^Sc (в малки количества), по-специално в лимфоретикуларната система (Aguzzi, 1997). В действителност, присъствието на PrP^Sc е установено в тъканта на сливиците и в апендикса, на пациенти с vCJD (Hill et al., 1997). Въпреки че не е известно, колко рано в процеса на заболяването се появява PrP^Sc, биопсията на сливиците и апендикса може да се използва за диагностиката на vCJD и е показано, че при овце, чувствителни към скрап, PrP^Sc може да бъде намерен в тъканта на сливиците пресимптоматично и рано през инкубационния период. Обаче, PrP^Sc засега не е наблюдаван в тъкани във всички случаи на спорадична CJD или GSS (Kawashima et al., 1997).

Нормалният белтък се експресира в белите кръвни клетки и тромбоцитите и затова е възможно някри бели клетки на засегнати индивиди да съдържат PrP^Sc (Aguzzi, 1997). Това увеличава възможността белите кръвни клетки, да се използват като тест за CJD, но този подход изисква по-чувствителен анализ, от тези които се използват понастоящем.

• · · • · · • · · · · • · • · · « · • · • · · · a

Съществува хипотеза, че прионната репликация се появява, когато PrP^Sc в инфектираният инокулум_взаимодейства специфично с РгР на гостоприемника, катализирайки неговото превръъщане в патогенна белтъчна форма (Cohen et al., 1994). Този процес протича в продължение на много месеци до години, докато се стигне до необходимата концентрация на PrP^Sc, достатъчна за да се проявят клиничните симптоми.

Инфекциозната единица на PrP^Sc изглежда притежава богата на бета-лист олигомерна структура, която се превръща в нормален белтък, чрез интегриране в нарастващия агрегат (Фиг.1). Превръщането се имитира in vitro чрез смесване на пречистен РгР е 50 пъти повече моларен излишък от предварително денатуриран PrP^Sc (Kocisko et al., 1994).

In vitro системата за превръщане, описана до сега, има ниска ефективност, тъй като изисква излишъкът от PrP^Sc олигомери (превръщащи се единици) да остане фиксиран по време на анализа. Превръщащите единици нарастват постепенно, и в крайна сметка, като резултат стават по-големи, но техният брой не се увеличава (Фиг. 1).

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Днес ние откриваме метод за диагностика или определяне на конформационно заболяване, където заболяването се характеризира с конформационен преход на определен белтък, между не-патогенна и патогенна конформационна форма, чрез анализиране на маркер за споменатото заболяване в проба, който метод включва:

(1) осъществяване на контакт на споменатата проба е друга не-патогенна конформационна форма;

(2) дезагрегиране на всеки от случайно образувалите се агрегати по време на стъпка (1); и (3) определяне на присъствието и/или количеството на споменатата патогенна конформационна форма в пробата.

Най-общо патогенната конформационна форма ще бъде маркер за присъствието на споменатото заболяване.

За предпочитане, стъпка (1) включва стъпка (1а) инкубиране на споменатата проба/не-патогенна ’’W' конформационна форма.

Съгласно предпочитан вариант от изобретението, стъпките (1а) и (2) образуват цикъл, който се повтаря най-малко два пъти преди да се извърши стъпка (3). В още по-предпочитан вариант, циклите се повтарят от 5 до 40 пъти, а в найпредпочитан вариант от 5 до 20 пъти.

Конформационни те заболявания се определят или се диагностицират, като такива, когато се характеризират с конформационен преход на определен белтък. Този “определен белтък” е белтък, който е способен да придобива не-патогенна и патогенна конформация. Един пример за такъв белтък е прионният белтък РгР. Следващ пример за такъв белтък е белтъкът, характерен за болестта на Алцхаймер, т.е. βамилоидният белтък.

За да бъдат диагностицирани или определени конформационните заболявания, за предпочитане те трябва да бъдат предавани (трансмисибилни) конформационни заболявания, като TSE (както са определени в Главата Предшестващо ниво на техниката).

В случаите на диагностициране на TSE и съгласно предпочитан вариант на изобретението, маркерът на заболяването, както и патогенната конформационна форма е

8.

• · · « · ..... ·· .:.

PrP^Sc, а не-патогенната конформационна форма на съответният белтъкът е РгР .

Количеството на не-патогенна конформационна форма, използвана в стъпка (1) (и избирателно в стъпка (16)) ще бъде обикновено в известно количество, въпреки че не е необходимо в случая, когато се изисква установяване на присъствието или отсъствието на патогенната конформационна форма.

За предпочитане е, количеството на не-патогенната конформационна форма, която се използва в стъпка (1) (и по избор в стъпка (16)) да бъде в излишни количества. Обикновено първоначалното съотношение на не-патогенната конформационна форма, спрямо патогенната конформационна форма (ако присъства в пробата) ще бъде повече от 100:1, за предпочитане, повече от 1000:1 и най-предпочитаното съотношение е повече от 1000000:1.

В следващ вариант на изобретението, не-патогенната конформационна форма от стъпка (1) присъства в мозъчни хомогенати от здрави лица и/или може да бъде добавена преди осъществяването на стъпка (1); ето защо, в този случай мозъчните хомогенати съдържат (за предпочитане известно количество) излишък от не-патогенната конформационна форма, добавена по време на стъпка (1). За предпочитане, мозъчният хомогенат от здраво лице идва от същият вид, от който е взета пробата за анализ (например човешки мозъчен хомогенат за анализиране на човешка проба, плъши мозъчен хомогенат за анализиране на проба от плъх). Още попредпочитан вариант, например е не-патогенната конформационна форма да присъства в специфични фракции от мозъчния хомогенат, например в липидни рафтове от мозъчен • · · 1»

-.9, • · · · • ·

хомогенат. Приготвянето на такива фракции може да бъде проведено например както е описано в Sargiacomo М et al., 1993.

Следователно, изобретението по-нататък се отнася до метод или анализ който е описан тук, където тъканта или тъканната фракция се добавя към не-патогенната конформационна форма в стъпка (1). За предпочитане е тъканта да е мозъчна тъкан, или хомогенат или фракция, получена от нея, от здрави лица (т.е. от такива, в които не присъства патогенната конформационна форма).

Съобщено е (Kocisko et al., 1994), че по-слабо £

гликозилираните форми на РгР се превръщат преимуществено Sc С в РгР форми. По-специално, РгР форми, които се третират с фосфатидилинозитол специфичната фосфолипаза С са обикновено по-ефективно превръщани в патогенни форми, в сравнение с пълната, по-тежка гликозилирана форма на РгР . Ето защо следващ вариант на изобретението се отнася до метод или анализ както този описан тук, където не-патогенна конформационна форма е РгР , която е с редуцирано ниво на гликозилиране (за предпочитане N-свързано гликозилиране) в сравнение с дивия тип РгР^с. За предпочитане РгР^с се обработва за отстраняване на някои, всички или значително количество от гликозилираните форми, преди да се използва като не-патогенна конформационна форма в методите и анализите описани тук, и в по-специално предпочитаните варианти, не-патогенната конформационна форма е РгР , където тя е в значителна степен не-гликозилирана.

f

В случая на диагностика на TSE, ако агрегати от патогенната форма присъстват в пробата по време на стъпка (1) те индуцират прехода PrP^c - PrP^Sc и по време на стъпка (2) такива агрегати ще бъдат разрушени в малки, все още .’•JO.:

::: · · ·

.. · · ·· · инфекциозни единици, като всяка от тях е все още в състояние да превключва към прехода на други РгР^с форми. Този тип метод, наречен тук “циклична амплификация” е представен на Фиг.2. Тази система води до експоненциално нарастване на количеството на PrP^Sc, в случаите когато той присъства в пробата, и той може лесно да се определи. Ето защо съгласно следващ предпочитан вариант на изобретението, е възможно да се изчисли количеството на PrP^Sc, първоначално присъстващо в пробата, като се знае какво е първоначалното количество на РгР , което се определя от количеството на РгР присъстващо в пробата в края на анализа и отчитайки броят на проведените цикли.

Ако в противовес на гореспоменатото, не се открие никакъв PrP^Sc (дали като такъв, или под формата на агрегати) да присъства в пробата, тогава нито една молекула РгР няма да се превърне в PrP^Sc и в края на анализа, маркерът ще отсъства напълно (няма да се открие никаква патогенна форма в пробата).

Показано е че инфекциозната единица PrP^Sc, като богат на β-лист олигомер, който може да се превръща в нормален белтък, чрез интегриране в нарастващ агрегат, където се изискват свойства свързани с ненормалната форма (протеазна устойчивост и не-разтворимост) (Jarrett and Lansbury, Jr., 1993, Caughey et al., 1997). След инкубирането на двете форми на РгР, олигомерните видове повишават размера си, чрез възстановяването и превръщането в РгР^с молекули. Този f процес, притежава ниска ефективност, тъй като зависи от фиксиран брой олигомери, които да нараснат на края. Броят на превръщащите се единици не се повишава в процеса на реакцията, когато те само стават по-големи. Приема се, че това е

процесът, който става в животинското или човешкото тяло след инфекция; процес известен с това, че продължава много месеци, дори няколко години. В това изобретение, ние описваме процедура за разрушаване на олигомерите, до по-малки единици, всяка от които след това е способна да се превърне в РгР^с.

Ето защо, системата има директно приложение в диагностиката на конформационни заболявания и по-специално в трансмисибилните конформационни заболявания, като TSE, чрез амплифициране от друга страна на незабележими количества от PrP^Sc в различни тъкани или биологични течности. Системата може да позволи ранно идентифициране на риск от развиване на TSE при хора, и може също да бъде широко приложима за следене на биохичината ефективност на съставките на TSE терапията по време на кличинчото развитие.

Съгласно предпочитан вариант на изобретението, пробата, която трябва да бъде анализирана се подлага на стъпка на “предварително-третиране” на пробата, в която се очаква да се установи патогенна конформационна форма. В случая на TSE са съобщени и РгР и РгР , че са локализирани в специална област на плазмената мембрана, която е устойчива към третиране с детергент при меки условия (като например изстуден Тритон Х-100), което се дължи на относително високото съдържание на холестерол и гликосфинголипиди (M.Vey et al., 1996). Тези мембранни домени са наречени липидни рафтове или детергент-устойчиви мембрани (DRM) или кавеоло-подобни домени (CLDs) и са богати на сигнални белтъци, рецептори и GPI-закотвени белтъци. Ние r-ι потвърждаваме, че 100 % от РгР в мозъка, се прикрепя към тази фракция, която съдържа < 2 % от всички белтъци (виж Пример • ·

-.12

6, Фигура 7). Следователно, проста стъпка на изолиране на липидни рафтове от пробата, позволява неимоверно обогатяване на РгР . Подобни резултати са получени от Заявка за изолиране на липидни рафтове, от мозъчни хомогенати на болни от скрап, в които PrP^Sc се възстановява в рафтовете.

Така, един вариант от изобретението включва стъпка, където пробата трябва да бъде анализирана и подложена на стъпка на предварително третиране, за успешно концентриране на патогенната конформационна форма в пробата. За предпочитане, патогенната конформационна форма е PrP^Sc и предварителното третиране е екстракцията от пробата на фракция, която е неразтворима в резултат от третиране с детергенти при меки условия.

Стъпка (1) и (1а) за предпочитане се повеждат при физиологични условия (pH, температура и йонна сила) и още по-предпочитан вариант протеазни инхибитори и детергенти, също се добавят към разтвора. Условията ще бъдат избрани, така че да позволят на която и да е патогенна конформационна форма, ако присъства в пробата да индуцира превръщането на не-патогенна конформационна форма в патогенна конформационна форма, и по този начин да образува агрегат или олигомер от патогенни конформационни форми. Подходящите физиологични условия, лесно ще станат очевидни за специалистите в областта.

Продължителността на инкубацията ще бъде за време, което ще позволи на някои, на всички или на значителна част от не-патогенната конформационна форма да се превърне в патогенна конформационна форма, приемайки че пробата съдържа известно количество патогенна конформационна форма. Времето ще бъде лесно определимо от специалистите в

областта. За предпочитане, всяка инкубация ще продължи между 1 минута до 4 часа, най-предпочитан вариант от 30 минути до 1 час и при по-специално предпочитан вариант продължителността е приблизително 60 минути.

Стъпката на инкубация (1а) може също да включва стъпка (16), която включва добавяне на ново количество от непатогенна конформационна форма.

Много методи могат да бъдат използвани за дезагрегация на агрегатите по време на стъпка (2) от метода, представен в изобретението. Те включват: третиране с разтворители (като натриев додецил сулфат, диметилсулфоксид, ацетонитрил, гуанидин, уреа, трифлуоретанол, разредена оцетна киселина, разредена мравчена киселина и т.н.), модификации на физикохимични характеристики на разтвора, като pH, температура, йонна сила, диелектрична константа, и физични методи, като ултразвуково третиране, лазерна ирадиация, замразяване/разчупване, French преса, автоклавиране, инкубация, високо налягане, разбъркване, хомогенизиране при меки условия, други видове на ирадиация и т.н. Ултразвуковото третиране е предпочитан метод, съгласно изобретението.

Дезагрегирането може да бъде осъществено за време, което позволява дезагрегиране на известно количество, на всички или на значителна част от агрегатите, които се образуват по време на стъпка (2). Не е необходимо за всички от агрегатите да бъдат дезагрегирани в всяка една стъпка на дезагрегиране. По този начин, броят на превърналите се единици се увеличава при всяка една стъпка на дезагрегиране.

Времето за дезагрегиране лесно ще бъде определено от специалистите в областта и може да зависи от метода за дезагрегиране който е приложен. За предпочитане, времето за • * ·« · · дезагрегиране се провежда за 1 секунда до 60 минути, в найпредпочитан вариант е от 5 секунди до 30 минути и специално предпочитан вариант е от 5 секунди до 10 минути. Ако дезагрегирането се извърши чрез ултразвуково третиране, ултразвуковото третиране за предпочитане продължава от 5 секунди до 5 минути и в най-предпочитан вариант от 5 до 30 секунди.

Ултразвуковото третиране се е прилагало в миналото, като част от няколко метода за пречистване на РгР, с цел увеличаване на разтворимостта на големи агрегати, но никога не е било описвано за in vitro амплифициране на РгР превръщането.

Използването на традиционен единичен ултразвуков дезинтергатор, налага разрешаването на проблема за работа е много проби едновременно, както ще се изисква при диагностичният тест. На пазара има някои ултразвукови дезинтегратори за 96-ямкови микро-плаки, които осигуряват ултразвуково третиране на всички ямки едновременно и могат да бъдат програмирани за автоматично опериране. Тези ултразвукови дезинтрегратори могат да бъдат лесно адаптирани за използване в диагностичният метод на настоящето изобретение.

Така, един вариант от изобретението се отнася до използването в стъпка (2) на ултразвуков дезинтергатор, опериращ с 96-ямкови микро-плаки.

Определянето на нова превърната патогенни конформационна форма, например PrP^Sc , (3) след процедура на 9 циклична амплификация, описана в стъпки (1) и (2) могат да бъдат проведени съгласно който и да е от известните методи. Специфично установяване на PrP^Sc обикновено (но не винаги, виж по-долу) се извършва при първата стъпка от разделянето на

-.15 ·* ·«·· двете PrP изоформите (нормален белтък и патогенен белтък).

Разделянето се провежда на базата на особени биохимични свойства на PrP^Sc, които го отличават най-вече по форма от нормалните белтъци в тялото, а именно: PrP^Sc е частично устойчив към

протеазно третиране и е не-разтворим, дори и в присъствие на не-денатуриращи детергенти. Ето защо, първата стъпка след процедурата на амплификация обикновено включва отстраняване или разделяне на РгР^с от пробата, или чрез третиране с протеази или чрез центрофугиране с цел разделяне на разтворимата форма (РгР ) от неразтворимата форма на белтъка (PrP^Sc). След това, определянето на PrP^Sc белтъка може да бъде определяно чрез който и да е от следните методи между другото:

А) Имуноблот след SDS-PAAGE. Той се извършва, чрез рутинна процедура, добре известна на специалистите в областта и чрез използване на някои от многото налични в търговската мрежа анти- РгР антитела.

Б) Elisa анализ. Определянето на твърдата фаза може да бъде направено, или чрез прост анализ в който пробата се натоварва върху плака и количеството на PrP^Sc се установява след това, чрез използване на анти-PrP антитела или в още по-предпочитан вариант чрез използване на сандвичова Elisa в която плаката първо се покрива с анти-PrP антитела, които улавят специфично РгР формата от пробата, които в крайна сметка се наблюдават чрез използване на втори анти- РгР антитела. И двете форми на Elisa могат също да бъдат използвани с белязани (радиоактивно, флуоресцентно, биотин-белязани и т.н.) анти- РгР антитела за допълнително увеличаване на чувствителността на детекцията.

В) Радиоактивни анализи. Нормалния РгР^с , който се използва като субстрат за процедурата на амплификация, може да бъде :16 ·· ··«· ·« •· • · •· • ·· ·· белязан (³Н, ^|4С, ³⁵S, ¹²⁵1 и т.н.) преди да започне процедурата и след отстраняването на не-превърната РгР форма, радиоактивността на новата PrP^Sc форма, може да бъде определена количествено. Тази процедура е по-скоро количествена и не разчита на

използането на антитела.

Г) Флуоресцентни анализи. Нормалните форми РгР^с , които се използват като субстрат за процедурата на амплификация, могат да бъдат белязани с флуоресцентни сонди, преди началото на процедурата и след отстраняването на не-превърнатите РгР^с, флуоресценцията на ново превърнатите PrP^Sc могат да бъдат определени количествено. Възможно е флуоресцентният анализ да не изисква отстраняване на не-превърнатите РгР^с , тъй като флуоресцентните свойства на РгР и РгР биха могли да бъдет различни, в резултат от различната конформация на двете изоформи.

Д) Анализи на агрегатите. Добре е известно,че PrP^Sc (но не и РгР ) е способен да образува агрегати, формиращи амилоидни фибрили или пръчковидни структури. Ето защо, детекцията на PrP^Sc може да бъде направена, чрез използване на методи, прилагани за количествено определяне на образуваните типове агрегати, включващи електронна микроскопия, оцветяване със специфични оцветители (Congo red, Thioflavin S и Т, и т.н. ), и турбидиметричен анализ. Анализа на агрегатите не изисква стъпка на разделяне на двете изоформи, тъй като е известно, че нормалните РгР^с не образуват агрегати.

Е) Структурни анализи. Най-важната разлика между нормалните и патогенните РгР е в техните третични структури. Ето защо, могат да бъдат използвани методи които позволяват структурна оценка на белтъците, включващи NMR, Цикличен дихроизъм, Fourier-трансформираща инфрачервена • · « · « * · · € · ··«···· · · ·· · · • · · · · ···· ···· · ·· ··· « · · · спектроскопия, Raman спектроскопия, вътрешна флуоресценция, УВ абсорбция и т.н.

Най-широко се използваното РгР моноклонално антитяло е “3F4” (Kascsak et al., 1987), което е моноклонално антитяло получено от мишка, имунизирана с хамстеровото 263К PrPres (устойчива към протеази конформационна форма). Така антитялото също е способно да разпознае не-патогенна конформационна форма на хамстери и хора, но не и от говежди, миши, плъши, овчи или заешки мозъци; също така е способно да се свърже с човешка патогенна конформационна форма, но само след денатурация на белтъците.

Такива антитела могат да бъдат белязани, с цел по-лесно определяне на маркера. Например време-разрешителните флуоресцентни измервания с европий-белязано 3F4 антитяло се използват от някои учени (Safer et al., 1998).

Гореописаните методи за детекция могат да бъдат прилагани за определяне на други патогенни конформационни форми, например за патогенната форма на β-амилоиден белтък, съответно.

В алтернативен вариант на изобретението, не-патогенната конформационна форма се добавя в излишък и може да бъде белязана и детектирана, така че количеството на неагрегираните конформационни форми накрая на анализа ще позволи определянето на количеството на патогенната конформационна форма, която първоначално е присъствала в пробата.

f

Съгласно следващ алтернативен вариант, патогенната конформационна форма (маркерът) може да бъде директно определена с антитяло свързващо се с нея.

• · · ·· .18 ···.··

... ··.· ·. .

······· . · ·. · ·

9 ... ···· ···· · ·· ... · · ··

В по-широк смисъл, белегът или белязан остатък, може да бъде добавен към патогенната конформационна форма, към непатогенната конформационна форма или към антитяло свързващо се с една от конформационните форми, в зависимост от вида на анализа, който се извършва.

Друга цел на изобретението е анализирането на маркер за конформационно заболяване, който се характеризира чрез конформационен преход на определен протеин между непатогенна и патогенна конформационна форма, в пробата, която се анализира и включва следните стъпки: (1) осъществяване на контакт на споменатата проба с количество от не-патогенна конформационна форма, (2) дезагрегиране на всички агрегати, които случайно се получават по време на стъпка (1) и (3) определяне на присъствието и/или количеството на споменатата патогенна конформационна форма в пробата. Най-общо патогенната конформационна форма ще бъде маркер за присъствието на споменатото заболяване.

Вероятно стъпка (1) включва стъпка (1а) инкубиране на споменатата проба/не-патогенна конформационна форма.

Съгласно предпочитан вариант на изобретението, стъпки (1а) и (2) формират цикъл, който се повтаря най-малко два пъти преди да се изпълни стъпка (3). В по-предпочитан вариант циклите да се повтарят от 5 до 40 пъти, и в най-предпочитан вариант те се повтарят от 5-20 пъти.

Следваща цел на настоящето изобретение е диагностичен кит за прилагане в специфичен анализ, който включва количество от не-патогенната конформационна форма и по избор също така, микро-плака и много-ямков ултразвуков дезинтегратор.

··· ·· .1 ο ······ • · · · · · · * · · · ·····>·· · · ·· · · • · ·4· ···· ···· · ·· ··· · · ··

Прилагайки методът от изобретението, е възможно да се детектират от 1 до 10 fg от патогенната конформационна форма, която първоначално е присъствала в пробата, което е еквивалентно на 3 до 30x10 мола.

Пробата ще бъде най-общо биологична проба или тъкан, и която и да е такава биологична проба или тъкан може да бъде анализирана с метода на настоящето изобретение. В случаят, когато се използва тъкан, анализът и методът от настоящето изобретение могат да бъдат извършени върху хомогенати или директно върху ex vivo проби. Методите и анализите най-общо ще бъдат проведени с ex vivo или in vitro проби. За предпочитане е, пробата да е биологична течност, като кръв, лимфа, урина или мляко; мозъчна тъкан, гръбначен мозък, тонзиларна тъкан или апендиксна тъкан; проба получена от кръв, като кръвни клетъчни сенки или на препарати от намазки; или препарати от плазмени мембрани, като липидни рафтове, детергент-устойчиви мембрани или кавеоло-подобни домени. Пробата може от друга страна да бъде съединение, състав, включващ съединение (по-специално белтък) получен от човешки или животински източник, като растежен хормон, или тъканен екстракт, като хипофизен екстракт . Като проба, съставът може да бъде заразен с патогенна конформационна форма.

Пробата може също да включва хранителен продукт или мляко, или част от хранителен продукт или напитка (предназначен или за човешка консумация или за животинска консумация) за да се установи присъствие или отсъствие на патогенна конформационна форма в продукта или напитката.

За предпочитане, не-патогенната конформационна форма се добавя по време на стъпка (1) и ще бъде от същият вид, както ’Че*» ······· « · ·· · е • · · · · ···· ···· · ·· · · · ·· ·· и пробата. Може например, да бъде получена от здрав индивид (т.е. не-патогенна) форма (например тъкан) от биологичната проба, която трябва да се тества. От друга страна, непатогенната конформационна форма може да бъде получена синтетично или рекомбинантно, като се използват средства известни в областта. Ще стане ясно, обаче, че не-патогенната конформационна форма не трябва да бъде пречистена, дори и като съществено пречистена форма. В повечето случаи непатогенната конформационна форма ще бъде под формата на тъканен хомогенат или на негова фракция, която съдържа съответната не-патогенна конформационна форма. Предпочитани примери включват мозъчни хомогенати и фракции, произлизащи от тях, например липидни рафтове.

За предпочитане, пробата и/или не-патогенната конформационна форма ще бъде с човешки произход или от домашно животно, например крава, овца или котка.

Друга цел на настоящето изобретение е да осигури метод за идентифициране на съединение, което модулира конформационния преход на определен протеин между непатогенна и патогенна конформационна форма, включващ: (1) осъществяване на контакт на количество от не-патогенната конформационна форма с количество от патогенната конформационна форма в присъствието и в отсъствието на споменатото съединение, (2) дезагрегиране на всички агрегати, които са се получили случайно по време на стъпка (1 ), (3) определяне на количеството на патогенната конформационна форма в присъствие и в отсъствие на споменатото съединение.

Ако се изисква, стъпка (1) може да включва стъпка (1а) инкубиране на споменатата проба/не-патогенна конформационна форма и провеждане на цикъл между стъпка •· · · ·♦ ······· · · ·« · · • · ··· ···· • · · · · ·· · · · «· ·· (la) и (2), както е описано по горе за методите и анализите от изобретението, съответно.

Ако количеството на патогенната конформационна форма, измерена в присъствие на съединението е по-голямо от измерено в негово отсъствие, това означава че съединението е фактор който “катализира” конформационния преход; ако това количество е по-малко, това означава че съединението е фактор, който инхибира прехода.

Съгласно гореописания метод “идентифициране” също ще бъде интерпретирано като “скриниране” на серия от съединения.

“Белег” или “белязана група” може да бъде което и да е съединение, което се използва е цел за детектиране на белтък. Белегът или белязаната група може да бъде свързана с белтъка, чрез йонни или ковалентни взаимодействия, водородни връзки, електростатични взаимодействия или чрез интеркалиране.

Примери за белези и белязани групи включват, но не са ограничени до конюгати на флуоресцентни оцветители, биотин, дигоксигенин, радионуклеотиди, хемилуминисцентни субстанции, ензими и рецептори, като определянето на белязания белтък се извършва, чрез флуоресценция, конюгиране със стрептавидин и/или авидин, количествено определяне на радиоактивността или хемилуминисценцията, и на каталитичните и/или лиганд-рецепторните взаимодействия. За предпочитане това е флуоресцентен или фосфоресцентен белег.

Терминът “конформационни заболявания” се отнася до f тази група от нарушения, които произтичат, чрез предаване на аберантен конформационен преход на определен белтък, което води до образуване на белтъчни агрегати и на промяна на мястото на белтъка в тъканта. Такива заболявания могат също ******* · · · · · · • · ··· ···« ···· * ·· ··· t · ·· да бъдат предавани чрез индуциране на конформационна промяна, предавани от патогенна конформационна форма на нормална или не-патогенна конформационна форма и в този случай те се наричат тук “трансмисибилни конформационни заболявания”. Примери за такива видове заболявания са прионните енцефалопатии, включващи говежда спонгиозна енцефалопатия (BSE) и човешкия еквивалент болестта на Кройцфелд-Якоб (CJD) при който даденият протеин е РгР.

Терминът “спорадична CJD, даден със съкращение sCJD се отнася до най-известните прояви на болестта на Кройцфелд-Якоб (CJD). Това заболяване се появява спонтанно в индивиди на средна възраст, с приблизителна честота 60 на един милион индивиди на земята за 1 година.

Терминът “Иатерогенна CJD, съкратена тук iCJD се отнася до заболяване, получено в резултат от случайна инфекция предадена от хора носещи човешки приони. Найзабележителния пример за такива вторични инфекции се наблюдават при деца, заразени с човешки приони от заразени препарати на човешки растежен хормон.

Терминът “Семейна CJD се отнася до форма на CJD, която се появява рядко в семейството и неминуемо се причинява от мутации в гена за човешкия прионен белтък. Заболяването се получава като резултат от доминантно автозомно нарушение. Членовете на семейството, които унаследяват мутациите се разболяват от CJD.

Терминът болест на Герстман-Щтраслер-Шенкер даден със съкращението GSS се отнася до форма на заболяване, унаследявана от човек, заболял от прионна болест. Заболяването е резултат от доминантно автозомно нарушение. Членовете от ····»·· · · · · · · • · · · · ···· •··· · ·· ··· ·· ·· семейството, които унаследяват мутиралият ген, се разболяват otGSS.

Терминът “прион” би означавал трансмисибилна частица, известна че причинява група подобни трансмисибилни конформационни заболявания (спонгиозни енцефалопатии) в хора и животни. Терминът “прион” се получава от думите “протеин” и “инфекция”, а частиците са представени главно, ако не и изцяло от молекулите PrP^sc.

Прионите са различни от бактериите, вирусите и вироидите. Известните приони включват тези, които инфектират животни и причиняват болести като скрап, трансмисибилни, дегенеративни заболявания на нервната система на овцете и козите, също говеждата спонгиозна енцефалопатия (BSE) или болестта луда крава, и котешката спонгиозна енцефалопатия. Четири са прионните заболявания, известни с това че засягат хората: (1) kuru, (2) болестта на Кройцфелд-Якоб (CJD), (3) болестта на Гешман-ЩраслерШенкер (GSS), и (4) фаталната семейна инсомния (FFI). Както се използва тук, прионът включва всичките форми, причиняващи всичките, или което и да е от тези заболявания или други заболявания на което и да е използвано животно, и по-специално причиняващи болести при хората и домашните селскостопански животни.

Термините ген за РгР и ген за прионен протеин се използват като взаимозаменяеми тук, за да опишат генетичният материал, който се експресира, като прионни протеини, f формите на полиморфизъм и мутации, като те са изброени тук в подзаглавието Патогенни мутации и форми на полиморфизъм. Генът за РгР може да бъде характерен за което и да било животно, включено като “гостоприемник” и “животно за тест”, • · «Μ* ·♦····· · · · · · · • · · · · ···· • ··· · « · ··· · · ·· от описаните тук животни, или под която и да е форма, или всички форми на полиморфизъм и техни мутации, се разбира, че термините включват и други гени, подобни на тези за РгР, които все още не са открити.

Най-общо терминът “ген за РгР” се отнася до който и да е ген от всички видове, който кодира амино-киселинната последователност на която и да е РгР форма, включваща всеки прионен белтък. Някои широко известни РгР секвенции са описани в Gabriel et al., 1992, които са включени тук в литературната справка, за да опишат тези секвенции.

Съкращенията използвани тук, включват:

CNS за централна нервна система;

BSE за говежда спонгиозна енцефалопатия;

CJD за болест на Кройцфелд-Якоб;

FFI за фатална семейна инсомния;

GSS за болест на Гершман-Щраслер-Шенкер;

РгР за прионен протеин ;

РгР за нормална, не-патогенна конформационна форма на РгР; PrP^Sc за патогенна или скрап изоформа на РгР (която също така е маркер за прионни заболявания).

ПАТОГЕННИ МУТАЦИИ И ФОРМИ НА ПОЛИМОРФИЗЪМ

Съществува известен брой патогенни мутации в гена за РгР. Също така, са известни и форми на полиморфизъм за човешкия, овчия и говеждия ген за РгР.

Последващият списък е не-ограничаващ списък на мутациите и формите на полиморфизъм.

······· · · ·· « · • · ··· ···· • ··· 4 ·· ··· · · ··

ТАБЛИЦА ЗА МУТАЦИИТЕ

Патогенни мутации при хората	Форми на човешки полиморфизъм	Форми на овчи полиморфизъм	Форми на говежди полиморфизъм
2 осем пъти повторен въведен генетичен елемент 4 осем пъти повторен въведен генетичен елемент 5 осем пъти повторен въведен генетичен елемент 6 осем пъти повторен въведен генетичен елемент 7 осем пъти повторен въведен генетичен елемент 8 осем пъти повторен въведен генетичен елемент 9 осем пъти повторен въведен генетичен елемент Кодон 102 Pro-Leu Кодон 105 Pro-Leu Кодон 117 Ala-Vai Стоп Кодон 145 Кодон 178 Asp-Asn Кодон 180 Val-Ile Кодон 198 Phe-Ser Кодон 200 Glu-Lys Кодон 210 Val-Ile Кодон 217 Asn-Arg Кодон 232 Met-Ala	Кодон 129 Met/Val Кодон 219 Glu/Lys	Кодон 171 Arg/Glu Кодон 136 Ala/Val	5 или 6 генетични елементи осем пъти повторени

Нормалната амино-киселинна секвенция, която се среща във много голяма част от индивидите, се отнася като див тип РгР секвенция. Тази див-тип секвенция е обект на определени, характерни вариации на форми на полиморфизъм. В случая с човешкия РгР, има две полиморфни амино-киселинни остатъка ·· ···· • ···· ··· ···« . ·:.. : *..· .:. ·./·..·

129 (Met/Val) и 219 (Glu/Lys). Овчия РгР има два полиморфни амино-киселинни остатъка 171 и 136, докато говеждия РгР има или пет или шест повтора от осем амино-киселинна секвенция в амино-крайната област на зрелия прионен белтък. Тъй като нито една от тези форми на полиморфизъм, сами по себе си не са патогенни, те се явяват като такива, повлияващи прионните заболявания. За разлика от тези, нормални вариации в дивият тип прионни белтъци, съществуват определени мутации на човешкият ген за РгР, които променят специфично аминокиселинните остатъци на РгР или броят на осем пъти повторените генетични елементи, за които е открито че се разпределят с унаследените човешки прионни заболявания.

За да се осигури по-нататък значимост на горепосочената диаграма, демонстрираща мутациите и формите на полиморфизъм, този който се интересува трябва се отнесе до публикуваните секвенции на гените за РгР. Например, пилешки, говежди, овчи, плъши и миши гени за РгР са описани и публикувани в Gabriel et al., 1992. Секвенцията на сирийският хамстер е публикувана в Baslet et al 1986. Генът за овчия РгР е публикуван от Goldmann et al., 1990. Секвенцията на гена за говеждия РгР е публикувана в Goldmann et al., 1991. Секвенцията на гена за пилешкия РгР е публикувана в Harris et al., 1991. Секвенцията на РгР гена на водния пор е публикувана в Kretzschmar et al., 1992. Секвенцията на човешкия ген за РгР е публикувана в Kretzschmar et al., 1986. Секвенцията на мишия ген за РгР е публикувана в Locht et al., 1986. Секвенцията на овчия ген за РгР е публикувана в Westaway et al., 1994. Всички тези публикации са въведени тук в литературната справка, за да опишат гена за РгР и амино-киселинната последователност на РгР.

• · · ·· · · · · • ···· ··· ···· · * · ··· ···· ···· · .........

Изобретението също осигурява метод за определяне присъствието на патогенна форма на прионен протеин в проба (за предпочитане кръвна или мозъчна проба), който включва:

(1) осъществяване на контакт в пробата с определено количество не-патогенен прионен белтък;

(1а) инкубиране проба/не-патогенен прионен белтък;

(2) дезагрегиране на всички агрегати, формирани по време на стъпка (1а);

повтаряне на стъпките (1а) - (2) два или повече пъти;и (3) определяне на присъствието и/или количеството на прионния патогенен белтък в пробата.

Следващ вариант на изобретението осигурява метод за диагностика на CJD на пациент, включващ: вземане на проба от пациент (за предпочитане кръвна или мозъчна проба);

(1) осъществяване на контакт на пробата с определено количество от белтъка РгР ;

(1а) инкубиране проба/РгР^с белтък;

(2) дезагрегиране на всички агрегати, получени по време на стъпка (1а);

повтаряне на стъпки (1а)- (2) два или повече пъти; и последващо (3) определяне на присъствието и/или количеството на PrP^Sc в пробата

Изобретението също осигурява метод за определяне присъствието на патогенната форма на β-амилоидния белтък в проба (за предпочитане кръвна или мозъчна проба), включващ:

(1) осъществяване на контакт на пробата с определено количество не-патогенна форма на β-амилоидния белтък;

• · • · • · · ·

• ’ ····

(la) инкубиране проба/ не-патогенна форма на βамилоидния белтък;

(2) дезагрегиране на всички агрегати, получени по време на стъпка (1а);

повтаряне на стъпки (1а)- (2) два или повече пъти; и последващо (3) определяне на присъствието и/или количеството на патогенната форма на β-амилоидния белтък в пробата.

Изобретението също осигурява метод диагностициране на болестта на Алцхаймер на пациент, включващ:

Взимане на пробата (за предпочитане кръвна или мозъчна проба) от пациента;

(1) осъществяване на контакт на пробата с определено количество не-патогенна форма на β-амилоидния белтък;

(1а) инкубиране проба/ не-патогенна форма на βамилоидния белтък;

(2) дезагрегиране на всички агрегати, получени по време на стъпка (1а);

повтаряне на стъпки (1а)- (2) два или повече пъти; и последващо (3) определяне на присъствието и/или количеството на патогенната форма на β-амилоидния белтък в пробата.

Изобретението по-нататък осигурява апаратура за прилагане на гореописаните методи, по-специално апаратура, включваща микро-плаки, много-ямков ултразвуков дезинтегратор и определено количество от не-патогенни f конформационни форми.

Следващ вариант на изобретението осигурява метод за диагностика и определяне на конформационно заболяване, характеризиращо се с конформационен преход на определен • · • · · • · · · · • « • · · · ·

2$ • ’ · · · ·

белтък между не-патогенна и патогенна конформационна форма, чрез анализиране в пробата на маркер за споменатото заболяване, който метод включва (1) осъществяване на контакт със споменатата проба с известно количество не-патогенна конформационна форма, (2) дезагрегиране на агрегатите, случайно получени по време на стъпка (1) и (3) определяне на присъствието и/или количеството на споменатата патогенна конформационна форма в пробата. За предпочитане стъпки (1) и (2) образуват цикъл, който се повтаря най-малко два пъти преди да се премине към стъпка (3), в най-предпочитан вариант стъпки (1) и (2) от цикъла се повтарят от 5 до 40 пъти преди да се проведе стъпка (3).

Изобретението също осигурява анализ за маркер за конформационно заболяване, характеризиращ се с конформационен преход на определен белтък между непатогенна и патогенна конформационна форма в пробата, който анализ включва стъпките: (1) осъществяване на контакт със споменатата проба с известно количество не-патогенна конформационна форма, (2) дезагрегиране на агрегатите, случайно получени по време на стъпка (1), и (3) определяне на присъствието и/или количеството на споменатата патогенна конформационна форма в пробата. За предпочитане стъпки (1) и (2) образуват цикъл, който се повтаря най-малко два пъти преди да се премине към стъпка (3).

Изобретението по-нататък осигурява метод за идентифициране на съединение, което модулира конформационния преход на определения белтък между непатогенна и патогенна конформационна форма, който включва:

(1) осъществяване на контакт на известно количество от не-патогенната конформационна форма с известно количество ♦ * ···· • · . . . ; ; · .· ··;· · : : : · · ^; ·

..........

от патогенната конформационна форма в присъствие и отсъствие на споменатото съединение, (2) дезагрегиране на агрегатите, случайно получени по време на стъпка (1), (3) определяне на количеството на патогенната конформационна форма в присъствие или отсъствие на споменатото съединение.

Настоящето изобретение е описано в цитираната литература като специфични варианти, но съдържанието на описанието включва всички модификации и замествания, които могат да бъдат доставени от специалистът в областта без да се промени значението или целта заявени в патентните претенции.

Изобретението ще бъде описано със значението на следващите примери за изпълнение на изобретението, които са конструирани така, че по никакъв начин да не ограничават настоящето изобретение. Примерите се отнасят до фигурите, които са специфицирани тук по-долу.

ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фигура 1. Схематично представяне на прехода РгР -> РгР . Инфекциозната единица РгР е β- лист богат олигомер, който превръща РгР^с чрез интегрирането си като нарастващ агрегат, който придобива свойствата на PrP^Sc.

Фигура 2. Диаграмно представяне на процедурата на циклична амплификация. Системата се базира на цикли на л 9 инкубиране на РгР в присъствието на излишни количества от РгР , последвани от цикли на ултразвукова дезинтеграция. По време на инкубационните периоди, олигомерните PrP^Sc се увеличават чрез инкорпориране на РгР^с в увеличаващия се • · ·♦ * · · ·· • · · ·· > ·« А . - ·· · • · · « · • · · · · • ··«··· ₉ .:.. :

агрегат, докато по време на ултразвуковото дезинтегриране, агрегатите се разбиват с цел да се намножат превърналите се единици. На фигурата са представени два цикъла ултразвукова дезинтергация/инкубиране.

Фигура 3. Амплифициране на PrP^Sc чрез циклично ултразвуково дезинтегриране. Малко количество от мозъчни хомогенати на болни от скрап, съдържащи PrP^Sc са инкубирани с мозъчни хомогенати от здрави плъхове (старт 1, експериментконтрола) или с мозъчни хомогенати от здрави хамстери (старт 2 и 3). Последната проба е разделена на две групи, едната от които се подлага на пет цикъла инкубация/ултразвуково дезинтегриране (старт 3). Половината от гореописаните проби се натоварват директно в гела и се оцветяват за тотални белтъци с Кумаси (панел А). Другата половина са третирани с РК и анализирани чрез имуноблот, чрез използване на анти-РгР антитялото 3F4 (панел Б). Панел В показва някои от контролите, от здрави мозъчни хомогенати самостоятелно инкубирани (стартове 1 и 2) или в присъствието на разреден мозъчен хомогенат от болен от скрап (стартове 3 и 4). Половината от пробите (стартове 2 и 4) са подложени на 5 цикъла ултразвуково дезинтегриране/инкубиране. Пробите от стартове 2, 3 и 4 са третирани с протеиназа К.

Фигура 4. Чувствителност на системата за циклично амплифициране. Минималната концентрация на PrP^Sc която може да бъде използвана за определяне след амплификация е изследвана чрез серийни разреждания на мозъчен хомогенат от болен от скрап и инкубиране с мозъчен хомогенат от здрав хамстер, с или без цикли на ултразвуково дезинтегриране. Панел А показва контролния експеримент, в който мозъчния хомогенат от хамстер, болен от скрап е приготвен като серийни ···· разреждания в плъши мозъчен хомогенат. Панел Б отговаря на експериментът, в който серийните разреждания на мозъчния хомогенат от хамстер, болен от скрап са инкубирани мозъчни хомогенати от здрави хамстери и са подложени на 5 цикъла инкубиране/ултразвуково дезинтегриране. Денситометрична оценка на имуноблотовете А и Б е показана на Панел В. Разрежданията са направени, като се взема за стартова концентрация материал от мозъка и последващи негови разреждания: 100 (старт 1), 200 (старт 2), 400 (старт 3), 800 (старт 4), 1600 (старт 5) and 3200 (старт 6).

Фигура 5. Връзка между PrPres сигнала и броят на циклите на амплификация. Разредените мозъчни хомогенати от скрап болни се инкубират с излишни количества мозъчни хомогенати от здрави хамстери. Пробите се подлагат на 0, 5, 10, 20 или 40 цикъла и PrPres сигнала се оценява чрез имуноблот.

Фигура 6. Амплификация на PrP^Sc в кръвни проби. Третирана с хепарин плъша кръв се смесва с мозъчен хомогенат от болен от скрап хамстер до крайна разреждане 10:1. Тази смес се инкубира 15 минути на стайна температура. 10-тократни серийни разреждания се правят от този материал, като се използва третираната с хепарин кръв. Пробите се подлагат на 11 цикъла инкубиране-ултразвуково дезинтегриране и PrPres сигнала се оценява, чрез имуноблот.

Фигура 7: Прионен белтък, присъстващ в липидни рафтове. Липидните рафтове (също означавани, като детергент устойчиви мембранни фракции или DRM) са изолирани, чрез прилагане на модификация на преди това описани протоколи. Една-хилядна от mg от мозъчната тъкан се хомогенизира в 1 ml PBS съдържащ 1% тритон Х-100 и 1х пълен коктейл от протеазни инхибитори (Boehringer). Тъканта е хомогенизирана *· ···· чрез 10 пасажа, с помощта на игла за спринцовка 22G и се инкубира за 30 минути на 4 ⁰ С върху ротаторна клатачка. Пробата се разрежда 1:2 в 60% захароза и се поставя на дъното на центрофужна епруветка. 7ш1 35% захароза се нанасят внимателно върху пробата. 5ml 15% захароза се нанасят внимателно на върха на градиента. Епруветката се центрофугира при 150,000g за 18 часа на 4° С. Липидните рафтове се придвижват в посока от 15% към 35% захарозна интерфаза (Панел А). Различните фракции се събират и се анализират чрез оцветяване за тотални белтъци със сребърен нитрат (Панел Б) и чрез имуноблот за детекция на РгР (Панел В). За да се отстрани захарозата от пробата, фракцията на липидният рафт се възстановява, чрез промиване е PBS и промиване и ресуспендиране в PBS съдържащ 0.5% Тритон X100, 0.5% SDS и протеазни инхибитори. Всички РгР се намират в тази фракция (Панел Г).

Фигура 8: Фракциите необходими за амплификацията са представени като липидни рафтове. Липидните рафтове са изолирани от мозъчни хомогенати на здрави хамстери, както е показано на Фигура 2 и са смесени със 700-кратно разредени PrP^Sc пречистени с висока чистота от мозъчни хомогенати на болен от скрап хамстер. Пробите са или замразени (старт 3) или са амплифицирани за 20h (старт 4). Стартове 1 и 2 показват проби получени, чрез същите процедури, но за които се използват тотални мозъчни хомогенати за амплификацията.

Фигура 9: Пресимптоматично определяне на PrP^Sc в мозъци от хамстери. Хамстерите се инокулират интрацеребрално (i. с.) със солеви разтвор (контролна група) или със 100-кратно разреден мозъчен хомогенат от болен от скрап. На всеки 4 седмици, хамстерите от всяка група се убиват и • · • · · · * · · • · · • ·· • · · · · •· • · · ·· « «

мозъците им се екстрахират и хомогенизират.Половината от пробите се замразяват веднага (бели колонки), а другата половина се подлагат на 20 цикъла инкубиране/ултразвуково дезинтегриране (черни колонки). Всички проби се третират е РК и се анализират чрез имуноблот. Интензивността на ивиците се оценява денситометрично. Всяка колонка показва средната стойност на пробите от 4 животни. Никаква детекция не се наблюдава в който и да е от контролните мозъци с или без амплификация - тези резултати не са показани на Фигурата.

Фигура 10: Амплификация на човешки PrP^Sc.

Изследванията са проведени върху проби от мозъци от 11 различни потвърдени случая на спорадична CJD, също така от 5 случая на фамилна CJD и 4 възрастово нагласени контроли, като са включени и пациенти, засегнати от други неврологични заболявания. Мозъците се хомогенизират и се подават като 20 амплифицирани проби. Представителни резултати от контрола (А) и три различни случая на спорадична CJD (Б) (1,2,3) са показани на Фигурата.

Фигура 11: Детекция на PrP^Sc в кръв, след приготвяне на препарати от кръвни клетъчни сенки Клетъчните сенки от 0.5 ml третирана с хепарин кръв, с произход от здрави индивиди (С) и засегнати от скрап хамстери (Sc) се приготвят, както е описано в текста. Половината от пробите не са подложени на амплификация, а другата половина се смесва с мозъчни хомогенати от нормални хамстери и се подлага на 20 цикъла на амплификация. Всички проби след това се третират е РК и се анализират чрез имуноблот. Един представителен експеримент е показан на Фигурата.

Фигура 12: Детекция на PrP^Sc в кръв след екстракция със саркозил. 0.5 ml от третирана с хепарин кръв от здрави (С) и • · 35· ·· ···· • · · · · · ······· · · ·· · · • · ··· ···· ···· · ·· · · · ·· ·· засегнати от скрап хамстери (Sc) се подлагат на саркозилова екстракция, както е описано в текста. Половината от пробите не се подлагат на амплификация, а другата половина се смесват с мозъчни хомогенати от нормални хамстери и се подлагат на 20 цикъла на амплификация. Всички проби след това се третират с РК и се анализират чрез имуноблот. Една представителна проба от контролни животни и две от засегнати от скрап животни е показана на Фигурата.

Фигура 13: Детекция на PrP^Sc в кръвта след пречистване на липидни рафтове. Липидните рафтове се екстрахират както е г описано в текста от 0.5 ml третирана с хепарин кръв, от здрави (С) и засегнати от скрап хамстери (Sc). Половината от пробите не се подлагат на амплификация, а другата половина се сместват с мозъчни хомогенати от нормални хамстери и се подлагат на 20 цикъла на амплификация. Всички проби след това се третират с РК и се анализират чрез имуноблотове. Един представителен пример на контролно животно и два за засегнати от скрап животни са представени на Фигурата.

Фигура 14: Детекция на PrP^Sc в кръв, след приготвяне на намазки. Кръвната фракция за приготвяне на намазки се получава чрез центрофугиране на 0.5 ml третирана с хепарин кръв, от здрави (С) и засегнати от скрап хамстери (Sc). Половината от пробите не се подлагат на амплификация, а другата половина се смесват с мозъчни хомогенати от нормални хамстери и се подлагат на 20 цикъла на амплификация. Всички проби след това се третират с РК и се анализират, чрез имуноблот. Един представителен експеримент е показан на Фигурата.

: ,··,3(>; ,··, ···;

··· ·· · ·· · ······· · · ·· · · • · · · · ···· ···· · ·· ··· ·· ··

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

ПРИМЕР 1

Амплификация на РК резистентни РгР чрез in vitro циклично превръщане.

Мозъчните хомогенати, екстрахирани от засегнати от скрап хамстери са разредени до степен на едва забележим чрез имуноблот РгР сигнал, след третиране с протеиназа К (РК) (Фигура ЗБ, старт 1). РК третирането се провежда, чрез рутинна за областта процедура, за да се различат нормалните от аномалните форми на РгР, които се различават по тяхната чувствителност към протеазна деградация (PrP^Sc е частично резистентна, а РгР се разгражда) (Prusiner, 1991). Формата на РгР, която е устойчива на третиране с РК ще бъде наричана от сега нататък PrPres. Инкубацията на проба от разредени мозъчни хомогенати от болни от скрап животни, се смесват с мозъчни хомогенати от здрави хамстери, съдържащи излишък от РгР , което води до повишаване на PrPres сигнала (Фигура ЗБ, старт 2).

Това предполага, че инкубацията на двата мозъчни р Q хомогената води до превръщането на РгР в РгР . Когато пробите се инкубират при същите условия, но се подложат на пет цикъла инкубиране/ултразвуково дезинтегриране, количеството на PrPres се повишава значително (Фигура ЗБ, старт 3). Денситометричен анализ на имуноблота показва, че PrPres сигналът се увеличава 84 пъти, чрез цикличното амплифициране, в сравнение със PrPres сигнала присъстващ в разредените хомогенати на болни от скрап, (старт 1).

·· 37 ·· ···· • · · · · · ······· · · ·· · · • · · · · ···· ···· · ·· · · · ·· ··

Преходът зависи от присъствието на PrP^Sc , докато липса на PrPres се наблюдава, когато мозъчни хомогенати от нормални хамстери се инкубират самостоятелно при същите условия или с или без ултразвукова дезинтеграция (Фигура ЗВ, старт 2). За да се контролират артефактите от преноса, тоталният белтък, натоварен върху гела се подържа постоянен (Фигура ЗА) чрез добавяне на плъши мозъчен хомогенат за да се разреди пробата от взета от животното болно от скрап, като фактът че плъшият РгР не се детектира, чрез използваното за имуноблот антитяло е предимство.

ПРИМЕР 2

Чувствителност на детекцията, чрез циклична амплификация.

За да се оцени минималната концентрация на PrPSc, която може да бъде прилагана за детекция след амплификацията, мозъчните хомогенати на болни от скрап хамстери се приготвят като серийни разреждания в мозъчни хомогенати от здрави животни. Без инкубация, сигналът от PrPres намалява прогресивно, докато не стане напълно не-забележим при 800кратно разреждане (Фигура 4А, В). Обратно, когато при същото разреждане се инкубират мозъчни хомогенати от здрави хамстери подложени на 5 цикъла инкубация/ултразвуково дезинтегриране, лимитът на PrPres детекцията намалява значително. В действителност чистия сигнал лесно се наблюдава даже при 3200 пъти разреждане (Фигура 4Б, В).

· • 444

444444 4 4 44 *4

4 4444444

4444 4 44 444 4'44

ПРИМЕР 3

Експоненциално нарастване на PrPres с броя на циклите

За да се изследва, дали интензитета на PrPres сигнала след цикличното амплифициране, зависи от броя на проведените цикли инкубиране/ултразвуково дезинтегриране, разреденият мозъчен хомогенат от скрап болни, се инкубира с излишни количества от мозъчен хомогенат от здрави хаметери. Пробите се подлагат на 0, 5, 10, 20 или 40 цикъла и PrPres сигналът се анализира чрез имуноблот.

Нивата на PrPres се повишават експоненциално с броя на циклите инкубация/ултразвуково дезинтегриране (Фигура 5). Тези резултати предполагат, че повишаването на броя на циклите би могъл да по-нататък да намали границите на детекция.

ПРИМЕР 4

Експерименти на ултразвуково дезинтегриране в кръвни проби смесени с PrP^Sc

Третирана с хепарин плъша кръв се смесва с мозъчен хомогенат от хамстер засегнат от скрап за да се достигне крайно разреждане 10: 1. Тази смес се инкубира 15 min на стайна температура.

f

10-кратни серийни разреждания се приготвят от този материал, чрез използване на третирана с хепарин плъша кръв. 50 μΐ от всяко разреждане се центрофугират при 3,000 гргп за 10 минути. Плазмата се разделя от утайката. 10 μΐ от плазмата се ······· · · ·· · · • · ··· · · · ♦ ···· · ·· ··· · · · · смесват в 50 μΐ мозъчен хомогенат от здрави хамстери, съдържащи РгР субстрат за реакцията на превръщане. Пробите се подлагат на 11 цикъла на инкубиране-ултразвуково дезинтегриране. Като контрола, същите проби се смесват с 50 μΐ мозъчен хомогенат от здрави хамстери и се съхраняват на -20 ⁰ С докато е необходимо. 15 μΐ от ултразвук дезинтегрираните и контролните проби се подлагат на смилане с протеиназа К, разделят се чрез SDS-PAGE и се анализират чрез уестерн блот и PrP^Sc се детектира и се описва в глава Методи.

Резултатите са съобщени във Фигура 6. Тези резултати показват ясно повишаване при детекцията на белтъка след процедурата на амплификация, която е по-специално очевидна при по-ниска концентрация на PrP^Sc (например при разреждане 1280). Ако сравним тези резултати с тези получени за инфектирани мозъчни тъкани, имаме конформация, подобна на която се изработва чрез методът на амплификация в кръвта.

ПРИМЕР 5

Циклична амплификация с висока степен на проникване

Използването на традиционен ултразвуков дезинтегратор за една проба, налага проблем за обработване на много проби едновременно, както се изисква в диагностичния тест. Ние адаптираме циклична система за амплификация, използвайки ултразвуков дезинтегратор с 96-ямков формат (Misonix 431МР20kHz), който осигурява ултразвуково дезинтегриране във всички ямки по едно и също време, и който може да бъде • · ······· · · · · · · • · ··« «*·· ···· · · · · · · ·· ·· програмиран за автоматично опериране. Това подобрение не само намалява времето за обработка, но също предотвратява загубата на материал, в сравнение, ако материалът се обработва с ултразвуков дезинтегратор за обработка на единична проба. Кръстосаното замърсяване се елиминира, като се избягва директно въвеждане на сонда в пробата. Последната значително поддържа инфекциозността на пробите и свежда до минимум получаването на фалшиви позитивни резултати. Двайсет цикъла за lh инкубация, последвана от ултразвуково дезинтегриране при пулс от 15 или 30 секунди, дава значителна амплификация на PrPres сигнала, подобно на предварително наблюдаваното приложение на ултразвуковия дезинтегратор за единични проби.

ПРИМЕР 6

Необходимите за амплификацията фактори са в детергентустойчиви мембранни фракции

Субклетъчната локализация на РгР прехода, осъществяващ се по време на патогенезата на заболяването все още не е изяснено. Обаче, и за двете РгР и РгР е съобщено че са локализирани в специфичен район на плазмената мембрана, който е устойчив на третиране с детергенти при меки условия, което се дължи на относително високото съдържание на холестерол и гликосфинголипиди (Vey et al., 1996; Harmey et al., *

1995). Тези мембранни домени са наречени липидни рафтове или детергент-устойчиви мембрани (DRM) и са богати на сигнални белтъци, рецептори и GPI-закотвени белтъци. Ние р потвърждаваме, че 100% от РгР в мозъка се прикрепва към тази • · · · · 41· · ···· ··· · · · · · · · ···»··· · · ·· · · • · ··· ···· ···· · ·· ··· ·· ·· фракция, която съдържа < 2% от всички белтъци (Фигура 7). Следователно, простата стъпка на изолиране на липидни рафтове позволява драстично обогатяване на РгР . Подобни резултати са получени при изолирането на липидни рафтове от мозъчни хомогенати на болни от скрап, в които PrP^Sc се възстановява в рафтовете.

За оценка, дали факторите, необходими за амплифициране на РгР се съдържат в липидни рафтове, ние ги пречистваме от мозъците на здрави животни и ги добавяме в минимални количества към високо пречистени PrP^Sc , екстрахирани от мозъци на болни животни. Амплифицирането в липидните рафтове е еквивалентно на това, получено като тотален мозъчен екстракт (Фигура 8), докато количеството на PrPres получено след амплифицирането е подобно при двата типа условия. Този резултат показва, че всички фактори, необходими за РгР превръщането и амплифицирането (включително и на т.нар. Фактор X; (Telling et al., 1995)) се съдържат в този специализиран мембранен домен. Ето защо идентифицирането и изолирането на факторите, необходими за РгР превръщането би трябвало да е възможно е последващо разделяне на белтъците от липидните рафтове и проследяване на тяхната активност чрез циклично амплифициране. В допълнение, липидните рафтове се предоставят възможност за заместване на използването на тотален мозъчен хомогенат при процедурата на циклична амплификация, като източник на РгР субстрат и други ендогенни фактори, участващи в прехода.

·»····· · · · · · · • · · · · · · · · ···· · ·· · · · ·· ··

ПРИМЕР 7

Пре-симптоматична диагностика на експериментални животни

За да се изследва пре-симптоматичната диагностика на хамстери, експериментално инфектирани със скрап, ние скринирахме 88 мозъчни проби на различни етапи по време на пре-клиничната фаза, половината от които са не-инфектирани контроли. Мозък се взима всяка седмица (4 за всяка група) и се подлага на 20 цикъла на амплификация, и аномалният белтък се наблюдава в мозъка, даже на втората седмица след инокулацията, много преди животното да развие който и да е от симптомите (Фигура 9). Без циклична амплификация PrP^Sc става видим в мозъка на шестата седмица след инфекцията, само 4 седмици преди появата на клиничното заболяване. Липсата на амплификация се наблюдава във всяко едно от контролните животни, които не са инфектирани със скрап.

ПРИМЕР 8

Прилагане на циклична амплификация на човешки мозъчни проби

За да се анализира приложението на процедурата на цикличната амплификация върху мозъчни проби (от мъртъвци) t от хора засегнати от болестта на Кройцфелд-Якоб (CJD), ние инкубираме мозъчните хомогенати от няколко CJD пациенти (или нормални контроли) с мозъчни хомогенати от здрави хора и проведохме процедурата на циклична амплификация.

···*··· · · ·· · _е • · · · · ···· ···· · ·· · · · 9 · ··

Резултатите показват, значителна амплификация в анализираните проби от мозъци на болни от спорадична CJD, докато такава не се наблюдава в нито една от 4 контролни проби (Фигура 10). Интересен е фактът, че амплификацията се наблюдава само в проби, за които е показано че са инфектирани и следователно, способни да превръщат не-мутантна РгР, като те не дават такъв резултат, когато мутантният белтък е неспособен да превърне дивият тип белтък. Тези данни подкрепят заключението, че методът работи при проби от хора, подобно на този прилаган за животински проби.

ПРИМЕР 9

Диагностика на кръвта, чрез циклична амплификация

Изследвания върху инфективността, предполагат, че наймалко при експерименталните животни, PrP^Sc присъства в кръвта в по-късните етапи (Brown et al., 2001). За да се проведе детекция на PrP^Sc в кръвта, чрез циклична амплификация, ние предпочитаме първо селективно да концентрираме белтъка, който трябва да се детектира в пробата, и да елиминираме множеството различни други кръвни белтъци, като албумин и хемоглобин. Следните четири различни протоколи се оказват ефективни за тази цел.

1. Приготвяне на кръвни клетъчни сенки

Третираната с хепарин кръв от хамстер се центрофугира при 2,500 грш на 4°С. Плазмата и клетъчната фракция се разделят и се замразяват на - 80 ⁰ С докато е необходимо. 0.5 ml • · · • · • · * ·

от кръвните клетки се промиват 3 пъти в 12-15 обема, прясно приготвен, изстуден PBS, pH 7.6. Тези клетки се ресуспендират в 12-15 обема 20 mOsM натриево-фосфатен буфер pH 7.6 и се разбъркват внимателно за 20 минути върху лед, след което се центрофугират при 30,000 rpm за 10 минути на 4 ⁰ С.

Супернатантата се отстранява, утайката се промива 3 пъти с 20 mOsM натриево-фосфатен буфер. Крайната утайка се ресуспендира в PBS съдържащ 0.5% Тритон Х-100, 0.5% SDS и протеазни инхибитори. 15 μΐ от тази суспензия се смесва е еднакъв обем 10% мозъчен хомогенат от здрав хамстер и се подлага на 20 цикъла инкубация-ултразвуково дезинтергиране 20 μΐ от ултразвук дезинтергираните и контролните проби се подлагат на смилане с протеиназа К, разделят се чрез SDSPAGE и се анализират чрез уестерн блот, и PrP^Sc се анализира, както е описано в глава “Методи”. Резултатите показват детекцията на PrP^Sc след процедурата на амплификация в кръвните проби от инфектирани животни (Фигура 11). В кръвните проби от не-инфектирани животни, липсва сигнал след амплификацията. Без амплификация не е възможно да се детектира присъствието на РгР (Фигура 11).

2. Екстракция със саркозил

Третираната с хепарин кръв от хамстер се центрофугира при 2,500 грт при 4 ⁰ С. 0.5 ml от кръвните клетки се разреждат в еднакъв обем 20% саркозил и се инкубират за 30 минути.

»

Пробата се центрофугира в ултрацентрофуга Beckman TL100 при 85,000 rpm за 2 часа на 4 ⁰ С. Утайката се промива и се ресуспендира в PBS, който съдържа 0.5% Тритон Х-100, 0.5% SDS и протеазни инхибитори. 15 μΐ от тази суспензия се смесват ··«· с еднакъв обем 10% мозъчен хомогенат от здрав хамстер и се подлагат на 20 цикъла инкубиране - ултразвуково дезинтегриране. 20 μΐ от ултразвук дезинтегрираните и контролни проби се подлагат на смилане с протеиназа К, разделят се с SDS-PAGE и се анализират чрез уестерн блот, и PrP^Sc се определя, както е описано в глава Методи. Резултатите показват, детектиране на PrP^Sc , след процедурата на амплификация в кръвните проби от инфектирани животни (Фигура 12). В кръвните проби от не-инфектирани животни липсва сигнал след амплификацията. Без амплификация не е възможно да се детектира присъствието на PrP^Sc (Фигура 12).

3. Екстракция на липидни рафтове

Третираната с хепарин кръв се центрофугира при 2,500 rpm на 4 ⁰ С. 0.5 ml от кръвните клетки се разреждат с еднакъв обем PBS с 1% Тритон Х-100 и се инкубират за 30 минути на 4 ⁰ С. Пробата се разрежда 1: 2 в 60% захароза и се нанася на дъното на центрофужна епруветка. 7 ml 35% захароза се нанасят внимателно над пробата. 1.5 ml 15% захароза се нанасят на върха на градиента. Епруветката се центрофугира при 150,000 rpm за 18 часа на 4 ⁰ С. Липи дните рафтове се възстановяват чрез промиване в PBS и центрофугиране при 28,000 rpm в продължение на 1 час на 4 ⁰ С. Утайката се промива и ресуспендира в PBS съдържащ 0.5% Тритон Х-100, 0.5% SDS и протеазни инхибитори. 15 μΐ от тази суспензия се смесва с равен обем 10% мозъчен хомогенат от здрав хамстер и се подлага на 20 цикъла инкубиране-ултразвуково дезинтегриране. 20 μΐ от ултразвук дезинтегрираните и контролните проби се подлагат на смилане с протеиназа К, разделят се с SDS

..46 • · в · · · • · · · w · ·· · ······· · · ·· · · • · ··· ···· ···· · ·· ··· ·· ··

PAGE, анализират се чрез уестерн блот и PrP^Sc се определя, какот е описано в главата Методи. Резултатите показват, детектиране на PrP^Sc след процедурата на амплифициране в кръвните проби от инфектирани животни (Фигура 13). В кръвни проби от не-инфектирани животни не се наблюдава сигнал след амплификацията.Без амплификация не е възможна детекция на присъствието на PrP^Sc (Фигура 13).

4. Приготвяне на намазки.

Третираната с хепарин кръв от хамстер се центрофугира

А при 1,500 rpm на 4 С за 10 минути. След това внимателно се възстановяват намазките, чрез стандартни процедури и се съхраняват на - 80 ⁰ С докато е необходимо. Замразените намазки след това се ресуспендират в PBS съдържащ 0.5% Тритон X-100, 0.5% SDS и протеазни инхибитори. 15 μΐ от тази суспензия се смесват с равен обем 10% мозъчен хомогенат от здрав хамстер и се подлагат на 20 цикъла инкубацияултразвуково дезинтергиране. 20 μΐ от ултразвук дезинтегрираните и контролните проби се подлагат на смилане с протеиназа К, разделят се чрез SDS

Чай’

PAGE и се анализират чрез уестерн блот, и PrP^Sc се анализира, както е описано в главата Методи. Резултатите показват, детекция на PrP^Sc след процедурата на амплификация в кръвните проби от инфектирани животни (Фигура 14). В кръвните проби от не-инфектирани животни, липсва сигнал след амплификацията. Без амплификация не е възможно да се детектира присъствието на PrP^Sc (Фигура 14).

• · • · 4 ·

МЕТОДИ

Приготвяне на мозъчни хомогенати

Мозъци от здрави и инфектирани с адаптиран скрап щам 236К, сирийски златисти хамстери, се получават след декапитация и непосредствено замразяване в сух лед и съхраняване на -80 ⁰ С преди употреба. Мозъците се хомогенизират в PBS и протеазни инхибитори, в концентрация 10 обемни %. Детергенти (0.5% Тритон Х-100, 0.05% SDS) се добавят и разтворите се избистрят, чрез ниска скорост на центрофугиране (10,000rpm) за 1 минута.

Приготвяне на пробите и циклична амплификация

Серийни разреждания от мозъчни хомогенати на болни от скрап се приготвят директно от мозъчни хомогенати на здрави индивиди. 30 μΐ от тези разреждания се инкубират на 37 ⁰ С с разклащане. На всеки час се прилага един цикъл на ултразвуково дезинтегриране (всеки по 5 пулса в секунда), чрез използване на микро-ултразвуков дезинтегратор с потопена в пробата игла. Тези цикли се повтарят няколко пъти (5-20).

PrP^Sc детекция.

Пробите се подлагат на смилане с РК 100 pg/mL за 90 минути на 37 ⁰ С. Реакцията се спира с 50mM PMSF. Пробите се разделят, чрез SDS-PAGE (при денатуриращи условия) и се пренасят върху нитроцелулозна мембрана в CAPS или трисглицин трансфер буфер с 10% метанол за 45 минути при 400шА.

-48.

• · · · « ·

Обратимо оцветяване за тотален белтък се провежда преди блокирането на мембраната с 5% обезмаслено мляко. След това, мембраните се инкубират за 2 часа с моноклоналното антитяло 3F4 (1: 50,000). Четири промивания, всяко по 5 минути се провеждат е PBS, 0.3% Tween20 преди инкубацията е второ анти-мишо антитяло, белязано с пероксидаза от хрян, (1: 5000) за 1 час. След промиване, реактивността на мембраната се проявява с ECL хемилуминисцентен кит (Amersham) съгласно инструкциите на производителя.

ЦИТИРАНА ЛИТЕРАТУРА

Aguzzi, А. (1997). Neuro-immune connection in the spread of prions in the body ? Lancet 349, 742-744.

Baldwin, M. A., Cohen, F. E., and Prusiner, S. B. (1995). Prion protein isoforms, a convergence of biological and structural investigations. J. Biol. Chem. 270, 19197-19200.

Baslet et al., Cell~46 : 417-428 (1986) Brown, P., Cervenakova, L., and Diriger, H. (2001). Blood infectivity and the prospects for a diagnostic screening test in Creutzfeldt-Jakob disease. J. Lab. Clin. Invest. 137, 5-13.

Bruce, Μ. E., Will, R. G., Ironside, J. W., McConnell, I., Drummond, D., and Suttie, A. (1997).

f

Transmissions to mice indicate that new variant CJD is caused by the BSE agent. Nature 3oxo9,498-501.

... · ·49 · ·· ·· ··

... «...· · ·

... ......

······« · · ·· · · • · · · ·♦··· ···· · ·· ··· ·· ··

Budka, Η., Aguzzi, A., Brown, P., BrucherJ. M., Bugiani, 0., Gullotta, F., Haltia, M., Hauw,J.J., Ironside, J. W., Jellinger, K., Kretzschmar, HA., Lantos, P. L., Masullo,C., Schlote,W., TateishiJ., and Weller, R. 0. (1995). Neuropathological diagnostic criteria for Creutzfeldt Jakob disease (CJD) and other human spongiform encephalopathies (Prion diseases). Brain Pathol. 5, 459-466.

Carrell, R. W., Lomas D. A. (1997). Conformational diseases. Lancet, 350,134-138.

Caughey, B., Raymond, G. J., Kocisko, D. A., and Lansbury, P. T., Jr. (1997). Scrapie infectivity correlates with converting activity, protease resistance, and aggregation of scrapie-associated prion protein in guanidine denaturation studies. J. Virol. 71,4107-4110.

Cohen, F. E., Pan, K. M., Huang, Z., Baldwin, M., Fletterick, R.J., and Prusiner, S. B. (1994). Structural clues to prion replication. Science 264, 530-531.

Cohen, F. E. and Prusiner, S. B. (1998). Pathologic conformations of prion proteins. Ann. Rev. Biochem. 67, 793-819.

Cousens, S. N., Vynnycky, E., Zeidler, M., Will, R. G., and Smith, R. G. (1997). Predicting the CJD epidemic in humans. Nature 385, 197-198.

Gabriel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9097-9101 (1992) Galvez, S. and Cartier, L. (1983). Computed tomography findings in 15 cases of Creutzfeldt Jakob disease with histological verification.

J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 47, 1244.

Goldmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2476-2480 (1990).

Goldmann et al., T. Gen. Virol. 72: 201-204 (1991).

Harmey, J. H., Doyle, D., Brown, V., and Rogers, M. S. (1995). The cellular isoform of the prion protein, PrPc, is associated with caveolae in mouse neuroblastoma (N2a) cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 210, 753-759.

Harris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7664-7668 (1991).

Hill, A. F., Zeidler, M., konside, J. W., and Collinge, J. (1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet 349, 99-100.

Hsieh, G., Kenney, K., Gibbs, C. J., Jr., Lee, K. H., and Harrington, M. G. (1996). The 14-3-3 brain protein in cerebrospinal fluid as a marker for transmissible spongiform encephalopathies. N. Eng. J. Med. 335, 924.

JarrettJ. T. and Lansbury, P. T., Jr. (1993). Seedingone-dimensional crystallizationof amyloid : a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie? Cell 73,1055-1058.

Jimi, T., Wakayama, Y., Shibuya, S., and et al (1992). High levels of nervous system specific protein in the cerebrospinal fluid in patients with early stage Creutzfeldt-Jakob disease. Clin. Chim. Acta 211, 37.

... ..51 · .·...· ··· ····· · · ··· <··· · ♦ ······· · · ·· * * • · · · ····· ···« · ·· ··· ·· ♦·

Kawashima, T., Furukawa, R, Doh-ura, K., and Iwaki, T. (1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet 350, 68-69.

Kascsak RJ, Rubenstein R, Merz PA, Tonna-DeMasi M, Fersko R, Carp RI, Wisnieswski HM, Diringer H, (1987). Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scarpie-associated fibril proteins. J. Virol., 61,3688-3693.

Kocisko, D. A., ComeJ. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, GJ., Lansbury, P. T., and Caughey, B. (1994). Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature 370,471474.

Kocisko, D. A., Priola, S. A., Raymond, G. J., Chesebro, B., Lansbury, P. T., Jr., and Caughey, B. (1995). Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,3923-3927.

Kretzschmar et al., DNA 5: 315-324 (1986).

Kretzschmar et al., T. Gen. Virol. 73: 2757-2761 (1992).

Locht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 6372-6376 (1986).

Onofrji, M., Fulgente, T., Gambi, D., and Macchi, G. (1993). Early MRI findings in Creutzfeld-Jakob disease. J. Neurol. 240, 423. Pan, K. M., Baldwin, M., NjuyenJ., Gassett, M., Serban, A., Groth,

D., Mehlhom, I., and Prusiner, S. B. (1993). Conversion of alpha helices into D # -sheets features in the formation of scrapie prion poteins. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90, 10962-10966.

Prusiner, S. B. (1991). Molecular biology of prion diseases. Science 252, 1515-1522.

Roos, R., Gajdusek, D. C., and Gibbs, C. J., Jr. (1973). The clinical characteristics of tmsmissible Creutzfeldt-Jakob disease. Brain 96,

1-20.

Saborio, G. P., Soto, C., Kascsak, R. J., Levy, E., Kascsak, R., Harris, D. A., and Frangione, B. (1999). Cell-lysate conversion of prion protein into its protease-resistant isoform suggests the participation of a cellular chaperone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 258, 470-475.

SafarJ, Wille H, Itri V, Groth D, Serban H, Torchia M, Cohen FE, Prusiner SB, (1998).

Eight prion strains have PrP (Sc) molecules with different conformations. Nat. Med. 4, 1157-1165.

Sargiacomo M, Sudol M, Tang Z, Lisanti MP. (1993), Signal transducing molecules and glycosyl-phosphatidylinositol-linked proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells., J Cell Biol. Aug; 122 (4): 789-807 f

Stahl, N., Baldwin, M. A., Teplow, D. B., Hood, L, Gibson, B. W., Burlingame, A. L., and Prusiner, S. B. (1993). Structural studies of « ♦

..53 • · · · · ·

the scrapie prion protein using mass spectrometry and amino acid sequencing. Biochem. 32,1991-2002.

Steinhoff, B. J., Racker, S., Herrendorf, G., and et al (1996). Accuracy and reliability of periodic sharp wave complexes in Creutzfeldt-Jakob disease. Arch. Neurol. 53, 162.

Telling, G. C., Scott, M., Mastrianni, J., Gabizon, R., Torcha, M., Cohen, F. E., DeArmond, S. J., and Prusiner, S. B. (1995). Prion propagation in mice expressing human and chimeric PrP transgenes implicates the interaction of cellular PrP with another protein. Cell 83, 7990.

Martin Vey et al. (1996), Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93,14945-9 Weber, T., Otto, M., Bodemer, M., and Zerr, I. (1997). Diagnosis of Creutzfeld-Jakob disease and related human spongiform encephalopathies. Biomed. Pharmacother. 51, 381-387.

Westaway et al., Genes Dev. 8: 959-969 (1994).

WHO/EMC/ZDI/98. 9, Global Surveillance, Diagnosis and Therapy of Human Transmissible Spongiform Encephalopathies: Report of a WHO Consultation, Geneva, Switzerland 9-11 February 1998, WHO.

Claims (20)

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ
1. (1) осъществяване на контакт на пробата с количество от не-патогенен β-амилоиден белтък;

   (1а) инкубиране пробата/не-патогенния β-амилоиден белтък;

   (1) осъществяване на контакт на пробата с количество от не-патогенен β-амилоиден белтък;

   (1а) инкубиране пробата/не-патогенния β-амилоиден белтък;

   (1) осъществяване на контакт на пробата с количество от РгР^с белтък;

   (1а) инкубиране на пробата/РгР^с белтъка;

   (1) осъществяване на контакт на количество от непатогенната конформационна форма с количество от патогенната конформационна форма (а) в присъствие на споменатото съединение, и (б) в отсъствие на споменатото съединение;

   (1) осъществяване на контакт на споменатата проба с количество на не-патогенна конформационна форма;

   (1) осъществяване на контакт на пробата с количество от не-патогенен β-амилоиден белтък;

   (1а) инкубиране пробата/не-патогенния β-амилоиден белтък;

   • * · · · · (1) осъществяване на контакт на пробата с количество от не-патогенен β-амилоиден белтък;

   (1а) инкубиране пробата/не-патогенния β-амилоиден белтък;

   (1) осъществяване на контакт на пробата с количество от

   РгР^с белтък;

   (1а) инкубиране на пробата/РгР^с белтъка;

   (1) осъществяване на контакт на пробата с количество от не-патогенен прионен белтък;

   (1а) инкубиране пробата/не-патогенния прионен белтък;

   (1) осъществяване на контакт на количество от непатогенната конформационна форма с количество от патогенната конформационна форма (а) в присъствие на споменатото съединение, и (б) в отсъствие на споменатото съединение;

   (1) осъществяване на контакт на споменатата проба с количество на не-патогенна конформационна форма;

   (1) осъществяване на контакт на споменатата проба с количество от не-патогенната конформационна форма; (2) дезагрегиране на всички случайно получили се агрегати по време на стъпка (1); и (3) определяне наличието и/или количеството на споменатата патогенна конформационна форма в пробата, като патогенната конформационна проба е маркер за присъствието на споменатото заболяване.

   1. Метод за диагностика или определяне на конформационно заболяване, характеризиращо се с конформационен преход на определен белтък между непатогенна и патогенна конформационна форма, чрез анализиране на маркер за споменатото заболяване в пробата, който метод се характеризира с това, че включва:
2. (2) дезагрегиране на всички агрегати получени по време на стъпка (1а);

   повтаряне на стъпки (1а)- (2) два или повече пъти; и последващо (3) определяне на наличието и/или количеството на патогенния β-амилоиден белтък в пробата.

   (2) дезагрегиране на всички агрегати, получени по време на стъпка (1а);

   ·· · ···· • · · · ♦ · •« · · · ·· · ·· ·· повтаряне на стъпки (1а) - (2) два или повече пъти; и последващо (3) определяне на наличието и/или количеството на патогенен β-амилоиден белтък в пробата.

   (2) дезагрегиране на всички агрегати, получени по време на стъпка (1а);

   повтаряне на стъпки (1а) - (2) два или повече пъти; и последващо (3) определяне на наличието и/или количеството на PrP^Sc в пробата.

   (2) дезагрегиране на всички агрегати, получени по време на стъпка (1а);

   повтаряне на стъпките (1а) - (2) два или повече пъти; и последващо (3) определяне на наличието и/или количеството на патогенния прионен белтък в пробата.

   (2) дезагрегиране на всички агрегати, случайно получени по време на стъпка (1); и (3) определяне на количеството на патогенната конформационна форма (а) в присъствие на споменатото съединение и (б) в отсъствие на споменатото съединение.

   (2) дезагрегиране всички агрегати, случайно получени по време на стъпка (1); и (3) определяне на присъствието и/или количеството на споменатата патогенна конформационна форма в пробата, като патогенната конформационна форма е използвана, като маркер за наличието на споменатото заболяване.

   (2) дезагрегиране на всички агрегати получени по време на стъпка (1а);

   повтаряне на стъпки (1а)- (2) два или повече пъти; и последващо (3) определяне на наличието и/или количеството на патогенния β-амилоиден белтък в пробата.

   21. Апаратура за прилагане на методът, съгласно която и да е от претенции от 1 до 9 или 15 или анализът, съгласно която и да е от претенциите от 10 до 12.

   t

   22. Апаратура за прилагане на който и да е метод, съгласно претенции от 1 до 9 или 15 или анализът, съгласно която и да е от претенции от 10 до 12, включваща микро-плака,

   (2) дезагрегиране на всички агрегати, получени по време на стъпка (1а);

   повтаряне на стъпки (1а) - (2) два или повече пъти; и последващо (3) определяне на наличието и/или количеството на патогенен β-амилоиден белтък в пробата.

   20. Метод за диагностика на болестта на Алцхаймер в пациент, характеризиращ се с това, че включва:

   вземане на проба от пациента;

   (2) дезагрегиране на всички агрегати, получени по време на стъпка (1а);

   повтаряне на стъпки (1а) - (2) два или повече пъти; и последващо (3) определяне на наличието и/или количеството на PrP^Sc в пробата.

   t

   (2) дезагрегиране на всички агрегати, получени по време на стъпка (1а);

   повтаряне на стъпките (1а) - (2) два или повече пъти; и последващо (3) определяне на наличието и/или количеството на патогенния прионен белтък в пробата.

   (2) дезагрегиране на всички агрегати, случайно получени по време на стъпка (1); и (3) определяне на количеството на патогенната конформационна форма (а) в присъствие на споменатото съединение и (б) в отсъствие на споменатото съединение.

   (2) дезагрегиране всички агрегати, случайно получени по време на стъпка (1); и (3) определяне на присъствието и/или количеството на споменатата патогенна конформационна форма в пробата, t

   като патогенната конформационна форма е използвана, като маркер за наличието на споменатото заболяване.

   • · · · ·· • · · ·· ······· · · · · * · • · ··· · · ·· ···· · ·· · · ·♦· ··

   2. Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че стъпка (1) включва стъпка (1а) инкубиране на споменатата проба/не-патогенна конформационна форма.
3. 3. Метод, съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че стъпките (1а) и (2) са от цикъл, който се повтаря най-малко два пъти преди провеждането на стъпка (3).
4. 4. Метод, съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че цикълът се повтаря от 5 до 40 пъти преди да се проведе стъпка (3).
5. 5. Методът, съгласно която и да е от предшестващите претенции, характеризиращ се с това, че стъпка (1) се провежда при физиологични условия.

   • ·

   ..55 • · · · • · ♦ · · · · ·· ··· · · · · ·· ·*····· « · · · ·· • · ··« ·· · · ···· · ·· · · · ·· ··
6. 6. Методът, съгласно която и да е от предшестващите претенции, характеризиращ се е това, че количеството на непатогенната конформационна форма от стъпка (1) е в излишно количество.
7. 7. Методът, съгласно която и да е от предшестващите претенции, характеризиращ се е това, че конформационното заболяване е трансмисибилно конформационно заболяване.
8. 8. Методът, съгласно която и да е от предшестващите претенции, характеризиращ се с това че пробата за анализ се подлага на предварително третиране за селективно концентриране на патогенната конформационна форма в пробата.

   8. Методът, съгласно която и да е от предшестващите претенции, характеризиращ се с това че пробата за анализ се подлага на предварително третиране за селективно концентриране на патогенната конформационна форма в пробата.
9. « · · · · • ·· • 9· • *9 • 9 ·· • · · ·

   9. Методът, съгласно претенция 8, характеризиращ се с това че патогенната конформационна форма е PrP^Sc и предварителното третиране е екстракция от пробата на фракция, която е не-разтворима в детергенти при меки условия.

   9< «··· много-ямков ултразвуков дезинтегратор и количество от не патогенна конформационна форма.

   2412/02-ГП ·· · ♦ ··· • · · · Js) ·♦ · · · ··· ··· ··· ·····«· · · ·· · · • · · · · · · · · ···· · ·· · · · ·· · ·

   ПРОМЕНЕНИ ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ,

   ДЕПОЗИРАНИ В МБ НА 14.10.2002 год,

   9. Методът, съгласно претенция 8, характеризиращ се с това че патогенната конформационна форма е PrP^Sc и предварителното третиране е екстракция от пробата на фракция, която е не-разтворима в детергенти при меки условия.
10. 10. Анализ на маркер за конформационно заболяване, който се характеризира с конформационен преход на определен белтък, между не-патогенна и патогенна конформационна форма, в проба, който анализ включва следните стъпки:

    10. Анализ на маркер за конформационно заболяване, който се характеризира с конформационен преход на определен белтък, между не-патогенна и патогенна конформационна форма, в проба, който анализ включва следните стъпки:
11. 11. Анализът, съгласно претенция 10, където стъпка (1) включва стъпка (1а) инкубиране на споменатата проба/непатогенна конформационна форма.

    11. Анализът, съгласно претенция 10, където стъпка (1) включва стъпка (1а) инкубиране на споменатата проба/непатогенна конформационна форма.
12. 12. Анализът, съгласно претенция 11, където стъпките (1а) и (2) са от цикъл, който се повтаря най-малко два пъти преди да се проведе стъпка (3).

    12. Анализът, съгласно претенция 11, където стъпките (1а) и (2) са от цикъл, който се повтаря най-малко два пъти преди да се проведе стъпка (3).
13. 13. Диагностичен кит, за прилагане на анализа, съгласно която и да е от претенции 10 до 12, който включва известно количество от не-патогенната конформационна форма, многоямкова микро-плака и много-ямков ултразвуков дезинтегратор.

    13. Диагностичен кит, за прилагане на анализа, съгласно която и да е от претенции 10 до 12, който включва известно количество от не-патогенната конформационна форма.
14. 14. Метод за идентифициране на съединение, което модулира конформационния преход на определен белтък между не-патогенна и патогенна конформационна форма, характеризиращ се с това, че включва:

    14. Диагностичен кит, съгласно претенция 13, който допълнително включва много-ямкова микро-плака и многоямков ултразвуков дезинтегратор.
15. 15. Методът, съгласно която и да е от претенции 1 до 9 или 14 или анализът, съгласно която и да е от претенции от 10 до 12, характеризиращи се с това, че патогенната конформационна форма е PrP^Sc, не-патогенната конформационна форма е РгР и дадения белтък е прионният белтък.

    15. Метод за идентифициране на съединение, което модулира конформационния преход на определен белтък между не-патогенна и патогенна конформационна форма, характеризиращ се с това, че включва:
16. 16. Метод за определяне на наличието на патогенна форма на прионен белтък в проба, характеризиращ се с това, че включва:

    ·· · ·<π ··' · • · · · ον · · ·· ··· · · * ·· • ····«· · * · ·* • » · · · ·♦ · ···· » ·· · · ·· · (1) осъществяване на контакт на пробата с количество от не-патогенен прионен белтък;

    (1а) инкубиране пробата/не-патогенния прионен белтък;

    16. Методът, съгласно която и да е от претенции 1 до 9 или 15 или анализът, съгласно която и да е от претенции от 10 до 12, характеризиращи се с това, че патогенната конформационна форма е PrP^Sc, не-патогенната ······· · · · · · · • · · · · ♦ · · · «··· · ·· ··» ·· ·· конформационна форма е РгР и дадения белтък е прионният белтък.
17. 17. Метод за диагностика на CJD в пациент, характеризиращ се с това, че включва:

    вземане на проба от пациента;

    17. Метод за определяне на наличието на патогенна форма на прионен белтък в проба, характеризиращ се с това, че включва:
18. 18. Метод за определяне на наличието на патогенна форма на β-амилоиден белтък в проба, характеризиращ се с това че включва:

    18. Метод за диагностика на CJD в пациент, характеризиращ се с това, че включва:

    вземане на проба от пациента;
19. 19. Метод за диагностика на болестта на Алцхаймер в пациент, характеризиращ се с това, че включва:

    вземане на проба от пациента;

    19. Метод за определяне на наличието на патогенна форма на β-амилоиден белтък в проба, характеризиращ се с това че включва:
20. 20. Апаратура за прилагане на който и да е метод, съгласно претенции от 1 до 9 или 14 или анализът, съгласно която и да е от претенции от 10 до 12, включваща микро-плака, много-ямков ултразвуков дезинтегратор и количество от непатогенна конформационна форма.