MXPA06001588A - Reactivos de peptido especificos de prion. - Google Patents

Abstract

Se describen peptidos que interactuan preferiblemente con la forma PrPsc de la proteina de prion. Tambien se describen metodos para usar los reactivos o anticuerpos para los reactivos para la deteccion, diagnostico, terapia y profilaxis para enfermedades de priones y asociadas con prion.

Description

REACTIVOS DE PEPTIDO ESPECÍFICOS DE PRION CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona a reactivos de péptido que interactúan con proteínas de prión, polinucleótidos que codifican estos reactivos de péptido, métodos de generación de anticuerpos que usan los reactivos de péptido y polinucleótidos, y los anticuerpos generados que usan estos métodos. La invención además se relaciona a métodos de uso de estos reactivos de péptido para detectar la presencia de priones patogénicos en una muestra y a métodos de uso de estos reactivos de péptido como componentes en una composición terapéutica o profiláctica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades conformacionales de proteínas incluyen una variedad de enfermedades no relacionadas, incluyendo encefalopatías espongiformes transmisibles, que se originan de transición conformacional aberrante de una proteína (una proteína de enfermedad conformacional) la cual a su vez lleva a una auto-asociación de las formas de proteína aberrantes, con deposición y daño de tejido subsiguiente. Estas enfermedades también comparten semejanzas de afectación en presentaciones clínicas, comúnmente un progreso rápido de diagnóstico hasta muerte seguido de períodos de incubación Ref.: 170006 que vanan. Un grupo de enfermedades conformacionales se denominan "enfermedades de prión" o "encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE) " . En humanos estas enfermedades incluyen enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) , síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) , Insomnio Familiar Fatal, y Kuru (ver, por ejemplo, Harrison' s Principies of Infernal Medicine, Isselbacher y colaboradores, eds., McGraw Hiü, Inc. New York, (1994); Medori y colaboradores, (1992) N. Engl. J. Med. 326:444-9.). En animales las TSE incluyen tembladera de los ovinos, encefalopatía espongiforme de bovino (BSE) , encefalopatía de visón transmisible, y enfermedad de desgaste crónico de muía, venado y alce cautivos (Gajdusek, (1990) Subacute Spongiform Encephalopathies : Transmisible Cerebral Amyloidoses Caused by Unconventional Virases. Pp. 2289-2324 in: Virology, Fields, ed. ?ew York: Raven Press, Ltd.). Las encefalopatías espongiformes transmisibles se caracterizan por los mismos contrastes: la presencia de la conformación anormal (rica en beta, resistente la proteinaza K) de la proteína de prión que transmite enfermedad cuando se inocula experimentalmente en animales de laboratorio incluyendo primates, roedores, y ratones transgénicos. Recientemente, la diseminación rápida de la encefalopatía espongiforme de bovino y su correlación con ocurrencia elevada de encefalopatías espongiformes en humanos ha llevado a un incremento significante de interés en la detección de encefalopatías espongiformes en mamíferos no humanos . Las consecuencias trágicas de transmisión accidental de estas enfermedades (ver, por ejemplo, Gajdusek, Infectious Amyloids, and Prusiner Prions In Fields Virology. Fields, y colaboradores, eds. Lippincott-Ravin, Pub. Philadelphia (1996); Brown y colaboradores, (1992) Lancet, 340:24-27), dificultades de descontaminación (Asher y colaboradores, (1986) páginas 59-71 en: Laboratory Safety: Principies and Practices, Miller ed. Am. Soc. Microb.), y la preocupación reciente alrededor de la encefalopatía espongiforme de bovino (British Med. J. (1995) 311:1415-1421) subrayan la urgencia de tener tanto una evaluación de diagnóstico que identificaría a humanos y animales con encefalopatías espongiformes transmisibles como terapias para sujetos infectados. Los priones son los patógenos infecciosos que provocan las encefalopatías espongiformes (enfermedades de prión) . Los priones difieren significativamente de bacterias, virus y viroides . La hipótesis que domina es que, a diferencia de todos los otros patógenos infecciosos, la infección se provoca por una conformación anormal de la proteína de prión, la cual actúa como una plantilla y convierte conformaciones de prión normales en conformaciones anormales. Una proteína de prión se caracterizó primero a principios de los años 80. (ver, por ejemplo, Bolton, McKinley y colaboradores, (1982) Science 218:1309-1311; Prusiner, Bolton y colaboradores, (1982) Biochemistry 21:6942-6950; McKinley, Bolton y colaboradores, (1983) Cell 35:57-62). Los genes que codifican proteína de prión completa han sido clonados, secuenciados y expresados en animales transgénicos. Ver, por ejemplo, Basler, Oesch y colaboradores, (1986) Cell 46:417-428. La característica clave de las enfermedades de prión es la formación de una proteína formada anormalmente (PrPSc) , también referida como una proteína de scrapie ("tembladera"), de la forma normal (celular o no patogénica) de la proteína de prión (PrPSc) . Ver, por ejemplo, Zhang y colaboradores, (1997) Biochem. 36 (12) :3543-3553 ; Cohén & Prusiner (1998) Ann Rev. Biochem. 67:793-819; Pan y colaboradores, (1993) Proc. Nati. Acad. Sci USA 90:10962-10966; Safar y colaboradores, (1993) J Biol Chem 268:20276-20284. Estudios de espectroscopia óptica y cristalografía han revelado que las formas de los príones relacionadas con la enfermedad están sustancialmente enriquecidas en estructura de hoja beta comparadas con las formas no enfermas multiplicadas helicoidales alfa predominantemente. Ver, por ejemplo, Wiüe y colaboradores, (2001) Proc . Nati . Acad. Sci USA 99:3563-3568; Peretz y colaboradores, (1997) J. MOI. Biol. 273:614-622; Cohén & Prusiner, Chapter 5: Structural Studies of prión Proteins in prión BIOLOGY AND DISEASES, ed. S. Prusiner, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, pp:191-228) . Los cambios estructurales son apreciables para ser seguidos por alteraciones en las proteínas bioquímicas: la PrPc es soluble en detergentes sin desnaturalización, la PrPSc es insoluble; la PrPc es fácilmente digerible por proteasas, mientras que las PrPSc es parcialmente resistente, resultando en la formación de un fragmento truncado de terminal N conocido como forma "PrPress" (Baldwin y colaboradores, (1995) ; Cohén & Prusiner (1995)), "PrP 27-30" (27-30 kDa) o "resistente de PK" (resistente de proteínasa K) . Además, la PrPSc puede convertir PrPc a la conformación patogénica. Ver, por ejemplo, Kaneko y colaboradores, (1995) Proc . Nati . Acad. Sci USA 92:11160-11164; Caughey (2003) Br Med Bull. 66:109-20. La detección de las isoformas patogénicas de las proteínas de enfermedad conformacional en sujetos vivos y muestras obtenidas de sujetos vivos ha resultado difícil. Así, el diagnóstico definitivo y los tratamientos paliativos para estas condiciones transmisibles y que contienen amiloide antes de la muerte del sujeto continúan siendo un reto no encontrado completamente. El examen histopatológico de biopsias de cerebro es peligroso para el sujeto y las lesiones y depósitos de amiloides pueden ser equivocados dependiendo de dónde se tome la muestra de la biopsia. Sin embargo, todavía hay riesgos involucrados con biopsias a animales, pacientes, y personal del cuidado de la salud.

Además, los resultados de pruebas de cerebro en animales usualmente no se obtienen hasta que el animal ha ingerido el suplemento alimenticio. Además, los anticuerpos generados contra péptidos de prión reconocen ambos: el PrPsc desnaturalizado y PrPc pero no son capaces de reconocer selectivamente los PrPSc infecciosos (no desnaturalizados) . (Ver, por ejemplo, Matsunaga y colaboradores, (2001) PROTEINS : Structure, Function and Genetics 44:110-118). Así, prevalece una necesidad de composiciones y métodos para detección de la presencia de proteínas de prión patogénico en varias muestras, por ejemplo en muestras obtenidas de sujetos vivos, en suministros de sangre, en animales de granja y en otros suministros de alimento humano y animal. Además, prevalece una necesidad de métodos y composiciones para diagnóstico y tratamiento de enfermedades relacionadas con prión.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona, en parte, a reactivos de péptidos que interactúan con proteínas de prión. Más específicamente, los reactivos de péptido descritos aquí interactúan preferentemente con isoformas patogénicas de proteínas de prión. Estos reactivos de péptido se pueden usar en un amplio rango de aplicaciones, que incluyen como herramientas para aislar priones patogénicos o para detectar la presencia de priones patogénicos en una muestra, como componentes de una composición terapéutica o profiláctica y/o para generar anticuerpos específicos de prión. Por ejemplo, reactivos de péptido que interactúan preferentemente con PrPSc en comparación con PrPc son útiles para la detección directa de formas patogénicas en muestras obtenidas de sujetos vivos, por ejemplo, para diagnóstico de una enfermedad o para separación por exclusión de muestras de sangre donada o separación por exclusión de órganos para donación de órganos. En un aspecto más amplio, la invención incluye un reactivo de péptidos que interactúa preferentemente con formas patogénicas de una proteína de enfermedad conformacional. En ciertas modalidades, los reactivos de péptido descritos aquí interactúan preferentemente con formas patogénicas de una proteína de prión en comparación con formas no patogénicas de la proteína de prión. Los reactivos de péptido descritos aquí pueden ser parcial o completamente sintéticos, por ejemplo, pueden comprender una o más de las siguientes porciones; residuos siclizados o péptidos, multímeros de péptidos, etiquetas, y/u otras porciones químicas. Ejemplos de reactivos de péptido apropiados incluyen aquellos derivados de péptidos de la SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, ú 84, y análogos y derivados de estos. Los reactivos de péptido descritos aquí pueden interactuar con cualquiera de las proteínas de enfermedad conformacional, por ejemplo, proteínas de prión (por ejemplo, la proteína patogénica PrPSc, y la forma no patogénica PrPc) . En ciertas modalidades, los reactivos de péptido interactúan preferentemente con PrPSc en comparación con PrPc. Los reactivos de péptido generalmente serán específicos para PrPSc de más de una especie, pero pueden ser específicos para PrPSc de una especie única. En otra modalidad, se proporcionan los reactivos de péptidos derivados de péptidos mostrados en cualquiera de las secuencias descritas aquí. En ciertas modalidades, los reactivos de péptido se derivan de regiones de una proteína de prión, por ejemplo, se emplean aquellas regiones que corresponden a residuos 23-43 ó 85-156 (por ejemplo, 23-30, 86-111, 89-112, 97-107, 113-135, y 136-156 enumerados de acuerdo con la secuencia de prión de ratón en SEQ ID NO: 2) . Por conveniencia, los números de residuo de aminoácidos puestos anteriormente son aquellos que corresponden a la secuencia de proteína de prión de ratón en SEQ ID NO: 2; un experto ordinario en la técnica puede identificar fácilmente las regiones que corresponden en proteínas de prión de otra especie con bese en las secuencias conocidas en la técnica y las enseñanzas proporcionadas aquí. Ejemplarmente los reactivos de péptidos incluyen aquellos derivados de péptidos que tienen la SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, ó 127; o de péptidos que tiene SEQ ID NO-.14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 129, 130, 131, 132, ó 128; o de péptidos que tienen SEQ ID N0:56, 57, 65, 82, Ú 84. En otro aspecto, la invención incluye un complejo que comprende uno o más de los reactivos de péptido descritos aquí y una proteína de prión. En otro aspecto, se proporciona un método de anticuerpos de generación que reconocen proteínas de prión, el método comprende el paso de administración de cualquiera de los reactivos de péptido descritos aquí (o polinucleótidos que codifican los reactivos de péptido) a un sujeto (por ejemplo, animal) . En ciertas modalidades, el método además comprende el paso de aislamiento de anticuerpos del animal . Un aspecto relacionado de la invención incluye anticuerpos hachos por el método. Los anticuerpos preferidos son específicos para la forma patogénica. En todavía otro aspecto, la invención incluye un complejo que comprende cualquiera de los anticuerpos descritos aquí y una proteína de prión. En ciertas modalidades, la proteína de prión es una isoforma no patogénica mientras que en otras modalidades esta es una isoforma patogénica.

Cualquiera de los reactivos de péptido y/o anticuerpos descritos aquí pueden ser codificados, en todo o en parte, mediante uno o más polinucleótidos, los cuales también forman parte de la presente invención. En todavía otro aspecto, se proporcionan los métodos para detección de la presencia de proteínas de prión. Los métodos de detección se pueden usar, ínter alia, en conexión con métodos para diagnóstico de una enfermedad relacionada con prión (por ejemplo, en humano o sujetos animales no humanos) , asegurando un suministro de sangre libre de PrPSc completamente, suministro de productos de sangre, o suministro de alimento, muestras de órgano y tejido de análisis para transplante, monitoreo de la descontaminación de herramientas y equipo quirúrgico, además de cualquier otra situación en la cual el conocimiento de la presencia o ausencia del prión patogénico es importante. Los métodos de detección dependen en la interacción preferente de los reactivos de péptido de la invención con la isoforma de prión patogénico. En ciertas modalidades, se proporciona un método para detección de la presencia de un prión patogénico en una muestra biológica. En una modalidad, el método comprende el contacto de la muestra sospechosa de contener un prión patogénico con uno o más de los reactivos de péptido descritos aquí bajo condiciones que permiten la interacción del o los reactivos de péptido y el prión patogénico, si está presente; y la detección de la presencia o ausencia del prión patogénico en la muestra por su enlace con el o los reactivos de péptido. La interacción del o los reactivos de péptido y el prión patogénico se pueden llevar a cabo en solución, o uno o más - de los reactivos se pueden proporcionar en o sobre una fase sólida. Los ensayos tipo intercalado se pueden llevar a cabo en los cuales los reactivos de péptido de la invención se pueden usar como un "reactivo de captura, un reactivo de detección o ambos . Se pueden usar otros reactivos que enlazan prión (por ' ejemplo, anticuerpos y otras moléculas de enlace que enlazan a proteína de prión desnaturalizada) en este aspecto en combinación con los reactivos de péptido de la invención. En un aspecto de esta modalidad, uno o más reactivos de péptido de la presente invención se proporciona en un soporte sólido y se contacta con una muestra sospechosa de contener un prión patogénico, bajo condiciones que permiten el enlace del prión patogénico, si está presente, al reactivo de péptidos. Los materiales de muestra no enlazados, que incluyen cualquier prión no patogénico, se pueden remover y el prión patogénico se puede detectar ya sea mientras permanece enlazado al reactivo de péptidos o después de disociación del reactivo de péptidos. El prión patogénico se puede detectar usando un reactivo de péptidos etiquetado detectablemente (ya sea el mismo reactivo de péptidos usado para "capturar" el prión patogénico o un segundo reactivo de péptidos de la invención) o un anticuerpo anti prión etiquetado detectablemente u otro reactivo de enlace de prión. Este anticuerpo o reactivo de enlace de prión necesita no ser específico para la forma patogénica del prión. En otro aspecto de esta modalidad, un reactivo de enlace de prión se proporciona en un soporte sólido y se contacta con una muestra sospechosa de contener un prión patogénico, bajo condiciones que permiten el enlace del prión patogénico, si está presente, al reactivo de enlace de prión. Los materiales de muestra no enlazados se pueden remover y el prión patogénico se puede detectar, ya sea mientras que permanece enlazado al reactivo de péptidos o después de disociación del reactivo de péptidos. El prión patogénico se puede detectar usando uno o más reactivos de péptido etiquetados detectablemente de la invención. En otro aspecto de esta modalidad, el prión patogénico en una muestra se puede enlazar no específicamente a un soporte sólido (por ejemplo, una placa de ELISA) y ser detectado por el enlace de uno o más reactivos de péptido etiquetados detectablemente de la invención que interactúan preferentemente con la isoforma de prión patogénico. En una modalidad más, el método comprende el contacto de la muestra sospechosa de contener un prión patogénico con uno o más reactivos de péptido seleccionados del grupo que consiste de péptido que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 12-132, y análogos y derivados de estos, bajo condiciones que permiten el enlace de los reactivos de péptido con el prión patogénico, si está presente; y detectar la presencia o ausencia del prión patogénico en la muestra mediante su enlace a los reactivos de péptido. En modalidades preferidas, la muestra se contacta con uno o más reactivos de péptido seleccionados del grupo que consiste de péptidos que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 66 , 61 , 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, ú 84, y análogos y derivados de estos. En todavía otras modalidades, se proporciona un método para detección de un prión patogénico en una muestra simple, el método comprende : proporcionar un soporte sólido que comprende un primer péptido, en donde el primer péptido comprende uno o más de los reactivos como se describe aquí que interactúan preferentemente con PrPSc; contactar del soporte sólido con la muestra bajo condiciones que permiten a los priones patogénicos, cuando estén presentes en la muestra, enlazar al primer péptido; contactar el soporte sólido con un segundo péptido etiquetado detectablemente, en donde el segundo péptido comprende uno o más de los reactivos de péptido descritos aquí que interactúan preferentemente con las proteínas PrPSc, bajo condiciones que permiten al segundo péptido enlazan a priones patogénicos enlazados por el primer péptido; y detectar complejos formados entre el primer péptido, un prión patogénico de la muestra y el segundo péptido, detectando de esa manera la presencia del prión patogénico en la muestra. En todavía otras modalidades, se proporciona aquí un método para detección de la presencia de un prión patogénico en una muestra que comprende: proporcionar un soporte sólido que comprende un reactivo de enlace de- prión, en donde los reactivos de enlace de prión enlazan proteínas de prión; contactar el soporte sólido con la muestra bajo condiciones que permiten proteínas de prión, cuando están presentes en la muestra, para enlazar al reactivo de enlace de prión; contactar el soporte sólido con el reactivo de péptidos etiquetado detectablemente de la invención, en donde el reactivo de péptidos interactúa preferentemente con la proteína de prión patogénico; y detectar complejos formados entre el reactivo de enlace de prión, un prión patogénico de la muestra, y el reactivo de péptidos. En otra modalidad, se proporciona un método para detección de la presencia de un prión patogénico en una muestra, el método comprende los pasos de proporcionar un soporte sólido que comprende un primer reactivo de péptidos como se describe aquí, en donde el primer reactivo de péptidos interactúa preferentemente con las formas patogénicas;, contactar el soporte sólido con un primer ligando etiquetado detectablemente (por ejemplo, plasminógeno, receptor de laminina y sulfato de heparán) , bajo condiciones que permiten la formación de un complejo de ligando-reactivo de péptidos etiquetado detectablemente, en donde la afinidad de enlace del primer reactivo de péptidos para el primer ligando etiquetado detectablemente es más débil que la afinidad de enlace del primer reactivo de péptidos para un prión patogénico; contactar una muestra sospechosa de contener priones patogénicos con el soporte sólido bajo condiciones que permiten a un prión patogénico, cuando está presente en la muestra, enlazar al primer reactivo de péptidos y reemplazar el primer ligando; y detectar la presencia del prión patogénico en la muestra por disminución en ligando etiquetado detectablemente en el soporte sólido. Cualquiera de los métodos anteriores de detección de un prión patogénico se puede usar en un método para diagnosticar una enfermedad relacionada con prión. La presente invención también proporciona un método para aislamiento de un prión patogénico que comprende: proporcionar un soporte sólido que comprende uno o más reactivos de péptido de la invención, contactar el soporte sólido con una muestra sabida o sospechosa de contener un prión patogénico bajo condiciones que permiten el enlace del prión patogénico, si están presente, al reactivo de péptido; y remoción de cualquier material de muestra no enlazado. Las modalidades adicionales además comprenden el paso de disociar el prión patogénico enlazado del reactivo de péptidos, y opcionalmente, recuperar el prión patogénico disociado. La presente invención también proporciona un método para remoción de priones patogénicos de una muestra que comprende; proporcionar un soporte sólido que comprende uno o más reactivos de péptido de la invención, contactar el soporte sólido con una muestra sabida o sospechosa de contener los priones patogénicos, bajo condiciones que permiten el enlace de los priones patogénicos, si están presentes, al reactivo de péptido; y recuperación de los materiales de muestra no enlazados . En todas las modalidades anteriores que proporcionan un soporte sólido que comprende uno o más reactivos de péptido de la invención, las modalidades alternativas están contempladas en las cuales el reactivo de péptidos se contacta con la muestra anterior al reactivo de péptidos que se une al soporte sólido. En estas modalidades, el reactivo de péptidos comprende un miembro de un par de enlace y el soporte sólido comprende el segundo miembro del par de enlace. Por ejemplo, el reactivo de péptidos de la invención puede contener o ser modificado para contener biotina. El reactivo de péptidos biotinilado se contacta con una muestra sospechosa de contener un prión patogénico bajo condiciones que permitan el enlace del reactivo de péptidos con el prión patogénico. Luego se contacta un soporte sólido que comprende avidina o estreptavidina con el reactivo de péptidos biotinilado. Aquí se describen otros pares de enlace apropiados . En cualquiera de los métodos que usan un soporte sólido descrito aquí, el soporte sólido puede ser, por ejemplo, nitrocelulosa, poliestireno, polipropileno, látex, fluoruro de polivinilo, papel diazotizado, membranas de nailon, perlas activadas, y/o perlas sensibles magnéticamente, poüvinilcloruro; polipropileno, látex de poliestireno, policarbonato, nylon, dextrano, quitina, arena, sílice, piedra pómez, agarosa, celulosa, vidrio, metal, poliacrilamida, silicio, hule, polisacáridos; papel diazotizado, perlas activadas, perlas sensibles magnéticamente, y cualquier material usado comúnmente para síntesis en fase sólida, separaciones de afinidad, purificaciones, reacciones de hibridización, inmunoensayos y otras aplicaciones . El soporte puede ser en forma de partícula o puede ser en la forma de una superficie continua e incluye membranas, mallas, placas, peletizados, transparencias, discos, capilares, fibras porosas, agujas, alfileres, chips, fibras sólidas, geles (por ejemplo, geles de sílice) y perlas, (por ejemplo, perlas de cristal de poro, geles de sílice, perlas de poliestireno opcionalmente reticuladas con divinilbenceno, perlas co-poli-injertadas, perlas de poliacrilamida, perlas de látex, perlas de dimetilacrilamida opcionalmente reticuladas con N-N' -bis-acrüoüetüendiamina, perlas magnéticas de óxido de hierro, y partículas de cristal recubiertas con un polímero hidrofóbico . Además, en cualquiera de los métodos descritos aquí la muestra puede ser una muestra biológica, que es, una muestra obtenida o derivada de un organismo vivo o anteriormente vivo, por ejemplo, órganos, sangre completa, fracciones de sangre, componentes de sangre, plasma, plaquetas, suero, fluido cerebroespinal (CSF) , tejido de cerebro, tejido de sistema nervioso, tejido de músculo, médula ósea, orina, lágrimas, tejido no del sistema nervioso, órganos, y/o biopsias o necropsias. En modalidades preferidas, la muestra biológica comprende sangre, fracciones de sangre o componentes de sangre. La muestra puede ser una muestra no biológica. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de diagnóstico de una enfermedad relacionada con prión en un sujeto por detección de la presencia de un prión patogénico en una muestra biológica del sujeto por cualquiera de los métodos de detección descritos aquí . En otro aspecto, la invención incluye métodos de preparación de un suministro de sangre que está completamente libre de priones patogénicos, el método comprende los pasos de separación por exclusión de alícuotas de sangre (por ejemplo, sangre completa, plasma, plaquetas o suero) de muestras de sangre recolectadas por cualquiera de los métodos descritos aquí, eliminación de cualquier muestra en la cual los priones patogénicos se detecten; y combinación de muestras donde los priones patogénicos no se detectaron para proporcionar un suministro de sangre completamente libre de priones patogénicos. En todavía otro aspecto, la invención incluye métodos de preparación de un suministro de alimentos, en particular, un suministro de carne (por ejemplo, carne de res, borrego, carnero o cerdo usada para consumo humano o animal) que está completamente libre de priones patogénicos, el método comprende los pasos de separación por exclusión, usando cualquiera de los métodos de detección descritos aquí, muestras recolectadas de organismos vivos o muertos que entrarán en el suministro de alimento o muestras recolectadas de alimento propuesto para entrar en el suministro de alimento; identificación de muestras en las cuales los priones patogénicos se detectaron; y remoción del suministro de alimentos de cualquier organismo vivo o muerto o alimento propuesto para entrar en el suministro de alimento, en muestras de las cuales los priones patogénicos son detectados; proporcionando de esa manera un suministro de alimento que está completamente libre de priones patogénicos. 5 En otro aspecto, la invención incluye un soporte sólido que comprende uno o más reactivos de péptido como se describió aquí. El soporte sólido se puede usar, inter alia, en los métodos de la invención para detección de una proteína de prión patogénico en una muestra, para .10 aislamiento de una proteína de prión de una muestra, y para eliminación de proteínas de prión patogénico de una muestra. El soporte sólido puede ser como se describe anteriormente . En otro aspecto, la invención incluye varios kits para •15 detección de la presencia de un prión patogénico en una muestra, para aislamiento de un prión patogénico de una muestra, para eliminación de un prión patogénico de una muestra, el kit comprende: uno o más de los reactivos de péptido descritos aquí; y/o cualquiera de los soportes 20 sólidos que comprenden uno o más de los reactivos de péptido descritos aquí y otros reactivos necesarios y, opcionalmente, controles positivo y negativo. El o los reactivos de péptidos pueden ser etiquetados detectablemente. En otros aspectos, aquí se proporcionan composiciones 25 que comprenden uno o más de los reactivos de péptido, polinucleótido y/o anticuerpos descritos aquí. En un aspecto más, se proporcionan los métodos de tratamiento o prevención de enfermedades de prión, por ejemplo, métodos que comprenden administración a un animal (por ejemplo, mamífero no humano o humano) una o más composiciones descritas aquí. En otras modalidades, los métodos comprenden administración de una primera composiciones que comprende cualquiera de las composiciones descritas aquí en un paso de cebado y administración de una segunda composición que comprende cualquiera de las composiciones descritas aquí como una agente de refuerzo, por ejemplo, en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune en el sujeto. La o las composiciones se pueden administrar intramusculármente, intramucosamente, intranasalmente, subcutáneamente, intradermalmente, transdermalmente, intravaginalmente, intrarectalmente, oralmente y/o intravenosamente . Estas y otras modalidades del objetivo de la invención ocurrirán fácilmente para aquellos expertos en la técnica a la luz de lo descrito aquí.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa la secuencia de aminoácidos de proteínas de prión humano (SEQ ID NO: 1) y de ratón (SEQ ID NO: 2) . La Figura 2 representa un alineamiento de proteínas de prión de humano (SEQ ID NO:3), hámster sirio (hámster) (SEQ ID NO: 4), bovino (SEQ ID NO: 5), oveja (SEQ ID NO: 6), ratón (SEQ ID NO: 7), alce (SEQ ID NO : 8), gamo (SEQ ID ?O : 9), venado uía (muía) (SEQ ID ?O: 10) , y venado de cola blanca (blanco) (SEQ ID ?O: 11) . El alce, venado de barbecho, venado muía, y venado de cola blanca solamente varía uno del otro en dos residuos, S/?128 y Q/E226 (mostrado en negritas) . Figura 3, los paneles A-F representan ejemplarmente sustituciones peptoides que pueden ser hechas para preparar cualquiera de los reactivos de péptidos descritos aquí. Los peptoides están encerrados en círculo en cada panel y se muestran en un reactivo de péptidos ejemplar como se describe aquí (SEQ ID ?O: 14, QW?KPSKPKTNG) , en el cual un residuo de proüna (residuo 8 de S?Q ID NO : 14) se reemplaza con un residuo de glicina ?-sustituida (peptoide) . El panel A muestra un reactivo de péptidos en el cual un residuo de prolina se sustituye con el residuo peptoide: ?- (S) - (-feniletil) glicina; el panel B muestra un reactivo de péptidos en el cual un residuo de prolina se sustituye con el residuo peptoide: ?- (4-hidroxifenil) glicina; el panel C muestra un reactivo de péptidos en el cual un residuo de prolina se sustituye con el residuo peptoide: ?- (ciclopropilmetil) glicina; el panel D muestra un reactivo de péptidos en el cual se sustituye un residuo de prolina con el residuo peptoide: ?- (isopropil) glicina; el panel E muestra un reactivo de péptidos en el cual se sustituye un residuo de prolina con el residuo peptoide: N-(3,5-dimetoxibencil) glicina; y el panel F muestra un reactivo de péptidos en el cual se sustituye un residuo de prolina con el residuo peptoide: N-butilgücina. La Figura 4 representa los resultados de experimentos de la técnica "Western blot" como se describen en el Ejemplo 2. Las líneas 1 y 2 muestran la presencia de proteínas de prión en homogeneizados de cerebro de ratón normal (Línea 1, etiquetado "C") y en homogeneizados de cerebro de ratón infectado desnaturalizado (línea 2, etiquetado "Se"). Las líneas 3,4 y 5 muestran enlace específico de un reactivo de péptidos como se describe aquí (SEQ ID NO: 68) a formas de prión patogénico en la presencia de plasma humano. En particular, la línea 3 es un control de plasma humano y la línea 4 es una muestra de homogeneizado de cerebro de ratón normal. La línea 5 muestra enlace fuerte por el reactivo de péptidos a PrPSc en muestras de homogeneizado de cerebro de ratón infectado. La Figura 5 representa las estructuras de reactivos de péptido ligadas a PEG ejemplarmente como se describen aquí.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona al descubrimiento sorpresivo e inesperado de que los péptidos relativamente pequeños (menores que 50 a 100 aminoácidos de longitud, preferiblemente menores que 50 aminoácidos de longitud y aún más preferiblemente menores que alrededor de 30 aminoácidos de longitud) se pueden usar para discriminar entre proteínas de prión no patogénicas y patogénicas . Así , la presente descripción se relaciona al hallazgo sorpresivo de que estos péptidos y derivados de estos (colectivamente "reactivos de péptido"), pueden enlazar formas de proteína patogénica y no patogénica en diferentes especificidades y/o afinidades y, en consecuencia, se pueden usar, en y de ellas mismas, como reactivos de diagnóstico/detección o como componentes de composiciones terapéuticas. Antes de la presente descripción, se creía que solamente las moléculas más grandes (por ejemplo, anticuerpos, PrPc, rPrP de forma y plasminógeno) se podían usar para diferenciar formas patogénicas y no patogénicas . Tal como se describió previamente los péptidos antigénicos se usaron para generar anticuerpos que se evaluaron para su capacidad de discriminar entre formas patogénicas y no patogénicas. Sin embargo, debido a la naturaleza relativamente no inmunogénica de proteínas anteriores, ha resultado difícil generar anticuerpos específicos para formas patogénicas. Ver por ejemplo, R. A. Williamson y colaboradores, "Antibodies as Tools to Probé prión Protein Biology" en prión BIOLOGY AND DISEASES, ed. S. Prusiner, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, pp:717-741. El descubrimiento de que ciertos péptidos como se describió aquí, interactúan preferentemente con proteínas de prión patogénico (PrPSc) permite el desarrollo de reactivos novedosos para diagnóstico, ensayos de detección y terapéuticos, inter alia. Así, la invención se relaciona a reactivos de péptido y, además, se relaciona a ensayos de detección y ensayos de diagnóstico que utilizan estos reactivos de péptido, métodos de purificación o aislamiento que utilizan estos reactivos de péptido y composiciones terapéuticas que comprenden estos reactivos de péptido. También se proporcionan polinucleótidos que codifican estos reactivos de péptido, y anticuerpos generados que usan estos reactivos de péptido. Los reactivos de péptido, polinucleótidos y/o anticuerpos descritos aquí son útiles en composiciones y métodos para detección de la presencia de priones patogénicos, por ejemplo en una muestra biológica. Además, la invención se relaciona a métodos de uso de tales reactivos de péptido, anticuerpos y/o polinucleótidos como un componente en una composición terapéutica o profiláctica. Los reactivos de péptido (y polinucleótidos que codifican estos reactivos de péptido) usados en la invención comprenden un péptido que interactúa preferentemente con isoformas patogénicas comparadas con isoformas no patogénicas. Por ejemplo, en ciertas modalidades, los reactivos de péptido como se describieron aquí específicamente enlazan a formas de proteína de enfermedad conformacional patogénica y no enlazan (o enlazan a una extensión menor) a formas no patogénicas . Los reactivos de péptido descritos aquí (y polinucleótidos que codifican lo mismo) se pueden usar, por ejemplo, para generar anticuerpos. Estos anticuerpos pueden reconocer formas patogénicas, formas no patogénicas o ambas. Estas moléculas son útiles, solas o en varias combinaciones, en ensayos de diagnóstico y/o en composiciones profilácticas o terapéuticas. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican ampliamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990) ; Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); y Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackweü, eds., 1986, Blackweü Scientific Publications) ; Sambrook, y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d Edition, 1989) ; Handbook of Surface an Colloidal Chemistry (Birdi, K. S. y colaboradores, CRC Press, 1997); Short Protocols in Molecular Biology, 4h ed. (Ausubel y colaboradores, 1999, John Wiley & Sons) ; Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Rea y colaboradores, eds. 1998, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag) ; Peters and Dalrymple, Fields Virology (2nd ed) , Fields y colaboradores, (eds.), B. N. Raven Press, New York, NY. Se entiende que los reactivos de péptido, anticuerpos y métodos de esta invención no están limitados a formulaciones particulares o parámetros de proceso tal como, por su puesto, pueden variar. También se entiende que la terminología usada aquí es para el propósito de describir modalidades particulares de la invención solamente, y no se pretende ser limitante. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas aquí están incorporadas aquí por referencia en su totalidad.

I. Definiciones Con el propósito de facilitar un entendimiento de la invención, términos seleccionados usados en la solicitud se discutirán a continuación. Los términos "prión" , "proteína de prión" , "proteína PrP" y "PrP" se usan intercambiablemente aquí para referirse tanto a la forma de proteína patogénica (varias referidas como proteína de scrapie, forma de proteína patogénica, isoforma patogénica, prión patogénico y PrPSc) y la forma no patogénica (varias referidas como forma de proteína celular, isoforma celular, isoforma no patogénica, proteína de prión no patogénico, y PrP) , tanto como a la forma desnaturalizada y varias formas recombinantes de la proteína de prión la cual puede no tener ya sea la conformación patogénica o la conformación celular normal . La forma de proteína patogénica se asocia con estado de enfermedad (encefalopatías espongiformes) en humanos y animales; la forma no patogénica normalmente está presente en células de animales y puede, bajo condiciones apropiadas, ser convertida a la conformación patogénica PrPsc. Los priones se producen naturalmente en una amplia variedad de especies mamíferas, -incluyendo humanos, ovejas, reses, y ratones. Una secuencia de aminoácido representativa de una proteína humana se establece como SEQ ID NO : 1. Una secuencia de aminoácidos representativa de una proteína de prión de ratón se establece como SEQ ID NO : 2. Otras secuencias representativas se muestran en la Figura 2.

Como se usa aquí, el término "patogénico" puede significar que la proteína provoca la enfermedad o esto simplemente puede significar que la proteína está asociada con la enfermedad y por lo tanto está presente cuando la enfermedad está presente. Así, una proteína patogénica como se usa en conexión con esta descripción no necesariamente es una proteína que sea el agente causativo específico de una enfermedad. Las formas patogénicas pueden o no ser infecciosas. El término "forma de prión patogénico" se usa más específicamente para referirse a la conformación y/o la conformación rica de láminas beta de proteínas de prión mamíferas, aviarias o recombinantes. Generalmente, la conformación rica de hojas beta es resistente a proteínasa K. Los términos "no patogénico" y "celular" cuando se usan con respecto a formas de proteína de enfermedad conformacional se usan intercambiablemente para referirse a la isoforma normal de la proteína cuya presencia no está asociada con enfermedad. Además , una "proteína de prión" o "proteína de enfermedad conformacional" como se usa aquí no se limita a un polipéptido que tiene la secuencia exacta para aquellos descritos aquí. Es fácilmente apreciable que los términos abarcan proteínas de enfermedad conformacional de cualquiera de las especies o enfermedades identificadas o no identificadas (por ejemplo, Alzheimer, Parkinson, etc.). Uno de experiencia en la técnica en vista de las enseñanzas de la presente descripción y la técnica puede determinar regiones que corresponden a las secuencias mostradas en las Figuras en cualquiera de otras proteínas de prión, usando por ejemplo, programas de comparación de secuencia (por ejemplo, BLAST y otros descritos aquí) o identificación y alineamiento de características estructurales o motivos. El término "gen PrR" se usa aquí para describir cualquier material genético que exprese proteínas de prión que incluyen mutaciones de polimorfismos y patogénicas conocidas . El términos "gen PrP" se refiere generalmente a cualquier gen de cualquier especie que codifica cualquier forma de una proteína PrP. Algunas secuencias PrP comúnmente conocidas se describen en Gabriel y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . EUA 89:9097-9101 (1992), y las Patentes de EUA Nos. 5,565,186; 5,763,740; 5,792,901; y WO 97/04814, incorporadas aquí por referencia para revelar y describir las secuencias. El gen PrP puede ser de cualquier animal, que incluyen los animales "hospedadores" y de "prueba" descritos aquí y cualquiera y todos lo polimorfismos y mutaciones de estos, siendo reconocido que los términos incluyen otros tales como genes PrP que todavía están por ser descubiertos . La proteína expresada por tal gen puede asumir ya sea una forma PrPc (no enfermedad) o PrPSc (enfermedad) . "Enfermedad relacionada con prión" como se usa aquí se refiere a una enfermedad provocada en todo o en parte por una proteína de prión patogénico (PrPSc) . Las enfermedades relacionadas de prión incluyen, pero no se limitan a, tembladera, encefalopatías espongiformes de bovino (BSE) , enfermedad de vacas locas, encefalopatías espongiformes felinas, kuru, Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) , nueva variante de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (nvCJD) , enfermedad de desgaste crónico (CWD) , Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker (GSS) , e insomnio familiar fatal (FFI) . El término "reactivo de péptido" como se usa aquí generalmente se refiere a cualquier compuesto que comprende polímeros que ocurren naturalmente o sintéticos de aminoácido o moléculas similares a aminoácido, que incluyen pero no se limitan a compuestos que comprenden solamente moléculas amino y/o imino. Los reactivos de péptido de la presente invención interactúan preferentemente con una proteína de prión patogénico y se derivan comúnmente de fragmentos de una proteína de prión. El término "péptido" se usará intercambiablemente con "oligopéptido" o "polipéptido" y no se implica tamaño particular por el uso de estos términos. Están incluidos dentro de la definición, por ejemplo, péptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluyen, por ejemplo, aminoácidos no naturales, peptoides, etc.), péptidos con enlaces sustituidos, además de otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto las que ocurren naturalmente y las que no ocurren naturalmente (por ejemplo, sintéticos) . Así, los péptidos sintéticos, dímeros, multímeros (por ejemplo, repeticiones de tándem, formas de péptido antigénico múltiple (MAP) , péptidos enlazados linealmente) , cicüzados, moléculas ramificadas y lo similar, se incluyen dentro de la definición. Los términos también incluyen moléculas que comprenden uno o más residuos de glicina N-sustituida (un "peptoide") y otros aminoácidos o péptidos sintéticos. (Ver por ejemplo, las Patentes de EUA Nos. 5,831,005; 5,877,278; y 5,977,301; Nguyen y colaboradores, (2000) Chem Biol. 7 (7) :463-473 ; y Simón y colaboradores, (1992) Proc. Nati . Acad. Sci EUA 89 (20) : 9367-9371 para descripciones de péptoides) . Las longitudes sin limitación de péptidos apropiadas para uso en la presente invención incluyen péptidos de 3 hasta 5 residuos de longitud, 6 hasta 10 residuos de longitud (o cualquier entero entre ellos) , 11 hasta 20 residuos de longitud (o cualquier entero entre ellos) , 21 hasta 75 residuos de longitud (o cualquier entero entre ellos) , 75 hasta 100 (o cualquier entero entre ellos) , o polipéptidos de más de 100 residuos de longitud. Comúnmente, los péptidos útiles en esta invención pueden tener una longitud máxima apropiada para la aplicación propuesta. Preferiblemente el péptido está entre alrededor de 3 y 100 residuos de longitud. Generalmente, un experto den la técnica puede seleccionar fácilmente la longitud máxima en vista de las enseñanzas aquí dadas. Además, los reactivos de péptidos como se describen aquí, por ejemplo péptidos sintéticos, incluyen moléculas adicionales tales como etiquetas, enlazadores, u otras porciones químicas (por ejemplo, biotina, colorantes específicos amiloides tales como Rojo de Control o Tioflavina) . Tales porciones además pueden mejorar la interacción de los péptidos con las proteínas de prión y/o más detección de proteínas de prión. Los reactivos de péptido también incluyen derivados de las secuencias de aminoácidos de la invención que tienen una o más sustituciones, adiciones y/o eliminaciones, incluyendo uno o más aminoácidos que no ocurren naturalmente . Preferiblemente, los derivados exhiben por lo menos alrededor de 50% de identidad para cualquier secuencia de tipo silvestre o de referencia, preferiblemente por lo menos alrededor de 70% de identidad, más preferiblemente por lo menos alrededor de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de identidad de secuencia para cualquier secuencia de tipo silvestre o de referencia descrita aquí. La identidad de secuencia (o porcentaje) se puede determinar como se describe a continuación. Los derivados pueden incluir modificaciones de postexpresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación, y lo similar. Los derivados de péptido también pueden incluir modificaciones a la secuencia nativa, tales como eliminaciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservadoras en naturaleza) , tanto como el polipéptido mantenga la- actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como a través de mutaciones de hospedadores que producen proteínas o errores debidos a amplificación de PCR. Además, las modificaciones se pueden hacer para que tengan uno o más de los siguientes efectos: reducción de toxicidad; incremento de afinidad y/o especificidad para proteínas de prión; procesamiento de célula que facilita (por ejemplo, secreción, presentación de antígeno, etc.=; y presentación que facilita para células B y/o células T. Los polipéptidos descritos aquí se pueden hacer recombinantemente, sintéticamente, purificados de fuentes naturales, o en cultivo de tejido. Un "fragmento" como se usa aquí se refiere a un péptido que consiste de solamente una parte de la proteína de longitud completa intacta y estructura como se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, un fragmento puede incluir una eliminación C-terminal y/o una eliminación N-terminal de una proteína. Comúnmente, el fragmento retiene uno, alguna o todas las funciones de la secuencia de polipéptido de longitud completa de la cual se deriva. Comúnmente, un fragmento comprenderá por lo menos 5 residuos de aminoácido consecutivos de la proteína nativa; preferiblemente, por lo menos alrededor de 8 residuos de aminoácido consecutivos; más preferiblemente, por lo menos alrededor de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ó 30 residuos de aminoácido consecutivos de la proteína nativa. El término "polinucleótido", como se conoce en la técnica, generalmente se refiere a una molécula de ácido nucleico. Un "polinucleótido" puede incluir tanto secuencia de hebra doble como sencilla y se refiere, pero no se limita a, secuencias procarióticas, ARNm eucariótico, ADNc de viral, ARNm procariótico o eucariótico, secuencias de ARN y ADN genómico de viral (por ejemplo, virus y retrovirus de ARN y AD?), ADN procariótico o AD? eucariótico (por ejemplo, mamífero), y secuencias de AD? especialmente sintéticas. El término también captura secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de base conocidos de AD? y AR?, e incluye modificaciones tales como eliminaciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservadoras en naturaleza) , para la secuencia nativa. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis dirigida a sitio, o pueden ser accidentales, tales como mutaciones a través de hospedadores que incluyen polinucleótidos que codifican prión. Las modificaciones de los polinucleótidos pueden tener cualquier número de efectos que incluyen, por ejemplo, facilitar la expresión del producto de polipéptido en una célula hospedadora. Un polinucleótido puede codificar una proteína o polipéptido biológicamente activo (por ejemplo, inmunogénico o terapéutico) . Dependiendo de la naturaleza del polipéptido codificado por el polinucleótido, un polinucleótido puede incluir como mínimo 10 nucleótidos, por ejemplo, donde el polinucleótido codifica un antígeno o epítopo. Comúnmente, el polinucleótido codifica péptidos de por lo menos 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 ó aún más aminoácidos. Una "secuencia que codifica un polinucleótido" o una secuencia que "codifica" un polipéptido seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se pone bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas (o "elementos de control"). Los límites de la secuencia de codificación se determinan por un codón de inicio en la terminación 5' (amino) y un codón de detención de translación la terminación 3' (carboxi) . Una secuencia de terminación de transcripción se puede localizar 3' a la secuencia de codificación. Comúnmente "elementos de control", incluye, pero no se limita a, reguladores de transcripción, tales como promotores, elementos mejoradotes de transcripción, señales de terminación de transcripción, y secuencias de poliadenilación; y reguladores de traducción, tales como secuencias para optimización de iniciación de traducción, por ejemplo, secuencias de Shine-Dalgarno (sitio de enlace de ribosoma) , secuencias de kozak (esto es, secuencias para optimización de traducción, localizada, por ejemplo, 5' a la secuencia de codificación) , secuencias líderes (heterólogas o nativas) , codón de iniciación de traducción (por ejemplo, ATG) , y secuencias de terminación de traducción. Los promotores pueden incluir promotores inducibles (donde la expresión de una secuencia de polinucleótido ligada operablemente al promotor se induce por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), promotores represibles (donde la expresión de una secuencia de polinucleótido ligada operablemente al promotor se induce por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), y los promotores constitutivos. "Enlazado Operativamente" se refiera a un arreglo de elementos en donde los componentes así descritos están configurados como para realizar su función usual. Así, un promotor dado enlazado operativamente a una secuencia de codificación es capaz de efectuar la expresión de la secuencia de codificación cuando las enzimas propias están presentes . El promotor necesita no estar contiguo con la secuencia de codificación, tanto como este funcione para dirigir la expresión de este. Así, por ejemplo, las secuencias transcritas todavía no traducidas que intervienen pueden estar presentes entre la secuencia del promotor y la secuencia de codificación y la secuencia del promotor todavía puede ser considerada "ligada operativamente" a la secuencia de codificación. Una molécula de ácido nucleico "recombinante" como se usa aquí para describir una molécula de ácido nucleico significa un polinucleótido de origen genómico, ADNc, semi sintético o sintético el cual, por virtud de su origen o manipulación : (1) no está asociado con todo o una porción del polinucleótido con el cual este se asocia en la naturaleza; y/o (2) está enlazado a un polinucleótido diferente que al cual este está enlazado en la naturaleza. El término "recombinante" como se usa con respecto a una proteína o polipéptido significa un polipéptido producido por expresión de un polinucleótido recombinante. "Células hospedadoras recombinantes" , "células hospedadoras" , "células", "líneas de células", "cultivos de células", y otros términos que denotan microorganismos procarióticos o líneas de células eucarióticas cultivadas como entidades unicelulares, se usan intercambiablemente, y se refieren a células que pueden ser, o han sido, usadas como recipientes para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia, e incluyen la progenie de la célula original la cual ha sido transfectada. Se entiende que la progenie de una célula de los precursores única no necesariamente es completamente idéntica en morfología o en complemento genómico o ADN total al precursor original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula de los precursores que es suficientemente similar al precursor a ser caracterizado por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótido que codifica un péptido deseado, está incluida en la progenie propuesta por esta definición, y están cubiertas por los términos anteriores . Por "aislado" significa, cuando se refiere a un polinucleótido o un polipéptido, que la molécula indicada está separada y discreta del organismo completo con el cual la molécula se encuentra en la naturaleza o, cuando el polinucleótido o polipéptido no se encuentra en ' la naturaleza, está suficientemente libre de otras macromoléculas biológicas tales que el polinucleótido o polipéptido puedan ser usados para su propósito proyectado. "Anticuerpo" como se conoce en la técnica incluye una o < más porciones biológicas que, a través de medios químicos o físicos, pueden enlazar o asociarse con un epítopo de un polipéptido de interés. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden interactuar preferentemente con (por ejemplo, enlazar específicamente a) conformaciones de prión patogénico. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos obtenidos de ambas preparaciones policlonal y monoclonal, además de lo siguiente: moléculas de anticuerpo híbridas (quiméricas) (ver, por ejemplo, Winter y colaboradores, (1991) Nature 349:293-299; y la Patente de EUA No. 4,816,567; fragmentos F(ab')2 y F(ab); moléculas Fv (heterodímeros no covalentes, ver, por ejemplo, Invar. y colaboradores, (1972) Proc. Nati . Acad. Sci EUA 69:2656-2662; y Ehrüch y colaboradores, (1980) Biochem 19: 4091-4093); moléculas de cadena Fv única (sFv) (ver por ejemplo, Huston y colaboradores, (1988) Proc. Nati . Acad. Sci EUA 85:5897-5883) ; constructos de fragmento de anticuerpo diméricos y triméricos; minicuerpos (ver por ejemplo, Pack y colaboradores, (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumbre y colaboradores, (1992) J Immunology 149B: 120-126) ; moléculas de anticuerpo humanizadas (ver, por ejemplo, Riechmann y colaboradores, (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan y colaboradores, (1988) Science 239:1534-1536; y Publicación de Patente U. K. No. GB 2,276,169, publicada en septiembre 21 de 1994) ; y, cualquiera de los fragmentos funcionales obtenidos de las moléculas, en donde los fragmentos retienen propiedades de enlace inmunológicas de la molécula de anticuerpo madre . El término "anticuerpo" además incluye anticuerpos obtenidos a través de procesos no convencionales, tales como despliegue de fagos. Como se usa aquí, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpo que tiene una población de anticuerpo homogénea. El término no está limitado a considerar las especies o fuentes del anticuerpo, ni está proyectado para ser limitado por la manera en la cual se hace. Así, el término abarca anticuerpos obtenidos de hibridomas de murino, además de anticuerpos monoclonales humanos obtenidos usando hibridomas humanos mejor que murinos. Ver, por ejemplo, Cote, y colaboradores, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, 1985, p 77. Si se desean anticuerpos policlonales, generalmente se inmuniza un mamífero seleccionado (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) con una composición inmunogénica (por ejemplo, un reactivo de péptidos como se describió aquí) . El suero del animal inmunizado se recolecta y trata de acuerdo a procedimientos conocidos. Si el suero que contiene anticuerpos policlonales para el reactivo de péptidos seleccionado contiene anticuerpos para otros antígenos, los anticuerpos policlonales se pueden purificar por cromatografía de inmunoafinidad. Las técnicas para producción y procesamiento policlonal antisuero se conocen en la técnica, ver por ejemplo, Mayer and Walter, eds. (1987) IMMUNOCHEMICAL METHODS I? CELL A D MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London) . Un experto en la técnica también puede producir fácilmente anticuerpos monoclonales dirigidos contra reactivos de péptido descritos aquí . La metodología general para producir anticuerpos monoclonales por hibridomas es bien conocida. Las líneas de células que producen anticuerpo inmortal se pueden crear por fusión de células, y también por otras técnicas tales como transformación directa de linfocitos B con AD? orgánico, o transfección con virus Epstein Barr. Ver, por ejemplo, M. Schreier y colaboradores, (1980) HYBRIDOMA TECH IQUES; Hammerüng y colaboradores, (1981) , MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HIBRIDOMAS; Kennett y colaboradores, (1980) MONOCLONAL ANTIBODIES; ver también las Patentes de EUA Nos. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; y 4,493,890. Como se usa aquí, un "anticuerpo de dominio único" (dAb) es un anticuerpo que está comprendido de un dominio VH, el cual enlaza específicamente con un antígeno designado. Un dAb no contiene un dominio VL, pero puede contener otro antígeno que enlaza dominios conocidos para existir a anticuerpos, por ejemplo, los dominios kappa y lambda. Los métodos para preparación de dab se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Ward y colaboradores, Nature 341:544 (1989) . Los anticuerpos también se pueden componer de dominios VH y VL, además de otros dominios de enlace de antígeno conocidos. En la técnica se conocen ejemplos de estos tipos de anticuerpos y métodos para su preparación (ver por ejemplo, la Patente de EUA No. 4,816,467, la cual está incorporada aquí por referencia), e incluyen lo siguiente. Por ejemplo, "anticuerpos de vertebrados" se refiere a anticuerpos que son tetrámeros o agregados de estos, que comprenden cadenas ligera o pesadas las cuales usualmente están agregadas en una configuración "Y" y las cuales pueden o tener no ligaduras covalentes entre las cadenas . En anticuerpos vertebrados, las secuencias de aminoácido de las cadenas son homologas con aquellas secuencias encontradas en anticuerpos producidos en vertebrados, ya sea' in situ o in vitro (por ejemplo, en hibridomas) . Los anticuerpos de vertebrados incluyen, por ejemplo, anticuerpos 'policlonales purificados y anticuerpos monoclonales, lo métodos para la preparación de los cuales se describen infra. "Anticuerpos híbridos" son anticuerpos donde las cadenas son separadamente homologas con referencia a cadenas de anticuerpos de mamíferos y representan ensambles novedosos de ellos, tal que dos antígenos diferentes se precipitan por el tetrámero o agregado. En anticuerpos híbridos, un paro de cadenas pesadas y ligeras son homólogos a aquellos encontrados en un anticuerpo provocado contra un primer antígeno, mientras que un segundo par de cadenas son homologas a aquellas encontradas en un anticuerpo provocado contra un segundo anticuerpo. Esto resulta en la propiedad de "bivalencia", esto es, la capacidad para enlazar dos antígenos simultáneamente. Los híbridos también se pueden formar usando cadenas quiméricas, como se establece a continuación. "Anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos en los cuales las cadenas pesadas y/o ligeras son proteínas de fusión. Comúnmente, una porción de las secuencias de aminoácido de la cadena es homologa a secuencias que corresponden en un anticuerpo derivado de una especie particular o una clase particular, mientras que el segmento que permanece de la cadena es homólogo a las secuencias derivadas de otra especie y/o clase. Usualmente, la región variable de ambas cadenas ligera y pesada imita las regiones variables o anticuerpos derivados de una especie de vertebrados, mientras que las porciones constantes son homologas a las secuencias en los anticuerpos derivados de otra especie de vertebrados. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo particular. También está incluido cualquier anticuerpo en el cual cualquiera o ambas de las cadenas ligera o pesada están compuestas de combinaciones de secuencias que imitan las secuencias en anticuerpos de fuentes diferentes, si estas fuentes son de clases que difieren o especies diferentes de origen, y si el punto de fusión está o no en el límite variable/constante. Así, es posible producir anticuerpos en los cuales ni la constante ni la región variable imita secuencias de anticuerpo conocidas . Luego se vuelve posible, por ejemplo, para construir anticuerpos cuya región variable tiene una afinidad específica mayor para un antígeno particular, o cuya región constante puede provocar fijación de complemento mejorado, o hacer otras mejoras en propiedades poseídas por una región constante particular. Otro ejemplo son los "anticuerpos alterados", lo cual se refiere a anticuerpos en los cuales la secuencia de aminoácido que ocurre naturalmente en un anticuerpo de vertebrado ha sido variada. Utilizando técnicas de ADN recombinante, los anticuerpos se pueden rediseñar para obtener características deseadas. Las variaciones posibles son muchas, y el rango de cambio de uno o más aminoácidos al rediseño completo de una región, por ejemplo, la región constante. Los cambrones en la región constante, en general, para conseguir las características de proceso celular deseadas, por ejemplo, cambios en fijación de complemento, interacción con membranas, y otras funciones de efector. Los cambios en la región variable se pueden hacer para alterar las características de enlace del antígeno. El anticuerpo -también se puede diseñar para ayudar al suministro específica de una molécula o sustrato para una célula específica o sitio de tejido. Las alteraciones deseadas se pueden hacer mediante técnicas conocidas en biología molecular, por ejemplo, técnicas recombinantes, mutagénesis dirigida al sitio, etc. Todavía otro ejemplo son "anticuerpos univalentes", los cuales son agregados comprendidos de un enlace de dímero de cadena pesada/cadena ligera a la región Fc (esto es, madre o troncal) de una segunda cadena pesada. Este tipo de anticuerpo escapa modulación antigénica. Ver, por ejemplo, Glennie y colaboradores, Nature 295:712 (1982). Incluido también dentro de la definición de anticuerpos están los fragmentos "Fab" de anticuerpos. La región "Fab" se refiere a aquellas porciones de las cadenas pesada y ligera las cuales son aproximadamente equivalentes, o análogos, a las secuencias que comprende la porción ramificada de las cadenas pesada y ligera, y las cuales han demostrado exhibir enlace inmunológico a un antígeno específico, pero el cual carece de la porción Fc efectora. Los "Fab" incluyen agregados de una cadena pesada y de una cadena ligera (comúnmente conocidos como Fab' ) , además de tetrámeros que contienen las cadenas 2H y 2L (referidas como F(ab)2), las cuales son capaces de reaccionar selectivamente con un antígeno o familia de antígeno designada. Los anticuerpos Fab pueden estar divididos en subconjuntos análogos a aquellos descritos anteriormente, esto es, "Fab vertebrados", "Fab híbridos", "Fab quiméricos" , y "Fab alterados" . Los métodos de producción de fragmentos Fab de anticuerpos son conocidos dentro de la técnica e incluyen, por ejemplo, proteóüsis, y síntesis por técnicas recombinantes. "Complejo de anticuerpo de antígeno" se refiere al complejo formado por un anticuerpo que se enlaza específicamente a un epítopo en un antígeno. Un péptido (o reactivo de péptidos) es el que "interactúa" con otro péptido o proteína si este enlaza específicamente, no específicamente o en alguna combinación de enlace específico y no específico. Un péptido (o reactivo de péptidos) es aquel que "preferentemente interactúa" con una proteína de prión patogénico si esta enlaza con mayor afinidad y/o mayor especificidad a la forma patogénica que a isoformas no patogénicas. Un reactivo de péptidos que interactúa preferentemente con una proteína de prión patogénico también se refiere aquí como un reactivo de péptidos específico de prión patogénico. Se entiende que una reacción preferencial no necesariamente requiere interacción entre residuos de aminoácido específicos y/o porciones de cada péptido. Por ejemplo, en ciertas modalidades, los reactivos de péptido descritos aquí interactúan preferentemente con isoformas patogénicas pero, sin embargo, pueden ser capaces de enlazar isoformas no patogénicas en unible débil, todavía detectable (por ejemplo, 10% o menos del enlace mostrado al polipéptido de interés) . Comúnmente, el enlace débil, o enlace antecedente, se discierne fácilmente de la interacción preferentemente con el compuesto o polipéptido de interés, por ejemplo, mediante el uso de controles apropiados. En general, los péptidos de la invención enlazan priones patogénicos en la presencia de exceso de 106 veces de formas no patogénicas. El término "afinidad" se refiere a la fuerza de enlace y se puede expresar cuantitativamente como una constante de disociación (K_.) . Preferiblemente, un péptido (o reactivo de péptidos) que interactúa preferentemente con una isoforma • patogénica preferentemente interactúa con la isoforma patogénica con por lo menos 2 veces mayor afinidad, más preferiblemente en por lo menos 10 veces mayor afinidad y aún más preferiblemente por lo menos 100 veces mayor afinidad de la que este interactúa con la isoforma no patogénica. La afinidad de enlace (esto es, K_.) se puede determinar usando técnicas estándar. Las técnicas para determinación de "similitud" o "porcentaje de identidad" de secuencia de aminoácido son bien conocidas en la técnica. En general "similitud" significa la comparación de aminoácido a aminoácido de dos o más polipéptidos en el lugar apropiado, donde los aminoácidos son _ idénticos o poseen propiedades químicas y/o físicas similares tales como carga o hidrofobicidad. Un, así llamado, "porcentaje de identidad" luego puede ser determinado entre las secuencias de polipéptido comparadas . Las técnicas para determinación de identidad de secuencia de ácido nucleico y aminoácido también son bien conocidas en la técnica e incluyen la determinación de la secuencia de nucleótido del ARNm para aquel gen (usualmente vía un AD?c intermedio) y determinación de la secuencia de aminoácido codificada de esa manera, y comparando esta a una segunda secuencia de aminoácido. En general, "identidad" se refiere a una correspondencia de nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido exacta de dos polinucleótidos o secuencias de polipéptido, respectivamente. Dos o más secuencias de aminoácidos o polinucleótidos pueden ser comparadas por determinación de su "porcentaje de identidad". El porcentaje de identidad se puede determinar por una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas (la secuencia de referencia y una secuencia con % de identidad desconocido a la secuencia de referencia) por alineación de secuencias, contando el número exacto de coincidencias entre las dos secuencias alineadas, dividido por la longitud de la secuencia de referencia y multiplicando el resultado por 100. Los programas de cómputo fácilmente disponibles se pueden usar para ayudar en el análisis, tal como ALIGN, Dayhoff, M. O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M. 0. Dayhoff ec, 5 Suppl. 3:353-358, Nacional Biomedical Research Foundation, Washington, DC, el cual adapta el algoritmo de homología local de Smith and Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 para análisis de péptido. Los programas para determinación de identidad de secuencia de nucleótido están disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, Wl) por ejemplo, los programas BESTIFIT, FASTA y GAP, los cuales también dependen del algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas se utilizan fácilmente con los parámetros implícitos recomendados por el fabricante y descritos en el Wisconsin Sequence Analysis Package referido anteriormente. por ejemplo, el porcentaje de identidad de una secuencia de nucleótido particular a una secuencia de referencia se puede determinar usando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de puntuación implícita y una penalidad de intervalo de seis posiciones de nucleótido. Otro método de establecimiento del porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es usar el paquete MPSRCH™ de programas registrados por la Universidad de Edimburgo, desarrollados por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y disponible de numerosas fuentes, por ejemplo en el Internet. De este juego de paquetes el algoritmo de Smith- - Waterman se puede emplear donde los parámetros implícitos se usan para la tabla de puntuación (por ejemplo, la penalidad abierta de intervalo de 12, la penalidad de extensión de intervalo de uno, y un intervalo de seis) . De los datos generados el valor de "Coincidencia" refleja la "identidad de secuencia" . Otros programas apropiados para calcular el porcentaje de identidad o la similitud entre secuencias son generalmente conocidos en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, usado con parámetros implícitos. Por ejemplo, BLASTIN y ALBSP se pueden usar con los parámetros implícitos siguientes: código genético = estándar; filtro = ninguno; estándar = ambos; corte = 60; espera = 10; Matrix = BL0SUM62 ; Descripciones = 50 secuencias; sorteo por = HIGH SCORE; Bases de datos = no redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS traslaciones + proteína Swiss + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas están disponibles fácilmente. Una "composición inmunogénica" como se usa aquí se refiere a cualquier composición (por ejemplo, péptido, anticuerpo y/o polinucleótidos) donde la administración de la composición a un sujeto resulta en el desarrollo en el sujeto de un humoral y/o respuesta inmune celular. La composición inmunogénica se puede introducir directamente en un sujeto receptor, tal como por inyección, inhalación, oral, intranasal o de cualquier otra ruta de administración parenteral o mucosal (por ejemplo, intrarectalmente o intravaginalmente) . Por "epítopo" se significa un sitio en un antígeno al cual las células B y/o las células T específicas responden, volviendo a hacer la molécula que incluye un epítopo tal capaz de provocar una reacción inmunológica o capaz de reaccionar con anticuerpos presentes en una muestra biológica. El término también se usa intercambiablemente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico" . Un epítopo puede comprender 3 o más aminoácidos en una conformación espacial única al epítopo. Generalmente, un epítopo consiste de por lo menos 5 aminoácidos y, más usualmente, consiste de por lo menos 8-10 aminoácidos. Los métodos de determinación de conformación espacial de aminoácidos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear bidimensional. Además, la identificación de epítopos en una proteína dada se logra fácilmente usando técnicas bien conocidas en la técnica, así como por el uso de estudios hidrofóbicos y por serología dirigida a sitio. Ver, también, Geysen y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci EUA (1984) 81:3998-4002 (método general para sintetizar rápidamente péptidos para determinar la localización de epítopos inmunogénicos en un antígeno dado) ; la Patente de EUA No. 4,708,871 (procedimientos para identificar y sintetizar químicamente epítopos de antígenos) ; y Geysen y colaboradores, Molecular Immunology (1986) 23:709-715 (técnica para identificación de péptido con alta afinidad para un anticuerpo dado) . Anticuerpos que reconocen el mismo péptido pueden ser identificados en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear el enlace de otro anticuerpo a un antígeno de dirección. Una "respuesta inmunológica" o "respuesta inmune" como se usó aquí es el desarrollo en el sujeto de una respuesta humoral y/o una inmune celular a un péptido .como se describe aquí cuando el polipéptido está presente en una composición ' de vacuna. Estos anticuerpos también pueden neutralizar infectivamente, y/o mediar anticuerpo-complemento o anticuerpo dependiente de la citotoxicidad de la célula para proporcionar protección a un hospedador inmunizado. La reactividad inmunológica se puede determinar en inmunoensayos estándar, tal como ensayos de competencia, bien conocidos en la técnica. "Transferencia de genes" o "suministro de genes" se refiera a métodos o sistemas para insertar fácilmente ADN de interés en una célula hospedadora. Los métodos pueden resultar en expresión transitoria de ADN transferido no integrado, replicación extracromosomal y expresión de replicones transferidos (por ejemplo, epitomas) , o integración de material genético transferido en el ADN genómico de las células hospedadoras. Los vectores de expresión de suministro de gen incluyen, pero no se limitan a, vectores derivados de alfavirus, virus de varicela, virus de vacuna. Cuando se usa para inmunización, los vectores de expresión de suministro de gen pueden ser referidos como vacunas o vectores de vacuna. El término "muestra" incluye muestras biológicas y no biológicas . Las muestras biológicas son aquellas obtenidas o derivadas de un organismo vivo o que vivió. La muestras no biológicas son no derivadas de organismos vivos o que vivieron alguna vez. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, muestras derivadas de un animal (vivo o muestro) tal como órganos (por ejemplo, cerebro, hígado, riñon, etc.) sangre completa, fracciones de sangre, plasma, fluido cerebroespinal (CSF), orina, lágrimas, tejido, órganos, biopsias. Ejemplos de muestras no biológicas incluyen farmacéuticos, alimentos, cosméticos y similares. El término "etiqueta" y "etiqueta detectable" se refiere a una molécula capaz de detección, que incluye, pero no se limita a, isótopos radioactivos, fluorescentes, luminescentes, quimioluminiscentes, enzimas, sustratos de enzima, cofactores de enzima, inhibidores de enzima, cromóforos, colorantes, iones de metal, soles de metal, ligandos (por ejemplo, biotina o haptenos) y similares. El término "fluorescente" se refiere a una sustancia o porción de esta que es capaz de exhibir fluorescencia en el rango detectable. Ejemplos particulares de etiquetas que se pueden usar con la invención incluyen, pero no se limitan a fluoresceína, rodamina, dansil, umbeüforona, rojo de Texas, luminol, esteres de acradimum, NADPH, beta-galactosidasa, peroxidasa de raíz de rábano, oxidasa de glucosa, fosfatasa alcalina y ureasa. La etiqueta también puede ser una etiqueta de epítopo (por ejemplo, una etiqueta His-His) , un anticuepro o un oligonucleótido ampüficable o de otra manera detectable.

II. Resumen general Aquí están descritas composiciones que comprenden un reactivo de péptidos (y/o polinucleótidos que codifican estos reactivos de péptido) en los cuales el reactivo de péptido es capaz de distinguir entre isoformas patogénicas y no patogénicas de proteínas de prión, por ejemplo por interacción preferentemente con una forma y no la otra. También se proporcionan los anticuerpos generados que usan estos reactivos de péptido además de las composiciones que comprenden y los métodos de producción y uso de estos reactivos de péptido y/o anticuerpos (por ejemplo, para aislamiento y/o detección de la proteína de prión patogénico) . La invención depende en parte del descubrimiento por los inventores presentes de que los fragmentos relativamente pequeños de una proteína de prión pueden interactuar preferentemente con la forma patogénica del prión. Estos fragmentos necesitan ser parte de una estructura de proteína larga u otro tipo de molécula andamio con el propósito de exhibir esta interacción preferencial con la isoforma de prión patogénico. Mientras que no espera a ser soportada por cualquier teoría particular, se hace' palpable que los fragmentos de péptido espontáneamente toman una conformación que permite el enlace a isoforma de prión patogénico pero no a la isoforma de prión no patogénico, posiblemente por imitación de una conformación que está presente en las isoformas no patogénicas. Este principio general, de que ciertos fragmentos de una proteína de enfermedad conformacional interactúan preferentemente con la forma patogénica de aquella proteína de enfermedad conformacional, aquí demostrado para priones, puede fácilmente ser aplicada a otras proteínas de enfermedad conformacional para producir reactivos de péptido que interactúan preferentemente con las formas patogénicas. Será palpable para un experto en la técnica que, mientras los fragmentos proporcionan un punto de inicio (en términos de tamaño o características de la secuencia, por ejemplo) , que muchas modificaciones se pueden hacer en los fragmentos para producir reactivos de péptido con más atributos deseables (por ejemplo, afinidad más alta, estabilidad mayor, solubilidad mayor, menos sensibilidad a la proteasa, especificidad mayor, más fácil de sintetizar, etc.). En general, los reactivos de péptido descritos aquí son capaces de interactuar preferentemente con formas patogénicas de proteínas de prión. Así, estos reactivos de péptido se permiten para la detección fácil de la presencia de proteínas de prión patogénico y, de ahí, el diagnóstico de enfermedades relacionadas con prión en virtualmenté cualquier muestra, biológica o no biológica, incluyendo cerebro, médula espinal, u otros tejidos del sistema nervioso vivos o muertos además de sangre . Además, los reactivos de péptido descritos aquí se pueden usar para generar anticuerpos que se pueden usar en composiciones y métodos de diagnóstico o terapéuticos . En particular, donde un reactivo de péptidos y/o anticuerpo interactúa preferentemente con una proteína patogénica, este se puede usar para detectar la presencia de isoformas patogénicas, por ejemplo por ordenación, agregado u otra manera de inducción de la enfermedad de proteínas a un estado que puede luego ser detectado. Los reactivos de péptido descritos aquí son útiles en una variedad de ensayos de diagnóstico, que incluyen detectar formas patogénicas en muestras que contienen sangre. Lo-s anticuerpos y/o reactivos de péptido (o uno o más de sus partes componentes) pueden ser etiquetados o marcados para facilitar la detección y/o mejorar la interacción con las proteínas de prión. Además, cualquier sistema de amplificación de señal apropiado se puede usar para facilitar más la detección, incluyendo pero no limitados a, el uso de ADN ramificado para amplificación de señal (ver, por ejemplo, las Patentes de EUA Nos. 5,681,697; 5,424,413; 5,451,503; 5,4547,025; y 6,235,483); aplicación de técnicas de amplificación dirigida como PCR, amplificación de círculo que rueda, invasor de Third Wave (Arruda y colaboradores, 2002 Expert. Rev. Mol. Diagn. 2:487; las Patentes de EUA Nos. 6090606, 5843669, 5985557, 6090546, 5846717), NASBA, TMA etc. (Patente de EUA No. 6,511,809; EP 0544212a!); y/o técnicas de inmuno PCR (ver, por ejemplo, la Patente de EUA No. 5,665,539; Publicaciones Internacionales WO 98/23962; WO 00/75663; y WO 01/31056). Además, los reactivos de péptido y anticuerpos descritos aquí se pueden usar solos o en cualquier combinación, para tratar o prevenir enfermedad.

III. . Reactivos de péptido Aquí están descritos reactivos de péptido que interactúan con formas patogénicas de una proteína de enfermedad conformacional. Las proteínas de enfermedad conformacional se ejemplifican aquí por proteínas de prión. La siguiente es una lista sin limitación de enfermedades con proteínas asociadas que sumen dos o más conformaciones diferentes.

Además, las proteínas de la enfermedad conformacional antes listada cada una incluye diversas variantes o mutaciones que resultan en diferentes cepas que todas se abarcan por la presente invención. El análisis funcional de diversas regiones y secuencias de proteína de prión de ratón se dan a continuación. Ver, también Priola (2001) Adv. Protein Chem. 57: 1-27. Las regiones y residuos que corresponden a aquellas abajo establecidas para ratón (Mo) , hámster (Ha) , humano (Hu) , aves (A) y ovejas (Sh) se pueden determinar fácilmente para otras especies siguiendo los procedimiento estándar y las enseñanzas en el presente.

Se debe también observar que las proteínas de prión (y otras proteínas de enfermedad conformacional) tienen dos conformaciones diferentes tridimensionales con la misma secuencia de aminoácidos . Una conformación se asocia con las características de enfermedad y es generalmente insoluble mientras que la otra conformación no se asocia con las características de enfermedad y es soluble. Ver, por ejemplo, Wille, et al., "Structural Studies of the Scrapie Prión Protein by Electron Crystallography" , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 99 (6) : 3563-3568 (2002) . Aunque se ejemplifica con respecto a las proteínas de prión, la presente invención no se limita a las enfermedades, proteínas y cepas enlistadas. Así, en ciertos aspectos, los reactivos de péptidos aquí descritos comprenden una secuencia de aminoácidos derivada de una proteína que se presenta naturalmente, por ejemplo una proteína de enfermedad conformacional (por ejemplo, proteína de prión) o una proteína que contienes porciones o secuencias que muestran homología con las proteínas de prión. En particular, los reactivos de péptidos de la invención se derivan típicamente a partir de una proteína de prión que se presenta naturalmente. Los reactivos de péptidos se derivan preferentemente de las secuencias de aminoácidos a partir de ciertas regiones de las proteínas de prión. Estas regiones preferidas se ejemplifican con respecto a la secuencia de prión del ratón (SEQ ID NO: 2), en regiones desde el residuo de aminoácido 23-43 y 85-156 y subregiones de los mismos. La invención no se limita a reactivos de péptidos derivados de secuencias de ratón pero incluyen reactivos de péptidos derivados en una forma similar como se describen en la presente, a partir de secuencias de prión de cualquier especie incluyendo humano, bovino, ovejas, venado, alce, hámster, cuando se deriva de proteína de prión, los reactivos de péptidos aquí descritos puede incluir un motivo de hélice del tipo II de la poliprolina. Este motivo contiene típicamente la secuencia general PxxP (por ejemplo, los residuos 102-105 de SEQ ID NO:l), aunque otras secuencias, en particular los tetrapéptidos de alanina, se han sugerido para forma hélices del tipo II de poliprolina también (ver por ejemplo, Nguyen et al. Chem Bio. 2000 7:463; ?guyen et al. Science 1998 282; 2088; Schweitze-Stenner et al., J. Am. Chem. Soc. 2004 126:2768). En la secuencia de PxxP "x" puede ser cualquier aminoácido y "P" es la prolina en la secuencia que se presenta naturalmente pero se puede reemplazar por un substituto de prolina en los reactivos de péptidos de la invención. Tales substitutos de prolina incluyen glicinas N-substituidas referidas comúnmente como peptoides. Así, en los reactivos de péptidos de la invención que incluyen una hélice de tipo II de poliprolina con base en la secuencia PxxP, "P" representa una prolina o residuos de glicina ? substituidos y "x" representa cualquier aminoácido o análogo de aminoácido. Se prefieren particularmente las glicinas N-substituidas aquí descritas . Además, la secuencia de polinucleótidos y aminoácidos para las proteínas de prión producidas por muchas especies diferentes se conocen, incluyendo humanos, ratón, oveja y ganado. También existen las variantes para estas secuencias dentro de cada especie. Así, los reactivos de péptidos usados en la invención pueden comprender fragmentos o derivados de las secuencias de aminoácidos de cualquier especie o variante. Por ejemplo, en ciertas modalidades, los reactivos de péptidos aquí descritos se derivan a partir de cualquiera de las secuencias establecidas en la figura 2 (SEQ ID NO : 3-11) . Las secuencias de los reactivos de péptido que se describen específicamente en la presente se basan en general en la secuencia del prión de ratón, sin embargo, alguien experto en la técnica puede substituir fácilmente las secuencias correspondientes a partir de otras especies cuando sea adecuada. Por ejemplo, si se desean diagnósticos o terapéuticos humanos, el reemplazo de las secuencias de ratón con aquellas de las secuencias humanas correspondientes se puede hacer fácilmente. En un ejemplo particular, en reactivos de péptidos derivados de la región desde alrededor del residuo 85 hasta alrededor del residuo 112 (por ejemplo, SEQ ID NO : 35, 36, 37, 40) , la leucina en la posición que corresponde al residuo 109 se puede reemplazar con una metionina, la valina en la posición correspondiente al residuo 112 se puede reemplazar con metionina y la asparagina en la posición correspondiente 97 se puede reemplazar con serina. Similarmente, si se desea un diagnóstico de bovino, las substituciones adecuadas se pueden hacer en las secuencias de péptido descritas para reflejar la secuencia de prión de bovino. Así, al continuar con el ejemplo anterior para los reactivos de péptidos derivados en la región de desde alrededor del residuo 85 a alrededor del residuo 112, la leucina en la posición que corresponde al residuo 109 se puede reemplazar con una metionina y la asparagina en la posición correspondiente a 97 se puede reemplazar con glicina. Los derivados de la proteína de prión incluyendo reemplazos de aminoácidos, eliminaciones, adiciones y otras mutaciones para estas adiciones se pueden usar. Preferentemente, algunos reemplazos de aminoácidos, adiciones y eliminaciones en comparación con una secuencia de proteína de prión no afectan la capacidad del reactivo de péptidos para interactuar con la forma patogénica. Se deberá entender que no importa cual fuente se use para los reactivos de péptidos aquí descritos, estos reactivos de péptido no necesariamente mostrarán identidad de secuencia con las proteínas de prión conocidas. Así, los reactivos de péptido aquí descritos pueden incluir uno o más reemplazos de aminoácidos, adiciones o eliminaciones con la relación a la proteína de prión que se presenta naturalmente o a las secuencias aquí descritas, con tal de que conserven la capacidad para interactuar preferentemente con las formas patogénicas de las proteínas de la enfermedad conformacional.

En ciertas modalidades, se prefieren conservadores de aminoácidos . Los reemplazos conservadores de aminoácidos son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que se relacionan en sus cadenas laterales . Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) no polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano y (4) polares sin carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptofano y la tirosina se clasifican algunas veces de manera conjunta como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonablemente predecible que un reemplazo aislado de una leucina con una valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo conservados similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente no tendrá un efecto importante en la actividad biológica. También será evidente que cualquier combinación de los aminoácidos naturales o análogos de aminoácidos no naturales se pueda usar para hacer los reactivos de péptidos aquí descritos. Los análogos de aminoácidos comúnmente encontrados que no se codifican por genes incluyen pero no se limitan a ornitina (Orn) ; ácido aminoisobutírico (Aib) ; benzotiofenilalanina (BtPhe) ; albizziina (Abz) ; T-butügücina (Tle) ; fenilgücina (PhG) ; ciclohexilalanina (Cha) ; norleucina (Nle) ; 2-naftilalanina ( 2 -Nal ) ; 1-naftalalanina ( I-Nal) ; 2-tienilalanina (2-Thi); ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinoün-3 -carboxílico (Tic) ; ?-metilisoleucina (N-Melle ) ; homoargínina (Har) ; ? -metilarginina (?-MeArg) ; fosfotirosina (pTyr o pY) ; ácido pipecolinico (Pip) ; 4-clorofenilalanina (4-ClPhe) ; 4-fluorofenilalanina (4-Fphe) ; ácido 1-aminociclopropancarbíxlico (1-?CPC) ; y sarcosina (Sar) . Cualquiera de los aminoácidos usados en los reactivos de péptidos de la presente invención pueden ser el isómero D o más típicamente el isómero L. Otros análogos que se presentan naturalmente de los aminoácidos que se pueden usar para formar los reactivos de péptidos aquí descritos incluyen compuestos peptoides y/o péptidos miméticos tales como los análogos del ácidos borónico y sulfónico de aminoácidos que son equivalentes biológicamente funcionales que son útiles en los compuestos de la presente invención e incluyen compuestos que tienen una o más ligaduras amida reemplazadas opcionalmente por un isostero. En el contexto de la presente invención, por ejemplo, --CO?H— se puede reemplazar por -CH2?H-, -?HCO- , S02?H-, -CH20-, -CH2CH2-, -CH2S-, -CH2SO-, -CH-CH- (cis o trans), -C0CH2-, -CH(OH)CH2- y tetrazol 1, 5-disubstituido tal que los radicales enlazados por estos isosteros ayudarían en orientaciones similares a los radicales enlazados por -CONH-. Uno o más de los residuos en los reactivos de péptidos aquí descritos pueden comprender peptoides . Así, los reactivos de péptidos también pueden comprender uno o más de residuos de glicina N substituidos (péptidos que tienen uno o más residuos de glicina N-substituidos se pueden referir como peptoides) . Por ejemplo, en ciertas modalidades, uno o más residuos de prolina de cualquiera de los reactivos de péptido aquí se reemplazan con residuos de glicina N substituidos . Las glicinas particulares N substituidas que son adecuadas en este respecto incluyen pero no se limitan a N- (S) - (1-feniletil) glicina; N- (4-hidroxifenil) glicina; N- (ciclopropilmetil) glicina; N- (isopropil) glicina; N-(3,5-dimetoxibencil) glicina y N-butilglicina (por ejemplo, la figura 3) . Otras glicinas N substituidas también pueden ser adecuadas para reemplazar uno o más residuos de aminoácidos en las secuencias de reactivos de péptidos aquí descritas . Para una revisión general de estos y otros análogos de aminoácidos y péptidos miméticos, ver, Nguyen et al. (2000) Chem Biol. 7(7): 463-473; Spatola, A. F., in Chemistry and Biochemistry of amino Acids., Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983). Ver también Spatola, A. F., Peptide Backbone Modifications (revisión general), Vega Data, Vol. 1, Número 3, (Marzo 1983) ; Morley, Trends Pharm Sci (revisión general) , pp. 463-468 (1980); Hudson, D. Et al., Int J Pept Prot Res, 14: 177-185 (1979) (--CH2NH-, CH2CH2) ; Spatola et al., Life Sci, 38: 1243-1249 (1986) (-CH2-S) ; Hann J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 307-314 (1982) (-CH-CH, cis y trans); Almquist et al., J Med Chem., 23: 1392-1398 (1980) (-COCH2-) ; Jennings-White et al., Tetrahedron Lett, 23: 2533 (1982) (-COCH2-) ;Szelke et al., European Appln. EP 45665 CA: 97: 39405 (1982) (-CH (OH) CH2-) ; Holladay et al., Tetrahedron Lett, 24: 4401-4404 (1983) (-C(OH)CH2-); y Hruby, Life Sci, 31: 189-199 (1982) (-CH2-S-) ; cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia. El ácido carboxílico en la terminal C se puede reemplazar por un ácido borónico -B (OH) 2 o un éster borónico -B (OR) u otros de tales derivados del ácidos borónico como se describen en la patente de E.U.A. No. 5,288,707, incorporada en la presente como referencia. Los reactivos de péptidos aquí descritos pueden comprender monómeros, multímeros, moléculas ciclizadas, moléculas ramificadas, enlazadores y similares. Los multímeros (esto es, dímeros, trímeros y similares) de cualquiera de las secuencias aquí descritas o equivalentes biológicamente funcionales de los mismos se contemplan. El multímero puede ser un homomultímero esto es, compuesto de monómeros idénticos, por ejemplo cada monómero es la misma secuencia de péptido. Alternativamente, el multímero puede ser un heteromultímero, por lo cual significa que no todos los monómeros que constituyen el multímero son idénticos . Se pueden formar los multímeros por la unión directa de los monómeros a cada uno de otros o al substrato, incluyendo, por ejemplo, péptidos antígenicos múltiples (MAPS) (por ejemplo, MAPS simétricos), péptidos unidos a andamiajes de polímeros, por ejemplo un andamiaje PEG y/o péptidos enlazados en tándem con o sin unidades espaciadoras . Alternativamente, se puede agregar grupos de enlace a las secuencias monómericas para unir los monómeros juntos y formar un multímero. Los ejemplos no limitativos de multímeros usando grupos de enlace incluyen repeticiones en tándem usando enlazadores de glicina; MAPS unidos por medio de un enlazador a un substrato y/o péptidos enlazados linealmente unidos por enlazadores aun andamiaj e . Los grupos de enlace pueden involucrar el uso de unidades espaciadoras bifuncionales (ya sea homobifuncional o heterobifuncional) como se conocen por alguien experto en la técnica. A manera de ejemplo y no de limitación, muchos métodos para incorporar tales unidades espaciadoras en los péptidos de enlace en conjunto utilizan reactivos tales como succinimidü-4- (p-maleimidometil) ciciohexano-1-carboxilato (SMCC) , succinimidil-4- (p-maleimidofenil) butirato y similares se describen en Pierce Immunotechnology Hanbook (Pierce Chemical Co., Rockville, III.) y también están disponibles de Sigma Chemical Co. (st. Louis, Mo.) y Aldrich chemical Co. (Milwaukee, Wis.) y se describen en "Comprehensive Organics Transformations" , VCK-Verlagsgesellschaft, Weinheim/Germany (1989) . Un ejemplo de un grupo de enlace que se puede usar para ligar secuencias monómericas juntas es -Y?-F-Y2 donde Yi y Y2 son idénticos o diferentes y son grupos alquileno de 0-20, preferiblemente 0-8, más preferiblemente 0-3 átomos de carbono y F es uno o más grupos funcionales tales como -O-, -S-, -S-S-, -C(0)-0-, -NR- , -C(0)-NR-, -NR-C(0)-0-, -NR-C (O) -NR- , -NR-C (S) -NR- , -NR-C(S)-0- . Yi y Y2 pueden ser opcionalmente substituidos con hidroxi, alcoxi, hidroxialquilo, alcoxialquilo, amino, carboxilo, carboxialquilo y similares . También se entenderá que cualquier átomo apropiado del monómero se puede unir al grupo de enlace. Además, los reactivos de péptidos de la invención pueden ser lineales, ramificados o cicüzados. Las unidades de monómeros se pueden cicüzar o se pueden ligar juntas para proporcionar los multímeros en una forma línea o ramificada, en forma de un anillo (por ejemplo, un macrociclo) , en forma de una estrella (dendrímeros) o en forma de una pelota (por ejemplo, fulerenos) . Los técnicos experimentados reconocerán fácilmente una multitud de polímeros que se pueden formar a partir de la secuencia monómericas aquí descritas . En ciertas modalidades, el multímero es un dímero cíclico. Al usar la misma terminología como anteriormente, el dímero puede ser un homodímero o heterodímero. Las formas cíclicas, sean un monómero o multímero, se pueden hacer por cualquiera de los enlaces antes descritos tal como pero no limitada a, por ejemplo: (1) ciclizar la amina en la terminal N con el ácido carboxílico de la terminal C ya sea por medio de la formación de un enlace amida directo entre el nitrógeno y el carbonilo en la terminal C, o por medio de la intermediación del grupo espaciador tal como por ejemplo por la condensación con un ácidos epsilon-amino carboxílico; (2) ciclizar por medio de una formación de un enlace entre las cadenas laterales de dos residuos, por ejemplo, al formar un enlace de amida entre una cadena lateral de aspartato o glutamato y una candela lateral de lisina o por la formación de un enlace de bisulfuro entre dos cadenas laterales de cisteína o entre una cadena lateral de penicilamina y cisteína o entre dos cadenas laterales de penicilamina; (3) ciclizar por medio de la formación de un enlace amida entre una cadena lateral (por ejemplo, aspartato o lisina) y cualquiera de la amina en la termina N o la carboxilo en la termina C respectivamente; y/o (4) ligar dos cadenas laterales por medio de la intermediación del grupo espaciador de carbón corto. Preferiblemente, los reactivos de péptidos aquí descritos no son patogénicos y/o infecciosos. Los reactivos de péptidos de la invención pueden estar en cualquier lugar desde 3 hasta alrededor de 100 de longitud (o cualquier valor entre ellos) o un más largos, preferiblemente alrededor de 4 a 75 residuos (o cualquier valor en el interior) , preferiblemente desde alrededor de 5 a alrededor de 63 residuos (o cualquier valor en el interior) y aun más preferiblemente desde alrededor de 8 a alrededor de 30 residuos (o cualquier valor en el interior) y más preferiblemente el reactivo de péptidos tendrá 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 residuos. Los ejemplos no limitativos de los reactivos de péptido útiles en las composiciones y métodos aquí descritos se derivan de secuencias que se muestran en la tabla 1 y en la tabla 4. Los reactivos de péptidos en las tablas se representan por códigos de aminoácidos convencionales de una letra y se detallan con su terminación N en la izquierda y la terminación C en la derecha. Los aminoácidos en los paréntesis cuadrados indican residuos alternativos que se pueden usar en esa posición en diferentes reactivos de péptidos. Los paréntesis indican los residuos que pueden estar presente o ausentes a partir del reactivo de péptido. Cualquier residuo de prolina se puede substituir con residuos de glicina N substituidos para forma peptoides. Cualquiera de las secuencias en la tablas puede incluir opcionalmente las ligaduras Gly (Gn donde n = 1, 2, 3 ó 4) o la terminal N y/o Secuencia de péptido Tabla 1 SEQID?O KKRPK 12 MANLGCWMLVLFVATWSDLGLC 13 En un aspecto, el reactivo de péptido de la invención incluye cada uno de los péptidos aquí descritos y derivados (como se describen en la presente) de los mismos. La invención así incluye un reactivo de péptidos derivado de un péptido de SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 1120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131 ó 132. La invención preferiblemente incluye un reactivo de péptido derivado de un péptidos de SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 65, 66, 67, 68, 72, 74, 76, 77, 78, 81, 82, 84, 89, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131 ó 132. En ciertas modalidades preferidas, los reactivos de péptidos se enlazan específicamente a priones patogénicos, por ejemplo reactivos de péptidos derivados de los péptidos de SEQ ID NOS: 66 , 61 , 68, 72, 81, 96, 97, 98, 10,7, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 12, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82 u 84 y análogos (por ejemplo, la substitución de una o más prolina con una glicina N substituida) y derivados de los mismos . Como se describe arriba, los reactivos de péptidos aquí descritos pueden incluir una o más substituciones, adiciones y/o mutaciones. Por ejemplo, pueden reemplazar uno o más residuos en los reactivos de péptido con otros residuos por ejemplo residuos de alanina o con un análogo de aminoácido o residuo de glicina N substituido con objeto de hacer un peptoide (ver, por ejemplo Nguyen et al. (2000) Chem Biol. 7(7) :463-473) . Adicionalmente, los reactivos de péptido aquí descritos también pueden incluir componentes adicionales de péptidos y no de péptidos. Los ejemplos no limitativos de componentes de péptidos adicionales incluyen residuos espaciadores por ejemplo dos o más glicinas (naturales o derivadas) en residuos o enlazantes de ácido aminohexanoico en uno o ambos extremos o residuos que pueden ayudar a solubilizar los reactivos de péptidos, por ejemplo residuos ácidos tales como el ácido aspártico (Asp o D) como se detalla para el ejemplo en SEQ ID NOs : 83, 86. En ciertas modalidades por ejemplo, los reactivos de péptidos se sintetizan como péptidos antigénicos múltiples (MAPs) . Típicamente, copias múltiples de los reactivos de péptidos (por ejemplo 2-10 copias) se sintetizan directamente en un portador MAP tal como una lisina ramificada u otro núcleo de un portador MAP. Ver por ejemplo, Wu et al. (2001) J Am Chem Soc. 2001 123 (28): 6778-874; Spetzler et al. (1995) Int J Pept Protein Res. 45(1): 77-85. Los ejemplos no limitativos de los componentes que no son de péptidos (por ejemplo porciones químicas) que se pueden incluir en los reactivos de péptidos aquí descritos incluyen una o más etiquetas detectables, etiquetas (por ejemplo biotina, etiquetas His, oligonucleótidos), colorantes, miembros de un par de enlace, y similares, en cualquier terminación o internos al reactivo de péptido. Los componentes que no son de péptido también se pueden unir (por ejemplo, por medio de unión covalente de una o más etiquetas) directamente o a través de un espaciador (por ejemplo un grupo amida) a posiciones en el compuesto que se predice por los datos de actividad y estructura cuantitativa y/o de modelado molecular para no ser de interferencia. Los reactivos de péptido como se describen en la presente también pueden incluir porciones químicas especificas del prión tal como colorantes específicos aminoüdes (por ejemplo rojo congo, tioflavina, etc.). La derivación (por ejemplo etiquetado, ciclización, unión de porciones químicas, etc.) de los compuestos, no debe interferir substancialmente con (e incluso puede mejorar) las propiedades de enlace, función biológica y/o actividad farmacológica del reactivo de péptidos. Los reactivos de péptidos de la invención tendrán típicamente al menos alrededor de un 50% de identidad de secuencia con los fragmentos de la proteína del prión o las secuencias de péptido aquí establecidas. Preferentemente, los reactivos de péptidos tendrán al menos un 70% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 , 91 , 98, 99 ó 100% de identidad de secuencia para los fragmentos de proteína de prión o las secuencias de péptidos aquí establecidas . Los reactivos de péptidos como se describen en la presente, interactúan preferentemente con las formas patogénicas y de esta manera, son útiles en una amplia variedad de aplicaciones de aislamiento, purificación, detección, diagnostico y terapéuticas. Por ejemplo, en la modalidad en la cual el reactivo de péptidos interactúa preferentemente con formas patogénicas, los reactivos de péptidos mismos se pueden usar para detectar formas patogénicas en una muestra tal como sangre, tejido del sistema nervioso (cerebro, médula espinal, CSF, etc) u otro tejido o muestra de órgano. Los reactivos de péptidos también son útiles para diagnosticar la . presencia de enfermedad asociada con las formas patogénicas, para aislar las formas patogénicas y para descontaminar las muestras al retirar las formas patogénicas . La interacción de los reactivos de péptidos con las proteínas de prión se pueden probar usando con cualquier ensayo de enlace conocido por ejemplo los inmunoensayos estándar tales como ELISA, técnicas de Western blots y similares . Un método conveniente de prueba de la especificidad de los reactivos de péptidos de la presente invención, es seleccionar una muestra que contenga priones tanto patogénicos como no patogénicos. Típico de tales muestras incluyen tejido del cerebro o de la espina dorsal a partir de animales enfermos . Los reactivos de péptidos como se describe en la presente que se enlazan de manera especifica a las formas patogénicas, se unen a un soporte sólido (por métodos bien conocidos en el arte y como se describen además a continuación) y se usan para separar (tirar) el prión patogénico de los otros componentes de la muestra y obtener un valor cuantitativo que se relaciona directamente con el número de interacciones de enlace del prión de péptidos sobre el soporte sólido. Las variaciones y otros ensayos conocidos en el arte también se pueden usar para demostrar la especificidad de los reactivos de péptidos de la invención. Ver por ejemplo, Ejemplos. Aunque no se requiere cuando se usan los reactivos de péptidos aquí descritos, estos ensayos pueden utilizar el hecho de que los priones tienen una conformación patogénica son generalmente resistentes a ciertas proteasas tales como proteinaza K. Las mismas proteasas pueden degradar los priones en una conformación no patogénica. Por lo tanto cuando se usa una proteasa la muestra se puede separar en 2 volúmenes iguales. La proteasa se puede agregar a la segunda muestra y llevarse a cabo la misma muestra. Debido a que la proteasa en la segunda muestra se degradará a algunos priones no patogénicos, algunas interacciones de enlace entre el péptido y el prión en la segunda muestra se pueden atribuir a priones patogénicos . Así, los ejemplos no limitativos de métodos de evaluación de la especificidad de enlace y/o la afinidad de los reactivos de péptidos aquí descritos, incluyen procedimientos estándar Western y Far-Western; péptidos etiquetados; ensayos de tipo ELISA y/o ensayos basados en células. Las técnicas Western blot por ejemplo, emplean típicamente un anticuerpo primario etiquetado que detecta la proteína de prión desnaturalizada a partir de un gel SDS-PAGE sobre las muestras obtenidas para un ensayo de tiro (como se describe en la presente) que ha sido electroteñido sobre nitrocelulosa o PVDF. Los anticuerpos que reconocen la proteína de prión desnaturalizada se han descrito (descritos inter alia, en Peretz et al. 1997 J. Mol. Biol.. 273 : 614; Peretz et al. 2001 Natrue 412: 739; Williamson et al. 1998 J. Virol. 72:9413; Patente de EUA ?o 6,765,088; Patente de EUA ?o. 6,537,548) y algunos están comercialmente disponibles. Se han descrito otras moléculas de enlace al prión por ejemplo polipéptidos híbridos injertados con la porción (ver, WO03/085086) , ciertos polímeros catiónicos o aniónicos (ver WO 03/073106) , ciertos péptidos que son catalizadores de programación (ver, WO 02/0974444) y plasminógenos . El anticuerpo primario luego se detecta (y/o amplifica) con una sonda para la etiqueta (por ejemplo fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina, peroxidasa de raíz de rábano, reactivo ECL y/u oligonucleótidos ampüficables) . También se puede evaluar el enlace usando reactivos de detección * tales como un péptido con una etiqueta de afinidad (por ejemplo, biotina} que se etiqueta y amplifica con una sonda para la etiqueta de afinidad (por ejemplo fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina, peroxidasa de raíz de rábano, reactivo ECL u oligonucleótidos ampüficables) . Además, los procedimientos de la placa de microtitulación similares al ELISA de intercalados se pueden usar por ejemplo, un reactivo de péptidos específico del prión como se describe en la presente se usa para inmovilizar las proteínas del prión en un soporte sólido (por ejemplo el pozo de una placa de microtitulación, perla, etc.) y un reactivo de detección adicional el cual incluiría pero no se limita a otro reactivo de péptidos especifico del prión con una etiqueta de afinidad y/o detección tal como una fosfatasa alcalina conjugada, peroxidasa de raíz de rábano, reactivo ECL u oligonucleótidos amplificables . Los ensayos basados en células también se pueden emplear por ejemplo en donde la proteína del prión se detecta directamente sobre células individuales (por ejemplo usando un reactivo de péptidos especifico del prión etiquetado de manera fluorescente, que permite la selección de células basadas en fluorescencia, conteo o detección de las células etiquetadas específicamente) . III. B. Producción de reactivos de péptidos Los reactivos de péptidos de la presente invención se pueden producir en cualquier número de formas todas las - cuales son bien conocidas en el arte . En una modalidad, en la cual el reactivo de péptido es, por completo o en parte, un péptido codificado genéticamente, el péptido se puede generar usando técnicas recombinantes bien conocidas en el arte. Alguien de experiencia en la técnica puede fácilmente determinar las secuencias de nucleótidos que codifican el péptido deseado usando una metodología estándar y las enseñanzas en la presente. Una vez aislado, el péptido recombinante de manera opcional se puede modificar para incluir componentes que no se codifican genéticamente (por ejemplo etiquetas detectables, miembros de pares de enlace, etc.) como se describen en la presente y como es bien conocido en el arte para producir los reactivos de péptidos. Las sondas de oligonucleótidos se pueden vislumbrar con base en las secuencias conocidas y usarse para hacer sondas de colecciones genómicas o de ADNc . Luego las secuencias se pueden asilar además usando técnicas estándar y por ejemplo, encimas de restricción empleadas para truncar el gen en porciones deseadas de la secuencia de longitud completa. De manera similar, las secuencias de interés se pueden aislar directamente a partir de células y tejidos que contienen las mismas usando técnicas conocidas tales como la extracción con fenol y la secuencia de manipula además para producir los truncamientos deseados. Ver por ejemplo Sambrook et al., supra para una descripción de las técnicas usadas para obtener y aislar el ADN. Las secuencias que codifican el péptido también se pueden producir sintéticamente por ejemplo con base en las secuencias conocidas . La secuencia de nucleótidos se puede diseñar con los codones adecuados para la secuencia particular de aminoácidos deseada. La secuencia completa se ensambla generalmente a partir de oligonucleótidos de traslape preparados por métodos estándar y ensamblados en una secuencia de codificación completa. Ver por ejemplo, Edge (1981) Nature 292: 7566; Nambair et al. (1984) Science 223 : 1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 6311; Stemmer et al. (1995) Gene 164:49-53. Las técnicas recombinantes se usan fácilmente para clonar secuencias que codifiquen polipéptidos útiles en los reactivos de péptidos reivindicados que se puedan mutageneizar in vitro por el reemplace de los pares de bases adecuados, para resultar el codon para el aminoácido deseado. Tal cambio puede incluir tan poco como un par base, efectuando un cambio en un aminoácido sencillo, o puede abarcar varios cambios de pares de bases. Alternativamente, se pueden efectuar las mutaciones usando un cebador que no es de coincidencia que hibridiza a la secuencia precursora de nucleótidos (generalmente el ADNc que corresponde a la secuencia de ARN) a una temperatura debajo de la temperatura de fusión del dúplex que no coincide. El cebador se puede hacer específico al mantener la longitud del cebador y la composición de la base dentro de límites relativamente estrechos y al mantener la base del mutante localizada centralmente. Ver por ejemplo, Innis et al, (1990) PCR Applications: Protocols for Functional Genomics; Zoller and Smith, Methods Enzymol (1983) 100:468. la extensión del cebador se efectúa usando la polimerasa del AD?, el producto clonado y los clones que contienen el AD? mutado, derivado por segregación del cebador de la hebra extendida seleccionada. La selección se puede lograr usando el cebador mutante como una sonda de hibridación. La técnica también aplica para generar mutaciones de punto múltiple. Ver por ejemplo, Dalbie-McFarland et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1982) 79: 6409. Una vez que se han aislado y/o sintetizado las secuencias de codificación, se pueden clonar en cualquier vector o replicón adecuado para la expresión. (Ver también Ejemplos) . Como será evidente de las enseñanzas en la presente, una amplia variedad de vectores que codifican los polipéptidos modificados se pueden modificar al crear constructos de expresión que se enlazan operativamente en diversas combinaciones, polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen eliminaciones o mutaciones en ellos.

Se conocen numerosos vectores de clonación para aquellos expertos en la técnica, y la selección de un vector de clonación adecuado es una materia de elección. Ejemplos de los vectores de ADN recombinantes para clonación y células hospedadoras que pueden transformar incluyen el bacteriófago ? (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bacterias gram negativas) pGV1106 (bacterias gram negativas) , pLAFRl (bacterias gram negativas) , pME290 (bacteria gram negativa que no es de E. coli), pHV14 (E. coli and Bacillus subtilis) , pBD9 (Bacillus) , pU61 (Streptomyces) , pUC6 (Streptomyces) , Yip5 (Saccharamyces) , YCpl9 (Saccharamyces) y el virus de papiloma de bovino (células de mamífero). Ver generalmente, DNA Cloning: Vols. I & II, supra; Sambrook et al., supra; B. Perbal , supra. Los sistemas de expresión de células de insectos tales como los sistemas de baculovirus también se pueden usar y se conocen por aquellos expertos en la técnica y se describen en por ejemplo Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Los materiales y métodos para los sistemas de expresión de células de insecto y de baculovirus están comercialmente disponibles en forma de kit de inter alia, Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac" kit) . 'También se pueden usar sistemas de expresión de plantas para producir los reactivos de péptidos aquí descritos. Generalmente tales sistemas utilizan vectores basados en virus para transfectar células de plantas con genes heterólogos . Para una descripción de tales sistemas ver, por ejemplo Porta et al., Mol. Biotech. (1996) 5_: 209-221; and Hackland et al., Arch. Virol. (1994) 139: 1-22. Los sistemas virales, tales como un sistema de transfección e infección basado en vaccinia como se describe en To ei et al., J. Virol. (1993) 67:4017-4026 and Selby et al., J. Gen. Virol. (1993) 74: 1103-1113, también encontrarán uso con la presente invención. En este sistema, las células se transfectan primero in vitro con un virus recombinante de vaccinia que codifica la polimerasa de ARN T7 del bacteriófago. Esta polimerasa despliega una especificidad exquisita en que solamente transcribe plantillas que soportan los promotores T7. después de la infección, se transfectan las células con el ADN de interés impulsado por un promotor T7. La polimerasa expresada en el citoplasma del virus recombinante de vaccinia transcribe el ADN transfectado en ARN que luego se traduce en una proteína por la maquinaria traduccional del hospedador. El método proporciona una producción citoplásmica transitoria de alto nivel de grandes cantidades de ARN y sus productos de traducción. El gen se puede colocar bajo en control de un promotor, sitio de enlace de un ribosoma (para la expresión bacteriana) y opcionalmente un operador (referido colectivamente en la presente como elementos de control) de manera que la secuencia de ADN que codifica el polipéptido deseado se transcriba en el ARN en la célula hospedadora transformada por un vector que contiene esta construcción de la expresión. La secuencia de codificación puede contener o no un péptido de señal o secuencia líder. Con la presente invención, tanto los péptidos de señal que se presentan naturalmente o las secuencias heterólogas se pueden usar. Las secuencias líder se pueden retirar por el hospedador en un procesamiento post-traduccional . Ver por ejemplo, las Patentes de EUA Nos. 4,431,739X4,425,437; 4,338,397. Tales secuencias incluyen, pero no se limitan a, el líder TPA así como la secuencia de señal de la melitina de la abeja de la miel. Otras secuencias reguladoras también pueden ser deseables que permitan la regulación de la expresión de las secuencias de proteínas con relación al crecimiento de la célula hospedadora. Tales secuencias reguladoras se conocen por aquellos expertos en la técnica y ejemplos incluyen aquellas que provocan la expresión de un gen para que se active o desactive en respuesta a un estimulo químico o físico incluyendo la presencia de un compuesto regulador.

Otros tipos de elementos reguladores también pueden estar presentes en el vector por ejemplo, secuencias potenciadoras . Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras se pueden ligar a la secuencia de codificación previo a la inserción en un vector. De manera alternativa, la secuencia de codificación se puede clonar directamente en un vector de expresión que ya contenga las secuencias de control y un sitio de restricción adecuado. En algunos casos, puede ser necesario modificar la secuencia de codificación de manera que se pueda unir a las secuencias de control con la orientación adecuada esto es, mantener la estructura de lectura adecuada. Los mutantes o análogos se pueden preparar por la eliminación de una porción de la secuencia que codifica la proteína, por inserción de una secuencia y/o por substitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos tales como la mutagénesis dirigida al sitio son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Ver por ejemplo, Sambrook et al., supra; DNA Cloning, Vols. I and II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra . Luego se usa el vector de expresión para transformar una célula hospedadora adecuada. Se conocen en el arte diversas líneas celulares de mamíferos e incluyen líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture (ATCC) , tal como pero no limitada a, a células de ovario de hámster chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster recién nacido (BHK) , células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelular (por ejemplo Hep G2) , células Vero293, así como otras. Similarmente, los hospedadores bacterianos tales como especies E. coli , Bacillus subtilis, y Streptococcus, encontrará el uso con los constructos de expresión actuales. Los hospedadores de levadura útiles en la presente invención, incluyen inter alia, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lac ti s, Pichia guillerimondii , Pichia pastoris, schizo saccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica . Las células de insecto para uso con los vectores de expresión de baculovirus incluyen inter alia, Aedes aegypti , Autographa calif ornica, Bombyx. morí , Drosophila melanogaster, Spodopetra frugiperda, y Trichoplusia ni . Dependiendo del sistema de expresión y el hospedador seleccionado, las proteínas de la presente invención se producen al hacer crecer célula hospedadoras transformadas por un vector de expresión antes descrito bajo condiciones por las cuales la proteína de interés se expresa. La selección de condiciones de crecimiento adecuadas está dentro de la experiencia del arte . En una modalidad, las células transformadas secretan el producto del polipéptido en los medios circundantes. Ciertas secuencias reguladoras pueden se incluir en el vector para mejorar la secreción del producto de proteína, por ejemplo usando un activador de plasminógeno de tejido (TPA) en su secuencia líder, una secuencia de señal de interferón (? o a) u otras secuencias de péptido de señales a partir de proteínas secretoras conocidas. El producto de polipéptidos secretado luego se puede aislar por diversas técnicas aquí descritas por ejemplo, al usar técnicas de purificación estándar tales como, pero no limitadas a resinas de hidroxapatita, cromatografía en columna, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de exclusión de tamaño, electroforesis, CLAR, técnicas inmunoabsorbentes, cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación, y similares. De manera alternativa, se fragmentan las células transformadas, al usar medios químicos, físicos o mecánicos, los cuales lisan las células todavía mantienen los polipéptidos recombinantes substancialmente intactos. Las proteínas intracelulares también se puede obtener al retirar componentes de la pared o membrana celular por ejemplo, por el uso de detergentes o solventes orgánicos, tal como la fuga de los polipéptidos sucede. Tales métodos se conocen por aquellos expertos en la técnica y se describe en por ejemplo, Protein Purificaction Applications: A Practical Approach, (E.L.V. Harris and S. Angal, Eds., 1990). Por ejemplo, los métodos para fragmentar las células para uso con la presente invención incluyen pero no se limitan a: sonicación o ultrasonicación, agitación, extrusión líquida o sólida; tratamiento térmico, deshielo por congelación, desecación, descompresión explosiva; choque osmótico, tratamiento con enzimas líticas incluyendo' proteasas tales como la tripsina, neuraminidasa y lisozima; tratamiento de álcali y el uso de detergentes y solventes tales como sales biliares, dodeciisulfato de sodio, Tritón, NP40 y CHAPS. La técnica particular usada para fragmentar las .células es principalmente un asunto de elección y dependerá del tipo de célula en la cual se expresa el polipéptido, las condiciones de cultivo y cualquier pre tratamiento usado. Después de la fragmentación de las células, se retiran los desechos celulares, generalmente por centrifugación y los polipéptidos producidos intracelularmente se purifican además usando técnicas de purificación estándar tales como pero no limitadas a cromatografía en columna, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de exclusión de tamaño, electroforesis, CLAR, técnicas inmunoabsorbentes, cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación y similares. Por ejemplo, un método para la obtención de polipéptidos intracelulares de la presente invención involucra la purificación por afinidad, tal como cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos previamente generados) , o por cromatografía de afinidad por lectina. Las resinas de lectina particularmente preferidas son aquellas que reconocen las porciones de mañosa tal como pero no limitadas a resinas derivadas de la aglutinina de Galanthus navalis (GNA) , aglutinina de Lens culinaris (LCA o lectina de la lenteja) , aglutinina de Pisum sativum (PSA o lectina del chícharo) , aglutinina de Narcissus pseudonarcissus (NPA) y aglutinina de Allium ursinum (AUA) . La elección de una resina de afinidad adecuada está dentro de la experiencia de la técnica. Después de la purificación por afinidad, los polipéptidos se pueden además purificar usando técnicas convencionales bien conocidas en el arte, tales como por cualquiera de las técnicas antes descritas. Los reactivos de péptidos se pueden sintetizar químicamente de forma conveniente por ejemplo por cualquiera de las diversas técnicas que se conocen por aquellos expertos en el arte del péptido. En general, estos métodos emplean la adición secuencial de uno o más aminoácidos a una cadena de péptidos en crecimiento. Normalmente, cualquiera del grupo amino o carboxilo del primer aminoácido se proteger del primer grupo protector adecuado. El aminoácido protegido o derivado luego se puede unir a un soporte sólido inerte o utilizarse en solución al agregar el siguiente aminoácido de la secuencia que tenga el grupo complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido, bajo condiciones que permitan la formación de una ligadura de amida. Luego se retira el grupo protector del residuo de aminoácidos recientemente agregado y luego se agrega el siguiente aminoácido (adecuadamente protegido) y así sucesivamente . Después de que sean enlazado los aminoácidos deseados en la secuencia adecuada, se retiran algunos grupos protectores restantes (y cualquier soporte sólido si se usan técnicas de síntesis en fase sólida) en secuencia o en paralelo para producir el polipéptido final. Por la modificación sencilla de este procedimiento general, es posible agregar más de un aminoácido a la vez a una cadena creciente por ejemplo, al acoplar (bajo condiciones que no racemizan los centros quirales) un tripéptido protegido con un dipéptido adecuadamente protegido, para formar después de la desprotección un pentapéptido. Ver por ejemplo, J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Síntesis (Pierce Chemical Co . , Rockford, IL 1984) and G. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Análisis, Síntesis, Biology, editors E. Gross and J. Meienhofer, Vol. 2, (Academic Press, New York, 1980), pp . 3-254, para técnicas de síntesis en péptidos de fase sólida y M. Bodansky, Principies of Peptide Synthesis. (Springer- Verlag, Berlín 1984) and E. Gross and J. Meienhofer, Eds., the Peptides: Análisis, Síntesis, Biology, vol. 1, para síntesis de solución clásica. Estos método se usan típicamente para polipéptidos relativamente pequeños esto es, de hasta 50-100 aminoácidos de longitud pero son aplicables a polipéptidos mayores. Los grupos protectores típicos incluyen t-butiloxicarbonil (Boc) , 9-fluorenümetoxicarbonüo (Fmoc) benciloxicarbonilo (Cbz); p-toluensulfonilo (Tx) ; 2,4-dinitrofenil; bencil (Bzl) ,- bifeniüsopropüoxicarboxi-carbonil, t-amiloxicarbonil, isoborniloxicarbonilo obro obenciloxicarbonüo, ciciohexilo, isopropilo, acetilo, o-nitrofenilsulfonilo y similares. Los soportes sólidos típicos son soportes poliméricos reticulados. Estos pueden incluir polímeros basados en estireno, reculados, divinilbenceno, por ejemplo, copolímeros de divinilbenceno-hidroximetilestireno, copolímeros de divinilbenceno-clorometilestireno y copolímeros de divinilbenceno-benhidrilaminopoliestireno . Las síntesis de los polímeros que contienen peptoides se pueden llevar acabo de acuerdo a por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,877,278; 6,033,631; Simón et al (1992) Proc. Nati . Acad. Sci. Usa 89:9367. El reactivo de péptidos de la presente invención también se puede preparar químicamente por otros métodos tal como por el método de síntesis de péptidos múltiples simultáneos. Ver por ejemplo, Houghten Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1985) 82: 5131-5135; Patente E.U.A. No. 4,631,211.

IV. Anticuerpos Además, los reactivos de péptidos aquí descritos usados en la invención se pueden usar para generar anticuerpos. En ciertas modalidades, los anticuerpos formulados contra estos reactivos de péptidos son específicos para los priones patogénicos. En otras modalidades, los anticuerpos se enlazan a las formas patogénicas y no patogénicas . Todavía en otra modalidades, los anticuerpos son específicos para las isoformas no patogénicas. Opcionalmente, los anticuerpos aquí descritos inhiben la conversión de la forma no patogénica a la conformación patogénica. Típicamente, los anticuerpos de la invención se generan al administrar un reactivo de péptidos como se describe en la presente (o un polinucleótido que codifica tal reactivo de péptido) a un animal. Los métodos también pueden incluir aislar los anticuerpos del animal . Los anticuerpos de la invención pueden ser preparaciones de anticuerpo policlonales o monoclonales, . anti sueros monoespecífieos, anticuerpos humanos, o pueden ser anticuerpos híbridos o quiméricos tales como anticuerpos humanizados, anticuerpos alterados (Fab')2 en fragmentos, fragmentos F (ab) , fragmentos Fv, anticuerpos de dominio sencillo, fragmentos o constructos de anticuerpos diméricos o triméricos, minicuerpos o fragmentos funcionales de los mismos que se pueden enlazar al antígeno en cuestión. Los anticuerpos se producen usando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y descritas en por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos . 4,011,308; 4,722,890; 4,016,043; 3,876,504; 3,770,380 y 4,372,745. por ejemplo, se generan anticuerpos policlonales al inmunizar un animal adecuado tal como un ratón, rata, conejo, oveja o cabra con un antígeno de interés (por ejemplo, un reactivo de péptidos como se describe en la presente) . Con objeto de mejorar la capacidad inmunogénica, el antígeno se puede ligar a un portador previo a la inmunización. Tales portadores son bien conocidos por aguellos expertos ordinarios en la técnica. La inmunización se lleva a cabo generalmente al mezclar o emulsificar el antígeno en solución salina, preferiblemente en un adyuvante tal como adyuvante completo de Freund e inyectar la mezcla o emulsión parenteralmente (generalmente de forma subcutánea o intramuscular) . El animal se refuerza generalmente 2-6 semanas después con una o más inyecciones del antígeno en solución salina, preferiblemente al usar un adyuvante incompleto de Freund. Los anticuerpos también se pueden generar por inmunización in vitro, al usar métodos conocidos en el arte. El antisuero policlonal luego se obtiene del animal inmunizado. Los anticuerpos monoclonales se preparan generalmente al usar el método de Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497, o una modificación del mismo. Típicamente se inmuniza un ratón o una rata como se describe arriba. Sin embargo, más que hacer sangrar al animal para extraer el suero, se retiran el bazo (y opcionalmente varios ganglios linfáticos grandes) y se disocian en células sencillas. Si se desea, las células del bazo se pueden seleccionar (después de retirar las células no específicamente adherentes) al aplicar a una suspensión celular a una placa pozo recubierto con el antígeno. Las células B que expresan la inmunoglobulina enlazada a la membrana específica para el antígeno, se enlazará a la placa y no se enjuagan completamente con el resto de la suspensión. Las células B resultantes y todas las células de bazo disociadas luego se inducen para fusionarse con las células de mieloma para formar hibridomas y se cultivan en un medio de cultivo (por ejemplo, medio de hipoxatina, aminopterina, timidina "HAT") . Lsa hibridomas resultantes se colocan en placas por dilución limitada y luego se ensayan para la producción de anticuerpos que se enlazan específicamente al antígeno inmunizante (y que no se enlazan con antígenos no relacionados) . Los hibridomas seleccionados que secretan el anticuerpos monoclonal luego se cultivan ya sea in vitro (por ejemplo, en botellas de cultivo de tejido o reactores de fibras huecas) , o in vivo (por ejemplo, como ascitos en ratones) . También son útiles en la invención los anticuerpos humanizados quiméricos . La moléculas de anticuerpos híbridos (quiméricos) se discuten generalmente en Winter et al. (1991) Nature 349: 393-299 y Patente E.U.A. No. 4,816,567. Las moléculas de anticuerpos humanizados se discuten generalmente en Riech ann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyan et al. (1988) Sciences 239: 1534-1536; y en la publicación de la patente del Reino Unido No. GB 2,276,169, publicada el 21 se Septiembre de 1994) . Un método para preparar por ingeniería un anticuerpo humanizado involucra clonar el ADN recombinante que contiene el promotor líder y secuencias región variable a partir de un gen de anticuerpo de ratón y los exones de la región constante a partir de un gen de anticuerpo humano para crear un anticuerpo humano de ratón, un anticuerpo humanizado. Ver, generalmente Kuby, "Immunology, 3rd Edition", W. H. Freeman and Company, New York (1998) en la página 136. Los anticuerpos tanto monoclonales y policlonales que se dirigen contra los reactivos de péptidos como se describen en la presente, son particularmente útiles en aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, por ejemplo, aquellos anticuerpos que se neutralizan son útiles en la inmunoterapia pasiva. Los anticuerpos monoclonales en particular, se pueden usar para formular anti idiotipos. Los anticuerpos anti-idiotipo son inmunoglobulinas que llevan una imagen interna de un. antígeno del agente contra el cual se desea la protección. La técnicas para formular los anticuerpos anti-idiotipo se conocen en el arte. Ver, por ejemplo, Grzych (1985), -Nature 316: 74; MacNa ara et al. (1984), Science 226: 1325; Uytdehaag et al (1985), J. Immunol . 134: 1225. estoa anticuerpo anti-idiotipo también pueden ser útiles para tratamiento y/o diagnóstico de enfermedades conformacionales. Los fragmentos de anticuerpos también se incluyen dentro del alcance de la invención. Se conocen en el arte diversos fragmentos de anticuerpos que comprenden sitios de enlace de antígehos capaces de mostrar propiedades de enlace inmunológicas de una molécula intacta de anticuerpos . Por ejemplo, los fragmentos funcionales de anticuerpos se pueden producir al desdoblar una región constante que no es responsable del enlace de antígeno a partir de la molécula de anticuerpos usando por ejemplo, pepsina para producir fragmentos de F(ab') . Estos fragmentos contendrán dos sitios de enlace de antígenos pero carecen de una porción de la región constante de cada una de las cadenas pesadas . Símilarmente si se desea, los fragmentos Fab que comprenden un sitio de enlace a antígeno sencillo se pueden producir por ejemplo, por digestión de anticuerpos policlonales o monoclonales con papaína. Los fragmentos funcionales que incluyen solamente las regiones variables de las cadenas ligera pesada también se pueden producir usando técnicas estándar tales como la producción recombinante o desdoblamiento proteolítico preferente de moléculas de inmuno globulina. Estos fragmentos se conocen como Fv. Ver por ejemplo, Invar. Et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69: 2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15: 2706-2710; and Ehrlich et al. (1980) Biochem 19: 4091-4096. Un polipéptido Fv de cadena sencilla ("sFv" p scFv") se liga covalentemente a un heterodímero VH - VL que se expresa a partir de la fusión de un gen que incluye genes que codifican VH y VL enlazados por una ligadura que codifican los péptidos . Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. Usa 85: 5879-5883. sean descrito diversos métodos para discriminar y desarrollar estructuras químicas (ligaduras) para convertir las cadenas de polipéptido ligeras y pesadas que se agregan naturalmente pero que se separan químicamente a partir de la región del anticuerpo V en una molécula sFv que se plegará en una estructura tridimensional substancialmente similar a la estructura de un sitio de enlace a antígenos. Ver por ejemplo las patentes de E.U.A. No. 5,091,513, 5,132,405 y 4,946,778. Las moléculas sFv se pueden producir usando métodos descritos en el arte. Ver por ejemplo, Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci USA 85: 5879-5338; Patentes de E.U.A. Nos. 5,091,513; 5,132,405 y 4,946,778. Los criterios de diseño incluyen la determinación de la longitud adecuada para abarcar la distancia entre la terminación C de una cadena y la terminación N de la otra, en donde la ligadura se forma generalmente a partir se residuos de aminoácidos pequeños hidrofílicos que no se enrollan o forman estructuras secundarias. Tales métodos se han descrito en el arte. Ver por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,091,531; 5,132,405 y 4,946,778. las ligaduras adecuada comprenden generalmente de cadenas de polipéptidos de conjuntos alternos de residuos de glicina y de serina y pueden incluir residuos se lisina y de ácido glutámico insertados para mejorar la solubilidad. Los "mini-anticuerpos" o "minicuerpos" también encontrarán uso con la presente invención. Los minicuerpos son cadenas de polipéptido de sFv que incluyen dominios de oügomerización en sus terminaciones C, separadas del sFv por una región de articulación. Pack et al., (1992) Biochem 31: 1579-1584. El dominio de oligorimerización comprende una autoasociación de hélices a, por ejemplo, cremalleras de leucina que se pueden estabilizar más por enlace bisulfuro adicionales. El dominio de oügomerízación - se diseña para ser compatible con el plegado vectorial a través de una membrana, un proceso que se cree que facilita el plegado in vivo del polipéptido en una proteína de enlace funcional. Generalmente, los minicuerpos se producen usando métodos recombinantes bien conocidos en el arte. Ver por ejemplo, Pack et al., (1992) Biochem 31: 1579-1584; Cumbre et al. (19982) J. Immunology 149B: 120-126. También se pueden usar medios no convencionales para generar e identificar anticuerpos. Por ejemplo, una colección de despliegue de fagos se puede separar por exclusión para anticuerpos que se enlazan más a formas patogénicas que a formas no patogénicas o viceversa. Ver generalmente Siegel, "Recombinant Monoclonal Antibody Technology", Transíus . Clin. Biol. (2002) 2(1): 15-22; Sidhu, "Phage Display in Pharmacuetical Biotechnology", Curr. Opin. Biotechnol. (2000) 11(6): 610-616; Sharon, et al., "Recombinant Polyclonal Antibody Libraries" , Comb, Chem. High Throughput Screen (2000) 3(3); 185-196; and Schmitz et al., "Phage Display: A Molecular Tool for the Generation of antibodies - Review" , Placenta, (2000) 21 SupplA: S106-12. Como se señala anteriormente, los anticuerpos también se pueden generar al administrar una secuencia de polinucleótidos que codifique un reactivo de péptidos como se describe en la presente en un animal. Cuando se expresa el péptido in vivo, los anticuerpos se generan in vivo. Se discuten a continuación los métodos para suministro de polinucleótidos . La especificidad de los anticuerpos de la invención se puede probar como se describe arriba para los reactivos de péptido. Como se mencionó anteriormente, los priones que tienen una conformación patogénica son generalmente resistentes a ciertas proteasas tales como la proteinasa K. Las mismas proteasas pueden degradar los priones' en una conformación no patogénica. Un método de prueba de la especificidad de los anticuerpos de la presente invención es seleccionar una muestra biológica que contenga priones patogénicos y no patogénicos . La muestra se puede separar en dos volúmenes iguales . Los anticuerpos de la invención se pueden agregar absorbidos sobre un soporte sólido (como se describe además a continuación) y se usan para obtener un valor cuantitativo directamente relacionado con el número de interacciones de enlace prión y anticuerpo sobre el soporte sólido. Se puede agregar la proteasa a la segunda muestra y llevarse a cabo la misma prueba. Debido a que la proteasa en la segunda muestra se degradará a cualquiera de los priones no patogénicos, algunas interacciones de enlace al prión de anticuerpos en la segunda muestra se pueden atribuir a los priones patogénicos . Las variaciones y otros ensayos conocidos en el arte también se pueden usar para demostrar la especificidad de los anticuerpos de la invención.

V. Ensayos Los reactivos de péptidos de la invención se pueden usar en una diversidad de ensayos para seleccionar muestras (por ejemplo, muestras biológicas tales como sangre, cerebro, espina dorsal, CSF o muestras de órganos), por ejemplo para detectar las presencia o ausencia de formas patogénicas de proteínas de enfermedad conformacional en esas muestras . A diferentes de muchos reactivos de diagnóstico actual de los priones, los reactivos de péptidos aquí descritos permitirán la detección en virtualmente cualquier tipo de muestra biológica o no biológica incluyendo muestras de sangre, productos sanguíneos o muestras de biopsias . La invención proporciona así un método para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra que comprende : poner en contacto la muestra que se sospecha que contiene un prión patogénico con un reactivo de péptido de la invención bajo condiciones que permiten el enlace del reactivo de péptidos a la proteína del prión patogénico si esta presente, y detectar la presencia del prión patogénico si lo hay en la muestra por su enlace al reactivo de péptido .

Para su uso en el método de la invención, la muestra puede ser cualquier cosas conocida o que se sospecha que contenga una proteína de un prión patogénico. La muestra puede ser una muestra biológica (esto es, una muestra preparada partir de un organismo vivo que alguna vez vivió) o una muestra no biológica. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a órganos, sangre entera, fracciones de sangre, componentes de sangre, plasma, plaquetas, suero, fluido cerebroespinal (CSF) , tejido de cerebro, tejido del sistema nervioso, tejido muscular, médula ósea, tejido del sistema no nervioso, lagrimas, orina, órganos y/o biopsias o necropsias. Las muestras biológicas preferidas incluyen sangre entera, fracciones de sangre, componentes de sangre, plasma, plaquetas y suero. La muestra hace contacto con uno o más reactivos de péptidos de la invención bajo condiciones que permiten enlace de los reactivos de péptidos a la proteína de prión patogénica si está presente en la muestra. Se encuentra bien dentro de la competencia de alguien experto ordinario en la técnica determinar las condiciones particulares con base en la descripción en la presente. Típicamente, la muestra y los reactivos de péptidos se incuban en conjunto en una solución amortiguadora adecuada a un pH de alrededor del neutro (por ejemplo una solución amortiguadora TBS a pH 7.5) a una temperatura adecuada (por ejemplo alrededor de 4°C) por un periodo de tiempo adecuado (por ejemplo, alrededor de 1 hora hasta durante la noche) para permitir que suceda el enlace. La presencia de la proteína del prión patogénico en la muestra se detecta por su enlace a los reactivos de péptidos. La detección de la presencia de la proteína del prión patogénico por su enlace a los reactivos de péptidos de la invención se puede lograr de diversas maneras. Por ejemplo, los reactivos de péptidos de la invención se pueden usar para capturar específicamente la proteína del prión patogénico por la formación de un primer complejo entre los reactivos de péptidos y la proteína del prión patogénico cuyo primer complejo se puede separar a partir de los materiales de muestra sin enlazar incluyendo alguna proteína de prión no patogénico presente en la muestra. La proteína de prión patogénico se puede detectar por la adición y enlace de uno o más reactivos de péptidos de la invención cuyos reactivos de péptidos se han etiquetado de manera detectable (esto es, reactivos de péptidos etiquetados) . La proteína de prión patogénica se puede detectar aunque en el primer complejo, en la proteína de prión patogénico se puede disociar del primer complejo antes de la adición y enlace a las reactivos de péptidos etiquetados de la invención. * De manera alternativa, cuando los reactivos de péptidos de la invención se usan para capturar la proteína de prión patogénica como se describe arriba, y se separa el primer complejo de los materiales de muestra sin enlazar, se puede usar un reactivo de enlace al prión etiquetado de manera detectable, para detectar la proteína del prión patogénico, ya sea mientras la proteína de prión patogénico está en el primer complejo, o después de la disociación de la proteína de prión patogénico del primer complejo. Un reactivo de enlace al prión es un reactivo que se enlaza a una proteína de prión en cualquier conformación, típicamente el reactivo de enlace al prión se enlazará a una forma desnaturalizada de la proteína del prión. Tales reactivos se han descrito e incluyen por ejemplo anticuerpos antiprión (descritos entre otros en Peretz et al. 1997 J. Mol. Bio. 273 : 614; Peretz et al. 2001 Natura 421:739; Williamson et al. 1998 J. Virol. 72:9413; Patente de EUA No . 6,765,088; Patente de EUA ?o. 6,537,548), híbridos injertados con una porción en polipéptidos (ver, WO 03/085086) , ciertos polímeros catiónicos o aniónicos (ver WO 03/073106) , ciertos péptidos que son catalizadores de la propagación (ver WO 02/0974444) y plasminógenos . Será evidente que si un reactivo de enlace al prión en particular usando se enlaza a una forma desnaturalizada del prión, que la proteína de prión patogénica capturada se deba desnaturalizar previo a la detección con el reactivo de enlace al prión. En otra alternativa, se puede usar un reactivo de enlace al prión para capturar algunos priones (patogénicos o no patogénicos) presentes en la muestra para formar un primer complejo, y uno o más reactivos de péptidos etiquetados de manera detectable de la invención se puede usar para detectar los priones patogénicos en el primer complejo o después de la disociación a partir del primer complejo. En una alternativa adicional, la muestra se puede capturar directamente (esto es, sin ningún reactivo de enlace al prión) sobre un soporte sólido y las proteínas de prión patogénicas si están presentes se pueden detectar usando uno o más reactivos de péptidos etiquetados de manera detectable de la invención. Las etapas de detección y captura antes descritas se pueden efectuar en solución o se pueden llevar a cabo en o sobre un soporte sólido o alguna combinación de fase sólida y en- solución. Algunos formatos de fase en solución adecuados incluyen por ejemplo espectroscopia de correlación de fluorescencia (ver, Giese et al. Arch. Virol. Suppl. 2000 16:161, Bieschke et al. Proc Nati. Acadf . Sci. USA 2000 97:55468) y transferencia de energía por resonancia de fluorescencia. Típicamente, los reactivos de péptidos de la invención se etiquetarán de manera detectable en estos formatos de fase de solución. Preferiblemente, los reactivos de péptidos se etiquetarán con 2 o más etiquetas detectables que se distinga. La presencia de proteína de prión patogénico se puede detectar por la coincidencia de 2 o más etiquetas detéctables en un primer complejo. Se describen en la presente los formatos de ensayo de fase sólida adecuado. En general, para los formatos en fase sólida, se une el reactivo de captura (el cual puede ser uno o más de los reactivos de péptidos de la invención o uno o más reactivos de enlace al prión) o se adaptan para unión a un soporte sólido. El reactivo de captura se puede adaptar' para unión a un soporte sólido por cualquier medio conocido en el arte por ejemplo, el reactivo de captura y el soporte sólido pueden comprender cada uno un miembro de un par de enlace de manera tal que cuando se haga contacto del reactivo de captura con el soporte sólido, el reactivo de captura se una al soporte sólido a través del enlace de los miembros al par de enlace. Por ejemplo, el reactivo de captura puede comprender biotina y el soporte puede comprender avidina o estreptavidina. Además de biotina-avidina y biotina-estreptavidina otros pares de enlace adecuados para esta modalidad incluyen por ejemplo antígeno-anticuerpo, hapteno- nticuerpo, mimeotopo-anticuerpo, receptor-hormona, receptor-ligando,' agonista-antagonista, lectina-carbohidrato, proteína A-anticuerpo Fc . Tales pares de enlace son bien conocidos (ver por ejemplo Patentes de EUA Nos. 6,551,843 y 6,586,193) y alguien de experiencia ordinaria en la técnica sería competente para seleccionar los pares de enlace adecuados y adaptarlos para su uso dentro de la presente invención. Cuando se adapta el reactivo de captura para su unión al soporte como se describe arriba la muestra puede hacer contacto con el reactivo de captura antes o después de que el reactivo de captura se una al soporte . La invención así proporciona un método para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra que comprende : (a) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene un prión patogénico con un primer reactivo de péptido bajo condiciones que permitan el enlace del primer reactivo de péptido a la proteína de prión patogénica si está presente para formar un primer complejo; y (b) detectar la presencia del prión patogénico si lo hay en la muestra por su enlace al primer reactivo de péptido El reactivo de péptido es como se describe en la presente, preferiblemente el reactivo de péptido se deriva de un péptido que tiene una secuencia SEQ ID NO : 12-132, más preferiblemente de un péptido que tiene una secuencia de SEQ ID ?O : SEQ ID ?O : 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 132; o de péptidos que tienen SEQ ID ?O : 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 ó 128; o de péptidos que tienen SEQ ID ?O : 56, 57, 65, 82 u 84. El reactivo de péptido puede estar biotinilado. El reactivo de péptido se puede unir a un soporte sólido. En algunas modalidades, el reactivo de péptido se puede etiquetar de forma detectable. La invención también proporciona un método para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra que comprende : (a) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene un prión patogénico con un primer reactivo de péptido bajo condiciones que permitan el enlace del primer reactivo de péptido al prión patogénico si está presente para formar un primer complejo; y (b) hacer contacto del primer complejo con un segundo reactivo de péptido bajo condiciones que permitan el enlace del segundo reactivo de péptido con el prión patogénico y el primer complejo en donde el segundo reactivo de péptido comprende una etiqueta detectable y (c) detectar la presencia del prión patogénico si lo hay en la muestra por su enlace al segundo reactivo de péptido. Cuando el método utiliza un primer reactivo de péptido y un segundo reactivo de péptido, el primero y segundo reactivo de péptidos pueden ser iguales o diferentes. Por "iguales" significa que el primero y segundo reactivos de péptidos difieren solamente en inclusión de un etiqueta detectable en un segundo reactivo de péptido. El primer reactivo de péptido y el segundo reactivo de péptido se pueden derivar de fragmentos péptidos de la misma región de una proteína de prión o de fragmentos péptidos de una región diferente de una proteína de prión. El primer reactivo de péptido y el' segundo reactivo de péptido se pueden seleccionar independientemente de reactivos péptidos derivados de los péptidos que tienen SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131 ó 132. El primer reactivo de péptido y el segundo reactivo de péptido se pueden seleccionar independientemente a partir de un reactivo de péptidos derivado de los péptidos que tengan SEQ ID NO : 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82 y 84. El primer reactivo de péptido -se puede seleccionar de un reactivo de péptido derivado de los péptidos que tengan SEQ ID ?O: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 ó 127, y el segundo reactivo de péptido se selecciona del reactivo de péptido derivado de péptidos que tengan SEQ ID NO : 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, ó 132 o viceversa. El primer reactivo de péptido se puede seleccionar a partir de un reactivo de péptido derivado de péptidos que tienen SEQ ID NO : 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 ó 127 y el segundo reactivo de péptido se puede seleccionar a partir del reactivo de péptido derivado de péptidos que tienen SEQ ID NO : 56, 57, 65, 82 y 84 o viceversa. El primer reactivo de péptido se puede seleccionar a partir de un reactivo de péptido derivado de péptidos que tienen SEQ ID ?O: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131 ó 132 y el segundo reactivo de péptido se puede seleccionar de reactivos péptidos derivados de péptidos que tengan SEQ ID ?O : 56, 57, 65, 82 y 84 o viceversa. El primer reactivo de péptido puede ser biotinilado y se puede unir a un soporte sólido. La invención proporciona también un método para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra que comprende : (a) poner en contacto una muestra que contiene un prión patogénico con un primer reactivo del péptido bajo condiciones que permiten el enlace del primer reactivo del péptido al prión patogénico, si está presente, para formar un primero complej o; (b) remover los materiales de la muestra no enlazados; (c) disociar los priones patogénicos del primer complejo; (d) poner en contacto al prión patogénico con un segundo reactivo del péptido bajo condiciones que permiten el enlace del segundo reactivo del péptido al prión patogénico, en donde dicho segundo reactivo del péptido comprende una etiqueta detectable; y (e) detectar la presencia de un prión patogénico, si alguno se encuentra en la muestra mediante su enlace al segundo reactivo del péptido. El primero y segundo reactivos del péptido pueden ser el mismo o diferentes . La invención proporciona también un método para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra que comprende: a) poner en contacto una muestra que se sospecha contiene un prión patogénico con un primer reactivo del péptido bajo condiciones que permiten el enlace del primer reactivo del péptido al prión patogénico, si está presente, para formar un primer complejo; b) remover los materiales de la muestra no enlazados; c) disociar el prión patogénico del primer complejo; d) poner en contacto el prión patogénico disociado con un reactivo que enlaza priones bajo condiciones que permiten el enlace del reactivo que enlaza priones al prión patogénico, en donde el reactivo que enlaza priones comprende una etiqueta detectable; y (e) detectar la presencia de un prión patogénico, si alguno se encuentra en la muestra mediante su enlace al reactivo que enlaza priones. El reactivo que enlaza priones puede ser un anticuerpo anti-prión, polipéptido de híbrido injertado con porciones, polímeros aniónicos o catiónicos, propagación de catalizadores de propagación y plasminógeno, o cualquier otra porción conocida para enlazar a las proteínas priones. La invención también proporciona un método para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra que comprende : a) poner en contacto una muestra que se sospecha contiene un prión patogénico con un reactivo que enlaza priones bajo condiciones que permiten el enlace del reactivo que enlaza priones al prión patogénico si está presente para formar un primer complejo; (b) remover los materiales de muestra no enlazados; c) poner en contacto el primer complejo con un reactivo del péptido bajo condiciones que permitan el enlace del reactivo del péptido al prión patogénico, en donde el reactivo del péptido comprende una etiqueta detectable; y d) detectar la presencia del prión patogénico, si alguno se encuentra en la muestra, se encuentra en la muestra mediante su enlace al reactivo del péptido. La invención también proporciona un método para detectar un prión patogénico en una muestra, que comprende: a) proporcionar un soporte sólido que comprende un primer reactivo del péptido b) poner en contacto el soporte sólido con una muestra bajo condiciones que permiten priones patogénicos cuando están presentes en la muestra, para enlazar al primer reactivo del péptido; c) poner en contacto el soporte sólido con un segundo reactivo del péptido etiquetado detectablemente bajo condiciones que permiten al segundo reactivo del péptido enlazar a priones patogénicos enlazados al primer reactivo del péptido; y, d) detectar los complejos formados entre el primer reactivo del péptido, un prión patogénico de la muestra y el segundo reactivo del péptido, detectando así, la presencia del prión patogénico en la muestra. Alternativamente, el reactivo que enlaza priones puede proporcionarse en el soporte sólido. La invención proporciona así, un método para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra que comprende : a) proporcionar un soporte sólido que comprende un reactivo que enlaza priones; b) poner en contacto el soporte sólido a una muestra bajo condiciones que permiten proteínas de priones, cuando están presentes en la muestra, para enlazar al reactivo que enlaza priones; c) poner en contacto el soporte sólido a un segundo reactivo del péptido etiquetado detectablemente; y d) detectar complejos formados entre el reactivo que enlaza priones, un prión patogénico de la muestra biológica y el segundo reactivo del péptido. El ensayo puede proporcionarse en un formato competitivo, así, la invención proporciona un método para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra que comprende : a) proporcionar un soporte sólido que comprende un primer reactivo del péptido; b) combinar el soporte sólido con un primer ligando etiquetado detectablemente, en donde el primer péptido de afinidad que enlaza a los reactivos al primer ligando etiquetado detectablemente es más débil que el primer péptido de afinidad que enlaza a los reactivos a un prión patogénico; - c) combinar una muestra con el soporte sólido bajo condiciones que permiten un prión patogénico, cuando está presente en la muestra, para enlazar al primer reactivo del péptido y reemplazar a los primeros ligandos; d) detectar complejos formados entre el primer reactivo del péptido y el prión patogénico de la muestra. Generalmente, los reactivos del péptido descritos en la presente se usan para enlazar a las proteínas del prión en una muestra (por ejemplo, como un reactivo de captura) y/o para detectar la presencia de proteínas del prión (por ejemplo, como un reactivo de detección) . El reactivo de captura y el reactivo de detección pueden ser moléculas individuales, o alternativamente, una molécula puede servir para ambas funciones de detección y de captura. En ciertas modalidades, los reactivos de captura y/o detección son reactivos del péptido descritos en la presente que interactúan preferentemente con priones patogénicos (es decir, son priones patogénicos específicos) . En otras modalidades, el reactivo, de captura es específico para priones patogénicos y el reactivo de detección enlaza a ambas formas patogénicas y no patogénicas, por ejemplo, anticuerpos que enlazan a las proteínas del prión. Tales reactivos que enlazan priones se han descrito anteriormente en la presente. Alternativamente, en otras modalidades, el reactivo de captura no es específico para los priones patogénicos y el reactivo de detección es específico para los priones patogénicos . Cualquier medio adecuado de detección puede usarse para identificar el enlace entre un reactivo del péptido como se describe en la presente y en una proteína del prión. Por ejemplo, los ensayos descritos en la presente pueden involucrar el uso de reactivos del péptido etiquetado o anticuerpos . Las etiquetas detectables adecuadas para usarse en la invención incluyen cualquier molécula capaz de detectarse, que incluye pero no se limita a, isótopos radiactivos, fluorescentes, quimioluminiscentes, cromóforos, nanocristales semiconductores fluorescentes, enzimas, substratos de la enzima, cofactores de la enzima, inhibidores de la enzima, cromoporos, tintes, iones metálicos, soles metálicos, ligandos (por ejemplo, biotina, estrepavidina o haptenos) y similares. Las etiquetas adicionales incluyen pero no se limitan a aquellos que usan fluorescencia, que incluyen aquellas sustancias o porciones de las mismas que son capaces de exhibir fluorescencia en un rango detectable . Ejemplos particulares de etiquetas que pueden usarse en la invención incluyen, pero no se limitan a, peroxidase de raíz de rábano picante (HRP) , fluoresceína, FITC, el rodamina, dansilo, umbeüferona, éster de acridinio de dimetilo (DMAE) , rojo de Texas, luminol, NADPH y ß-galactosidasa. Además, la etiqueta detectable puede incluir una etiqueta de oligonucleótidos, cuya etiqueta puede detectarse mediante cualquier método conocido de detección de ácidos nucleicos que incluyen PCR, TMA, b-ADN, NASBA, etc., Además del uso de reactivos de detección etiquetados (descritos anteriormente) , pueden usarse la inmunoprecipitación para separar fuera reactivos del péptido que se enlazan a la proteína del prión (por ejemplo, prión patogénico) . Preferentemente, la inmunoprecipitación se facilita por la adición de un agente que mejora la precipitación. Un agente que mejora la precipitación incluye porciones que pueden mejorar o incrementar la precipitación de los reactivos del péptido que se enlazan a los priones patogénicos. Tales agentes que mejoran la precipitación incluyen polietilen glicol (PEG) , proteína G, proteína A y similares . Cuando se usa la proteína G o la proteína A como agentes que mejoran la precipitación, la proteína puede unirse opcionalmente a una perla, preferentemente una perla o cuenta magnética. La precipitación puede mejorarse además mediante el uso de una centrifugación o con el uso de una fuerza magnética. El uso de tales agentes que mejoran la precipitación se conocen en el arte . Se conocen también ensayos que amplifican las señales del reactivo de detección. Ejemplos de éstos son ensayos que utilizan biotina y avidina e inmunoensayos mediados y etiquetados por una enzima tales como los ensayos ELISA: Una o más de las etapas de los ensayos descritos en la presente pueden realizarse en la solución (por ejemplo, un medio líquido) o en un soporte sólido. Un soporte sólido, para los propósitos de la invención, puede ser cualquier material que sea una matriz insoluble y que pueda tener una superficie rígida o semi-rígida para que una molécula de interés (por ejemplo, los reactivos del péptido de la invención, las proteínas del prión, los anticuerpos, etc) pueden enlazarse o unirse. Ejemplos de soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, substratos tales como polivinilcloruro de nitrocelulosa, polipropileno, poliestireno, látex, policarbonato, nylon, dextran, chitin, arena, sílice, piedra pómez, agarosa, celulosa, vidrio, metal, poliacrilamida, silicón, plástico, polisacáridos, fluoruro de polivinilo, papel diazotizado, perlas activadas, perlas sensibles magnéticamente y cualquiera de los materiales usados comúnmente para la síntesis de fase sólida, separaciones de afinidad, purificaciones, reacciones de hibridación, inmunoensayos y otras aplicaciones. El soporte puede ser particulado o puede estar en la forma de una superficie continua e incluye membranas, mallas, placas, peletizados, portaobjetos, discos, capilares, fibras huecas, agujas, alfileres, astillas, fibras sólidas, geles (por ejemplo, geles de sílice) y perlas, (por ejemplo, perlas de vidrio porosas, geles de silicio, perlas de poliestireno reticuladas opcionalmente con divinilbenceno, perlas co-poli injertadas, perlas de poliacrilamida, perlas de látex, perlas de dimetilacrilamida reticuladas opcionalmente con N-N' -bis-acrüoüetüendiamina, perlas magnéticas de óxido de hierro y partículas de vidrio cubiertas con un polímero hidrofóbico. Los reactivos del péptido descritos en la presente pueden acoplarse fácilmente al soporte sólido usando técnicas estándar. La inmovilización del soporte puede mejorarse acoplando primero el reactivo del péptido a una proteína (por ejemplo, cuando la proteína tiene mejores propiedades para enlazar la fase sólida) . Las proteínas de acoplamiento adecuadas incluyen pero no se limitan a, macromoléculas tales como albúminas de suero que incluyen albúmina de suero bovina (BSA) , hemocianina de una variedad de lapa, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbú ina, y otras proteínas bien conocidas por aquellos expertos en el arte . Otros reactivos que pueden usarse para enlazar moléculas al soporte incluyen polisacáridos, ácidos polüácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y similares. Tales moléculas y métodos que acoplan estas moléculas a las proteínas son bien conocidos por aquellos expertos en el arte. Ver por ejemplo, Brinkley, M. A. , (1992) Bioconjugate Chem., 3: 2-13; Hashida et al. (1984) J. Appl . Biochem. , 6_ : 56-63; y Anjaneyulu y Staros (1987) Intermational J. of Peptide and Protein Res . 30: 117-124. Si se desea, las moléculas que van a ser agregadas al soporte sólido pueden funcionalizarse fácilmente para crear porciones de estireno o acrilato, permitiendo así, la incorporación de las moléculas en el poliestireno, poliacrilato u otros polímeros tales como poüimida, poliacrilamida, polietileno, polivinilo, polidiacetileno, polifenileno-vinileno, polipéptido, polisacárido, poüsulfona, polipirrol, polümidazol, politiofeno, poliéter, epoxis, vidrio de sílice, gel de sílice, siloxano, polifosfato, hidrogel, agarosa, celulosa y similares.

Los reactivos del péptido pueden unirse al soporte sólido a través de la interacción de un par que se enlaza a las moléculas. Tales pares de enlace son bien conocidos y los ejemplos se describen en otra parte en la presente. Un miembro del par de enlace se acopla mediante técnicas descritas anteriormente al soporte sólido y al otro miembro del par de enlace se une al reactivo del péptido (antes, durante o después de la síntesis) . El reactivo del péptido así modificado puede contactarse con la muestra y la interacción con el prión patogénico, si está presente, puede ocurrir en la solución después de que el soporte sólido puede ponerse en contacto con el reactivo del péptido (o complejo del prión del péptido) . Los pares de enlace preferidos para esta modalidad incluyen biotina y avidina, y biotina y estreptavidina. También pueden usarse controles adecuados en los ensayos de la invención. Por ejemplo, un control negativo de PrPc puede usarse en los ensayos. Un control positivo de PrPSc (o PrPres) también podrían usarse en los ensayos. Tales controles pueden opcionalmente ser etiquetados detectablemente . Pueden aplicarse distintas variaciones y combinaciones usando los reactivos del péptido de la invención en los ensayos de la invención. Los siguientes ejemplos no limitantes se describen como ilustración.

En ciertas modalidades, se describen ensayos para detectar priones en una muestra biológica. En tales métodos, el reactivo del péptido de la invención puede usarse como un reactivo de captura para los priones patogénicos en una muestra biológica o no biológica. En tal modalidad, un soporte sólido (por ejemplo, perlas magnéticas) se hace reaccionar primero con un reactivo del péptido como se describe en la presente, que interactúa preferentemente con los priones patogénicos tal que el reactivo del péptido se inmoviliza suficientemente al soporte. El soporte sólido se pone en contacto con una muestra que se sospecha contiene priones patogénicos bajo condiciones que permiten el reactivo del péptido para enlazar a los priones patogénicos. Siguiendo la eliminación del material de la muestra no enlazada, los priones patogénicos enlazados pueden ser disociados a partir del reactivo del péptido y detectarse usando cualquier mecanismo de detección conocido, que incluye pero no se limita a Western Blot y ELISA, por ejemplo, como se describe abajo en los ejemplos y referencias citadas allí. Alternativamente, los priones patogénicos de enlace pueden detectarse sin la disociación del reactivo del péptido. Alternativamente, el reactivo del péptido de la invención puede ponerse en contacto con la muestra sospechosa de contener priones patogénicos antes de unirse al soporte sólido, seguido por la unión del reactivo del péptido al soporte sólido (por ejemplo, el reactivo del péptido puede ser biotinilado y el soporte sólido comprende avidina o estreptavidina) . Siguiendo la eliminación del material de la muestra no enlazada, los priones patogénicos pueden disociarse a partir del reactivo del péptido y detectarse usando cualquier mecanismo de detección conocido, que incluye pero no se limita a Western Blot y ELISA, por ejemplo, como se describe abajo en los ejemplos y referencias citadas en la presente. Alternativamente, los priones patogénicos no necesitan disociarse del reactivo del péptido antes de la detección. La detección de los priones patogénicos en la muestra puede realizarse usando un reactivo del péptido descrito en la presente, que interactúa preferentemente con las formas patogénicas. Alternativamente, los priones patogénicos pueden ser detectados mediante reactivos de detección no específicos (por ejemplo, los péptidos o anticuerpos que generalmente se enlazan a PrP) . En ciertas modalidades, siguiendo la disociación del soporte sólido, el prión patogénico capturado se desnaturaliza previo a la detección que puede facilitar la detección permitiendo el uso de reactivos de detección no específicos. Alternativamente, los priones patogénicos capturados pueden desnaturalizarse sin la disociación del reactivo del péptido si, por ejemplo, el reactivo del péptido se modifica para contener un grupo reactivo activable (por •ejemplo, un grupo fotoreactivo) que puede usarse para enlazarse covalentemente al reactivo del péptido y el prión patogénico. Los protocolos tales como ELISA descritos en Ryou et al. (2003) LaJ .Invest. 83(6):837-43 pueden realizarse para cuantificar la cantidad de priones patogénicos eluidos del soporte sólido. (Ver, los Ejemplos). Brevemente, los pozos de una placa de microtitulación se cubren con el prión patogénico capturado que ha sido disociado (eluido) del soporte sólido. La placa (s) puede ser lavada para remover las porciones no enlazadas y se añade una molécula de enlace etiquetada detectablemente tal como un anticuerpo anti-prión o un reactivo del péptido de la invención (ya sea el mismo usado para la captura o uno diferente) . Esta molécula de enlace se permite reaccionar con cualquier prión de la muestra capturado, la placa se lava en presencia de los anticuerpos etiquetados y/o reactivos del péptido etiquetado detectado usando métodos bien conocidos en el arte. La molécula de enlace necesita no ser específica para la forma del prión patogénico pero puede enlazarse a ambas isoformas o un PrP desnaturalizado, con tal de que el reactivo de captura sea específico para- la forma del prión patogénico. En otros ensayos de ejemplo, el reactivo de captura y el prión no se disocian antes de la detección. Por ejemplo, un soporte sólido (por ejemplo, los pozos de una placa de micortitulación) se enlazan a una primera molécula específica de priones específicos (reactivo del péptido) . Una muestra biológica que contiene o se sospecha contiene priones patogénicos se agrega entonces al soporte sólido . Después de un período de incubación suficiente para permitir que cualquier prión se enlacen a la primera molécula, el soporte sólido puede lavarse para remover las porciones no enlazadas y una molécula de enlace secundario etiquetado detectablemente como se describe anteriormente, se añade un anticuerpo secundario anti-PrP o un reactivo del péptido-específico de priones. Alternativamente, una molécula que enlaza a las formas patogénicas y no patogénicas (por ejemplo, el reactivo de captura no específico) puede acoplarse a un soporte sólido (por ejemplo, cubierto sobre los pozos de una placa de microtitulación) y detección pueden realizarse usando un reactivo de detección específica de priones patogénicos (por ejemplo, un reactivo del péptido descrito en la presente) . Otro ensayo de ejemplo es un "intercalado de dos péptidos" pueden usarse para detectar priones (por ejemplo, priones patogénicos) . En esta técnica, el soporte sólido se hace reaccionar con uno o más primeros reactivos del péptido de la invención como se describe en la presente, se lavan para remover el primer reactivo del péptido sin reaccionar y después se expone a la muestra de prueba (por ejemplo, una muestra biológica) sospechosa de contener una proteína del prión patogénico bajo condiciones que permiten la interacción entre el primer reactivo (s) del péptido y cualquier proteína del prión patogénico presente en la muestra. Los componentes de la muestra sin reaccionar se remueven y uno o más reactivos del segundo péptido de la invención se añade bajo condiciones que permiten la interacción del segundo reactivo (s) del péptido para interactuar con cualquier proteína del prión patogénica presente . La interacción entre el primer péptido de la segunda proteína del prión del primer péptido puede detectarse mediante cualquier medio que se conoce en el arte. Típicamente, los reactivos del péptido secundario comprenden una etiqueta detectable. Para estos ensayos, el primer reactivo (s) del péptido y/o el reactivo (s) del segundo péptido interactúan preferentemente con una proteína del prión patogénico. En ciertas modalidades, se usan anticuerpos anti-PrP para detectar las proteínas del prión. Los anticuerpos, anticuerpos modificados y otros reactivos que enlazan a los priones, particularmente a PrPc o el PrP desnaturalizado, se han descrito y algunos de éstos se encuentran comercialmente disponibles (ver ejemplo, anticuerpos anti-prión descritos en Peretz et al., 1997 J. Mol. Biol. 273 : 614; Peretz et al. 2001 Nature 412: 739; Williamson et al. 1998 J. Virol. 72: 9413; Patente U. S. No. 6,765, 088. Algunos de estos y otros se encuentran comercialmente disponibles de, inter alia, InPro Biotechnology, South San Francisco, CA, Cayman Chemicals, Ann Arbor MI; Prionics AG, Zurich; ver también, WO 03/085086 para la descripción de los anticuerpos modificados) . También pueden usarse los reactivos del péptido de la invención en los ensayos de competición. Pueden usarse medios de detección para identificar cuando un ligando se enlaza débilmente a PrPSc que se desplaza por medio de un reactivo del péptido descrito en la presente que es específico para PrPSc. Por ejemplo, una muestra sospechosa de contener PrPSc puede ser absorbida sobre un soporte sólido. Posteriormente, el soporte sólido se combina con un ligando etiquetado detectablemente que se enlaza a PrPSc (por ejemplo, plasminógeno, receptor del laminina y sulfato de heparina) bajo condiciones tales que el ligando etiquetado detectablemente se enlaza a PrPSc. Se detectan los complejos PrPSc. Se añade entonces un reactivo del péptido que enlaza al PrPSc descrito en la presente. La afinidad de enlace del ligando etiquetado detectablemente es más débil que la afinidad de enlace del reactivo del péptido para un prión patogénico. Por consiguiente, puede detectarse el reactivo del péptido que enlaza PrPSc reemplazará al ligando etiquetado y disminuirá las cantidades detectadas de los complejos que indican el ligando etiquetado formado entre el reactivo del péptido y los priones patogénicos de la muestra biológica.

Los reactivos del ensayo descrito anteriormente, que incluye los reactivos del péptido descritos en la presente pueden proporcionarse en kits, con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios para conducir ensayos de detección como los descritos anteriormente. Cuando el reactivo del péptido se absorbe sobre un soporte sólido, el kit puede comprender adicionalmente o alternativamente tales reactivos del péptido absorbidos sobre uno o más soportes sólidos. El kit puede contener además, controles negativos y positivos adecuados como los descritos anteriormente. El kit también puede contener, dependiendo del ensayo de detección particular usado, las etiquetas adecuadas y otros reactivos empaquetados y materiales (es decir, soluciones amortiguadoras y similares) . Aun en otras modalidades adicionales, la invención se refiere a soportes sólidos que comprenden un reactivo del péptido de priones específico patogénico . Se proporcionan también métodos para producir estos soportes sólidos, por ejemplo, mediante (a) proporcionar un soporte sólido; y (b) enlazando al mismo uno o más reactivos del péptido de priones específico patogénico. Los reactivos del péptido específicos de priones pueden usarse además para aislar las proteínas de priones patogénicas usando un soporte de afinidad. Los reactivos del péptido pueden fijarse a un soporte sólido mediante por ejemplo, adsorción, unión covalente, etc., para que los reactivos del péptido retengan su actividad de enlace de priones selectiva. Opcionalmente, pueden ser incluidos grupos más espaciales, por ejemplo para que el sitio de enlace del reactivo del péptido permanezca accesible. Las moléculas inmovilizadas pueden usarse entonces para enlazar a la proteína de priones patogénica de una muestra biológica, tal como sangre, plasma, cerebro, médula espinal u otros tejidos. Los reactivos o complejos del péptido enlazado se recubren a partir del soporte mediante por ejemplo, un cambio en el pH o el prión patogénico puede disociarse del complejo. Muestras que pueden probarse de acuerdo con la invención incluyen cualquier muestra afín para un ensayo del anticuerpo, que incluye muestras del tejido del sistema nervioso (por ejemplo, cerebro, médula espinal, CSF, etc.) sangre y/o otras muestras del tejido de sujetos muertos o vivos. Como se anota arriba, en las modalidades preferidas, las muestras son sangre, producto de la sangre o muestras del tejido obtenidas de un sujeto vivo.

VI. Aplicaciones Adicionales A. Detección Como se describe anteriormente, los reactivos del péptido descritos en la presente pueden usarse para diagnosticar enfermedades relacionadas con un prión en un sujeto. Además, también pueden usarse los reactivos del péptido descritos anteriormente para detectar la contaminación con priones patogénicos en la sangre y/o suministros de comida. Así, el suministro de la sangre puede prepararse de manera que este substancialmente libre de priones patogénicos mediante la separación por exclusión de alícuotas de muestras recogidas individualmente o muestras concentradas descritas en la presente . Las muestras o muestras concentradas que se contaminan con los priones patogénicos pueden eliminarse antes de que se combinen. De esta manera, puede proporcionarse un suministro de sangre substancialmente libre de la contaminación de priones patogénicos. Por "substancialmente libre de priones patogénicos" significa que la presencia de priones patogénicos no se detecta usando cualquiera de los ensayos descritos en la presente. De manera importante, los reactivos del péptido descritos en la presente, que ya han demostrado detectar las formas de proteínas patogénicas en el tejido del cerebro diluyen 106 pliegues por tejido normal, son los únicos reactivos demostrados que pueden ser capaces de detectar priones patogénicos en la sangre . La invención proporciona así, un método para preparar un suministro de sangre que está substancialmente libre de priones patogénicos, el suministro de sangre que comprende sangre entera, células de glóbulos rojos, plasma, plaquetas o suero , el método comprende : a) separación por exclusión de alícuotas de sangre entera, células de glóbulos rojos, plasma, plaquetas o suero recogido de muestras de sangre mediante cualquiera de los métodos de detección proporcionados en la presente para la detección de priones patogénicos; b) eliminar muestras en las que se detectan priones patogénicos; y c) combinar muestras en las que los priones patogénicos no se detectan para proporcionar un suministro sanguíneo que se encuentre sustancialmente libre de priones patogénicos. Semejantemente, el suministro de alimento puede separarse por exclusión para la presencia de priones patogénicos para proporcionar alimento que se encuentra substancialmente libre de priones patogénicos. Así, usando cualquiera de los métodos descritos en la presente, las muestras de organismos vivos proyectados como comida para humanos o el consumo animal puede separarse por exclusión mediante la presencia de priones patogénicos . Las muestras tomadas del producto alimenticio proyectado para ingresar el suministro alimenticio también pueden separarse por exclusión. Las muestras en las que los priones patogénicos se detectan son identificadas y los organismos vivos o alimentos proyectados para ingresar el suministro alimenticio de las muestras en los priones patogénicos se detectaron y se removieron del suministro alimenticio. En esta forma, puede proporcionarse un suministro alimenticio que está sustancialmente libre de priones patogénicos . La invención proporciona así, un método para preparar un suministro alimenticio que está sustancialmente libre de priones patogénicos, el método comprende: a) separar por exclusión una muestra recogida de un organismo vivo que entrará en el suministro alimenticio o una muestra recogida del alimento proyectado para ingresar al suministro alimenticio mediante cualquiera de los métodos de detección proporcionados en la presente para detectar priones patogénicos . b) eliminar muestras en las que se detectan priones patogénicos; y c) combinar muestras en las que los priones patogénicos no se detectan para proporcionar un suministro alimenticio que está sustancialmente libre de priones patogénicos.

B. Purificación Los péptidos de la invención también pueden usarse para remover priones patogénicos de una muestra, ambos con el propósito de aislar el prión patogénico (por ejemplo, para concentrar la proteína de priones antes de la detección) y con el propósito de eliminar el prión patogénico de la muestra (por ejemplo, como un medio para proporcionar una muestra que está substancialmente libre de priones patogénicos. En estos métodos, los reactivos del péptido se proporcionan típicamente en un soporte sólido. El soporte sólido que comprende el reactivo del péptido se pone en contacto con la muestra que contiene el prión patogénico bajo condiciones en las que se enlaza al reactivo del péptido. Si el objetivo es aislar el prión patogénico, la muestra no enlazada se remueve y el soporte sólido que contiene el prión se recoge; si el objetivo es eliminar los priones de la muestra, se recoge la muestra no enlazada. La invención proporciona así, un método para aislar una proteína del prión patogénico de una muestra que comprende : a) proporcionar un soporte sólido que comprende un reactivo del péptido de acuerdo con la invención; b) poner en contacto dicha muestra con el soporte sólido bajo condiciones que permiten el enlace de una proteína de prión patogénica, es está presente en dicha muestra, para el primer reactivo del péptido, para formar un primer complejo y c) remover los materiales de la muestra no enlazada. En una modalidad adicional, dicha proteína de prión patogénica puede ser disociada a partir de el primer complejo. Esta disociación puede realizarse mediante técnicas que son bien conocidas en las artes de la purificación de la proteína.

La invención también proporciona un método para eliminar proteínas de priones patogénicos de una muestra que comprende; a) proporcionar un soporte sólido que comprende un reactivo de acuerdo con la invención; b) poner en contacto al soporte sólido con una muestra sospechosa de contener proteínas de priones patogénicos bajo condiciones que permiten el enlace de las proteínas del prión patogénico si está presente, al reactivo del péptido; y c) recuperar los materiales de la muestra no enlazada.

C. Composiciones La invención se refiere además a composiciones que comprenden reactivos del péptido y/o anticuerpos descritos en la presente (y polinucleótidos que codifican a estos reactivos del péptido y/o anticuerpos) y métodos de uso de estas composiciones en constituciones terapéuticas y profilácticas para el tratamiento o prevención de enfermedades relacionadas con los priones. Además, los anticuerpos, reactivos del péptido (y polinucleótidos que codifican a estos anticuerpos y/o reactivos del péptido) también puede usarse en composiciones, individualmente o en combinación, para propósitos profilácticos (es decir, para prevenir la patogénesis) o terapéuticas (para tratar la enfermedad después de una infección) .

El mecanismo preciso mediante el que las composiciones descritas en la presente actúan para tratar o prevenir enfermedades no es crítica. Sin estar limitado por una teoría, las composiciones descritas en la presente pueden actuar para tratar o prevenir las enfermedades de la estructura mediante uno o más de los siguientes mecanismos: inducción de una respuesta inmune en el sujeto que después se trata o previene el estado de la enfermedad; interacción (por ejemplo, de enlace) para formas no patogénicas que pueden prevenir la conversión a formas no patogénicas; enlazando a formas patogénicas que puede prevenir las consecuencias patogénicas; y/o enlazando a formas patogénicas que pueden prevenir las formas patogénicas para convertir formas no patogénicas adicionales a formas de la enfermedad (Ver por ejemplo, Peretz et al. (2001) Nature 412: 739-743 ensayando la capacidad de ciertas Fabs para inhibir la propagación del prión) . Las composiciones pueden comprender mezclas de uno o más de los reactivos del péptido, anticuerpos y/o polinucleótidos. Estas moléculas pueden obtenerse de una variedad de fuentes, por ejemplo, de proteínas producidas recombinantemente, proteínas producidas sintéticamente, etc. Las composiciones también pueden' administrarse junto con otras moléculas, por ejemplo, los antígenos y agentes inmunoreguladores como las inmunoglobulinas, citoquinas, ünfocinas y quimocinas que incluyen pero no se limitan a IL-2, IL-2 modificadas (cys 125-serl25) , GM-CSF, IL-12, interferón alfa o gama, IP-10, MIP1 y RANTES . Las composiciones pueden administrarse como polipéptidos o, alternativamente, como ácidos nucleicos desnudo (por ejemplo, ADN) , usando vectores virales (por ejemplo, vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores virales asociados con el adeno, vectores alfavirales) o vectores no virales (por ejemplo, liposomas, partículas cubiertas con ácidos nucleicos o proteínas) . Las composiciones también pueden comprender una mezcla del reactivo del péptido y del ácido nucleico que a su vez pueden suministrarse usando las mismas o diferentes modalidades y/o vehículos. Las mismas o diferentes composiciones pueden darse más de una vez (por ejemplo, una administración "cebadora" seguida por una o más "reforzadores") para lograr los efectos deseados. La misma composición puede administrarse como cebador y como uno o más reforzadores. Alternativamente, pueden usarse composiciones diferentes para cebar y reforzar. Las composiciones de la invención son de preferencia farmacéuticamente aceptables y farmacológicamente aceptables. En particular, las composiciones no son preferentemente biológicas o por otra parte indeseables, es decir, el material puede administrarse a un individuo en una formulación o composición sin causar cualquier efecto biológico indeseable o interactuar de una manera nociva con cualquiera de los componentes de la composición en la que está contenida. Las composiciones descritas en la presente comprenderán típicamente una cantidad terapéuticamente efectiva de las moléculas (reactivos del péptido) o secuencias de los nucleótidos que codifican a los mismos anticuerpos dirigidos a estas moléculas y cualquier otro de los componentes mencionados anteriormente como sea necesario. Por "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad que inducirá una respuesta protectora y/o terapéutica en el sujeto no infectado, infectado o no expuesto a un sujeto a • quien se administra. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" caerá relativamente en un amplio rango que puede determinarse a través de ensayos de rutina. La cantidad exacta necesaria variará dependiendo del sujeto que se trata; la edad y la condición general del individuo que a ser tratado; la capacidad del sistema inmunológico del individuo para sintetizar los anticuerpos; el grado de protección deseado, la severidad de la condición que se trata; la composición particular seleccionada y su modo de administración, entre otros factores . En ciertas modalidades, los reactivos del péptido son inmunogénicos y los métodos de la invención comprenden administrar una composición inmunogénica que comprende un reactivo del péptido descritos en la presente, un anticuerpo específico para los priones patogénicos y/o polinucleótidos que codifican estos reactivos del péptido o anticuerpos a un animal . Las composiciones inmunogénicas usadas en la invención comprenden preferiblemente una cantidad inmunológicamente efectiva de estos componentes . Una "cantidad inmunológicamente efectiva" es una cantidad suficiente para permitir que el mamífero aumente una respuesta para una proteína - del prión, preferentemente un prión patogénico. La respuesta inmune resulta generalmente en el desarrollo en el sujeto de una respuesta inmune secretora, celular y/o mediada por el anticuerpo. Normalmente, tal respuesta incluye pero no se limita a uno o más de los siguientes efectos; la producción de anticuerpos de cualquiera de las clases inmunológicas, tales como inmunoglobulinas A, D, E, G o M; la proliferación de linfocitos B y linfocitos T, la provisión de activación, crecimiento y señales de diferenciación a las células inmunológicas; expansión de las células T auxiliadoras, células T supresoras y/o células T citotóxicas. La cantidad de anticuerpos producidos variará dependiendo de varios factores que incluyen el animal usado, la presencia de un adyuvante, etc. , Las composiciones de la invención pueden comprender uno o más adyuvantes. Los adyuvantes adecuados para usarse en la invención incluyen uno o más de los siguientes: Enterotoxina inestable al calor de la E. coli ("LT") o mutantes detoxificados de los mismos tales como mutantes K63 o R72; Toxina de la cólera ("CT") o mutantes destoxificados de los mismos; -Micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a ~150 µm en diámetro, más preferiblemente ~200 nm a ~300 µm en diámetro, y más preferiblemente ~500 nm a ~10 µm en diámetro) formada de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, poli (ácido a-hidroxi) , ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.) - un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno (ver solicitud de patente Internacional WO 99/52549) ; - un tensoactivo de éster de sorbitan polioxietileno en combinación con un octoxinol (ver la solicitud de patente Internacional WO 01/21207) o un éter de alquil polioxietileno o tensoactivo de éster en combinación con al menos un tensoactivo no iónico adicional tal como un octoxinol (ver la solicitud de patente Internacional WP 01/21152) ; quitosan (por ejemplo, la solicitud de patente Internacional WO 99/27960) - un oligonucleótido inmunoestimulador (por ejemplo, un oligonucleótido CpG) y una saponina (ver la solicitud de patente Internacional WO 00/62800) -ARN de hebra doble inmunoestimulador. -compuestos de aluminio (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, hidroxifosfato de aluminio, oxihidróxido, ortofosfato, sulfato etc. (ver por ejemplo, capítulos 8 y 9 de Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & ?ewman, Plenum Press 1995 (ISB? 0-4306-4867-X) (más adelante "diseño de vacunas"), o mezclas de compuestos de aluminio diferentes, con los compuestos que toman cualquier forma conveniente (por ejemplo, gel, cristalino, amorfo etc.), y que se prefiere con adsorción; -MF59 (5% de escualeno, 0.5% Tween 80 y 0.5% de Span 85, formulado en partículas de submicras usando un microfluidizador) (ver el capítulo 10 de Vaccines design; ver también la solicitud de patente Internacional WO 90/14837) ; - liposomas (ver los capítulos 13 y 14 de diseño de vacunas) ; -ISCOMs (ver el capítulo 23 de diseño de vacunas) ; -SAF, que contiene 10% de escualeno, 0.4% Tween 80,5% de polímero L121 de bloque plurónico y thr-MDP ya sea microfluidizado en una emulsión de submicras o sometido a un vótice para generar una emulsión de tamaño de partícula grande (ver el capítulo 12 de diseño de vacunas) ; -Sistema adyuvante Ribi™ (RAS) (Ribi Immunochem) que contiene 2% de escualeno, 0.2% de Tween 80, y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste de monofosforolípidos A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TDM) , y una estructura de pared celular (CWS) , preferentemente MPL + CWS (Detox™) ; - adyuvantes de saponina tales como QuilA o QS21 (ver el capítulo 22 de diseño de vacunas) , también conocido como Stimulon™; ISCOMs que puede estar desprovisto de un detergente adicional (solicitud de patente Internacional WO 00/07621) ; - el adyuvante de Freund completo (CFA) y el adjuvante de Freund incompleto (IFA) ; citoquinas, como las interleucinas (por ejemplo, IL- 1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo, interferón-?) , factor que estimula la colonia de macrófagos, factor de la necrosis de tumor, etc. (Ver, capítulos 27 y 28 de Diseño de Vacunas) ; - Lípido A monofosforilo (MPL) o 3-O-deacüatado MPL (3dMPL) (por ejemplo, capítulo 21 de Diseño de Vacunas) ; - Combinaciones de 3dMPL con por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua (solicitudes de patente Europeas 0835318, 0735898 y 0761231); Oligonucleótidos que comprenden porciones CpG (ver Krieg (2000) Vaccine, 19:618-622; Krieg (2001) Curr. Opin. Mol.

Ther., 2001,3:15-24; WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/40100, WO 98/55495, WO 98/37919 y WO 98/52581, etc.,) es decir, que contienen al menos un dinucleótido CG, - Un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno (solicitud de patente Internacional WO 99/52549) ; - Un tensoactivo de éster de sorbitan de poliexietileno en combinación con un octoxinol (solicitud de patente Internacional WO 01/21207) o un éter de alquil polioxietileno o tensoactivo del éster en combinación con por lo menos un tensoactivo no iónico adicional tal como un octoxinol (solicitud de patente Internacional WO 01/21152) ; un oligonucleótido inmunoestimulador (por ejemplo, un oligonucleótido CpG) y una saponina (solicitud de patente Internacional WO 00/62800) ; - un inmunoestimulante' y una partícula de sal metálica (la solicitud de patente Internacional WO 00/23105) ; una saponina y una emulsión de aceite en agua (solicitud de patente Internacional WO 99/11241) ; y - una saponina (por ejemplo, QS21) + ' 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) (solicitud de patente Internacional WO 98/57659) . Los péptidos de muramilo incluyen pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonü-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acteil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamato (no-MDP) , N-acetümuramü-L-alanü-D-isoglutaminü-L-alanina-2- (1' -2' -dipalmitoü-sn-glicero-3-huidroxifosforüoxi) -etilamina (MTP- PE) , etc. Otros adyuvantes convenientes para administración mucosal o parenteral también están disponible (por ejemplo, ver capítulo 7 de Diseño de Vacunas: the subunit and adjuvant approach, edc . Powell & Newman, Plenum Press 1995 (ISB? 0- 306-44867-X) . Los mutantes de LT son adyuvantes preferidos (por ejemplo, adyuvantes de mucosas) en particular, mutantes "K63" y "R72" (por ejemplo, ver la solicitud de patente Internacional WO 98/18928) , que resultan en una respuesta inmune mejorada. Las micropartículas también son útiles y se derivan preferentemente de un poli (a-ácido hidroxi), en particular, de un poli (lactido) ("PLA"), un copolímero de D,L-lactido y glycolido o ácido glicólico, tal como un poli (D,L-lactido-co-glicoüdo) ("PLG" o"PLGA"), o un copolímero de D,L-lactido y caprolactona. Las micropartículas pueden derivarse de cualquiera de varios materiales de inicio poliméricos que tienen una variedad de pesos moleculares y, en el caso de los copolímeros tales como PLG, una variedad de lactidos: proporciones del gücóüdo, la selección de que será ampliamente una materia de opción. Los priones, anticuerpos y/o polinucleótidos pueden atraparse dentro de las micropartículas o pueden absorberse de ellas. Se prefiere una trampa dentro de las micropartículas de PLG. Las micropartículas PLG se discuten en detalle adicional en Morris et al., (1994), Vaccine, 12:5-11, en el capítulo 13 de Mucosal Bacines, eds. Kiyono et al., Academic Press 1996 (ISBN 012410587) , y en los capítulos 16 & 18 de vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X) . Los mutantes LT pueden usarse ventajosamente en combinación con el antígeno que atrapa micropartículas, resultando en respuestas inmunes .significativamente mejoradas. Se prefieren los compuestos de aluminio y MF59 para el uso parenteral . Típicamente, las composiciones se preparan como inyectables, o como soluciones líquidas o suspensiones; las formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, vehículos líquidos previo a la inyección también pueden prepararse. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en los liposomas para el efecto adyuvante mejorado, como se discutió anteriormente. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden usarse también en las composiciones de la invención, por ejemplo, las sales minerales tales como los clorhidratos, bromhidratos o sulfatos, así como sales de ácidos orgánicos tales como los acetatos, proprionatos, malonatos o benzoatos. Los substratos de proteína especialmente útiles son las albúminas de suero, hemocianina de una variedad de lapa, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobuüna, ovalbúmina, toxoide del tétano, y otras proteínas bien conocidas por aquellos expertos en el arte. Las composiciones de la invención también pueden contener líquidos o excipientes, tales como el agua, solución salina, glicerol, glucosa, etanol o similares, individualmente o en combinación, así como substancias tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes o agentes que amortiguan el pH. Un portador está opcionalmente presente en una molécula que no induce la producción de anticuerpos dañinos al recibir individual la composición. Los portadores adecuados típicamente son macromoléculas metabolizadas lentamente, grandes tales como las proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados de lípidos (como gotas de aceite o liposomas) , y partículas del virus inactivas. Tales portadores se conocen bien por aquellos expertos en el arte. Además, uno o más polipéptidos en la composición pueden conjugarse a un toxoide bacteriano, tal como el toxoide de la difteria, del tétanos, cólera, etc., D. Administración Las composiciones de la invención pueden administrarse en una dosis sencilla, o como parte de un régimen de administración. Los ácidos nucleicos y/o péptidos pueden administrarse por cualquier modalidad que incluye, pero no se limitan a intramuscularmente, intramucosalmente, subcutáneamente, intradermalmente, transdermalmente, intravaginalmente, intrarectalmente, oralmente e/o intravenosamente. El régimen de dosis puede incluir dosis de imprimado e impulso, que pueden administrarse mucosalmente, parenteralmente o varias combinaciones de las mismas. En ciertas modalidades, uno o más componentes de las composiciones se administran parenteralmente o mucosalmente. Las rutas apropiadas para administración parenteral incluyen rutas intramuscular (IM) , subcutánea, intravenosa, intraperitonal , intradermal, transcutanea y transdermal (ver por ejemplo la Solicitud de patente Internacional WO 98/20734) , así como la administración al espacio intersticial de un tejido. Las rutas apropiadas de administración mucosal incluyen rutas oral, íntranasal, intragastrica, pulmonar, intestina, rectal, ocular y vaginal. La composición puede adaptarse para administración mucosal. Por ejemplo, donde la composición es para administración oral, puede estar en forma de tabletas o cápsulas opcionalmente recubiertas de forma entérica, líquidos, plantas transgénicas, etc. Donde la composición para administración intranasal, puede estar en forma de rocío nasal, gotas nasales, gel o polvos. El tratamiento de dosis puede ser un programa de dosis sencillo o un programa de dosis múltiple. Las composiciones (o componentes de las mismas) también pueden encapsularse, absorber a, o asociarse con, portadores de partículas . Tales portadores presentan copias múltiples de una antígeno seleccionado para el sistema inmune y promueven el atrape y retención de antígenos en los ganglios linfáticos locales . Las partículas pueden ser fagocitosas por macrófagos y pueden aumentar la presentación del antígeno a través de la liberación de citoquina. Los ejemplos de portadores particulares incluyen aquellos derivados de polímeros de polimetil metacrilato, así como micropartículas derivadas de poli (lacturos) y poli (lactura-co-gücoluros) , conocidos como PLG. Ver, por ejemplo Jeffery et al., Pharm. Res (1993) 10^:365-368; McGee JP et al., J Microemcapsul . 14 (2) : 197-210, 1997; O'Hagan DT, et al., Vaccine 11 (2) : 149-54, 1993. Las micropartículas apropiadas también pueden fabricarse en presencia de detergentes cargados, tales como detergentes aniónicos o catiónicos para proporcionar micropartículas con una superficie que tiene una carga negativa pura o positiva pura. Por ejemplo, las micropartículas fabricadas con detergentes aniónicos, tales como bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) , esto es micropartículas CTAB-PLG, absorben macromoléculas negativamente cargadas, tal como ADN. (ver por ejemplo, Solicitud Internacional Número PCT7US99/17308) .

Adicionalmente, otros sistemas de partículas y polímeros pueden usarse para la administración ín vivo o ex vivo. Por ejemplo, los polímeros tales como polilisina, poliarginina, poliornitina, espermina, espermidina, así como conjugados de estas moléculas, son útiles para transferir un ácido nucleico de interés. Similarmente, la transfección mediada por dextrano DEAE, precipitación de fosfato de calcio o precipitación usando otras sales inorgánicas insolubles, tal como fosfato de estroncio, silicatos de aluminio incluyendo bentonita y caolín, óxido crónico, silicato de magnesio, talco y similares, encuentra uso con los presentes métodos. Ver, por ejemplo Felgner, O.L., Advanced Drug Delivery Reviews (1990) 5: 163-187, para una revisión de los sistemas de administración útiles para la transferencia de genes. Los peptoides (Zuckerman, R .N. , et al., Patente EUA ?o. 5,831,00 publicada el 3 de Noviembre de 1998, incorporado en la presente para referencia) también puede usarse para administrar un constructo de la presente invención. Como se nota arriba, los péptidos (o anticuerpos) también pueden administrarse a ácidos nucleicos que codifican estas moléculas. La secuencia deseada se inserta en un vector uni-cistrónico o multi-cistrónico que contiene los elementos de control seleccionados (por ejemplo, promotores, aumentadores, etc.) . Una vez completos, los constructos pueden administrarse usando los protocolos de administración de genes estándar que incluyen, por ejemplo inyección usando ya sea una jeringa convencional (por ejemplo, Patentes EUA Nos. 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466) o una pistola de genes, tal como el sistema de administración de genes Accell® (PowderJect Technologies, Inc., Oxford, Inglaterra); usando sistemas basados en virus tales como sistemas retrovirales como se describe en (Patante EUA No. 5,219,740), sistemas adenovirales (Barr et al., Gene Therapy (1994) 1 : 51-58; Berkner, K.L. BioTechniques (1988) 6_ : 616-629; and Rich et al., Human Gene Therapy (1993) 4_: 461-476) , sistemas de virus asociados con adeno (AAV) (Patentes EUA Nos. 5,173,414 y 5,139,941), sistemas virales de viruela, sistemas de administración viral en vacuna (ver, por ejemplo Publicación Internacional No. WO 94/26911), sistemas de virus de la viruela aviar, tal como los virus de la viruela de canario y viruela de pollo, sistemas de administración de virus alfa (Patentes EUA Nos. 5,843,723; 5,789,245; 6,342,372; 6,329,201) así como otros sistemas virales; sistemas no virales tales como liposomas cargadas o no cargadas (ver, por ejemplo Hug and Sleight, Biochim. Biophys. Acta. (1991) 1097:1-17; Straubinger et al., Methods of Enzymology (1983), Vol. 101, pp. 512-527; Felgner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1987) 84: 7413-7416) ) ; y/o composiciones de cocleato lípido similares a aquellas descritas por Papahadjopoulos et al., Biochem, Biophys. Acta. (1975) 394:483-491. Ver, también Patentes EUA Nos . 4,663,161 y 4,871,488. Los polinucleótidos pueden administrarse ya sea directamente al sujeto vertebrado o, alternativamente, administrarse ex vivo a las células derivadas del sujeto y las células reimplantarse en el sujeto . Los métodos de la invención comprenden además tratar o prevenir una enfermedad relacionada con prión al administrar a un animal una composición que comprende una cantidad efectiva de los anticuerpos de la invención. Los métodos de tratamiento pueden combinar cualesquiera de las composiciones descritas en la presente, por ejemplo composiciones que contienen péptido y/o composiciones de anticuerpos. Los diversos componentes pueden administrarse juntos o separadamente. Los animales apropiados para usarse en los métodos de la invención incluyen humanos y otros primates, incluyen primates no humanos tales como chimpancés, y otros simios y otras especies de simios y monos; animales de granja tales como ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos, animales domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio que incluyen roedores tales como ratones, ratas, hámster y conejillos de indias; pájaros, incluyendo pájaros domésticos, silvestres y de juego tales como pollos, pavos y otros pájaros gallináceos, patos, gansos y similares. Los animales apropiados para usarse en la invención pueden ser de cualquier edad, incluyendo tanto adultos como recién nacidos . También pueden usarse animales transgénicos en la invención. Ver generalmente, Prusiner "Prions" Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1998) 9_5: 13363-13383 para una discusión de animales transgénicos actualmente usados para estudiar enfermedades relacionadas con prión. Las composiciones de la invención pueden usarse para tratar o prevenir enfermedades relacionadas con prión. Tales enfermedades relacionadas con prión incluyen una enfermedad causada en su totalidad o en parte por una proteína de prión patogénica (PrPSc) . Las enfermedades relacionadas con prión incluyen urticaria, encefalopatías esponguiformes de bovino (BSE) , enfermedad de vacas locas, encefalopatías espongiformes de felinos, kuru, enfermedad Creutzfeldt-Jakob (CJD) , enfermedad Gerstmann-Strassler-Scheinker (GSS) e insomnio familiar fatal (FFI) .

EJEMPLOS Abajo están ejemplos de modalidades específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos únicamente, y no se pretenden que limiten en alcance de la presente invención de ninguna manera . Se hacen esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo cantidades, temperaturas, etc.), pero algunos errores experimentales y de desviación podrán, por supuesto, presentarse.

Ejemplo 1: Producción del Reactivo de Péptidos Fragmentos de péptidos de proteínas de prión se sintetizan químicamente usando las técnicas de síntesis de péptido estándar, esencialmente como se describe en Merrifield (1969) Advan. Enzymol. 32: 221 and Holm and Medal (1989), Múltiple column peptide synthesis, p. 208E, Bayer and G. Jung (ed.), Peptides 1988, Walter de Gruyter & Co . Berlin-N.Y. Los péptidos se purifican por CLAR y la secuencia se verifica por espectroscopia de masa. En ciertos casos, los péptidos sintetizados incluyen residuos adicionales en la terminación N o C, por ejemplo residuos GGG y/o incluyen una o más substituciones de aminoácidos en comparación con las secuencias de tipo silvestre .

A. Substituciones peptoides También pueden hacer substituciones peptoides en el péptido presentado en SEQ ID NO: 14 (QWNKPSKPKTN, que corresponde a los residuos 97 hasta 107 de SEQ ID NO: 2), SEQ ID NO: 67 (KKRPKPGGWNTGG, que corresponde a los residuos 23-26 de SEQ ID NO: 2) y SEQ ID NO: 68 (KKRPKPGG) , que corresponde a los residuos 23-20 de SEQ ID NO: 2) . En particular, uno o más residuos de prolina de estos péptidos se substituyen con varios peptodies substituidos en N. Ver, la figura 3 para peptoides que pueden substituirse por cualquier prolina. Los peptoides se preparan y sintetizan como se describe en las Patentes EUA Nos. 5,877,278 y 6,033,631 ambas de las cuales se incorporan para referencia en su totalidad en la presente; Simón et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:9367.

B. Multimerización Ciertos reactivos de péptido también se preparan como multimeros, por ejemplo al preparar repeticiones en tándem (copias múltiples ligadas de un péptido por medio de enlazadores tales como GGG) , péptidos antigénicos múltiples (MAPS) y/o péptidos enlazados linealmente. En particular, los MAPS se preparan usando técnicas estándar, esencialmente como se describe en Wu et al., (2001) J Am Chem Soc. 2001 123(28): 67778-84; Spetzler et al. (1995) Int J Pept Protein Res. 45(1): 78-85. Los péptidos lineales y ramificados (por ejemplo, multimerización del enlazador PEG) también se preparan usando enlazadores de polietilen glicol (PEG) , usando técnicas estándar. En particular, se crean andamiajes PEG de péptidos múltiples ramificados con las siguientes estructuras: Biotina-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys (sin péptido de control) y Biotina-PEG-Lys (péptido) -PEG-Lys (péptido) -PEG-Lys (péptido) -PEG-Lys (péptido) -PEG-Lys (péptido) . Además, el péptido para las ligaciones Lys se preparan: Lys-epsilon-NH-CO- (CH2) 3-Mal-S-Cys-péptido, ver figura 5.

C. Biotinilación Los péptidos se biotinilan usando técnicas estándar después de la síntesis sin purificación. Se agrega biotina la terminal N o C del péptido.

Ejemplo 2: Ensayos de enlace A. Descarte Los reactivos de péptido como se describen en la presente se prueban para su capacidad para enlazar específicamente a proteínas prión usando ensayo de bajado de perlas magnéticas. Para este ensayo, los reactivos de péptido se etiquetan con biotina, que se permite que se enlace a las perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina.

Se preparan homogeneizados cerebrales a partir de ratones Balb-c RML prpSc+ y PrPc+ . En breve 5 ml de solución amortiguadora TBS (Tris-HCl 50 mM pH 7.5 y NaCl 37.5 mM) con TW20 al 1% y tritón 100 al 1% agregado a los cerebros pesando -0.5 g para producir un homogeneizado al 10%. La mezcla espesa cerebral se hace saltar hasta que las partículas grandes desaparecen. Se diluyen alícuotas de 200 µl 1:1 en solución amortiguadora agregada a tubos eppendorf previamente enfriados y las muestras se sonican durante varias repeticiones de varios segundos cada una. Las muestras se centrifugan durante 10-15 minutos a 500x y se remueven los sobrenadantes . Para probar el efecto de la digestión de proteinazsa K se dividen ciertos sobrenadantes en 2 muestras y se agrega 4 µl de proteinasa K a una muestra y se gira a 37°C durante 1 hora. Ocho microlitros de PMSF se agregan a los tubos de proteinaza K para detener la digestión y los tubos se incuban durante un mínimo de una hora a 4°C. Se almacenan los homogeneizados a 4°C hasta que se usan y se sonican nuevamente como se describe arriba si es necesario. Una preparación PrPc+ o PrPSc+ al 10% p/v de los homogenados cerebrales se incuba durante la noche a 4°C con un reactivo de péptido etiquetado en biotina, como sigue. Tubos que contienen 400 µl de solución amortiguadora, 50 µl de extracto y 5 µl de reactivo de péptido etiquetado en biotina (solución de reserva 10 mM) se preparan. Los tubos se incuban durante un mínimo de 2 horas a temperatura ambiente o durante noche a 4°C en una plataforma osciladora. Después de la incubación, se agregan 50 µl de perlas SA (Dynal M280 estreptavidina 112.06) y los tubos se mezclan por vórtice. Los tubos se incuban, con el oscilador (VWR, plataforma oscialdora, modelo 100) , durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C. Se remueven las muestras del agitador, se colocan en un campo magnético para colectar las perlas magnéticas con reactivo de péptido enlazado y prión y se lavan 5-6 veces usando 1 ml de solución amortiguadora de ensayo. Las muestras se usan inmediatamente o se almacenan a -20 °C hasta el Western Blotting o ELISA, como se describe abajo.

B. Western Blotting Se realiza el análisis de Western Blotting como sigue. Complejos perla-péptido-prión precipitados como se describe arriba se desnaturalizan después del lavado natural al agregar 25-30 µl de solución amortiguadora SDS (Novex Trsi-Glycine solución amortiguadora de muestra SDS 2X) agregado a cada tubo. Los tubos se mezclan por vórtice hasta que todas las perlas se suspenden. Los tubos se hierven hasta que las partes superiores comienzan a abrirse, se corre en un gel SDS-PAGE estándar y se transfiere a. una membrana sólida para análisis WB . La membrana se bloquea durante 30 minutos en leche al 5%/TBS-T [50 ml Tris 1 M pH 7.5; NaCl 37.5 ml 4M, 1-10 mL Tween llevado hasta un volumen de 1L con leche] a temperatura ambiente. Entre 10-15 ml de anticuerpos policlonales antiprión, como se describe en la Solicitud Internacional No . PCT/US03/31057 presentada el 30 de Septiembre dé 2003, titulada "Quimeras prión y usos de las mismas" se agregan a una dilución de 1:50 veces a la membrana y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana se lava múltiples veces en TBS-T. Después de lavado el anticuerpos secundario (anticuerpo IgG anticonejo de cabra (H+L) (Pierce) conjugado con fosfataza alcalina (AP) se agrega a un dilución 1:1000 (en TBS-T) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. La membrana se lava múltiples veces en TBS-T. Se agrega reactivo precipitante de fosfatasa alcalina (una etpa NBT/BCIP (Pierce) y se desarrolla hasta que un respaldo aparente o señal se presenta.

C. ELISA Después del lavado final, los complejos perla-péptido descritos arriba se desnaturalizan con guanidina tiocianato y el ELISA se realiza en la proteína desnaturalizada como se describe previamente en Ryou et al. (2003) Lab Invest. 83(6) : 837-43. Los valores O.D. sobre controles en blanco (en el rango desde .172-.259) se consideran positivos.

D. Resultados Los resultados de la Western Blotting y enlace ELISA se resumen en la Tabla 2. En breve, la digestión de la proteína K de homogeneizados cerebrales no es necesaria con objeto de detectar el enlace especifica de los reactivos de péptido como se describen en la presente para enlazarse a PrPSc . Como se muestra en la figura 4, en ningún caso se observa enlace a los homogeneizados cerebrales de tipo silvestre, lo que indica que los reactivos péptidos se enlazan a PrPSc específicamente. Adicionalmente, los análisis de Western Blotting descritos arriba detectan PrPSc sobre 4 logs de dilución mientras que ELISA fue ' al menos 10X más sensible que el Western Blotting .

Tabla 2 1: Intensidad de señal relativa evaluada relativamente 2 : Ciclizado 3: Residuos GGGG agregados/insertados en la posición indicada 4: Residuos GGG agregados/insertados en la posición indicada 5: Residuos GG agregados/insertados en la posición indicada 6: Residuos KKK agregados/insertados en la posición indicada ND = no determinada También se realiza el barrido de alanina para identificar residuos involucrados en el enlace. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Tabla 3 Además, como se muestra en la tabla 4, el enlace a PrPSc or reactivos de péptido que tienen SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68 se aumenta además por las substituciones en los residuos de prolina por n número de glicinas substituidas en N (peptoides) Tabla 4 1 El enlazador GGG opcional no se presenta en los reactivos de péptido en los experimentos mostrados en esta tabla Adicionalmente, la multimerización de reactivos de péptido enlazados a PrP?c también mejora la afinidad para PrPSc. En particular, las repeticiones en tándem dan señales más fuertes (como se mide por la Western Blotting) que las copias sencillas . Las formas MAP previamente derivadas en perlas incrementan el enlace en ciertos casos hasta 2 veces. Sin embargo, las formas MAP causan la precipitación del péptido en la solución. Los péptidos enlazados linealmente también se prueban para su capacidad para aumentar el enlace sin causar la precipitación.

Ejemplo 3: Producción de anticuerpos Lo siguiente proporciona un ejemplo de un protocolo que puede usarse para generar anticuerpos para los reactivos de péptido de la invención. Se inmunizan ratones con una composición que comprende un reactivo de péptido como se describe en la presente (por ejemplo cualesquiera de SEQ ID NOs : 12-108, preferiblemente cualesquiera de SEQ ID ?Os : 14, 35, 50, 51, 56, 57, 65, 66, 67, 68, 72, 73, 77, 81, 82) ya sea IM (intramuscular) o IP (intraperitonal) el día 0, seguido por 2-5 elevaciones a intervalos de no más frecuentemente que cada 2 semanas. Se colecta la sangre antes de la primera inmunización y luego de 7 días después de cada elevación para monitorear la respuesta humoral al antígeno. Se toman 6 sangrados de ojo orbital de cada animal (3 de cada ojo) de aproximadamente 0.2 mis o menos por sangrado. La elevación final se administra por inyección IV (intravenosa) . Tres días después de la elevación final, los ratones se les provoca la eutanasia por exposición a C02 o isofluorano seguido por dislocación cervical. Se cosechan entonces los bazos para producción de hibridoma. Se usa adyuvante Freund, completo, como un adyuvante para la primera inyección seguido por adyuvante Freund incompleto para las infecciones restanters, excepto para la infección IV. La inyecciones IV se preparan en solución salina. No obstante que las modalidades preferidas de la actual invención se han descrito en algún detalle, se entenderá que pueden hacerse variaciones obvias sin salir del espíritu y alcance de la invención como se define en la presente. Se hace constar que con esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a cabo la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (55)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un reactivo de péptido aislado caracterizado porque interactúa preferiblemente con formas patogénicas de una proteína de enfermedad conformacional en comparación con formas no patogénicas de la proteína de enfermedad conformacional .
2. 2. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad conformacional es una enfermedad relacionada con prión, la proteína patogénica es PrPsc, y la forma no patogénica es PrP^
3. 3. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque se deriva de un fragmento de una proteína de prión.
4. 4. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el péptido contiene un motivo de hélice de tipo II de poliprolina.
5. 5. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque contiene el motivo de la secuencia PXXP, en donde P es una prolina o una glicina N-substituida en y X es cualquier aminoácido.
6. 6. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque contiene el motivo de la secuencia PXXP, en donde P es una prolina o una glicina N-substituida y X es cualquier aminoácido.
7. 7. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se codifica genéticamente .
8. 8. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque se deriva de un péptido seleccionado del grupo que consiste de péptidos que tienen las SEQ ID NOs : 12-132.
9. 9. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque se deriva de un péptido seleccionado del grupo que consiste de péptidos que tienen las SEQ ID NOs: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, y 84.
10. 10. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque se deriva de un péptido seleccionado del grupo que consiste de péptidos que tienen las SEQ ID NOs: 66, 67, 68, 72, 81, 96 , 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 y 127.
11. 11. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque incluye la secuencia de aminoácidos (G)n, donde n= 1, 2, 3 ó 4, en el extremo N-terminal y/o en C- terminal .
12. • 12. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque se biotinila.
13. 13. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque se deriva de un péptido seleccionado del grupo que consiste de péptidos que tienen las SEQ ID NOs: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, y 132.
14. 14. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque incluye la secuencia de aminoácido (G)n, donde n= 1, 2, 3, ó 4, en el extremo N-terminal y/o en el extremo de la C- terminal .
15. 15. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque se biotinila.
16. 16. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque se deriva de un péptido seleccionado del grupo que consiste de péptidos que tienen las SEQ ID NOs : 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 129, 130, 131, y 132.
17. 17. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque se biotinila.
18. 18. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque se deriva de un péptido seleccionado del grupo que consiste de péptidos que tienen las SEQ ID NOs : 56, 57, 65, 82, y 84.
19. 19. El reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque se biotinila.
20. 20. Un polinucleótido, caracterizado porque codifica un reactivo de péptido de conformidad con la reivindicación 7.
21. 21. Un complejo, caracterizado porque comprende el reactivo de péptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2 hasta 19 y una proteína de prión patogénica.
22. 22. Un método para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene un prión patogénico con un primer reactivo de péptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2, 8, 9, 10, 13 ó 16 bajo condiciones que permiten el enlace del primer reactivo de péptido a la proteína de prión patogénica, si se presenta, para formar un primer complejo; y (b) detectar la presencia del prión patogénico, si hay, en la muestra por su enlace al primer reactivo de péptido .
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el primer reactivo de péptido se etiqueta detectablemente.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el primer reactivo de péptido se biotinila.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el primer reactivo de péptido se enlaza a un soporte sólido.
26. 26. Un método para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene un prión patogénico con un primer reactivo de péptido de conformidad con cualesquiera ' de las reivindicaciones 2, 8, 9, 10, 13 ó 16, bajo condiciones que permiten el enlace del primer reactivo de péptido al prión patogénico, si se presenta, para formar un primer complejo; (b) poner en contacto el primer complejo con un segundo reactivo' de péptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2, 8, 9, 10, 13 ó 16 bajo condiciones que permiten el enlace del segundo reactivo de péptido al prión patogénico en el primero complejo, en donde el segundo reactivo de péptido comprende una etiqueta detectable; y (c) detectar la presencia del prión patogénico, si hay, en la muestra por su enlace al segundo reactivo de péptido.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el primer reactivo de péptido y el segundo reactivo de péptido son diferentes .
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el primer reactivo de péptido y el segundo reactivo de péptido son el mismo.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el primer reactivo de péptido se enlaza a un soporte sólido.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el primer péptido se biotinila.
31. 31. Un método para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene un prión patogénico con un primer reactivo de péptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2, 8, 9, 10, 13 ó 16 bajo condiciones que permiten el enlace del primer reactivo de péptido al prión patogénico, si se presenta, para formar un primer complejo; (b) remover los materiales de muestra no enlazados; (c) disociar el prión patogénico del primer complejo; (d) poner en contacto el prión patogénico disociado con un segundo reactivo de péptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2, 8, 9, 10, 13 ó 16 bajo condiciones que permiten el enlace del segundo reactivo de péptido al prión patogénico, en donde el segundo reactivo de péptido comprende una etiqueta detectable; y (e) detectar la presencia del prión patogénico, si hay, en la muestra por su enlace al segundo reactivo de péptido.
32. 32. Un método para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra, caracterizado porgue comprende: (a) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene un prión patogénico con un primer reactivo de péptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2, 8, 9, 10, 13 ó 16 bajo condiciones que permiten el enlace del primer reactivo de péptido al prión patogénico, si se presenta, para formar un primer complejo; (b) remover los materiales de muestra no enlazados; (c) disociar el prión patogénico del primer complejo; (d) poner en contacto el prión patogénico disociado con un reactivo que enlaza al prión bajo condiciones que permiten el enlace del reactivo que enlaza al prión al prión patogénico, en donde el reactivo que enlaza al prión comprende una etiqueta detectable; y (e) detectar la presencia del prión patogénico, si hay, en la muestra por su enlace al reactivo que enlaza al prión.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el reactivo que enlaza al prión es seleccionado del grupo que consiste de anticuerpos anti-prión, polipéptidos híbridos injertados al motivo, polímeros catiónicos o aniónicos, catalizadores de propagación y plasminógenos .
34. 34. Un método para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra, caracterizado porque comprende : (a) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene un prión patogénico con un reactivo que enlaza al prión bajo condiciones que permiten el enlace del reactivo que enlaza al prión al prión patogénico, si se presenta, para formar un primer complejo; (b) remover los materiales de muestra no enlazados; (c) poner en contacto el primer complejo con un reactivo de péptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2, 8, 9, 10, 13 ó 16 bajo condiciones que permiten el enlace del reactivo de péptido al prión patogénico, en donde el reactivo de péptido comprende una etiqueta detectable; y (d) detectar la presencia del prión patogénico, si hay, en la muestra por su enlace al reactivo de péptido.
35. 35. Un método para detectar un prión patogénico en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un soporte sólido que comprende un primer reactivo de péptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2, 8, 9, 10, 13 ó 16; (b) poner en contacto el soporte sólido con una muestra bajo condiciones que permiten a los priones patogénicos, cuando se presentan en la muestra, enlazarse al primer reactivo de péptido; poner en contacto el soporte sólido con un segundo reactivo de péptido etiquetado detectablemente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2, 8, 9, 10, 13 ó 16 bajo condiciones que permiten al segundo reactivo de péptido enlazarse a priones patogénicos enlazados por el primer reactivo de péptido; y, (c) detectar complejos formados entre el primer reactivo de péptido, un prión patogénico de la muestra y el segundo reactivo de péptido, por ello detectando la presencia del prión patogénico en la muestra.
36. 36. Un método para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un soporte sólido que comprende un reactivo que enlaza al prión; (b) poner en contacto el soporte sólido a la muestra bajo condiciones que permiten que las proteínas prión, cuando se presentan en la muestra, se enlacen al reactivo que enlaza al prión; (c) poner en contacto el soporte sólido a un segundo reactivo de péptido etiquetado detectablemente de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2, 8, 9, 10, 13 ó 16; y (d) detectar complejos formados entre el reactivo que enlaza al prión, un prión patogénico de la muestra biológica, y el segundo reactivo de péptido.
37. 37. Un método para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un soporte sólido que comprende a un primer reactivo de péptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2, 8, 9, 10, 13 ó 16; (b) combinar el soporte sólido con un primer ligando etiquetado detectablemente, en donde el primer reactivo de péptido se enlaza con afinidad al primer ligando enlazado detectablemente es más débil que el primer reactivo de péptido se enlaza con afinidad a un prión patogénico; (c) combinar una muestra con el soporte sólido bajo condiciones que permiten a un prión patogénico, cuando se presenta en la muestra, enlazarse al primer reactivo de péptido y reemplazar el primer ligando; (d) detectar complejos formados entre el primer reactivo de péptido y el prión patogénico de la muestra.
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el soporte sólido es seleccionado del grupo que consiste de nitrocelulosa, látex de poliestireno, fluoruro de polivinilo, papel diazotizado, membranas de nylon, perlas activadas, y perlas que responden magnéticamente .
39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la muestra es una muestra biológica.
40. . 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la muestra biológica es seleccionada del grupo que consiste de órganos, sangre entera, fracciones sanguíneas, componentes sanguíneos, plasma, plaquetas, suero, fluido cerebroespinal (CSF),' tejido cerebral, tejido del sistema nervioso, tejido muscular, médula ósea, orina, lágrimas, tejido del sistema no nervioso, órganos, y/o biópsias o necropsias.
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la muestra biológica es sangre entera, plasma, plaquetas, fracciones sanguíneas, o suero.
42. 42. Un soporte sólido, caracterizado porque comprende al menos un reactivo de péptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2, 8, 9, 10, 13 ó 16.
43. 43. Un kit para detectar la presencia de un prión patogénico en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) un soporte sólido de conformidad con la reivindicación 42; y otros reactivos necesarios y, opcionalmente, controles positivos y negativos.
44. 44. Una composición, caracterizada porque comprende un reactivo de péptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2, 8, 9, 10, 13 ó 16.
45. 45. una composición, caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 20.
46. 46. Un método para tratar o prevenir una enfermedad de prión, caracterizado porque comprende administrar a un animal una o más composiciones de conformidad con la reivindicación 44.
47. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el sujeto es un mamífero.
48. 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el mamífero es un humano.
49. 49. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la composición se administra intramuscularmente, intramucosalmente, intranasalmente, subcutáneamente, intradermalmente, transdermalmente, intravaginalmente, intrarectalmente, oralmente o intravenosamente .
50. 50. Un método para tratar o prevenir una enfermedad de prión, caracterizado porque comprende (a) administrar una primera composición que comprende una composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 44 en una etapa de cebado y (b) administrar una segunda composición que comprende una composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 44, como un impulsor, en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune en el sujeto.
51. 51. Un método para aislar una proteína de prión patogénica de una muestra, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un soporte sólido que comprende un reactivo de péptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2, 8, 9, 10, 13 ó 16; (b) poner en contacto la muestra con el soporte sólido bajo condiciones que permiten el enlace de una proteína de prión patogénica, si se presenta en la muestra, al primer reactivo de péptido, para formar un primer complejo y (c) remover los materiales de muestra no enlazados.
52. 52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado además porque comprende la etapa de disociar la proteína de prión patogénico del primer complejo.
53. 53. Un método para eliminar proteínas de prión patogénicas de una muestra, caracterizado porque comprende; (a) proporcionar un soporte sólido que comprende un reactivo de péptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2, 8, 9, 10, 13 ó 16; (b) poner en contacto el soporte sólido con una muestra que se sospecha que contiene proteínas prión patogénicas bajo condiciones que permiten el enlace de las proteínas de prión patogénicas, si se presentan, al reactivo de péptido; y (c) recuperar los materiales de muestra no enlazados.
54. 54. Un método para preparar un suministro sanguíneo que está substancialmente libre de priones patogénicos, el suministro sanguíneo que comprende sangre entera, plasma, plaquetas o suero, el método caracterizado porque comprende: (a) separar por exclusión alícuotas de sangre entera, plasma, plaquetas o suero de las muestras de sangre colectadas, por el método de conformidad con la reivindicación 22; (b) eliminar las muestras en las cuales los priones patogénicos se detectan; y (c) combinar las muestras en las cuales los priones patogénicos no se detectan para proporcionar a un suministro sanguíneo que está substancialmente libre de pri?nes patogénicos .
55. 55. Un método para preparar suministro alimenticio que está substancialmente libre de priones patogénicos, caracterizado porque comprende: (a) separar por exclusión una muestra colectada de organismos vivos que entran en el suministro alimenticio o una muestra colectada del alimento que se pretende que entre al suministro alimenticio, por el método de conformidad con la reivindicación 22; (b) eliminar las muestras en las cuales los priones patogénicos se detectan; y (c) combinar las muestras en las cuales los priones patogénicos no se detectan para proporcionar un suministro alimenticio que está substancialmente libre de priones patogénicos .