CZ200336A3 - Způsob časné diagnostiky konformačních onemocnění - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu diagnostiky nebo detekce konformačních onemocnění provedením testu na markér (tj. patogenní konformer) těchto onemocnění ve vzorku, přičemž tento způsob zahrnuje cyklický amplifikační systém pro zvýšení hladin patogenního konformeru. Tato konformační onemocněni mohou být zvláště prionové encefalopatie.

Dosavadní stav techniky

Konformační onemocnění představují skupinu onemocnění, která jsou zdánlivě nepříbuzná, ale která sdílejí překvapivou podobnost v klinických projevech, které odrážejí jejich sdílený molekulární mechanismus iniciace a samouspořádání s následným ukládáním v tkáních a jejich poškozováním.

Význam struktury je důsledkem skutečnosti, že tato rozdílná onemocnění vždy vycházejí z odchylného konformačního přechodu v základním proteinu (underlying protein), což charakteristicky vede k agregaci proteinu a ukládáni v tkáni. Klinicky odráží projevy těchto konformačních onemocnění jejích molekulární mechanismus, typicky s pomalým a zákeřným nástupem, jestliže přechod probíhá u normálního proteinu, ale s rychlejším nástupem, jestliže se vyskytuje u nestabilní varianty proteinu. Dva příklady těchto konformačních onemocnění, které mají zvláštní význam, jsou přenosné spongiformní encefalopatie a Alzheimerova demence, což je onemocnění, které může způsobit ohrožení zdravotních systémů v rozvinutém světě jejich přetížením (přehledný článek viz Carrell a další, 1997).

Přenosné spongiformní encefaiopatie (transmissible spongiform encephalopathies, TSE) známé také jako prionová onemocnění jsou skupinou neurodegenerativních onemocnění, která postihují člověka i zvířata. Některá z onemocnění TSE jsou Creutzfeldt-Jakobova choroba (Creutzfeldt-Jakob disease, CJD), kuru, GerstmannStraussler-Schenkerova choroba (GSS) a fatální familiální insomníe (FFI) u lidí stejně jako klusavka (skrapie) a bovinní spongiformní encefaiopatie (BSE) u zvířat (Prusiner, 1991).

I když tato onemocnění jsou u lidí poměrně vzácná, riziko přenosu BSE na člověka prostřednictvím potravního řetězce vzbudilo pozornost orgánů veřejného zdraví a vědecké komunity (Cousens a další, 1997, Bruče a datší, 1997).

Tato onemocnění jsou charakterizována extrémně dlouhou Ínkubační dobou, po níž následuje krátké a vždy fatální klinické onemocnění (Roos a další, 1973). Dosud není dostupná žádná terapie.

Klíčovým znakem onemocnění je tvorba abnormálně tvarovaného proteinu označovaného PrP^Sc, což je posttransiačně modifikovaná verze normálního proteinu označovaného PrP^c (Cohen a Prusiner, 1998). Nebyly dosud detekovány chemické rozdíly, které by rozlišily mezi isoformami PrP (Stáhl a další, 1993) a zdá se, že konverze zahrnuje konformační změnu, při které se zmenšuje obsah α-šroubovice normálního proteinu a vzrůstá množství β-listu (Pan a další, 1993). Za strukturními změnami následují změny biochemických vlastností: PrP^cje rozpustný v nedenaturujících rozpouštědlech, PrP^Sc je nerozpustný; PrP^c se snadno štěpí proteázami, zatímco PrP^Sc je částečně rezistentní, což vede ke tvorbě N-koncově zkráceného fragmentu známého jako „PrPres“ (Baldwin a další, 1995; Cohen a Prusiner, 1998), „PrP 27-30“ (27-30 kDa) nebo „PK-resistanť‘ (forma rezistentní k proteináze K).

♦ • · · • * • Φ «φ • · «· ····

V současnosti neexistuje přesná diagnostika TSE (WHO Report, 1998, Budka a další, 1995, Weber a další, 1997). Pokusy vyvinout diagnostický test na prionová onemocnění jsou znesnadňovány zdánlivě nepřítomnou imunitní reakcí vůči PrP^Sc. Klinická diagnóza CJD je v současnosti založena na kombinaci subakutní progresivní demence (méně než dva roky), myoklonu a multifokální neurologické dysfunkci, spojených s charakteristickým periodickým elektroencefalogramem (EEG) (WHO Report, 1998, Weber a další, 1997). U nové varianty CJD (variantní CJD, vCJD), většiny iatrogenních forem CJD a až u 40 % sporadických případů nedochází k abnormalitám na EEG (Steinhoff a další, 1996). Přesnost klinické diagnózy je pro CJD přibližně 60 %, přičemž pro jiná prionová onemocnění je tato přesnost vysoce variabilní. Klinická diagnóza je přesnější pouze v pozdním stadiu onemocnění, kdy již došlo k vyvinutí zřetelných příznaků (Weber a další, 1997).

Pro diagnostiku dědičných prionových onemocnění je použitelná genetická analýza, ale tato onemocnění představují pouze 15 % případů. Neurologické zobrazování je použitelné pouze pro vyloučení jiných stavů rychlé progresivní demence způsobené strukturními poškozeními mozku (Weber a další, 1997). Nálezy získané zobrazením mozku počítačovou tomografií (CT) a magnetickou rezonancí (MRI) závisí hlavně na stupni onemocnění. CT má mnohem nižší citlivost a v časné fázi se u 80 % případů nedetekuje žádná atrofie (Galvez a Cartier, 1983). Signály MRI se zvýšenou intenzitou byly detekovány v bazálních gangliích vedle atrofie (Onofrji a další, 1993). Podobně jako změny pozorované metodou CT nejsou tyto odchylky v žádném případě specifické.

Nedávno získané údaje vedly k identifikaci několika neuronálních, astrocytárních a gliáiních proteinů, jejichž hladina je u CJD zvýšena (Jimi a další, 1992). V časné fázi onemocnění je podstatně zvýšena koncentrace proteinu S-100, isoenzymu specifického pro neurony a ubikvitinu v cerebrospinální tekutině (CSF), • · · » · · ·«

-4 ···* přičemž v průběhu onemocnění dochází k poklesu koncentrací (Jimi a další, 1992). Jako specifický a citlivý test pro sporadickou CJD byl navrhován markér smrti neuronů, protein 14-3-3 (Hsich a další, 1996). Není však použitelný pro diagnózu vCJD, a má mnohem nižší specificitu v případě genetických forem. Protože protein 14-3-3 může být přítomen v CSF pacientů s jinými onemocněními, test není doporučován WHO pro obecný screening na CJD, a je vyhrazen pro potvrzení klinické diagnózy (WHO Report, 1998).

Kombinací klinických dat s biochemickými markéry se dosahuje vysoké úspěšnosti diagnózy. Podle operační diagnózy v současnosti používané v systému sledování CJD v Evropě (European Surveillance of CJD) je definitivní diagnóza určena pouze neuropatologickým vyšetřením a detekcí PrP^Sc buď imunohistochemicky, histologickým přenosem nebo westernovým přenosem (Weber a další, 1997, Budka a další, 1995).

Tvorba PrP^Sc je nejen nejpravděpodobnější příčinou onemocnění, ale je také nejlepším známým markérem. Detekce PrP^Sc ve tkáních a buňkách široce koreluje s onemocněním a s infekčností TSE a léčení, které inaktivuje nebo eliminuje infekčnost TSE odstraňuje také PrP^sc (Prusiner, 1991). Identifikace PrP^Sc ve zvířecích nebo lidských tkáních je považována pro diagnózu TSE za klíčovou (WHO Report, 1998). Důležitým omezením tohoto přístupu je jeho citlivost, protože množství PrP^Sc jsou vysoká (dostatečná pro detekci běžnými metodami) pouze v CNS v pozdních stadiích onemocnění. Bylo však ukázáno, že v dřívějších stadiích onemocnění existuje generalizovaná distribuce PrP^Sc (v nízkých množstvích), zvláště v lymforetikulárním systému (Aguzzi, 1997). Přítomnost PrP^Sc byla také hlášena ve tkáni patrových mandlí a apendixu u pacientů s vCJD (Hill a další, 1997). I když není známo, jak časně v průběhu onemocnění by mohla být použita tonsilární biopsie nebo biopsie apendixu při diagnóze vCJD, bylo ukázáno, že u ovcí geneticky vnímavých na scrapii, by PrP^Sc mohl být detekován v tonsilární tkáni • · · >··· ··

S c ještě před projevením příznaků a časně v inkubačním období. PrP však nebyl dosud v těchto tkáních detekován v žádných případech sporadické CJD nebo GSS (Kawashima a další, 1997).

Normální protein je exprimován v bílých krvinkách a destičkách a proto je možné, že některé krvinky postižených jedinců mohou obsahovat PrP^Sc (Aguzzi, 1997). To zvyšuje možnost vytvoření krevního testu na CJD, ale bylo by zapotřebí testu s mnohem vyšším stupněm citlivosti než u současných testů.

Předpokládá se, že k replikaci prionů dochází, jestliže PrP^Sc v infikujícím inokulu specificky interaguje s PrP^c hostitele, čímž katalyzuje jeho konverzi na patogenní formu proteinu (Cohen a další, 1994). Tento proces probíhá mnoho měsíců až let pro dosažení dostatečné koncentrace PrP^Sc pro spuštění klinických příznaků.

Zdá se, že infekční jednotkou PrP^Sc je oligomerní struktura bohatá na β-list, která přeměňuje normální protein jeho integrací do rostoucího agregátu (obr. 1). Tato konverze byla napodobena in vitro smísením vyčištěného PrP^c s padesátínásobným molárním nadbytkem předem denaturovaného PrP^Sc (Kocisko a další, 1994).

Konverzní systémy in vitro, které byly dosud popsány, mají nízkou účinnost, protože vyžadují nadbytek PrP^Sc, a proto nejsou použitelné pro diagnostické účely, protože nejsou schopny monitorovat nedetekovatelné množství markéru. Důvodem pro nízkou účinnost je skutečnost, že počet oligomerů PrP^Sc (konvertující jednotky) zůstává v průběhu testu nezměněn. Konvertující jednotky postupně narůstají na svých koncích a důsledkem je, že se zvětší, ale nezvýší se jejich počet (obr. 1),

Podstata vynálezu

Autoři vynálezu nyní nalezli způsob diagnostiky nebo detekce konformačního onemocnění, kde toto onemocnění je charakterizováno

• · · • ·

-6tt ···· tt • ♦ « tt konformačním přechodem základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, testováním markéru uvedeného onemocnění ve vzorku, přičemž uvedený způsob zahrnuje následující kroky:

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního konformeru;

(ii) provede se rozbití agregátů, které se popřípadě vytvořily během kroku (i); a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního konformeru ve vzorku.

Patogenní konformer bude s výhodou markér přítomnosti uvedeného onemocnění.

Krok (i) s výhodou zahrnuje krok (ia), při kterém se inkubuje uvedený vzorek/nepatogenní konformer.

Podle výhodného provedení vynálezu tvoří kroky (ia) a (ii) cyklus, který se před provedením kroku (iii) opakuje alespoň dvakrát. Výhodněji se cykly opakují 5 až 40 x a nejvýhodněji 5 až 20 x.

Konformační onemocnění určená k detekci nebo diagnostice jsou onemocnění charakterizovaná konformačním přechodem základního proteinu. Tento „základní protein“ (underlying protein) je protein, kterýje schopen přijmout nepatogenní konformaci a patogenní konformaci. Jedním příkladem takového proteinu je prionový protein, PrP. Dalším příkladem takového proteinu je protein, který se účastní Alzheimerovy choroby, tj. β-amyloidní protein.

Konformační onemocnění, která mají být diagnostikována nebo detekována, jsou s výhodou přenosná konformační onemocnění, jako je TSE (jak je definováno v části Dosavadní stav techniky.

V případě diagnózy TSE a podle výhodného provedení vynálezu Sc je markérem onemocnění stejně jako patogenním konformerem PrP , £ zatímco nepatogenním konformerem sledovaného proteinu je PrP .

• * • ·

-7Množství nepatogenního konformeru, které se používá v kroku (i) (a popřípadě v kroku (ib)) bude obecně známé množství, ačkoli tento požadavek nemusí být splněn, jestliže se jedná pouze o zjištění přítomnosti nebo nepřítomnosti patogenního konformeru.

Množství nepatogenního konformeru, které se použije v kroku (i) (a popřípadě v kroku (ib)) bude s výhodou nadbytečné množství. Počáteční poměr nepatogenního konformeru k patogennímu konformeru (jestliže je ve vzorku přítomen) bude obecně větší než 100: 1, s výhodou větší než 1000 : 1 a nejvýhodněji větší než 1 000 000 : 1.

V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu je nepatogenní konformer v kroku (i) přítomen v homogenátů mozku zdravého jednotlivce a/nebo může být k němu přidán před provedením kroku (i); v tomto případě se proto v průběhu kroku (i) přidá homogenát mozku obsahující (s výhodou známý) nadbytek nepatogenního konformeru. Mozkový homogenát zdravého jedince s výhodou pochází ze stejného druhu, ze kterého pochází vzorek určený k analýze (například homogenát lidského mozku z analyzovaného vzorku pocházejícího z člověka, homogenát krysího mozku z analyzovaného vzorku pocházejícího z krysy). Nepatogenní konformer je výhodněji přítomen ve specifické frakci homogenátů mozku, například v lipidických raftech (lipid-rafts) homogenátů mozku. Příprava těchto frakcí se může provádět například podle popisu v Sargiacomo M. a další, 1993.

Vynález se tedy dále týká způsobu nebo testu popisovaného v přihlášce, při kterém se k nepatogennímu konformeru v kroku (i) přidá tkáň nebo frakce tkáně. Tkáň je s výhodou mozková tkáň nebo z ní odvozený homogenát nebo frakce pocházející ze zdravého subjektu (tj. subjektu, u kterého není přítomen patogenní konformer).

Bylo již publikováno (Kocisko a další, 1994), že méně glykosylované formy PrP^c se preferenčně konvertují na formu PrP^Sc.

• · · • 0 *· ·· ···* ·· • * •· ♦ ···

Konkrétně PrP^c, na který se působilo fosfolipázou C specifickou pro fosfatidylinositol, rutinně přecházel s vyšší účinností na patogenní formu než úplný, více glykosylovaný PrP^c Další provedení vynálezu se proto týká způsobu nebo testu popsaného v přihlášce, ve kterém nepatogenním konformerem je PrP^c, který má sníženou míru glykosylace (zvláště N-glykosylace) ve srovnání s PrP^c standardního typu. S výhodou se při způsobech a testech popisovaných v přihlášce působilo na PrP^c při jeho použití jako nepatogenního konformeru pro odstranění některé, veškeré nebo podstatného množství glykosylace; a výhodněji je nepatogenní konformer PrP^c, který je v podstatě neglykosylovaný.

V případě diagnózy TSE, jestliže jsou ve vzorku přítomny agregáty patogenní formy, budou tyto formy v průběhu kroku (i) indukovat přechod PrP^c->PrP^Sc a v průběhu kroku (ii) budou tyto agregáty rozbity na menší, stále ještě infekční jednotky, z nichž každá si zachová schopnost indukovat konverzi jiného PrP . Tento druh metody se zde nazývá „cyklická amplifikace“ a je znázorněn na obr. 2. Tento systém vede k exponenciálnímu zvýšení množství PrP^Sc popřípadě přítomného ve vzorku, které může být snadno detekováno. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu je proto možné vypočíst množství PrP^Sc přítomného ve vzorku na počátku, přičemž se vychází ze známého množství PrP^c, zjišťuje se množství PrP^Sc přítomné ve vzorku na konci testu a v úvahu se bere počet provedených cyklů.

Jestliže naopak ve vzorku nebude přítomen žádný PrP^Sc (buď

Q jako takový nebo ve formě agregátů), nebude žádná molekula PrP převedena na PrP^Sc a na konci testu bude tento markér zcela nepřítomný (žádný patogenní konformer nebode ve vzorku detekován).

Bylo ukázáno, že infekční jednotkou PrP^Sc je oligomer bohatý na strukturu β-listu, který může přeměňovat normální protein jeho integrací do rostoucího agregátu, kde získává vlastnosti spojené s abnormální formou (rezistence na proteázu a nerozpustnost) (Jarrett a

Lansbury, Jr., 1993, Caughey a další, 1997). Po inkubaci těchto dvou forem PrP zvyšují oligomerní molekuly svou velikost přibíráním a transformací molekul PrP^c. Tento proces má nízkou účinnost, protože závisí na pevném počtu oligomerů rostoucích na svých koncích. Počet konvertujících jednotek se v průběhu reakce nezvyšuje, jestliže se oligomery pouze zvětšují. Předpokládá se, že tento proces je proces, který probíhá v těle zvířete nebo člověka po infekci; tedy proces, o kterém je známo, že trvá měsíce nebo dokonce několik let. V předkládaném vynálezu popisují autoři postup rozbíjení oligomerů na menší části, z nichž každá je potom schopna konvergovat PrP^c.

Tento systém má proto přímá použití pro diagnózu konformačních onemocnění a zvláště přenosných konformačních onemocnění jako je TSE amplifikaci jinak nedekovatelných množství PrP^Sc v různých tkáních nebo biologických tekutinách. Tento systém může umožnit časnou identifikaci lidí s rizikem vyvinutí TSE, a mohl by být také velmi užitečný pro biochemické sledování účinnosti léků na TSE při klinických pokusech.

Podle výhodného provedení vynálezu se analyzovaný vzorek nejprve vystaví kroku „předběžného zpracování“, jehož účelem je „selektivní zakoncentrování“ detekovaného patogenního konformeru ve vzorku. V případě TSE bylo zjištěno, že PrP^c í PrP^Sc jsou umístěny ve zvláštní oblasti plasmatické membrány, která je rezistentní na působení mírných detergentů (jako je ledový Triton X-100) v důsledku relativně vysokého obsahu cholesterolu a glykosfingolipidů (M. Vey a další, 1996). Tyto membránové domény se označují jako lipidické rafty (lipid-rafts) nebo membrány rezistentní na detergenty (detergentresistant membranes, DRM) nebo kaveolám podobné domény (caveolae-like domain, CLD) a jsou bohaté na signální proteiny, receptory a proteiny zakotvené na GPI. Autoři vynálezu potvrdili, že 100 % PrP^c v mozku je navázáno na tuto frakci, která tvoří méně než 2 % celkových proteinů (viz příklad 6 a obr. 7). Jednoduchým krokem izolace lipidických raftů ze vzorku se tedy umožní podstatné • 9 *

9» • •99

- 10obohacení na PrP . Podobné výsledky byly přihlašovateli získány při izolaci lipidických raftů z homogenátů mozků se scrapií, ve kterých byl PrP^Sc izolován v raftech.

V jednom provedení tedy vynález zahrnuje krok, ve kterém se analyzovaný vzorek vystaví kroku předběžného zpracování pro selektivní zakoncentrování patogenního konformeru ve vzorku. Patogenní konformer je s výhodou PrP^Sc a předběžné zpracování je extrakce frakce nerozpustné v mírných detergentech ze vzorku.

Kroky (i) a (ia) se s výhodou provádějí za fyziologických podmínek (pH, teplota a iontová síla) a výhodněji se k roztoku přidávají také inhibitory proteáz a detergenty, Tyto podmínky se budou volit tak, aby umožnily přeměnu nepatogenního konformeru na patogenní konformer působením případného patogenního konformeru, jestliže je ve vzorku přítomen, za vytvoření agregátu nebo oligomerů patogenních konformeru. Vhodné fyziologické podmínky budou odborníkům v oboru zřejmé.

Délka inkubace bude dostatečná pro umožnění konverze veškerého nebo podstatné části nepatogenního konformeru na patogenní konformer za předpokladu, že vzorek nějaký patogenní konformer obsahuje. Tuto dobu může odborník v oboru snadno určit. S výhodou se každá inkubace bude provádět po dobu mezi 1 min až 4 hod, výhodněji 30 min až 1 hod, a zvláště výhodně přibližně 60 min.

Krok inkubace (ia) může také zahrnovat další krok (ib), jehož součástí je přidání dalšího množství nepatogenního konformeru.

Pro rozbití (disagregaci) agregátů při kroku (ii) způsobu podle předkládaného vynálezu mohou být použity různé metody. Patří sem; působení rozpouštědel (jako je dodecylsulfát sodný, dimethylsulfoxid, acetonitril, guanidin, močovina, trifluorethanol, zředěná kyselina trifluroctová, zředěná kyselina mravenčí atd.), modifikace fyzikálněchemických vlastností roztoku jako je pH, teplota, iontová síla, dielektrická konstanta, a fyzikální metody, jako je sonikace, ozáření « ·

Β ·

Β · * · · ·« ··

- 11 «·*«

Β

ΒΒΒΒ laserem, zmrazení/tání, homogenizátor typu French press, inkubace do autoklávu, vysoký tlak, míchání, mírná homogenizace, jiné typy ozáření atd. Výhodným způsobem podle vynálezu je sonikace.

Rozbíjení agregátů se může provádět po dobu, ve které dojde k disagregaci některých, veškerých nebo podstatné části agregátů vytvořených v průběhu kroku (ii). Není nutné, aby se v kterémkoli kroku disagregace rozbily veškeré agregáty. Tímto způsobem se v každém kroku rozbíjení agregátů zvyšuje počet konvertujících jednotek.

Dobu rozbíjení může snadno určit odborník v oboru a může záviset na použité metodě disagregace. rozbíjení se s výhodou provádí po dobu 1 s až 60 min, výhodněji 5 s až 30 min a zvláště výhodně 5 s až 10 min. Jestliže se rozbíjení provádí sonikací, sonikace trvá s výhodou 5 s až 5 min, a nejvýhodněji 5 až 30 s.

Sonikace se dosud používala jako součást několika metod pro čištění PrP s cílem zvýšit rozpustnost velkých agregátů, ale dosud nikdy nebylo popsáno její použití pro amplifikaci konverze PrP in vitro.

Použití tradičních sonikátorů s jednoduchou sondou přináší problém se současnou manipulací s velkým počtem vzorků, jak je nezbytné při diagnostických testech. Na trhu jsou nyní některé sonikátory pro mikrotitrační destičky s 96-jamkovým formátem, které poskytují sonikací všech jamek současně a mohou být naprogramovány pro automatický provoz. Tyto sonikátory mohou být snadno upraveny pro použití při způsobu diagnózy podle předkládaného vynálezu.

V jednom provedení se tedy předkládaný vynález týká použití sonikátorů pro více jamek (vícejamkového sonikátorů) v kroku (ii).

Detekce nové zkonvertovaného patogenního konformeru, např. PrP^Sc, (iii) po postupu cyklické amplifikace popsaném v krocích (i) až (ii), by se mohla provádět jakýmkoli ze známých způsobů. Specifická

i a ♦

4· ·*

- 12 detekce PrP^Sc se obvykle (ale ne vždy, viz dále) provádí nejprve separací dvou isoforem PrP (normálního proteinu a patogenního proteinu). Separace se provádí na základě odlišných biochemických vlastností PrP^Sc, kterými se liší od většiny normálních proteinů v těle, tedy: PrP^Sc je částečně rezistentní na štěpení proteázami a je nerozpustný i v přítomnosti nedenaturujících detergentů. První krok po amplifikačním postupu je tedy obyčejně odstranění nebo oddělení PrP^c ve vzorku, buď působením proteáz nebo centrifugací pro oddělení rozpustného (PrP^c) od nerozpustného (PrP^Sc) proteinu. Potom se může provést detekce PrP^Sc kterýmkoli z následujících způsobů, mj.:

A) Imunologický přenos (imunobloting) po SDS-PAGE. Tento způsob se provádí rutinním postupem známým odborníkům v oboru s využitím některé z mnoha komerčně dostupných protilátek anti-PrP.

B) Test Elisa. Detekce na pevné fázi se může provádět buď jednoduchým testem, při kterém se vzorek nanese na destičku a potom se detekuje množství PrP^Sc použitím protilátek anti-PrP nebo výhodněji použitím sendvičové metody Elisa, při které se destička nejprve potáhne protilátkou anti-PrP, která specificky vychytá PrP ze vzorku, a PrP se potom detekuje použitím druhé anti-PrP protilátky. Obě formy Elisa se mohou také použít se značenými (radioaktivita, fluorescence, biotin, atd.) anti-PrP protilátkami pro další zvýšení citlivosti detekce.

C) Testy radioaktivity. Normální PrP^c použitý jako substrát pro amplifikaČní postup může být radioaktivně značený (3H, 14C, 35S, 1251, atd.) před zahájením postupu a potom po odstranění nekonvertovaného PrP^c se může kvantifikovat radioaktivita nově zkonvertovaného PrP^Sc. Tento postup je kvantitativnější a není založen na použití protilátek.

D) Testy založené na fluorescenci. Normální PrP^c použitý jako substrát pro amplifikaČní postup se může označit fluorescenčními • · * • ·*

-13, · · · · ··«·*» « · tttt* tt* ·**· sondami před zahájením postupu a po odstranění nezkonvertovaného PrP^c, a může se kvantifikovat fluorescence nově zkonvertovaného PrP^Sc. Je možné, že fluorescenční test nemusí vyžadovat odstranění nezkonvertovaného PrP^c, protože fluorescenční vlastnosti PrP^c a PrP^Sc by mohly být různé v důsledku odlišné konformace těchto dvou isoforem.

E) Agregační testy. Je dobře známo, že PrP^Sc (a nikoli PrP^c) je schopen agregovat za vytvoření amyloidních fibril nebo struktur tyčinkového typu. Proto by mohla být detekce PrP^Sc prováděna použitím způsobů používaných pro kvantifikaci tvorby těchto typů agregátů včetně elektronové mikroskopie, barvení specifickými barvivý (Kongo červeň, thioflavin S a T, atd.), a turbidimetrickýmí testy. Testy agregace nevyžadují krok separace dvou isoforem, protože je známo, že normální PrP^c neagreguje.

F) Strukturní testy. Nejdůležitější rozdíl mezi normálním a patogenním PrP je rozdíl v sekundární a terciární struktuře. Proto mohou být použity metody, které umožňují strukturní vyhodnocení proteinů, včetně NMR, cirkulárního dichroismu, infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací, Ramanovy spektroskopie, vlastní fluorescence, UV absorpce apod.

Nejrozšířenější používanou monoklonální protilátkou proti PrP je „3F4“ (Kascsak a další, 1987), což je monoklonální protilátka odvozená z myši imunizované křeččím 263K PrPres (konformer rezistentní na proteázu). Tato protilátka je také schopna rozpoznat nepatogenní konformer křečků a lidí, ale nikoli z mozků hovězího dobytka, myší, krys, ovcí nebo králíků; je také schopna vázat se na lidský patogenní konformer, ale pouze po denaturaci proteinu.

Tyto protilátky mohou být označeny, aby byla možná snadná detekce markéru. Například někteří vědci používali fluorescenční měření s časovým rozlišením s protilátkou 3F4 značenou europiem (Safar a další, 1998).

• ···

- 14 • to · · · • to · · toto· · ·· to · toto ···« to · • to toto

Výše uvedené metody detekce mohou být použity po příslušných úparavách pro detekci jiných patogenních konformerů, například patogenní formy β-amyloídního proteinu.

V dalším provedení může být označený a detekovatelný nepatogenní konformer přidávaný v nadbytku, takže množství neagregovaného konformerů na konci testu umožní určení množství patogenního konformerů přítomného ve vzorku na počátku.

Podle dalšího alternativního provedení by mohl být patogenní konformer (markér) přímo detekován proti němu zaměřenou protilátkou.

V širším hledisku může být k patogennímu konformerů, nepatogennímu konformerů nebo protilátce proti některému z konformerů přidána značka nebo značící skupina v závislosti na druhu prováděného testu.

Dalším předmětem vynálezu je test na markér konformačního onemocnění, které je charakterizováno konformačním přechodem základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, ve vzorku, kde tento test zahrnuje následující kroky:

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního konformerů, (ii) agregáty popřípadě vytvořené v kroku (i) se rozbíjí, a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství uvedeného patogenního konformerů ve vzorku.

Patogenní konformer bude obecně markér na přítomnost uvedeného onemocnění.

Krok (i) s výhodou zahrnuje krok (ia) inkubace uvedeného vzorku/nepatogenního konformerů.

- 15 • 9 9 ·

9999 99 • 9 ····

99

Podle výhodného provedení vynálezu tvoří kroky (ia) a (ii) cyklus, který se opakuje před provedením kroku (iii) alespoň dvakrát. Výhodněji se cykly opakují 5 až 40 x a nejvýhodněji 5 až 20 x.

Další předmět předkládaného vynálezu je diagnostický kit pro použití ve specifikovaném testu, který obsahuje množství nepatogenního konformeru a popřípadě navíc mikrotitrační destičku a vícejamkový sonikátor.

Použitím způsobu podle vynálezu je možné detekovat 1 až 10 fg patogenního konformeru na počátku přítomného ve vzorku, což je ekvivalentní 3 až 30 χ 10'²° mol.

Vzorek bude obecně biologický vzorek nebo tkáň a způsobem podle předkládaného vynálezu je možno testovat jakýkoli takový biologický vzorek nebo tkáň, V případě tkáně se mohou test a způsob podle předkládaného vynálezu provádět na homogenátech nebo přímo na vzorcích ex vivo. Tyto způsoby a testy se budou obecně provádět na vzorcích ex vivo nebo in vitro. Vzorkem je s výhodou biologická tekutina jako je krev, lymfa, moč nebo mléko; mozková tkáň, míšní tkáň, tonsilární tkáň, tkáň apendixu; vzorek odvozený z krve jako jsou membrány krvinek (blood cell ghosts), povlaky sražených leukocytů; nebo preparát plasmatické membrány jako jsou lipidické rafty, membrány rezistentní na detergent nebo kaveolám podobné domény (caveolae-like domains). Vzorek by mohl alternativně být směs obsahující sloučeninu (zvláště protein) odvozenou z lidského nebo zvířecího zdroje, jako je růstový hormon nebo tkáňový extrakt, jako je hypofyzární extrakt. Takový směsný vzorek by mohl být kontaminován patogenním konformerem.

Vzorek by mohl také obsahovat potravinářský výrobek nebo nápoj, nebo část potravinářského výrobku nebo nápoje (pro použití pro člověka nebo zvířata), aby se zjistila přítomnost nebo nepřítomnost patogenního konformeru v tomto výrobku nebo nápoji.

- 16 Φ Φφφ • · « · φφφφ φφ • φ φ» ··♦* • Φ ··

Nepatogenní konformer přidaný v kroku (i) bude s výhodou od stejného druhu jako je vzorek. Může být například odvozen od zdravé (tj. nepatogenní) formy (například tkáně) biologického vzorku, který se testuje. Alternativně se může nepatogenní konformer vyrábět synteticky nebo rekombinantně použitím v oboru známých prostředků.

• Bude však zřejmé, že nepatogenní konformer nemusí být v čisté formě nebo dokonce ve v podstatě čisté formě. Ve většině případů bude nepatogenní konformer ve formě tkáňového homogenátu nebo jeho frakce, který obsahuje relevantní nepatogenní konformer. Mezi příklady patří mozkové homogenáty a z nich odvozené frakce, např. lípidické rafty.

Vzorek a/nebo nepatogenní konformer budou s výhodou lidského původu nebo budou pocházet z domácího zvířete, například krávy, ovce, kozy nebo kočky.

Další předmět předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu identifikace sloučeniny, která moduluje konformační přechod základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, který zahrnuje následující kroky:

(i) množství nepatogenního konformeru se přivede do styku s množstvím patogenního konformeru v přítomnosti a v nepřítomnosti uvedené sloučeniny, (Íi) rozbijí se agregáty popřípadě vytvořené v kroku (i), (iii) určí se množství patogenního konformeru v přítomnosti a v nepřítomnosti uvedené sloučeniny.

V případě potřeby může krok (i) zahrnovat krok (ia) inkubace uvedeného vzorku/nepatogenního konformeru a cyklus se může provádět mezi kroky (ia) a (ii) jak bylo popsáno výše pro způsoby a testy podle vynálezu a naopak.

Jestliže je množství patogenního konformeru naměřené v přítomnosti sloučeniny vyšší než množství naměřené v její

- 17 • ·♦♦ · to · · · · ··· · · to ««·* ·«·· ·· to* ··*· ·· ·· nepřítomnosti, znamená to, že sloučenina je faktor, který „katalyzuje konformační změnu; jestliže je toto množství nižší, znamená to, že sloučenina je faktor inhibujicí tento přechod.

Podle výše uvedeného způsobu by měla být „identifikace“ také interpretována ve smyslu „screeningu“ řady sloučenin.

„Značka“ nebo „značící skupina“ může být jakákoli sloučenina použitá jako prostředek pro detekci proteinu. Značka nebo značící skupina může být na protein navázána iontovými nebo kovalentními interakcemi, vodíkovou vazbou, elektrostatickými interakcemi nebo interkalací. Mezi příklady značek a značících skupin patří bez omezení konjugáty fluorescenčních barviv, biotin, digoxigenin, radionukleotidy, chemiluminescenční látky, enzymy a receptory, takže detekce značeného proteinu se provádí fluorescencí, konjugací se streptavidinem a/nebo avidinem, kvantifikací radioaktivity nebo chemiluminiscence, katalytickými interakcemi a/nebo interakcemi ligand-receptor. S výhodou se používá fluorescenční nebo fosforescenční značka.

Termín „konformační onemocnění“ označuje skupinu onemocnění pocházejících z pomnožení přechodu základního proteinu do odlišné konformace, což vede k agregaci proteinu a uložení ve tkáni. Tato onemocnění mohou být také přenášena indukovanou konformační změnou, šířena z patogenního konformerů na svůj normální nebo nepatogenní konformer a v tomto případě se zde také nazývají „přenosná konformační onemocnění“. Příklady takových druhů onemocnění jsou prionové encefalopatie včetně bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) a jejího lidského ekvivalentu Creutzfeld-Jakobovy choroby (CJD), ve kterých je základním proteinem PrP.

Termín „sporadická CJD“ zkracovaný jako „sCJD“ označuje nejběžnější projev Creutzfeldt-Jakobovy choroby (CJD). Toto onemocnění se vyskytuje spontánně u jednotlivců se středním věkem • ···

- 18• · · · ···· ·· »· ··· · *· ·· přibližně 60 let a počtem případů celosvětově 1 na milion jednotlivců za rok.

Termín „iatrogenní CJD“ zkracovaná jako „iCJD“ označuje onemocnění pocházející z náhodné infekce člověka lidskými priony. Nejvýznamnějším příkladem tohoto onemocnění je náhodná infekce dětí lidskými priony z kontaminovaných preparátů lidského růstového hormonu.

Termín „familiální CJD označuje formu CJD, ke které zřídka dochází v rodinách a je nevyhnutelně způsobena mutacemi genu lidského prionového proteinu. Tato nemoc je výsledkem autosomální dominantní poruchy. Členové rodiny, kteří zdědí tyto mutace, trpí CJD.

Termín „Gerstmann-Stráussler-Scheínkerova choroba“ zkracovaná jako „GSS“ označuje formu dědičného lidského prionového onemocnění. Toto onemocnění pochází z autosomální dominantní poruchy. Členové rodiny, kteří zdědí mutantní gen, trpí GSS.

Termín „prion“ znamená částici schopnou přenosu, o které je známo, že způsobuje skupinu těchto přenosných konformačních onemocnění (spongiformních encefalopatií) u lidí a zvířat. Termín „prion“ je zkratka slov „protein“ a „infekce“ a částice jsou složeny zvětší části, pokud ne výlučně, z molekul PrP^Sc.

Priony se liší od bakterií, virů a viroidů. Mezi známé priony patří priony infikující zvířata za vzniku klusavky (scrapie), což je přenosné degenerativní onemocnění nervové soustavy ovcí a koz, stejně jako bovinních spongiformních encefalopatií (BSE) nebo nemoci šílených krav a kočičích spongiformních encefalopatií postihujících kočky. Jsou známa čtyři prionová onemocnění postihující člověka: (1) kuru, (2) Creutzfeldt-Jakobova choroba (CJD), (3) Gerstmann-StráusslerScheinkerova choroba (GSS), a (4) fatální familiální insomnie (FFI). Jak se zde používá, prion zahrnuje všechny formy prionů způsobující všechna nebo některá z těchto onemocnění nebo jiná onemocnění

9 99 • 9

- 19 9 9 9 9

9999 99 • 9

9« 9999

9 9

99 u jakýchkoli živočichů a zvláště u lidí a domestikovaných hospodářských zvířat.

Termíny „gen PrP“ a „gen prionového proteinu“ se zde používají zaměnitelně pro popis genetického materiálu, který exprimuje prionové proteiny a polymorfismy a mutace uvedené zde pod názvem „Patogenní mutace a polymorfismy“. Gen PrP může pocházet z jakéhokoli živočicha včetně „hostitelských a „pokusných“ zvířat popisovaných v přihlášce a všech jejich polymorfismů a mutací, přičemž je zřejmé, že tyto termíny zahrnují jiné takové geny PrP, které dosud nebyly objeveny.

Termín „gen PrP“ označuje obecně jakýkoli gen jakéhokoli druhu, který kóduje kteroukoli formu aminokyselinových sekvencí PrP včetně kteréhokoli prionového proteinu. Některé běžně známé sekvence PrP se popisují v článku Gabriel a další, 1992, který se zde zařazuje odkazem pro zveřejnění a popis těchto sekvencí.

Používají se následující zkratky:

CNS pro centrální nervový systém;

BSE pro bovinní spongiformní encefalopatii;

CJD pro Creutzfeldt-Jakobovu chorobu;

FFI pro fatální familiální insomnii;

GSS pro Gerstmann-Stráussler-Scheinkerovu chorobu;

PrP pro prionový protein;

PrP^c pro normální, nepatogenní konformer PrP;

PrP^Sc pro patogenní nebo „scrapiovou“ isoformu PrP (která je také markérem pro prionová onemocnění).

-20 • 00 0 00

0

00*0

Patogenní mutace a polymorfismy

Je známa řada patogenních mutací lidského genu PrP. Existují také známé polymorfismy u lidských, ovčích a hovězích genů PrP.

Dále je uveden neomezující seznam těchto mutací a polymorfismů;

Tabulka mutací

Patogenní mutace člověka	Lidské polymorfismy	Polymorfismy ovcí	Bovinní polymorfismy
2 inzerty oktarepeticí	Kodon 129	Kodon 171	5 nebo 6
4 inzerty oktarepeticí	Met/Val	Arg/Glu	oktarepeticí
5 inzertů oktarepeticí	Kodon 219	Kodon 136
6 inzertů oktarepeticí 7 inzertů oktarepeticí 8 inzertů oktarepeticí 9 inzertů oktarepeticí Kodon 102 Pro-Leu Kodon 105 Pro-Leu Kodon 117 Ala-Val Kodon 145 Stop Kodon 178 Asp-Asn Kodon 180 Val-lle Kodon 198 Phe-Ser Kodon 200 Glu-Lys Kodon 210 Val-íie Kodon 217 Asn-Arg Kodon 232 Met-Ala	Glu/Lys	Ala/Val

		• AAA • A	A A · * A A • · A A AAAA
	21 -	···· AA	AA AAAA AA AA
Normální aminokyselinová	sekvence,	která	se vyskytuje
u převážné většiny jedinců, se	označuje	jako	sekvence PrP

standardního typu. Tato sekvence standardního typu podléhá některým charakteristickým polymorfním variacím. V případě lidského PrP se dvě polymorfní aminokyseliny vyskytují na zbytcích 129 (Met/Val) a 219 (Glu/Lys). Ovčí PrP má dva aminokyselinové polymorfismy na zbytcích 171 a 136, zatímco bovinní PrP má buď pět nebo šest opakování sekvence motivu osmi aminokyselin v aminokoncové oblasti zralého prionového proteinu. I když žádné z těchto polymorfismů nejsou samy o sobě patogenní, zdá se, že mají vliv na prionová onemocnění. Na rozdíl od těchto normálních variací prionových proteinů standardního typu byly identifikovány některé mutace genu lidského PrP, které mění buď specifické aminokyselinové zbytky PrP nebo počet oktarepeticí a které se segregovaly u zděděných lidských prionových onemocnění.

Pro získání dalších významů výše uvedené tabulky demonstrující mutace a polymorfismy je možno odkázat na zveřejněné sekvence genů PrP. Například geny kuřecí, bovinní, ovčí, krysí a myší PrP jsou popsány a publikovány v článku Gabriel a další, 1992. Sekvence pro syrského křečka je zveřejněna v článku Baslet a další, 1986. Gen PrP ovcí je publikován v Goldmann a další, 1990. Genová sekvence hovězího PrP je publikována v Goldmann a další, 1991. Sekvence kuřecího genu PrP je publikována v Harris a další, 1991. Genová sekvence PrP norka je zveřejněna v Kretzschmar a další, 1992. Genová sekvence lidského PrP je publikována v Kretzschmar a další, 1986. Genová sekvence PrP myši je publikována v Locht a další, 1986. Ovčí genová sekvence PrP je zveřejněna ve Westaway a další, 1994. Tyto publikace jsou všechny zařazeny odkazem pro zveřejnění a popis genu PrP a aminokyselinové sekvence PrP.

Vynález také poskytuje způsob detekce přítomnosti patogenní formy prionového proteinu ve vzorku (s výhodou vzorku krve nebo mozku), který zahrnuje následující kroky:

φ Φ·Φ φ φ • · φ · φ φ φ φ φφφφ

- 22 - ...... ·· ........

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního prionového proteinu;

(ia) provede se inkubace vzorku/nepatogenního prionového proteinu;

(ii) provede se rozbití jakýchkoli agregátů vytvořených v průběhu kroku (ia);

dvakrát nebo vícekrát se opakují kroky (ia) až (ii); a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního prionového proteinu ve vzorku.

Další provedení vynálezu poskytuje způsob diagnostiky CJD u pacienta, který zahrnuje následující kroky: odebere se vzorek z pacienta (s výhodou vzorek krve nebo mozku);

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím proteinu PrP^c;

(ia) inkubuje se vzorek/protein PrP^c;

(ii) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia); dvakrát nebo vícekrát se opakuji kroky (ia) až (ii); a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství PrP^Sc ve vzorku.

Vynález také poskytuje způsob detekce přítomnosti patogenní formy β-amyloidního proteinu ve vzorku (s výhodou vzorku krve nebo mozku), který zahrnuje následující kroky:

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního βamyloidního proteinu;

(ia) inkubuje se vzorek/nepatogenní β-amyloidní protein;

(ii) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia); dvakrát nebo vícekrát se opakují kroky (ia) až (ii); a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního β-amyloidního proteinu ve vzorku.

• «·· « ·

-234 · 4

4444 44 • *

4444 • * 4

44

Další provedení vynálezu poskytuje způsob diagnostiky Alzheimrovy choroby u pacienta, který zahrnuje následující kroky: odebere se vzorek (s výhodou vzorek krve nebo mozku) z pacienta;

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního βamyloidního proteinu;

(ia) inkubuje se vzorek/nepatogenní β-amyloidní protein;

(ti) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia);

dvakrát nebo vícekrát se opakují kroky (ia) až (ii); a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního β-amyloidního proteinu ve vzorku.

Vynález dále poskytuje zařízení pro použití při způsobech popsaných výše, zvláště zařízeni zahrnující mikrotitrační destičku, vícejamkový sonikátor a množství nepatogenního konformeru.

Další provedení vynálezu poskytuje způsob diagnostické detekce konformačního onemocnění, které se vyznačuje konformačním přechodem základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, testováním markéru uvedeného onemocnění ve vzorku, přičemž tento způsob zahrnuje následující kroky:

(i) uvedený vzorek se přivede do styku se známým množstvím nepatogenního konformeru, (ii) rozbijí se agregáty popřípadě vytvořené v kroku (i), a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství uvedeného patogenního konformeru ve vzorku.

Kroky (i) a (íí) s výhodou tvoří cyklus, který se alespoň dvakrát opakuje před provedením kroku (iii), nejvýhodněji tvoří kroky (i) a (ii) cyklus, který se opakuje 5 až 40 x před provedením kroku (iii).

Vynález také poskytuje test na markér konformačního onemocnění charakterizovaného konformačním přechodem základního • «·· • ·

- 24 • · · · tttttttt tttt • · • tt tttttttt tt tttt · tttt tttt proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, ve vzorku, kde tento test zahrnuje následující kroky:

(i) uvedený vzorek se přivede do styku se známým množstvím nepatogenního konformeru, (ii) rozbijí se agregáty popřípadě vytvořené v průběhu kroku (i), a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství uvedeného patogenního konformeru ve vzorku.

Kroky (i) a (ii) s výhodou tvoří cyklus, který se opakuje před provedením kroku (iii) alespoň dvakrát.

Vynález dále poskytuje způsob identifikace sloučeniny, která moduluje konformační přechod základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, a který zahrnuje následující kroky:

(i) známé množství nepatogenního konformeru se přivede do styku se známým množstvím patogenního konformeru v přítomnosti a v nepřítomnosti uvedené sloučeniny, (ii) rozbijí se agregáty popřípadě vytvořené v průběhu kroku (i), (iii) zjistí se množství patogenního konformeru v přítomnosti a nepřítomnosti uvedené sloučeniny.

Předkládaný vynález byl popsán na konkrétních provedeních, ale obsah popisu zahrnuje všechny modifikace a substituce, které může provést odborník v oboru, aniž by zašel za rámec významu a účelu nároků.

Vynález bude nyní popsán na následujících příkladech, které by v žádném případě neměly být považovány za omezující předkládaný vynález. Příklady budou odkazovat na dále uvedené obrázky.

• ·9· • ·

- 25 9 9 9

999· 99 • · •9 9999

9 9 9

9» 99

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1. Schematické znázornění konverze PrP^c->PrP^Sc. Infekční jednotka PrP^Sc je olígomer bohatý na β-list, který převádí PrP^c jeho integrací do rostoucího agregátu, kde získá vlastnosti spojené s PrP^Sc.

Obr. 2. Schematické znázornění cyklického amplifikačního postupu. Systém je založen na cyklech inkubace PrP^Sc v přítomnosti nadbytku PrP^c následovaných cykly sonikace. V průběhu inkubačních period se oligomerní PrP^Sc zvětšuje inkorporací PrP^c do rostoucího agregátu, zatímco při sonikaci se agregáty rozbíjejí s cílem rozmnožit konvertující jednotky. V tomto obrázku jsou ukázány dva cykly sonikace/inkubace.

Obr. 3. Amplifikace PrP^Sc sonikačními cykly. Malé množství homogenátů mozku se scrapií obsahujícího PrP^Sc bylo inkubováno s homogenátem zdravého krysího mozku (dráha 1, kontrolní experiment) nebo s homogenátem zdravého mozku křečka (dráha 2 a 3). Poslední vzorek byl rozdělen na dvě skupiny, z nichž jedna byla vystavena pěti cyklům inkubace/sonikace (dráha 3). Polovina výše uvedených vzorků byla nanášena přímo na gel a barvena na celkové proteiny Coomasie (část A). Druhá polovina byla zpracována působením PK a byl proveden imunologický přenos s použitím protilátky anti-PrP 3F4 (část B). Část C ukazuje některé kontroly, ve kterých byl homogenát zdravého mozku inkubován samostatně (dráhy 1 a 2) nebo v přítomnosti zředěného homogenátů mozku se scrapií (dráhy 3 a 4). Polovina vzorků (dráhy 2 a 4) byla vystavena pěti cyklům sonikace/inkubace. Dráhy 2, 3 a 4 byly zpracovány působením proteinázy K.

Obr. 4. Citlivost systému cyklické amplifikace. Minimální koncentrace PrP^Sc, která může být použita pro detekci po amplifikaci, byla studována sériovým ředěním homogenátů v mozku se scrapií a inkubací s homogenátem zdravého mozku křečka s nebo bez cyklů sonikace. Část A ukazuje kontrolní experiment, ve kterém byl mozek • ««· ♦ «

-26·····* φ φφφφ φφ ·Φ φφφφ φφ φφ křečka se scrapií sériově ředěn v homogenátu krysího mozku. Část B odpovídá experimentu, ve kterém byla sériová ředění mozku křečka se scrapií inkubována se zdravým mozkem křečka a vystavena pěti cyklům inkubace/sonikace. Densitometrické vyhodnocení imunologických přenosů v částech A a B je ukázáno v části C. Ředění byla prováděna s mozkem jako výchozím materiálem a byla následující: 100 {dráha 1), 200 (dráha 2), 400 (dráha 3), 800 (dráha 4), 1600 (dráha 5) a 3200 (dráha 6).

Obr. 5. Vztah mezi signálem PrPres a počtem cyklů amplifikace. Zředěný homogenát mozku se scrapií byl inkubován s nadbytkem homogenátu mozku zdravého křečka. Vzorky byly vystaveny 0, 5, 10, 20 nebo 40 cyklům a signál PrPres byl vyhodnocen imunologickým přenosem.

Obr. 6. Amplifikace PrP^Sc ve vzorcích krve. Do heparinizované krysí krve byl přidán homogenát mozku křečka se scrapií pro dosažení konečného ředění 10 : 1. Tato směs byl inkubována 15 min při laboratorní teplotě. Byla provedena desetinásobná sériová ředění tohoto materiálu s použitím heparinizované krysí krve. Vzorky byly vystaveny jedenácti cyklům inkubace/sonikace a signál PrPres byl vyhodnocován imunologickým přenosem.

Obr. 7. Prionový protein je přítomný v lipidických raftech. Lípidické rafty (nazývané také membránová frakce rezistentní na detergenty nebo DRM) byly izolovány použitím modifikace dříve popsaných protokolů. 100 mg mozkové tkáně bylo homogenizováno v 1 ml PBS s obsahem 1% triton X-100 a 1 x kompletního koktejlu inhibitorů proteáz (Boehringer). Tkáň byla homogenizována deseti průchody přes jehlu stříkačky 22G a inkubována 30 min při 4 °C na rotační třepačce. Vzorek byl zředěn v poměru 1 : 2 v 60% sacharóze a umístěn na dno centrifugační zkumavky. Přes vzorek bylo opatrně převrstveno 7 ml 35% sacharózy. Na horní část gradientu bylo navrstveno 1,5 ml 15% sacharózy. Zkumavka byla centrifugována při • 000 • 0 • v

-27 0

0 0 0#· 0 · * 0 0000 ·0 ·0 «000 00 00

150 000 g 18 hod při 4 °C. Lípidické rafty plavou na rozhraní 15% a 35% sacharózy (část A). Byly odebírány různé frakce, které byly analyzovány barvením celkových proteinů dusičnanem stříbrným (část

B) a byl proveden imunologický přenos pro detekci PrP (část C). Pro odstranění sacharózy ze vzorku byla izolována frakce lipidických raftů, která byla promyta v PBS a centrifugována při 28 000 ot/min 1 hod při 4 °C. Centrifugán byl promyt a resuspendován v PBS s obsahem 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS a inhibitorů proteáz. Veškerý PrPC byl obsažen v této frakci (část D).

Obr. 8: Faktory nezbytné pro amplifikaci jsou přítomné v lipidických raftech. Lípidické rafty byly izolovány z mozku zdravého křečka, jak je popsáno na obr. 2, a smíchány s vysoce čištěným PrP^Sc z mozku křečka se scrapií v 700násobném zředění. Vzorky byly bud zamraženy (dráha 3) nebo amplifikovány 20 hod (dráha 4). Dráhy 1 a 2 reprezentují stejné postupy, ale s použitím celkového mozkového homogenátu pro amplifikaci.

Obr. 9: Předsymptomatická detekce PrP^Sc v mozku křečka. Křečci byli zaočkováni intracerebrálně (i.c.) fyziologickým roztokem (kontrolní skupina) nebo homogenátem mozku se scrapií ve stonásobném zředění. Každý týden byli usmrceni čtyři křečci ve skupině a byly extrahovány a homogenizovány mozky. Polovina vzorků byla ihned zamražena (bílé pruhy) a druhá polovina vystavena 20 cyklům inkubace/sonikace (černé pruhy). Všechny vzorky byly zpracovány působením PK a byl proveden imunologický přenos. Intenzita pruhů byla vyhodnocována denzitometricky. Každý pruh znázorňuje průměr vzorků od čtyř zvířat. Detekce nebyla pozorována v žádném z kontrolních mozků ať s amplifikaci nebo bez ní; tyto výsledky nejsou v obrázku ukázány.

Obr. 10. Amplifikace lidského PrP^Sc. Tyto studie byly prováděny použitím vzorků mozků 11 různých potvrzených případů sporadické CJD a 5 případů familiální CJD spolu se čtyřmi kontrolami shodného • ···

- 28 • 9 · 9 9 · >··· • •94 ·♦ »9 ···· 94 ·· věku, které zahrnovaly pacienty postižené jinými neurologickými onemocněními. Mozek byl homogenizován a vystaven dvaceti cyklům amplifikace. Reprezentativní výsledky kontroly (A) a tří různých případů (1,2, 3) sporadické CJD (B) jsou ukázány na obrázku.

Obr. 11: Detekce PrP^Sc v krvi po přípravě prázdných krevních buněk. Prázdné krvinky z 0,5 ml heparinizované krve pocházející ze zdravých (C) křečků a křečků postižených scrapií (Sc) byly připraveny podle popisu v textu. Polovina vzorků nebyla vystavena amplifikaci a druhá polovina byla smíchána s homogenátem normálního mozku křečka a vystavena dvaceti cyklům amplifikace. Všechny vzorky byly potom zpracovány působením PK a analyzovány imunologickými přenosy. Jeden reprezentativní experiment je ukázán na obrázku.

Obr. 12: Detekce PrP^Sc v krvi po extrakci sarkosylem. 0,5 ml heparinizované krve pocházející od zdravých (C) křečků a křečků postižených scrapií (Sc) bylo vystaveno extrakci sarkosylem, jak se popisuje v textu. Polovina vzorků nebyla vystavena amplifikaci a druhá polovina byla smíchána s homogenátem normálního mozku křečka a vystavena 20 cyklům amplifikace. Všechny vzorky byly potom zpracovány působením PK a analyzovány imunologickými přenosy. Na obrázku je ukázán jeden reprezentativní vzorek kontrolních zvířat a dva vzorky zvířat postižených scrapií.

Obr. 13: Detekce PrP^Sc v krvi po purifikaci lipidických raftů. Lipidické rafty byly extrahovány jak je popsáno v textu z 0,5 ml heparinizované krve zdravých křečků (C) a křečků postižených scrapií (Sc). Polovina vzorků nebyla vystavena amplifikaci a druhá polovina byla smíchána s homogenátem normálního mozku křečka a vystavena dvaceti cyklům amplifikace. Všechny vzorky byly zpracovány působením PK a analyzovány imunologickými přenosy. Na obrázku je ukázán jeden reprezentativní přiklad kontrolního zvířete a dvou zvířat postižených scrapií.

tttttttt

- 29 ······ tttttttt · • tt* ··· tttttttt tttttttt tttt tttt ···· tttt tttt

Obr. 14: Detekce PrP^Sc v krvi po přípravě povlaků sražených leukocytů. Frakce sražených leukocytů z krve byla oddělena centrífugací z 0,5 ml heparinizované krve zdravých křečků (C) a křečků postižených scrapií (Sc). Polovina vzorků nebyla amplifikována a druhá polovina byla smíchána s homogenátem normálního mozku křečka a vystavena 20 cyklům amplifikace. Všechny vzorky byly potom zpracovány působením PK a analyzovány imunologickými přenosy.

Jeden reprezentativní experiment je ukázán na obrázku.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Amplifikace PK-resistentního PrP cyklickou konverzí in vitro

Homogenát mozku křečka extrahovaný ze zvířat postižených scrapií byl ředěn, dokud byl signál PrP^Sc ještě stěží detekovatelný imunologickým přenosem po působení proteinázy K (PK) (obr. 3B, dráha 1). Zpracování PK se provádí v oboru rutinně pro rozlišení mezi normální a abnormální formou PrP, které se odlišují svou citlivostí na degradaci proteázou (PrP^Sc je částečně rezistentní a PrP^c se degraduje) (Prusiner, 1991). Forma PrP, která je rezistentní vůči štěpení PK, se bude označovat jako PrPres. Inkubace vzorku zředěného homogenátu mozku se scrapií s homogenátem mozku zdravého křečka obsahujícím nadbytek PrP^c vedla ke zvýšení signálu PrPres (obr. 3B, dráha 2).

To ukazuje, že inkubace těchto dvou mozkových homogenátů vedla ke konverzi PrP^c na PrP^Sc. Když byly vzorky inkubovány za stejných podmínek, ale vystaveny pěti cyklům inkubace/sonikace, došlo k dramatickému zvýšení množství PrPres (obr. 3B, dráha 3). Densitometrická analýza imunologického přenosu ukazuje, že signál PrPres byl cyklickou amplifikaci zvýšen 84 x ve srovnání se signálem • · • ···

- 30 »··♦ ·« • · ·· ««··

PrPres přítomným ve zředěném homogenátu mozku se scrapií (dráha 1).

Tato konverze je závislá na přítomnosti PrP^Sc, protože žádný PrPres nebyl pozorován, jestliže byl homogenát normálního křeččího mozku inkubován za stejných podmínek samostatně, ať už se sonikací nebo bez ní (obr. 3C, dráha 2). Pro vyloučení artefaktů přenosu bylo celkové množství proteinu naneseného na gel udržováno konstantní (obr. 3A) přidáním homogenátu krysího mozku ke zředěnému mozku se scrapií, přičemž se využívá toho, že krysí PrP není protilátkou používanou pro imunologický přenos detekován.

Příklad 2

Citlivost detekce využívající cyklické amplifikace

Pro vyhodnocení minimální koncentrace PrP^Sc, který může být použit pro detekci po amplifikaci byl homogenát mozku se scrapií sériově ředěn přímo v homogenátu zdravého mozku křečka. Bez inkubace se signál PrPres progresivně zmenšuje, přičemž v osmisetnásobném zředění je již zcela nedetekovatelný (obr. 4A, C). Naopak jestliže se stejné zředění inkubovalo s homogenátem zdravého mozku křečka a vystavilo pěti cyklům inkubace/sonikace, došlo k dramatickému snížení meze detekce PrPres. Jasný signál bylo možno snadno detekovat i při ředění 3200 (obr. 4B, C).

Příklad 3

Exponenciální zvýšení PrPres s počtem cyklů

Pro studium, zda intenzita signálu PrPres po cyklické amplifikaci závisí na počtu provedených cyklů inkubace/sonikace byl zředěný homogenát mozku se scrapií inkubován s nadbytkem homogenátu zdravého mozku křečka. Vzorky byly vystaveny 0, 5, 10, 20 nebo 40 cyklům a signál PrPres byl vyhodnocován imunologickým přenosem.

• ···

- 31 • · to to to to • •toto·· · · · to • to·· ·· ·· ···· ·· toto

Hladina PrPres exponenciálně stoupala s počtem cyklů inkubace/sonikace {obr. 5). Tento výsledek ukazuje, že zvýšení počtu cyklů by mohlo dále snížit detekční limity.

Příklad 4

Experimenty se sonikací vzorků krve s přídavkem PrP^Sc

K heparinizované krysí krvi byf přidán homogenát mozku křečka se scrapií pro získání konečného ředění 10 : 1. Tato směs byla inkubována 15 min při laboratorní teplotě.

Použitím heparinizované krve krysy byla z tohoto materiálu připravena desetinásobná sériová ředění. 50 μΐ každého ředění bylo centrifugováno při 3000 ot/min 10 min. Od centrifugátu byla oddělena plasma. 10 μΙ plasmy bylo smíseno s 50 μΙ homogenátu zdravého mozku křečka s obsahem substrátu PrP^c pro konverzní reakci. Vzorky byly vystaveny 11 cyklům inkubace/sonikace. Pro získání kontroly byly některé vzorky smíchány v 50 μΙ homogenátu zdravého mozku křečka a udržovány při -20 °C až do použití. 15 μΙ sonikovaných a kontrolních vzorků bylo štěpeno proteinázou K, děleno SDS-PAGE a analyzováno westernovým přenosem a PrP^Sc byl detekován jak je popsáno v části Metody.

Výsledky jsou ukázány na obr. 6. Je ukázáno jasné zvýšeni detekce proteinu po amplifikačnim postupu, které je zvláště zřejmé při nižší koncentraci PrP^Sc (například při ředění 1280). Jestliže porovnáme tyto výsledky s výsledky získanými na infikovaných mozkových tkáních, je potvrzeno, že proces amplifikace pracuje podobně i v krvi.

- 32 ·· · · · · · * · ««·· ·· ·· ···· ·· ··

Příklad 5

Cyklická amplifikace prováděná u velkého počtu vzorků

Použití tradičního sonikátoru s jednou sondou přináší problém se současnou manipulací s mnoha vzorky, jak je vyžadováno při diagnostickém testu. Cyklický amplifikační systém byl upraven pro formát 96-jamkového sonikátoru pro mikrodestičky (Misonix 431 MP 20 kHz), který umožňuje sonikaci ve všech jamkách současně a může být naprogramován pro automatický provoz. Toto zlepšení nejen sníží dobu zpracování, ale zabrání také ztrátě materiálu v porovnání s použitím jediné sondy. Je odstraněna možnost křížové kontaminace, protože nedochází k přímému ponoření sondy do vzorku. Tato skutečnost je nezbytná pro manipulaci s infekčními vzorky a minimalizaci falešně pozitivních výsledků. Dvacet cyklů inkubace v trvání 1 hod s následnými pulsy sonikace 15 s nebo 30 s poskytne významnou amplifikaci signálu PrPres, podobnou jako bylo pozorováno dříve použitím tradičního sonikátoru.

Příklad 6

Faktory nezbytné pro amplifikaci jsou přítomny v membránové frakci rezistentní na detergenty

Subcelulární umístění, kde dochází ke konverzi PrP v průběhu patogeneze onemocnění, ještě není zjištěno. Bylo však uváděno, že jak PrP^c, tak i PrP^Sc jsou umístěny ve zvláštní oblasti piasmatické membrány, která je rezistentní na působení mírných detergentů v důsledku relativně vysokého obsahu cholesterolu a glykosfingolipidů (Vey a další, 1996; Harmey a další, 1995). Tyto membránové domény jsou označovány jako lipidické rafty nebo membrány rezistentní na detergenty (DRM) a jsou bohaté na signální proteiny, receptory a proteiny ukotvené na GPI. Autoři předkládaného vynálezu potvrdili, že 100 % PrP^c v mozku je navázán na tuto frakci, která tvoří méně než % celkových proteinů (obr. 7). Proto umožní jednoduchý krok izolace lipidíckých raftů dramatické obohacení PrP^c Podobné výsledky byly získány při izolaci lipidíckých raftů z homogenátu mozku se scrapií, ve kterých byl v raftech izolován PrP^Sc.

Pro vyhodnocení, zda faktory potřebné pro amplifikaci PrP jsou obsaženy v lipidíckých raftech, byly tyto rafty čištěny z mozku zdravých zvířat a byla přidávána menší množství vysoce čištěného PrP extrahovaného z mozku nemocných zvířat. Amplifikace lipidíckých raftů byla ekvivalentní k amplifikaci získané s použitím celkového mozkového extraktu (obr. 8), protože množství PrPres vyprodukovaného po amplifikaci bylo za obou podmínek podobné. Tento výsledek ukazuje, že všechny prvky nezbytné pro konverzi a amplifikaci PrP (včetně tzv. „faktoru X“ (Telling a další, 1995)) jsou obsaženy v této specializované membránové doméně. Proto by identifikace a izolace faktorů nezbytných pro konverzi PrP měla být možná další separací proteinů z lipidíckých raftů a monitorováním jejich aktivity cyklickou amplifikaci. Navíc představují lipidické rafty možnou náhradu použití celkových mozkových homogenátů při procesu cyklické amplifikace jako zdroje substrátu PrP^c a jiných endogenních faktorů s předpokládanou účastí na konverzi.

Příklad 7

Předsymptomatická diagnóza u experimentálních zvířat

Pro studium předsymptomatické diagnózy u křečků experimentálně infikovaných scrapií byl proveden screening 88 vzorků mozku v různých stadiích v průběhu předklinické fáze, z nichž polovina byly neínfikované kontroly. Mozky byly odebírány každý týden (čtyři v každé skupině) a vystaveny 20 cyklům amplifikace. Výsledky ukázaly, že tato metoda je schopná detekovat abnormální protein v mozku již ve druhém týdnu po zaočkování, což je daleko před vyvinutím jakýchkoli příznaků u zvířat (obr. 9). Bez cyklické amplifikace byl PrP^Sc

-34• ·«· · · · · 9 · • ·· · · · · · · ···* *· ·· ···· ·· ·· detekován v mozku v šestém týdnu po infekci, pouze čtyři týdny před prvním výskytem klinického onemocnění. U žádného z kontrolních zvířat, která nebyla infikován scrapii, nebyla pozorována žádná amplifikace.

Příklad 8

Použití cyklické amplifikace na vzorky lidského mozku

Pro analýzu použití postupu cyklické amplifikace na vzorcích mozků mrtvých lidí postižených Creutzfeldt-Jakobovou chorobou (CJD) byly inkubovány mozkové homogenáty několika pacientů s CJD (nebo normálních kontrol) s homogenátem zdravého lidského mozku a byt proveden postup cyklické amplifikace. Výsledky ukazují, že došlo k významné amplifikaci u vzorků analyzovaného mozku se sporadickou CJD a u žádného ze čtyř kontrolních vzorků (obr. 10). Je zajímavé, že amplifikace byla získána pouze ve vzorcích, které se ukázaly jako infekční a tedy schopné konvertovat nemutovaný PrP^c, zatímco nefungovala v případě, kdy mutantní protein není schopen konvergovat protein standardního typu. Tyto údaje podporují závěr, že metoda pracuje v lidských vzorcích podobně jako bylo ukázáno výše pro vzorky zvířat.

Příklad 9

Diagnóza v krvi s použitím cyklické amplifikace

Studie infekčností ukázaly, že alespoň u experimentálních zvířat je PrP^Sc přítomen u zvířat v pozdním stadiu onemocnění v krvi (Brown a další, 2001). Aby bylo možno provádět detekci PrP^Sc v krvi cyklickou amplifikaci, nejprve bylo provedeno selektivní zakoncentrování vzorku na detekovaný protein a odstranění velkého objemu krevních proteinů přítomných v nadbytku, jako je albumin nebo hemoglobin. Pro tento účel se ukázaly jako účinné následující čtyři odlišné protokoly.

• ··«

- 35 • · · · ·· · ·· * · ·· ···· • · · • · · *· ··

1, Příprava prázdných krvinek (cell ghosts)

Heparinizovaná krev křečka byla centrifugována při 2500 ot/min při 4 °C. Plasma a buněčná frakce byly odděleny a zamraženy při -80 °C až do použití. 0,5 ml centrifugátu krvinek bylo třikrát promyto ve 12 až 15 objemech čerstvého chladného PBS, pH 7,6. Buňky byly resuspendovány ve 12 až 15 objemech 20 mOsM pufru s fosforečnanem sodným, pH 7,6, a míchány mírně na ledu 20 min, potom centrifugovány při 30 000 ot/min 10 min při 4 °C. Supernatant byl odlit, centrifugát byl promyt třikrát 20 mOsM pufrem s fosforečnanem sodným. Získaný centrifugát byl resuspendován v PBS s obsahem 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS a inhibitorů proteázy. 15 μΙ této suspenze bylo smícháno se stejným objemem 10% homogenátu zdravého mozku křečka a bylo provedeno dvacet cyklů inkubace/sonikace. 20 μΙ sonikovaných a kontrolních vzorků bylo štěpeno proteinázou K, děleno SDS-PAGE a analyzováno westernovým přenosem, přičemž PrP^Sc byl detekován jak je popsáno

Λ _ v části Metody. Výsledky ukazují detekci PrP po postupu amplifikace ve vzorcích krve z infikovaných zvířat (obr. 11). Ve vzorcích krve z neinfikovaných zvířat není přítomen po amplifikaci žádný signál. Bez amplifikace není možné přítomnost PrP^Sc detekovat (obr. 11).

2. Extrakce sarkosylem

Heparinizovaná krev křečka byla centrifugována při 2500 ot/min při 4 °C. 0,5 ml zcentrifugovaných buněk bylo zředěno ve stejném objemu 20% sarkosylu a inkubováno 30 min. Vzorek byl centrifugován v ultracentrifuze Beckman TL100 při 85 000 ot/min 2 hod při 4 °C. Centrifugát byl promyt a resuspendován v PBS s obsahem 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS a inhibitorů proteázy. 15 μΙ této suspenze bylo smíseno se stejným objemem 10% homogenátu zdravého mozku křečka a bylo provedeno dvacet cyklů inkubace/sonikace. 20 μΙ • ··· • φ sonikovaných a kontrolních vzorků bylo štěpeno proteínázou K, děleno SDS-PAGE a analyzováno westernovým přenosem a PrP^Sc byl detekován jak je popsáno v části Metody. Výsledky ukazují detekci PrP^Sc po postupu amplifikace ve vzorcích krve z infikovaných zvířat (obr. 12). Ve vzorcích krve z neinfikovaných zvířat není přítomen po amplifikací žádný signál. Bez amplifikace není možné přítomnost PrP^Sc detekovat (obr. 12).

3. Extrakce lipidických raftů

Heparinizovaná krev křečka byla centrifugována při 2500 ot/min při 4 °C. 0,5 ml stočených buněk bylo zředěno ve stejném objemu PBS 1% TritonX-100 a inkubováno 30 min při 4 °C. Vzorek byl zředěn 1 : 2 v 60% sacharóze a umístěn na dno centrifugační zkumavky. 7 ml 35% sacharózy bylo opatrně navrstveno přes vzorek. Na horní povrch gradientu bylo navrstveno 1,5 ml 15% sacharózy. Zkumavka byla centrifugována při 150 000 ot/min 18 hod při 4 °C. Lípidické rafty byly izolovány promytím v PBS a centrifugovány při 28 000 ot/min 1 hod při 4 °C. Centrifugát byl promyt a resuspendován v PBS s obsahem 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS a inhibitorů proteázy. 15 μΙ této suspenze bylo smíseno se stejným objemem 10% homogenátu zdravého mozku křečka a vystaveno dvaceti cyklům inkubace/sonikace. 20 μΙ sonikovaného a kontrolního vzorku bylo štěpeno proteínázou K, děleno SDS-PAGE a analyzováno westernovým přenosem a PrP byl detekován jak bylo popsáno v části Metody. Výsledky ukazují detekci PrP^Sc po amplifikací ve vzorcích krve infikovaných zvířat (obr. 13). Ve vzorcích krve neinfekčních zvířat se nevyskytuje po amplifikací žádný signál. Bez amplifikace není možné přítomnost PrP^Sc detekovat (obr. 13).

- 37, ·*·· ·· .......^.

4. Příprava povlaku ze sražených leukocytů

Heparlnizovaná krev křečka byla centrifugována při 1500 ot/min při 4 °C 10 min. Povlak sražených leukocytů byl opatrně izolován standardními postupy a udržován při -80 °C až do použití. Zmrazený povlak sražených leukocytů byl resuspendován v PBS s obsahem 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS a inhibitorů proteázy. 15 μΙ této suspenze bylo smíseno se stejným objejem 10% homogenátů zdravého mozku křečka a vystaveno dvaceti cyklům inkubace/sonikace. 20 μΙ soníkovaných a kontrolních vzorků bylo štěpeno proteinázou K, děleno SDS-PAGE a analyzováno westernovým přenosem a detekce PrP^Sc byla provedena jak je popsáno v části Metody. Výsledky ukazují detekci PrP^Sc po postupu amplifikace ve vzorcích krve infikovaných zvířat (obr. 14). Ve vzorcích krve z neinfikovaných zvířat není po amplifikaci přítomen žádný signál. Bez amplifikace není možné přítomnost PrP^Sc detekovat (obr. 14).

Metody

Příprava mozkových homogenátů

Mozky syrských zlatých křečků, zdravých nebo infikovaných upraveným kmenem klusavky 263 K byly získány po usmrcení a okamžitě zamraženy v suchém ledu a udržovány při -80 °C až do použití. Mozky byly homogenizovány v PBS s inhibitory proteázy na koncentraci 10 % hmotn./obj. Byly přidány detergenty (0,5% Triton X100, 0,05% SDS) a směs byla vyčeřena centrifugací při nízké rychlosti (10 000 ot/min) 1 min.

Příprava vzorků a cyklická amplifikace

Sériová ředění homogenátů mozku se scrapií byla prováděna přímo v homogenátů zdravých mozků. 30 μΙ těchto ředění bylo inkubováno za míchání při 37 °C. Každou hodinu byl proveden cyklus * ·· *«· · · · · · · ·

- 38 - ...... ...... ·· ·· sonikace (5 pulsů po 1 s) použitím mikrosonikátoru s jehlou ponořenou ve vzorku. Tyto cykly byly několikrát opakovány (5 až 20).

Detekce PrP^Sc

Vzorky byly štěpeny PK 100 pg/ml 90 min při 37 °C. Reakce byla ukončena PMSF 50mM. Vzorky byly děleny SDS-PAGE (za denaturujících podmínek) a elektricky přenášeny na nitrocelulózovou membránu v pufru CAPS nebo tris-glycinovém přenášecím pufru s 10% methanolem po dobu 45 min při 400 mA. Před blokováním membrány 5% odtučněným mlékem bylo provedeno reverzibilnt barvení na celkové proteiny. Potom byla membrána inkubována 2 hod s monoklonální protilátkou 3F4 (1 : 50 000). Byla provedena čtyři promytí po 5 min pufrem PBS, 0,3% Tween 20 před inkubací se sekundární protimyší protilátkou značenou křenovou peroxidázou (1 : 5000) 1 hod. Po promytí byla vyvíjena reaktivita v membráně pomocí soupravy ECL chemiluminiscence Kit (Amersham) podle instrukcí výrobce.

Odkazy

Aguzzi, A. (1997). Neuro-immune connection in the spread of prions in the body? Lancet 349, 742 - 744.

Baldwin, M. A., Cohen, F. E., a Prusiner, S. B. (1995). Prion protein isoforms, a convergence of biological and structural investigations. J. Biol. Chem. 270, 19197 - 19200.

Baslet a další, Cell 46: 417 - 428 (1986)

Brown, P., Cervenakova, L., a Diriger, H. (2001). Blood infectivity and the prospects for a diagnostic screening test in CreutzfeldtJakob disease. J. Lab. Clin. Invest. 137, 5 - 13.

444

- 39 9 9 9 9 •949 ·· • » ·* »99· • 9 9·

Bruče, Μ. E., Will, R. G., Ironside, J. W., McConnell, I., Drummond, D., a Suttie, A. (1997). Transmissions to míče indicate that new variant CJD is caused by the BSE agent. Nátuře 389, 498 - 501.

Budka, H., Aguzzi, A., Brown, P., Brucher, J. M., Bugiani, O., Gullotta, F., Haltia, M., Hauw, J.J., Ironside, J. W., Jellinger, K., Kretzschmar, H. A., Lantos, P. L., Masullo, C., Schlote, W., Tateishi J., a Weller, R. O. (1995). Neuropathological diagnostic criteria for Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and other human spongiform encephalopathies (Prion diseases). Brain Pathol. 5, 459 -466.

Carrell, R. W., Lomas D. A. (1997). Conformational diseases. Lancet, 350, 134 - 138.

Caughey, B., Raymond, G. J., Kocisko, D. A., a Lansbury, P. T,, Jr. (1997). Scrapie infectivity correlates with converting activity, protease resistance, and aggregation of scrapie-associated prion protein in guanidine denaturation studies. J. Virol. 71, 4107 - 4110.

Cohen, F. E., Pan, K. M., Huang, Z., Baldwin, M., Fletterick, R.J., a Prusiner, S. B. (1994). Structural clues to prion replication. Science 264, 530 - 531.

Cohen, F. E. a Prusiner, S. B. (1998). Pathologic conformations of prion proteins. Ann. Rev. Biochem. 67, 793 - 819.

Cousens, S. N., Vynnycky, E., Zeidler, M., Will, R. G., a Smith, R. G. (1997). Predicting the CJD epidemie in humans. Nátuře 385, 197 - 198.

Gabriel a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9097 - 9101 (1992).

Galvez, S. a Cartier, L. (1983). Computed tomography findings in 15 cases of Creutzfeldt-Jakob disease with histological verification. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 47, 1244,

-40*«···· · · · 9999 99 99 9999 99 99

Goldmann a další, Proč. Nati. Acad. Sci, USA 87: 2476 - 2480 (1990).

Goldmann a další, J. Gen, Virol. 72: 201 - 204 (1991).

Harmey, J. H., Doyle, D., Brown, V., a Rogers, M. S. (1995). The cellular isoform of the prion protein, PrPc, is associated with caveolae in mouše neuroblastoma (N2a) cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 210, 753 - 759.

Harris a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 7664 - 7668 (1991).

Hill, A. F., Zeidler, M., Ironside, J. W., a Collinge, J. (1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet 349, 99 - 100.

Hsich, G., Kenney, K., Gibbs, C. J., Jr., Lee, K. H., a Harrington, M. G. (1996). The 14-3-3 brain protein in cerebrospinal fluid as a markér for transmissible spongiform encephalopathies. N. Eng. J. Med. 335, 924.

Jarrett, J. T. a Lansbury, Ρ. T., Jr. (1993). Seeding „on-dimensional crystallization“ of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer’s disease and scrapie? Cell 73, 1055 - 1058.

Jimi, T., Wakayama, Y., Shibuya, S., a další (1992). High levels of nervous systém specific protein in the cerebrospinal fluid in patients with eariy stage Creutzfeldt-Jakob disease. Clin. Chim. Acta 211, 37.

Kawashima, T., Furukawa, R., Dohura, K., a Iwaki, T. (1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet 350, 68 - 69.

Kascsak, R. J., Rubenstein, R., Merz, P. A., Tonna-DeMasi, M., Fersko, R., Carp, R. I., Wisnieswski, Η. M., Diringer, H., (1987). Mouše polycional and monoclonal antibody to scrapieassociated fibril proteins. J. Virol., 61, 3688 - 3693.

-41 * ··· • · « · · · · · · · tttt·· tttt tttt tttttttt ·· tttt

Kocisko, D. A., Come, J. H., Prioia, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., a Caughey, B. (1994). Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nátuře 370, 471 - 474.

Kocisko, D. A., Prioia, S, A., Raymond, G. J., Chesebro, B., Lansbury, P. T., Jr., a Caughey, B. (1995). Species specificity in the cellfree conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 3923 - 3927.

Kretzschmar a další, DNA 5: 315 - 324 (1986).

Kretzschmar a další, J. Gen. Virol. 73: 2757 - 2761 (1992).

Locht a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 6372 - 6376 (1986).

Onofrji, M., Fulgente, T., Gambi, D., a Macchi, G. (1993). Early MRÍ findings in Creutzfeld-Jakob disease. J. Neurol. 240, 423.

Pan, K. M., Baldwin, M., Njuyen J., Gassett, M., Serban, A., Groth, D., Mehlhorn, I,, a Prusiner, S. B. (1993). Conversion of alphahelices into β-sheets features in the formation of scrapie prion proteins. Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 90, 10962 - 10966.

Prusiner, S. B. (1991). Molecular biology of prion diseases. Science 252, 1515 - 1522.

Roos, R., Gajdusek, D. C., a Gibbs, C. J., Jr. (1973). The clinical characteristics of transmissible Creutzfeldt-Jakob disease. Brain 96, 1 - 20.

Saborio, G. P., Soto, C., Kascsak, R. J., Levý, E., Kascsak, R., Harris, D. A., a Frangion, B. (1999). Cell-lysate conversion of prion protein into its protease-resistant isoform suggests the participation of a cellular chaperone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 258, 470 - 475.

Safar, J., Wille, H., Itri, V., Groth, D., Serban, H., Torchia, M., Cohen, F. E., Prusiner, S. B., (1998). Eight prion strains háve PrP(Sc) • ·

-42• «·· ····*· ·*·· · ·· ··· · · · · ««·· ·· ·· ···· *· · molecules with different conformations. Nat. Med. 4, 1157 1165.

Sargiacomo, M., Sudol, M., Tang, Z., Lisanti, Μ. P. (1993). Signál transducing molecules and glycosyl-fosfatidylinositol-linked proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells. J. Cell Biol., srpen; 122(4); 789 - 807.

Stáhl, N., Baldwin, M. A., Teplow, D. B., Hood, L., Gibson, B. W., Buriingame, A. L., a Prusiner, S. B. (1993). Structural studies of the scrapie prion protein using mass spectrometry and amino acid sequencing. Biochem. 32, 1991 - 2002.

Steinhoff, B. J., Racker, S., Herrendorf, G., a další (1996). Accuracy and reliability of periodic Sharp wave complexes in CreutzfeldtJakob disease. Arch. Neurol. 53, 162.

Telling, G. C., Scott, M., Mastrianni, J., Gabizon, R., Torcha, M., Cohen, F. E., DeArmond, S. J., a Prusiner, S. B. (1995). Prion propagation in mice expressing human and chimeric PrP transgenes implicates the interaction of cellular PrP with another protein. Cell 83, 7990.

Martin Vey a další (1996). Pro. Nati. Acad. Sci. USA, 93, 14945 - 9.

Weber, T., Otto, M., Bodemer, M., a Zerr, I. (1997). Diagnosis of Creutzfeld-Jakob disease and related human spongiform encephalopathies. Biomed. Pharmacother. 51, 381 - 387.

Westaway a další, Genes Dev. 8: 959 - 969 (1994).

WHO/EMC/ZDI/98,9, Global Surveillance, Diagnosis and Therapy of Human Transmissible Spongiform Encephalopathies: Report of a WHO Consultation, Ženeva, Švýcarsko 9. -11. února 1998, WHO.

Zastupuje:

• 000 • 0 <•0 000 φ··· _ _ ···· ·· ·· ··*· ·· ··

Í>V 4663 - 36'

Claims (20)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob diagnostiky nebo detekce konformačního onemocnění charakterizovaného konformačním přechodem základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, testováním markéru tohoto onemocnění ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

   (i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního konformeru;

   (ii) rozbijí se jakékoli agregáty popřípadě vytvořené v průběhu kroku (i); a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství uvedeného patogenního konformeru ve vzorku, kde patogenní konformer je markér přítomnosti uvedeného onemocnění.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e krok (i) zahrnuje krok (ia), při kterém se inkubuje uvedený vzorek/nepatogenní konformer.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, ž e kroky (ia) a (ii) se provádějí v cyklu, který se před provedením kroku (iii) alespoň dvakrát opakuje.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, ž e cyklus se opakuje před provedením kroku (iii) pětkrát až čtyřicetkrát.

   • φφφ • φ • · * φφφ φ··· φφφφ φφ φφ φφφφ φφ φφ
5. 5. Způsob podie některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že krok (i) se provádí za fyziologických podmínek,
6. 6. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že množství nepatogenního konformeru v kroku (i) je nadbytečné množství.
7. 7. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že konformační onemocnění je přenosné konformační onemocnění.
8. 8. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že analyzovaný vzorek se předběžně zpracuje pro selektivní zakoncentrování patogenního konformeru ve vzorku.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, ž e patogenní konformer je PrP^Sc a předběžné zpracování je extrakce frakce nerozpustné v mírných detergentech ze vzorku.
10. 10. Test na markér konformačního onemocnění charakterizovaného konformačním přechodem základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, ve vzorku, vyznačující se tím, že tento test zahrnuje následující kroky:

    (i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního konformeru;

    • ··· * · · · · · ««···· · · · · · « · · ♦ · · » · ♦ · «··· ·* ·· ···· ·· ·*

    -45(ií) rozbíjí se jakékoli agregáty popřípadě vytvořené v průběhu kroku (i); a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství uvedeného patogenního konformeru ve vzorku, kde patogenní konformer je markér přítomnosti uvedeného onemocnění.
11. 11. Test podle nároku 10, vyznačující se tím, ž e krok (i) zahrnuje krok (ia, při kterém se inkubuje uvedený vzorek/nepatogenni konformer.
12. 12. Test podle nároku 11, vyznačující se tím, ž e kroky (ia) a (ii) se provádějí v cyklu, který se opakuje před provedením kroku (iii) aiespoň dvakrát.
13. 13. Diagnostický kit pro použití v testu podle některého z nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že obsahuje známé množství nepatogenního konformeru, vícejamkovou mikrotitrační destičku a vícejamkový sonikátor.
14. 14. Způsob identifikace sloučeniny modulující konformační přechod základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

    (i) množství nepatogenního konformeru se přivede do styku s množstvím patogenního konformeru (a) v přítomnosti uvedené sloučeniny a (b) v nepřítomnosti uvedené sloučeniny;

    (ii) rozbijí se jakékoli agregáty popřípadě vytvořené v průběhu kroku (i); a

    -46 • 444 «444

    4 · · 4·· <444 «444 «· 44 4444 4* 44 (iii) zjistí se množství patogenního konformeru (a) v přítomnosti uvedené sloučeniny a (b) v nepřítomnosti uvedené sloučeniny.
15. 15. Způsob podle některého z nároků 1 až 9 nebo 14, nebo test podle některého z nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že patogenním konformerem je PrP^Sc, nepatogenním konformerem je PrP^c a základním proteinem je prionový protein.
16. 16. Způsob detekce přítomnosti patogenní formy prionového proteinu ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

    (i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního prionového proteinu;

    (ia) inkubuje se vzorek/nepatogenní prionový protein;

    (ii) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia); kroky (ia) - (ii) se opakují dvakrát nebo vícekrát; a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního prionového proteinu ve vzorku.
17. 17. Způsob diagnózy Creutzfeldt-Jakobovy choroby u pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

    odebere se vzorek z pacienta;

    (i) vzorek se přivede do styku s množstvím proteinu PrP^c;

    (ia) inkubuje se vzorek/protein PrP^c;

    (ii) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia);

    • ··· • · • ·

    -47 «*»*'· ♦ · · · *··· »r *· ···· ·· ·· kroky (ia) až (ii) se opakují dvakrát nebo vícekrát; a potom

    Q Λ (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství PrP ve vzorku.
18. 18. Způsob detekce přítomnosti patogenní formy β-amyloidního proteinu ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky;

    (i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního βamyloidního proteinu;

    (ia) inkubuje se vzorek/nepatogenní β-amyloidní protein;

    (íi) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia);

    kroky (ia) až (ii) se opakují dvakrát nebo vícekrát; a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního βamyloidního proteinu ve vzorku.
19. 19. Způsob diagnózy Alzheimerovy choroby u pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

    odebere se vzorek z pacienta;

    (i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního βamyloidního proteinu;

    (ia) inkubuje se vzorek/nepatogenní β-amyloidní protein;

    (ii) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia); kroky (ia) až (ii) se opakují dvakrát nebo vícekrát; a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního βamyloidního proteinu ve vzorku.

    * · 0 0

    0 0

    -48 0000 0*

    0 0 »0 «··· • ♦ 0 0 • 0 «0
20. 20. Zařízení pro použití při způsobu podle některého z nároků 1 až 9 nebo 14, nebo při testu podle některého z nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že zahrnuje mikrotitrační destičku, vícejamkový sonikátor a množství nepatogenního konformeru.

    Zastupuje:

    • 999

    999 9 99

    1/13 ?(/ - 3í

    Obr. 1.

    Schematické znázornění konverze PrP^c->PrP

    Exogenní PrP^Sc

    Vazba

    Interakce PrP^c-PrP^Sc

    Konverze

    Nový a starý Prp^Sc

    Obr. 2.

    Schematické znázornění cyklického amplifikačního postupu • 9 • 9 9 9 9 9 ♦ · 9··· *9 99

    3/13 _O <

    Li_ cO >« >.

    o

    Obr. 3.

    Amplifikace PrP^Sc sonikačními cykly

    CQ

    CN +

    i

    Φ '</)

    W ra

    E o

    o

    O

    Φ o

    ra

    o.

    E ra >.

    O ···

    CO ··· ·

    4/13 ·· · ··' ·♦··

    JJjX> 3<ř

    Citlivost systému cyklické amplifikace

    CO

    O <

    o o o o o o

    LO σ LO r- co cm

    Ředění nijnjd e)izueiu|

    5/13 ?|r ύ; · - 3é ·*··

    Obr. 5.

    Vztah mezi signálem PrPres a počtem cyklů amplifikace

    Homogenát mozku se scrapií v ředění 10‘² v homogenátu mozku zdravého křečka

    Cykly amplifikace

    Obr. 6.

    Amplifikace PrP^Sc ve vzorcích krve

    Amplifikace + + - ⁺ + • «·Φ • » • φ • · φ φ φ φ φ*·· φφφφ φφ ·φφ ··· * ·· ?Ι/ &Q3 - 3έ

    6 /13 «

    •(ϋ »ϋ

    Έ ο

    ο

    ΙΛ

    Π3 >Ο £2

    Ο

    Ο)

    4—·

    Μ— σι ο

    >, ο

    Τ3

    Ω.

    >

    X

    L—

    X }>|ejpo Αλο>|ιθ0 . r, 4:: - < ί ί 1! ί - sy % ον BA)SJA leBnjkijuao

    AA0UBJqiU9!/\]

    Q

    7 Τ'

    CC α

    φ ο

    φ 'ra c

    ω σι ο

    Ε ο

    X σ>

    •π >ο

    C ο

    Q ϋ

    15%-35% Vrstva vzorku rozhraní

    7/13 •*»· · * » * * ···«· ···· • · · —·. ·- · · · ···· ·· ·· ··· ·· I

    Obr. 8:

    Faktory nezbytné pro amplifikaci jsou přítomné v lipidických raftech Čistý PrP^Sc inkubovaný s

    Amplifikace extraktem mozku DRM • · · · » ·· ···· ·· · + ty ££¢3 »·*· ··

    8/13

    'Φ 'CD C CO c — Φ o >N co ú- ι- Ε Q. CO E N < □

    Předsymptomatická diagnóza v mozcích se scrapii

    Intenzita PrPres

    9/13 • i « * .· · · · · t · · · « ···· ·« ·· ···· ·♦ «♦

    Cyklická amplifikace lidského PrP

    E * < 0- + +

    1 +

    I I

    O O ro

    LD O ~

    CO co CL

    E < 0• ··· • 4 • 4 *444 ·· • ·

    10/13

    4 ·

    4 4 4

    4 4 ••44 44 44

    Obr. 11

    Detekce PrP^Sc v krvi po přípravě prázdných krevních buněk

    Bez amplifikace S amplifikaci

    11/13

    Íi63 - 36

    Obr. 12

    Detekce PrP^Sc v krvi po extrakci sarkosylem

    Bez amplifikace S amplifikaci

    -_HC Sc C Sc Sc

    12/13 • ··· * 9 9

    9 9 9 <>·· «

    Obr. 13

    Detekce PrP^Sc v krvi po purifikaci lipidických raftů

    Bez amplifikace S amplifikaci

    -₁₍-

    13/13 • ··♦ • · · · * · _ · ···· o • · • « · • · ·♦ ···· řv £C'C· 3 • · » • » » • · « 9

    99 99 t

    Obr. 14

    Detekce PrP^Sc v krvi po přípravě povlaků sražených leukocytů

    Bez amplifikace S amplifikaci

    I II I

    C Sc C Sc