KR20060066088A

KR20060066088A - 프리온-특이적 펩티드 시약

Info

Publication number: KR20060066088A
Application number: KR1020067002997A
Authority: KR
Inventors: 멜리사 디. 미쉘리치; 셀린 휴; 로날드 엔. 주커만; 미쉘 디. 콘놀리
Original assignee: 카이론 코포레이션
Priority date: 2003-08-13
Filing date: 2004-08-13
Publication date: 2006-06-15
Also published as: CA2535261A1; ES2398394T3; CA2535261C; AU2009225337A1; JP2010158247A; NZ580256A; NZ545385A; AU2009225337B2; KR101166012B1; US20050118645A1; EP1653844B1; US7439041B2; WO2005016127A3; JP2007502120A; AU2004264953A1; AU2004264953B2; IL173480A0; EP1653844A2; WO2005016127A2; EP1653844A4

Abstract

프리온 단백질의 PrP^SC 형태와 우세하게 상호작용하는 펩티드 시약이 설명되어 있다. 또한, 및 프리온-관련 질환에 대한 검출, 진단, 정제, 치료 및 예방을 위한 시약 또는 시약에 대한 항체를 사용하는 방법이 설명되어 있다.

프리온 단백질, PrPSC, 프리온-관련 질환.

Description

프리온-특이적 펩티드 시약{PRION-SPECIFIC PEPTIDE REAGENTS}

본 발명은 프리온 단백질과 상호작용하는 펩티드시약, 이 펩티드 시약을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이 같은 펩티드 시약과 폴리뉴클레오티드를 사용하여 항체를 제조하는 방법, 및 이 방법을 사용하여 제조된 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이 펩티드 시약을 사용하여 샘플 내 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법 및 이 펩티드 시약을 치료 또는 예방 조성물에서 구성성분으로서 사용하는 방법에 관한 것이다.

단백질 입체구조 질환은, 차례로 비정상 단백질 형태의 자기-결합과 결과적인 조직 침전 및 손상을 가져오는 단백질의 비정상 입체구조 변이 (입체구조 질환 단백질)로부터 발생하는 전염성 해면상 뇌병증을 포함하는 다양한 비관련 질환을 포함한다. 이들 질환은 또한 전형적으로 다양한 길이의 잠복기 후의 진단부터 사망의 급속 진행이라는 임상적 발현형태에서 놀라운 유사성을 공유한다.

한 그룹의 입체구조 질환은 "프리온 질환" 또는 "전염성 해면상 뇌병증 (TSE)"이라고 지칭된다. 사람에서 이들 질병은 크로이츠펠트-야콥병(CJD), 저스만 스트라우슬러 슁크 증후군 (GSS), 치명적 가족성 불면증, 및 쿠루병을 포함한다 (예를 들어, Harrison's Principles of Internal Medicine, Isselbacher 등, eds., McGraw-Hill, Inc. New York, (1994); Medori 등 (1992) N.Engl. J. Med. 326: 444-9 참조). TSE는 동물에서 양 스크래피병, 소 해면상 뇌병증 (BSE), 전염성 밍크뇌증, 및 뮬사슴 및 엘크의 만성 소모성 질환을 포함한다 (Gajdusek, (1990) Subacute Spongiform Encephalopathies: Transmissible Cerebral Amyloidoses Caused by Unconventional Viruses. Pp. 2289-2324 In: Virology, Fields, ed. New York: Raven Press, Ltd.). 전염성 해면상 뇌병증은 영장류, 설치류 및 트랜스유전자 마우스를 포함하는 실험실 동물 내로 실험적으로 접종될 때 질병을 전염시키는 프리온 단백질의 비정상 (베타-풍부, 프로테아제 K 내성) 입체구조의 존재라는 동일한 성질을 특징으로 한다.

최근, 소 해면상 뇌병증의 급속한 전파 및 그것의 사람에서의 해면상 뇌병증 발생 증가와의 관련성으로 인하여, 사람 아닌 포유 동물에서의 전염성 해면상 뇌병증의 검출에 대한 관심이 증가하고 있다. 이들 질환의 뜻밖의 전염의 비극적 결과 (예를 들어, Gajdusek, Infectious Amyloids, and Prusiner Prions In Fields Virology. Fields, 등 , eds. Lippincott-Ravin, Pub. Philadelphia (1996); Brown 등 (1992) Lancet, 340: 24-27), 오염제거의 어려움 (Asher 등 (1986) pages 59-71 In: Laboratory Safety: Principles and Practices, Miller ed. Am. Soc.Micro.), 및 소 해면상 뇌병증에 관한 최근의 우려 (British Med. J. (1995) 311: 1415-1421)는 전염성 해면상 뇌병증에 걸린 사람 및 동물을 확인할 진단 시험법 및 감염된 환자에 대한 치료법 둘 다를 갖는 것의 시급성을 촉발시킨다.

프리온은 해면상 뇌병증 (프리온 질환)을 유발하는 감염성 병원체이다. 프리 온은 박테리아, 바이러스 및 비로이드와 현저하게 다르다. 우세한 가설은, 모든 다른 감염성 병원체와는 달리, 감염이 프리온 단백질의 비정상 입체구조에 의하여 유발되고, 이것이 주형으로서 작용하여 정상적 프리온 입체구조를 비정상 입체구조로 변화시킨다는 것이다. 프리온 단백질은 1980년대 초반에 최초로 특성 결정되었다 (예를 들어, Bolton, McKinley 등 (1982) Science 218: 1309-1311; Prusiner, Bolton 등 (1982) Biochemistry 21: 6942-6950; McKinley, Bolton 등 (1983) Cell 35: 57-62). 예를 들어, Basler, Oesch 등 (1986) Cell 46: 417-428.

프리온 질환의 핵심 특징은, 프리온 단백질의 정상 (세포의 또는 비병원성의) 형태 (PrP^C)로부터 스크래피 단백질로 지칭되기도 하는 비정상적 형태의 단백질 (PrP^Sc)의 형성이다. 예를 들어, Zhang 등 (1997)Biochem. 36 (12): 3543-3553; Cohen & Prusiner (1998) AnnRev. Biochem. 67: 793-819 ; Pan 등 (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 10962-10966; Safar 등 (1993) J Biol Chem 268: 20276-20284 참조. 광학 분광학 및 결정학 연구는, 프리온의 질환관련 형태는 알파-헬릭스 접힘이 우세한 비질환 형태와 비교하여 베타-시트 구조가 유의하게 풍부하다는 것을 밝혔다. 예를 들어, Wille 등 (2001) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99: 3563-3568; Peretz 등 (1997) J. Mol. Biol. 273: 614-622; Cohen & Prusiner, Chapter 5: Structural Studies of Prion Proteins in PRION BIOLOGY AND DISEASES, ed. S. Prusiner, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, pp: 191-228 참조. 구조의 변화 후에는 생화학적 성질의 변화가 수반되는 것으로 보인다: 비변성 세제에서 PrP^C는 가용성이고 PrP^Sc는 불용성이며; PrP^C는 프로테아제에 의하여 쉽게 가수분해됨에 반하여 PrP^Sc는 부분적으로 내성을 가져서 결과적으로 "PrPres" (Baldwin 등 (1995); Cohen & Prusiner (1995)), "PrP 27-30" (27-30 kDa) 또는 "PK-내성" (프로티나제 K 내성) 형태로 알려진 N-말단이 절단된 단편이 형성된다. 또한, PrP^Sc 는 PrP^C를 병원성 입체구조 변환시킬 수 있다. 예를 들어, Kaneko 등 (1995) Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 92:11160-11164 ; Caughey (2003) BrMed Bull. 66: 109-20 참조.

살아있는 피험체 및 살아있는 피험체로부터 얻어지는 샘플에서의 입체구조 질환 단백질의 병원성 이소형의 검출은 어려운 것으로 증명되었다. 그러므로, 환자의 사망 전 이들 전염성 및 아밀로이드 함유 상태에 대한 결정적인 진단 및 경감은 실질적으로 불만족스러운 문제로 남아있다. 뇌 생검의 조직병일학적 실험은 피험체에게 위험하고 생검 샘플이 어디에서 채취되었느냐에 따라 병소 및 아밀로이드 침전물을 놓칠 수 있다. 그러나, 생검 관련하여 동물, 환자 및 의료진에게 위험이 아직 존재한다. 게다가, 동물에 대한 뇌 시험으로부터의 결과는 동물이 사료 공급에 들어갈 때까지 통상 얻어지지 않는다. 또한, 프리온 펩티드에 대하여 생성된 항체는 변성된 PrP^Sc 및 PrP^C 둘 다를 인지하지만 감염성 (비변성) PrP^Sc를 선택적으로 인지하지는 못한다. (예를 들어, Matsunaga 등 (2001) PROTEINS: Structure, Function and Genetics 44: 110-118 참조).

그러므로, 다양한 샘플에서, 예를 들어, 살아있는 피험체, 혈 공급물, 농장 동물 및 다른 사람 및 동물 식품 공급물에서 병원성 프리온 단백질의 존재를 검출하는 조성물 및 방법에 대한 필요성이 남아있다. 또한, 프리온-관련 질환을 진단하는 방법 및 조성물의 필요가 남아 있다.

발명의 개요

본 발명은 부분적으로 프리온 단백질과 상호작용하는 펩티드 시약에 관한 것이다. 더 구체적으로, 여기에 기재된 펩티드 시약은 프리온 단백질의 병원성 이소형과 우선적으로 상호작용한다. 이들 펩티드 시약은, 병원성 프리온을 분리하거나 또는 샘플 내 병원성 프리온의 존재를 검출하기 위한 도구로서, 치료 또는 예방 및/또는 프리온 특이적 항체를 제조하기 위한 조성물의 구성성분으로서 다양한 범위의 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, PrP^C에 비하여 PrP^Sc와 우세하게 상호작용하는 펩티드 시약은, 살아있는 피험체로부터 얻어지는 샘플 내, 예를 들어, 질환의 진단 또는 헌혈 샘플을 스크리닝하거나 기증 장기의 스크리닝하기 위하여 샘플 내 병원성 형태의 직접 검출에 유용하다.

더 광범위한 양태에서, 본 발명은 입체구조 질환 단백질의 병원성 형태와 상호작용하는 펩티드 시약을 포함한다. 특정 구체예에서, 여기에 기재된 펩티드 시약은 프리온 단백질의 비병원성 형태와 비교할 때 프리온 단백질의 병원성 형태에 우세하게 상호작용한다. 여기에 기재된 펩티드 시약은 부분적으로 또는 완전히 합성된 것일 수 있고, 예를 들어 하나 이상의 다음 부분: 고리화된 잔기 또는 펩티드, 펩티드의 다수체, 표지, 및/또는 다른 화학적 부분을 포함할 수 있다. 적당한 펩티드 시약의 예는 SEQ ID NOs: 12-132의 펩티드, 예를 들어, SEQ ID NOs: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, 또는 84, 및 그것의 유사체 및 유도체에 기재된 것 같은 펩티드로부터 유도된 것을 포함한다. 여기에 기재된 펩티드 시약은 어떤 입체구조 질환 단백질, 예를 들어, 프리온 단백질 (예를 들어, 병원성 단백질 PrP^Sc, 및 비병원성 단백질 PrP^C)과 상호작용할 수 있다. 특정 구체예에서, 펩티드 시약은 PrP^C과 비교하여 PrP^Sc와 우세하게 상호작용한다. 펩티드 시약은 한 종 이상으로부터의 PrP^Sc에 대하여 일반적으로 특이적일 것이지만, 단일 종으로부터의 PrP^Sc에 대하여 특이적일 수 있다.

다른 구체예에서, 여기에 기재된 어떤 서열에서 나타난 펩티드로부터 유도되는 펩티드 시약이 제공된다. 특정 구체예에서, 펩티드 시약은 프리온 단백질의 영역, 예를 들어, 잔기 23-43 또는 85-156 (예를 들어, SEQ ID NO : 2에 나타난 마우스 프리온 서열에 따라 번호 매길 때 23-30, 86-111, 89-112, 97-107, 113- 135, 및 136-156)에 대응하는 그 영역으로부터 유도된다. 편의상, 상기 기재된 아미노산 잔기 번호는 SEQ ID NO : 2의 마우스 프리온 단백질 서열에 대응하는 그것이고; 당업자는 당업계 공지 서열 및 여기에 제공된 교시에 기초하여 다른 종의 프리온 단백질에서 대응 영역을 쉽게 확인할 수 있다. 대표적인 펩티드 시약은 SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 또는 127을 갖는 펩티드; 또는 SEQ ID NO: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 129, 130, 131, 132 또는 128을 갖는 펩티드; 또는 SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82, 또는 84를 갖는 펩티드로부터 유도되는 그것을 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 여기에 기재된 펩티드 시약 및 프리온 단백질을 포함하는 복합체를 포함한다.

다른 양태에서, 프리온 단백질을 인지하는 항체를 제조하는 방법이 제공되는데, 그 방법은 여기에 기재된 어떤 펩티드 시약 (또는 펩티드 시약을 코딩하는 폴리뉴클레오티드)을 피험체(예를 들어, 동물)에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 그 방법은 동물로부터 항체를 분리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 관련 양태는 그 방법에 의하여 제조되는 항체를 포함한다. 바람직한 항체는 병원성 형태에 대하여 특이적이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 여기에 기재된 어떤 항체 및 프리온 단백질을 포함하는 복합체를 포함한다. 특정 구체예에서, 프리온 단백질은 비병원성 형태이지만 다른 구체예에서는 그것은 병원성 형태이다.

여기에 기재된 어떤 펩티드 시약 및/또는 항체는 전체적으로 또는 부분적으로, 본 발명의 일부를 또한 구성하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의하여, 코딩될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 프리온 단백질의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 이 검출 방법은, 특히, 프리온 관련 질환을 진단하고, 실질적으로 PrP^Sc 없는 혈 공급물, 혈 제품 공급물, 또는 식품 공급물을 보증하고, 이식을 위한 장기 및 조직 샘플을 분석하고, 외과수술기구 및 장비의 오염제거를 모니터링하는 방법 및, 병원성 프리온의 존재와 부재 여부를 아는 것이 중요한 어떤 다른 상황과 관련하여 사용될 수 있다.

검출 방법은 본 발명의 펩티드 시약이 병원성 프리온 이소형과 우세한 상호작용하는 것에 의존한다. 특정 구체예에서, 생물학적 샘플에서 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법이 제공된다.

한 구체예에서, 방법은 만약 병원성 프리온이 존재한다면 펩티드 시약과 병원성 프리온의 상호작용을 허용하는 조건 하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 하나 이상의 여기에서 기재된 펩티드 시약(들)과 접촉시키는 단계; 및 펩티드 시약(들)에 대한 결합에 의하여 샘플 내 병원성 프리온의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계를 포함한다. 펩티드 시약(들)과 병원성 프리온 사이의 상호작용은 용액 내에서 수행될 수도 있고, 또는 하나 이상의 반응물은 고체상 내에서 또는 그 위에서 제공될 수 있다. 샌드위치-형태 분석법이 수행될 수도 있는데, 그 방법에서는 본 발명의 펩티드 시약은 포획 시약, 검출 시약 또는 둘 다로서 사용될 수 있다. 다른 프리온-결합 시약(예를 들어, 항체 및 변성된 프리온 단백질과 결합하는 다른 결합 분자)이 본 발명의 펩티드 시약과 조합하여 이 양태에서 사용될 수 있다.

본 구체예의 한 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 펩티드 시약은 고체 지지체 상에 제공되고, 병원성 프리온이 만약 존재한다면 병원성 프리온이 펩티드 시약에 결합하도록 허용하는 조건 하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시킨다. 어떤 비병원성 프리온을 포함하는 결합되지 않은 샘플 물질은 제거될 수 있고 병원성 프리온은 잔여물이 펩티드 시약에 결합되는 동안 또는 펩티드 시약으로부터 해리된 후에 검출될 수 있다. 병원성 프리온은 검출 가능하게 표지된 펩티드 시약 (병원성 프리온을 포획하기 위하여 사용되는 동일한 펩티드 시약 또는 본 발명의 제 2의 펩티드 시약) 또는 검출 가능하게 표지된 항-프리온 항체 또는 다른 프리온-결합 시약을 사용하여 검출할 수 있다. 이 항체 또는 프리온-결합 시약은 프리온의 병원성 형태에 특이적일 필요는 없다.

이 구체예의 다른 양태에서, 프리온-결합 시약은 고체 지지체 상에서 제공되고, 병원성 프리온이 만약 존재한다면 병원성 프리온이 프리온-결합 시약에 결합하도록 허용하는 조건 하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시킨다. 어떤 비병원성 프리온을 포함하는 결합되지 않은 샘플 물질은 제거될 수 있고 병원성 프리온은 잔여물이 펩티드 시약에 결합되는 동안 또는 펩티드 시약으로부터 해리된 후에 검출될 수 있다. 병원성 프리온은 본 발명의 하나 이상의 검출 가능하게 표지된 펩티드 시약을 사용하여 검출될 수 있다.

이 구체예의 다른 양태에서, 샘플 내의 병원성 프리온은 고체 지지체(예를 들어, ELISA 플레이트)에 비특이적으로 결합될 수 있고 병원성 프리온 이소형과 우세하게 상호작용하는 본 발명의 하나 이상의 검출 가능하게 표지된 펩티드 시약의 결합에 의하여 검출될 수 있다.

더 나아간 구체예에서, 방법은 병원성 프리온이 만약 존재한다면 병원성 프리온이 프리온-결합 시약에 결합하도록 허용하는 조건 하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 SEQ ID NO: 12-132의 서열을 갖는 펩티드 및 그것의 유사체 및 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드 시약과 접촉시키는 단계; 및 펩티드 시약과의 결합에 의하여 샘플 내의 병원성 프리온의 존재 또는 부존재 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 샘플은 SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, 또는 84의 서열을 갖는 펩티드 및 그것의 유사체 및 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드 시약과 접촉시킨다.

또 다른 구체예에서, 샘플 내 병원성 프리온을 검출하는 방법을 제공하는데, 그 방법은: PrP^Sc와 우세하게 상호작용하는 하나 이상의 여기에 기재된 펩티드 시약을 포함하는 제 1 펩티드를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계; 병원성 프리온이 샘플 내에 존재할 때 제 1 펩티드와 결합을 허용하는 조건 하에서 샘플을 고체 지지체와 접촉시키는 단계; 제 1 펩티드에 의하여 결합되는 병원성 프리온에 제 2 펩티드가 결합하도록 허용하는 조건 하에서, 고체 지지체를 PrP^Sc 단백질과 우세하게 상호작용하는 하나 이상의 여기에 기재된 펩티드 시약을 포함하는, 검출 가능하게 표지된 제 2 펩티드에 접촉시키는 단계; 및 제 1 펩티드, 샘플로부터의 병원성 프리온 및 제 2 펩티드 사이에 형성되는 복합체를 검출함으로써 샘플 내에서 병원성 프리온의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 프리온 단백질에 결합하는 프리온-결합 시약을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계; 샘플에 프리온 단백질이 존재할 때 프리온 결합 시약과 결합하도록 허용하는 조건 하에서 고체 지지체를 샘플과 접촉시키는 단계; 고체 지지체를 병원성 프리온 단백질과 우세하게 상호작용하는 본 발명의 검출 가능하게 표지된 펩티드 시약과 접촉시키는 단계; 및 프리온-결합 시약, 샘플로부터의 병원성 프리온 및 펩티드 시약 사이에 형성되는 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에서 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법이 여기에서 제공된다.

다른 구체예에서, 샘플 내에서 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 병원성 형태와 우세하게 상호작용하는 여기에 기재된 바와 같은 제 1 펩티드 시약을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계; 검출 가능하게 표지된 펩티드 시약-리간드 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에서 고체 지지체를 검출 가능하게 표지된 제 1 리간드 (예를 들어, 플라스미노겐, 라미닌 리셉터 및 헤파란 설페이트)와 접촉시키는 단계로서, 여기에서 제 1 펩티드 시약의 검출 가능하게 표지된 제 1 리간드와의 결합 친화도는 병원성 프리온에 대한 제 1 펩티드 시약의 결합 친화도보다 약한 것을 특징으로 하는 단계; 병원성 프리온이 샘플 내에 존재할 때 제 1 펩티드 시약과 결합하여 제 1 리간드와 교체되는 것을 허용하는 조건 하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 고체 지지체와 접촉시키는 단계; 및 고체 지지체 상의 검출 가능하게 표지된 리간드의 감소에 의하여 샘플 내 병원성 프리온의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.

상기 어떤 병원성 프리온의 검출 방법도 프리온-관련 질환을 진단하기 위한 방법에서 사용될 수 있다.

본 발명은: 본 발명의 하나 이상의 펩티드 시약을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계; 병원성 프리온이 만약 존재하는 경우 펩티드 시약에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 알려지거나 의심되는 샘플에 고체 지지체를 접촉시키는 단계; 및 어떤 결합되지 않은 샘플 물질을 제거하는 단계를 포함하는, 병원성 프리온을 분리하는 방법 또한 제공한다. 추가의 구체예는 펩티드 시약으로부터 결합된 병원성 프리온을 해리시키는 단계 및 선택적으로, 해리된 병원성 프리온을 회수하는 단계를 더 포함한다.

본 발명은 본 발명의 하나 이상의 펩티드 시약을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계; 병원성 프리온이 만약 존재하는 경우 펩티드 시약에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 알려지거나 의심되는 샘플에 고체 지지체를 접촉시키는 단계; 및 결합되지 않은 샘플 물질을 회수하는 단계를 포함하는, 샘플로부터 병원성 프리온을 제거하는 방법 또한 제공한다.

하나 이상의 본 발명의 펩티드 시약을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 상기한 모든 구체예에서, 펩티드 시약이 고체 지지체에 부착되기 전에 펩티드 시약을 샘플에 접촉시키는 대안적 구체예가 고려된다. 이들 구체예에서, 펩티드 시약은 결합 짝의 한 멤버를 포함하고 고체 지지체는 결합 짝의 제 2 멤버를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드 시약은 비오틴을 함유하거나 함유하도록 변형된다. 비오틴 결합된 펩티드 시약은 펩티드 시약이 병원성 프리온과 결합하도록 허용하는 조건 하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉된다. 그 후, 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 포함하는 고체 지지체를 비오틴 결합된 펩티드 시약과 접촉시킨다. 다른 적당한 결합 짝이 여기에 기재된다.

여기에 기재된 고체 지지체를 사용하는 어떤 방법에서도, 고체 지지체는, 예를 들어 니트로셀룰로스, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스, 폴리비닐 플루오라이드, 이질소화 종이, 나일론 멤브레인, 활성화된 비드, 및/또는 자성으로 반응하는 비드, 폴리비닐 클로리드; 폴리프로필렌, 폴리스티렌 라텍스, 폴리카르보네이트, 나일론, 덱스트란, 키틴, 모래, 실리카, 푸마이스, 아가로스, 셀룰로스, 유리, 금속, 폴리아크릴아미드, 실리콘, 고무, 다당류; 이질소화 종이; 활성화된 비드, 자성으로 반응하는 비드, 및 고체상 합성, 친화성 분리, 정제, 혼성화 반응, 면역분석법 및 다른 이 같은 응용에 일반적으로 사용되는 어떤 재료일 수 있다. 지지체는 미립자일 수 있거나 연속 표면 형태일 수 있고, 멤브레인, 그물, 플레이트, 펠린, 슬라이드, 디스크, 모세관, 중공섬유, 바늘, 핀, 칩, 고체 섬유, 겔 (예를 들어, 실리카겔) 및 비드, (예를 들어, 다공 유리 비드, 실리카겔, 선택적으로 디비닐벤젠과 교차결합된 폴리스티렌 비드, 접합된 코폴리 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 라텍스 비드, 선택적으로 N-N'-비스-아크릴로일에틸렌디아민과 교차결합된 디메틸아크릴아미드 비드 산화철 자성 비드, 및 소수성 폴리머로 코팅된 유리 입자를 포함한다.

또한, 여기에 기재된 어떤 방법에서도 샘플은 생물학적 샘플, 즉, 살아있거나 한때 살아 있던 생체로부터 얻어지거나 유도된 샘플, 예를 들어 장기, 전혈, 혈 분획, 혈 구성성분, 혈장, 혈소판, 혈장, 뇌척수액 (CSF), 뇌조직, 신경계 조직, 근조직, 골수, 소변, 눈물, 비신경계 조직, 장기 및/또는 생검 또는 시체일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 생물학적 샘플은 혈, 혈 분획 또는 혈 구성성분을 포함한다. 샘플은 비생물학적 샘플일 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 여기에 기재된 어떤 검출 방법에 의하여 피험체로부터의 생물학적 샘플 내의 병원성 프리온의 존재를 검출함에 의하여 피험체에서 프리온-관련 질환을 진단하는 방법을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 병원성 프리온이 실질적으로 없는 혈 공급물을 제공하는 방법을 포함하는데, 그 방법은 여기에 기재된 어떤 방법에 의하여 수집된 혈 샘플로부터의 혈 (예를 들어, 전혈, 혈장, 혈소판 또는 혈청)의 분액을 스크리닝하는 단계; 병원성 프리온이 검출되는 어떤 샘플을 제거하는 단계; 및 병원성 프리온이 검출되지 않는 샘플을 합하여 병원성 프리온이 실질적으로 없는 혈 공급물을 제공하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 병원성 프리온이 실질적으로 없는 식품 공급물, 특히 육류 공급물 (특히, 사람 또는 동물의 소비에 사용되는 쇠고기, 새끼 양고기, 양고기 또는 돼지고기)를 제조하는 방법을 포함하는데, 그 방법은 식품 공급원에 첨가될 살아 있거나 죽은 생체로부터 수집된 샘플 또는 식품 공급물에 첨가되려고 의도되는 식품으로부터 수집된 샘플을 여기에 기재된 어떤 검출 방법을 사용하여 스크리닝하는 단계; 병원성 프리온이 검출되는 샘플을 확인하는 단계; 및 샘플 중에 병원성 프리온이 검출된, 식품 공급물에 첨가되려고 의도된 어떤 살아있거나 죽은 생체 또는 식품을 식품 공급물로부터 제거함으로써 병원성 프리온이 실질적으로 없는 식품 공급물을 제공하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 여기에 기재된 하나 이상의 펩티드 시약을 포함하는 고체 지지체를 포함한다. 고체 지지체는 특히, 샘플 내 병원성 프리온 단백질을 검출하기 위한 방법, 샘플로부터 프리온 단백질을 분리하는 방법, 및 샘플로부터 병원성 프리온 단백질을 제거하는 방법에서 사용될 수 있다. 고체 지지체는 상기 기재한 것과 같을 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 샘플에서 병원성 프리온의 존재를 검출하기 위한, 샘플로부터 병원성 프리온을 분리하기 위한, 및 샘플로부터 병원성 프리온을 제거하기 위한 다양한 키트를 포함하는데, 키트는: 하나 이상의 여기에 기재한 펩티드 시약; 및/또는 하나 이상의 여기에 기재한 펩티드 시약을 포함하는 어떤 고체 지지체 및 다른 필수 시약 및 선택적으로, 포지티브 및 네거티브 대조표준을 포함한다. 펩티드 시약은 검출가능하게 표지될 수 있다.

다른 양태에서, 하나 이상의 여기에 기재된 펩티드 시약, 폴리뉴클레오티드 및/또는 항체를 포함하는 조성물을 여기에서 제공한다.

더 나아간 양태에서, 프리온 질환을 치료하거나 예방하는 방법, 예를 들어, 동물 (예를 들어, 사람 아닌 또는 사람인 포유 동물)에 하나 이상의 여기에 기재된 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 방법은 프라이밍 단계에서 여기에서 기재하는 조성물 중 어느 것을 포함하는 제 1 조성물을 투여하는 단계 및 추가 투여로서 여기에서 기재하는 조성물 중 어느 것을 포함하는 제 2 조성물을, 예를 들어, 피험체에서 면역 반응을 유도하기 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 조성물은 근육 내로, 점막 내로, 코 안으로, 피하로, 내피 내로, 경피적으로, 질 내로, 직장 내로, 경구로 및/또는 정맥 내로 투여될 수 있다.

본 발명의 이들 및 다른 구체예는 여기에 개시된 것을 고려하여 당업자에게 용이하게 실시될 수 있다.

도 1은 사람 (SEQ ID NO : 1) 및 마우스 (SEQ ID NO : 2) 프리온 단백질의 아미노산 서열을 도시한다.

도 2는 사람 (SEQ ID NO : 3), 시리안 햄스터 (햄스터) (SEQ ID NO : 4), 소 (SEQ ID NO : 5), 양 (SEQ ID NO : 6), 마우스 (SEQ ID NO : 7), 엘크 (SEQ ID NO : 8), 연한 황갈색 (황갈색) (SEQ ID NO : 9), 뮬사슴 (뮬) (SEQ ID NO : 10), 및 흰 꼬리 사슴 (백색) (SEQ ID NO : 11)으로부터의 프리온 단백질의 배열을 도시한다. 엘크, 연한 황갈색 사슴, 뮬사슴, 및 흰 꼬리 사슴은 서로 두 잔기, S/N128 및 Q/E226 (굵게 표시됨)에서만 다르다.

도 3, 패널 A-F는 여기에 기재된 어떤 펩티드 시약을 제조하기 위하여 제조될 수 있는 대표적 펩토이드 치환체를 도시한다. 이들 펩토이드는 각 패널에서 동그라미 표시가 되어 있고, 여기에 기재된 대표적 펩티드 시약 (SEQ ID NO : 14, QWNKPSKPKTNG)에 나타는데, 여기에서 프롤린 잔기 (SEQ ID NO : 14의 잔기 8)은 N-치환된 글리신 (펩토이드) 잔기로 치환된다. 패널 A는 프롤린 잔기가 펩토이드 잔기: N-(S)-(l-페닐에틸)글리신으로 치환된 펩티드 시약을 나타내고; 패널 B는 프롤린 잔기가 펩토이드 잔기:N-(4-히드록시페닐)글리신으로 치환된 펩티드 시약을 나타내고; 패널 C는 프롤린 잔기가 펩토이드 잔기: N-(시클로프로필메틸)글리신으로 치환된 펩티드 시약을 나타내고; 패널 D 는 프롤린 잔기가 펩토이드 잔기: N-(이소프로필)글리신으로 치환된 펩티드 시약을 나타내고; 패널 E는 프롤린 잔기가 펩토이드 잔기: N-(3,5-디메톡시벤질)글리신으로 치환된 펩티드 시약을 나타내고; 그리고 패널 F는 프롤린 잔기가 펩토이드 잔기: N-부틸글리신으로 치환된 펩티드 시약을 나타낸다.

도 4는 실시예 2에 기재된 것 같은 웨스턴 블롯 실험의 결과를 도시한다. 레인 1 및 2는 정상 마우스 뇌 호모지네이트 (레인 1, "C"로 표시됨) 및 변성된 감염된 마우스 뇌 호모지네이트 (레인 2, "Sc"로 표시됨)에서 프리온 단백질의 존재를 나타낸다. 레인 3, 4 및 5는 여기에 기재된 바와 같은 펩티드 시약 (SEQ ID NO : 68)이 사람 혈장의 존재 하에서 병원성 프리온 형태에 특이적으로 결합하는 것을 나타낸다. 특히 레인 3은 사람 혈장 대조표준이고 레인 4는 정상 마우스 뇌 호모 지네이트 샘플이다. 레인 5는 감염된 마우스 뇌 호모지네이트 샘플에서 PrP^Sc에 대한 펩티드 시약의 강한 결합을 나타낸다.

도 5는 여기에 기재된 바와 같은 대표적 PEG-결합 펩티드 시약의 구조를 도시한다.

상세한 설명

본 발명은 상대적으로 작은 (50 내지 100 개 아미노산 길이 미만의, 바람직하게는 50 개 아미노산 길이 미만이고, 더욱더 바람직하게는 약 30 개 아미노산 길이의) 펩티드가 비병원성 및 병원성 프리온 단백질 사이를 구분하기 위하여 사용될 수 있다는 놀랍고 예기치 못한 발견에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명의 개시는 이들 펩티드와 그것의 유도체 (집합적으로 "펩티드 시약")가 상이한 특이성 및/또는 친화도로 병원성 및 비병원성 단백질 형태에 결합할 수 있고, 따라서, 스스로 진단/검출 시약으로서 또는 치료 조성물의 구성성분으로서 사용될 수 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 본 발명의 개시 이전에는 오직 큰 분자 (예를 들어, 항체, PrP^C, α-형태 rPrP 및 팔라즈미노겐)만이 병원성 및 비병원성 형태를 구분하는데 사용될 수 있다고 믿어졌다. 그렇기 때문에, 병원성 및 비병원성 형태 사이를 구별하는 능력이 평가된 항체를 형성하기 위하여 종래 기재된 항원 펩티드가 사용되었다. 그러나, 프리온 단백질의 상대적으로 비면역원성인 성질 때문에, 병원성 형태에 특이적 항체를 제조하는 것이 어려운 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, R. A. Williamson 등 "Antibodies as Tools to Probe Prion Protein Biology"in PRION BIOLOGY AND DISEASES, ed. S. Prusiner, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, pp: 717-741 참조.

여기에 기재된 것과 같은 특정 펩티드가 병원성 (PrP^Sc) 프리온 단백질에 우세하게 상호작용한다는 발견은 특히 진단, 검출 분석법 및 치료를 위한 신규 시약의 개발을 가능하게 한다. 그러므로, 본 발명은 펩티드 시약에 관한 것이고, 또한, 이들 펩티드 시약을 사용하는 검출 분석법 및 진단 분석법, 이들 펩티드 시약을 사용하는 정제 또는 분리 방법 및 이들 펩티드 시약을 포함하는 치료 조성물에 관한 것이다. 이들 펩티드 시약, 및 이들 펩티드 시약을 사용하여 항체를 제조하는 방법 또한 제공된다. 여기에 기재되는 펩티드 시약, 폴리뉴클레오티드 및/또는 항체는, 예를 들어, 생물학적 샘플에서의 병원성 프리온의 존재를 검출하는 조성물 및 방법에 유용하다. 또한, 본 발명은 더 나아가 이 같은 펩티드 시약, 항체 및/또는 폴리뉴클레오티드를 치료 또는 예방 조성물로 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 펩티드 시약 (및 이들 펩티드 시약을 코딩하는 폴리뉴클레오티드)은 비병원성 이소형과 비교하여 병원성 이소형에 우세하게 상호작용하는 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 여기에 기재된 것 같은 펩티드 시약은 병원성 입체구조 질환 단백질 형태에 특이적으로 결합하고 비병원성 형태에는 결합하지 않(거나 더 약한 정도로 결합한)는다. 여기에 기재된 펩티드 시약 (및 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드)는, 예를 들어, 항체를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 항체는 병원성 형태, 비병원성 형태 또는 둘 다를 인지할 수 있다. 이들 분자는 단독 또는 다양한 조합으로 진단 분석법 및/또는 예방 또는 치료 조성물에서 유용하다.

본 발명의 실시는 별도로 다르게 표시되지 않는 한, 당업계 기술 내에서 화학, 생화학, 분자 생물학, 면역학 및 약학의 전통적 방법을 사용할 것이다. 이 같은 기술은 논문에 완전하게 설명되어 있다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan,eds., Academic Press, Inc.) ; 및 Handbook of Experimental Immunology, Vols.I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds. , 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook, 등, MolecularCloizing : A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K. S. ed. , CRC Press, 1997); Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed. (Ausubel 등 eds. , 1999, John Wiley & Sons); Molecular Biology Techniques : An Intensive Laboratory Course, (Ream 등 , eds. , 1998, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag); Peters 및 Dalrymple, Fields Virology (2ded), Fields 등 (eds. ), B. N. Raven Press, New York, NY 참조.

이 발명의 펩티드 시약, 항체 및 방법은 특정 제제 또는 방법 매개변수에만 제한되지 않고 물론 다양하게 변화될 수 있음이 이해된다. 여기에 사용되는 용어는 본 발명의 특정 구체예를 설명하기 위한 목적으로 사용될 뿐 제한하려는 의도가 아님 또한 이해되어야 한다.

여기에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전체로 참고로 여기에 수록된다.

I. 정의

본 발명의 이해를 용이하게 하기 위하여, 본원에서 사용되는 선택된 용어를 아래에서 설명할 것이다.

용어 "프리온", "프리온 단백질", "PrP 단백질" 및 "PrP"는 (스크래피 단백질, 병원성 단백질 형태, 병원성 이소형, 병원성 프리온 및 PrP^Sc로 다양하게 지칭되는) 병원성 단백질 형태 및 (세포 단백질 형태, 세포 이소형, 비병원성 이소형, 비병원성 프리온 단백질 및 PrP^C로 다양하게 지칭되는) 비병원성 단백질 형태 둘 다 뿐 아니라, 변성된 형태 및 병원성 입체구조 또는 정상 세포 입체구조를 갖지 않을 수 있는 프리온 단백질의 다양한 재조합 형태를 지칭하기 위하여 여기에서 호환하여 사용된다. 병원성 단백질 형태는 사람과 동물에서의 질병 상태 (해면상 뇌병증)과 관련되고; 비병원성 형태는 동물세포에서 정상적으로 존재하고 적당한 조건에서 병원성 PrP^Sc 입체구조로 변화될 수 있다. 프리온은 사람, 양, 소 및 마우스를 포함하는 광범위한 포유동물 종들에서 천연적으로 생산된다. 사람 프리온 단백질의 대표적 아미노산 서열은 SEQ ID NO : 1에 기재된다. 마우스 프리온 단백질의 대표적 아미노산 서열은 SEQ ID NO : 2에 기재된다. 다른 대표적 서열은 도 2에 나타난다.

여기에서 사용될 때, 용어 "병원성"은 단백질이 실제로 질병을 유발하는 것을 의미하거나 단순히 단백질이 그 질병과 관련되어서 질병이 존재할 때 그것이 존재한다는 의미일 수 있다. 그러므로, 본 개시와 연관되어 사용될 때 병원성 단백질은 질병의 특이적 원인 물질이 되는 단백질일 필요는 없다. 병원성 형태는 감염성일수도 있고 아닐 수도 있다. 용어 "병원성 프리온 형태"는 포유동물, 조류 또는 재조합 프리온 단백질의 입체구조 및/또는 베타-시트가 풍부한 입체구조를 지칭하기 위하여 더 구체적으로 사용된다. 일반적으로, 베타-시트가 풍부한 입체구조는 프로티나제 K 내성이 있다. 용어 "비병원성" 및 "세포성"은 입체구조 질환 단백질 형태에 관하여 사용될 때, 단백질의 존재가 질환과 관련되지 않는 단백질의 정상 이소형을 지칭하기 위하여 호환적으로 사용된다.

게다가, "프리온 단백질" 또는 "입체구조 질환 단백질"은 여기에서 사용될 때, 여기에 기재된 것에 대한 정확한 서열을 갖는 폴리펩티드에 제한되지 않는다. 이 용어가 어떤 동정되거나 동정되지 않은 종 또는 질환(예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 등)으로부터의 입체구조 질환 단백질을 포괄한다는 것은 곧 명백하다. 당업자는 본 발명의 개시 및 당업계 기술을 고려하여, 예를 들어, 서열비교 프로그램 (예를 들어, BLAST 및 다른 여기에 기재된 것)을 사용하거나 구조 특징이나 모티프의 확인과 얼라인을 사용하여 어떤 다른 프리온 단백질에서 도면에 나타난 서열에 대응하는 영역을 결정할 수 있다.

용어 "PrP 유전자"는 여기에서 사용될 때 알려진 다형성 및 병원성 돌연변이를 포함하는 프리온 단백질을 발현하는 어떤 유전 물질을 말한다. 용어 "PrP 유전 자"는 어떤 형태의 PrP 단백질을 코딩하는 어떤 종의 어떤 유전자를 일반적으로 지칭한다. 몇몇 일반적으로 알려진 PrP 서열은, 여기에 참고문헌으로서 그 서열을 개시하고 설명하기 위하여 수록된 Gabriel 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9097-9101 (1992), 및 U. S. Pat. Nos. 5,565, 186; 5,763, 740; 5,792, 901; 및 W097/04814 참조. PrP 유전자는 여기에서 기재된 "숙주" 및 "시험" 동물 및 그것의 어떤 및 모든 다형성 및 돌연변이를 포함하는 어떤 동물로부터 유래할 수 있고, 그 용어는 아직 발견되지 않은 다른 이 같은 PrP 유전자를 포함하는 것으로 간주 된다. 이 같은 유전자에 의하여 발현되는 단백질은 PrP^C (비질병) 또는 PrP^Sc (질병) 형태를 가질 수 있다.

"프리온-관련 질환"은 여기에서 사용될 때, 전적으로 또는 부분적으로 병원성 프리온 단백질 (PrP^Sc)에 의하여 유발되는 질병을 지칭한다. 프리온-관련 질환은 스크래피, 소 해면상 뇌병증 (BSE), 광우병, 고양이 해면상 뇌병증, 쿠루병, 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), 신종 변성 크로이츠펠트-야콥병 (nvCJD), 만성 소모성 질환 (CWD), 게르스트만-스트로이슬러-샤인케르병 (GSS), 및 치명적 가족성 불면증(FFI)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

용어 "펩티드 시약"은 여기에서 사용될 때, 아미노산, 또는 오직 아미노 및/또는 이미노 분자만을 포함하는 화합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 아미노산-유사 분자의 천연 발생 또는 합성 폴리머를 포함하는 어떤 화합물을 일반적으로 지칭한다. 본 발명의 펩티드 시약은 병원성 프리온 단백질과 우세하게 상호작용하 고 전형적으로 프리온 단백질의 단편으로부터 유도된다. 용어 "펩티드"는 "올리고펩티드" 또는 "폴리펩티드"와 호환하여 사용될 것이고 이들 용어를 사용함에 있어 특정 크기는 함축되지 않은 것이다. 이 정의는, 예를 들어, (예를 들어, 비천연 아미노산, 펩토이드 등을 포함하는) 하나 이상의 아미노산의 유사체를 함유하는 펩티드, 치환 결합뿐 아니라 천연 발생 및 비천연적으로 발생하는 (예를 들어, 합성되는) 당업계에 알려진 다른 변형을 갖는 펩티드를 포함한다. 그러므로, 합성 펩티드, 이수체, 다수체 (예를 들어, 연결된 반복단, 다수 항원성 펩티드 (MAP) 형태, 직선적으로 연결된 펩티드), 고리화된, 분지된 분자 등이 이 정의에 포함된다. 이 용어는 또한 하나 이상의 N-치환된 글리신 잔기를 포함하는 분자(펩토이드) 및 다른 합성 아미노산이나 펩티드를 포함한다. (펩토이드에 관한 기재는 예를 들어, 미국 특허 제 5,831,005; 5,877,278; 및 5,977,301 호; Nguyen 등 (2000) Chem Biol.7 (7): 463-473; 및 Simon 등 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (20): 9367-9371 참조). 본 발명의 용도에 적당한 제한되지 않는 길이의 펩티드는 3-5 잔기 길이, 6-10 (또는 그 사이의 어떤 정수) 잔기 길이, 11-20 (또는 그 사이의 어떤 정수) 잔기 길이, 21-75 (또는 그 사이의 어떤 정수) 잔기 길이, 75-100 (또는 그 사이의 어떤 정수) 잔기 길이의 펩티드, 또는 100 잔기 길이보다 더 긴 펩티드를 포함한다. 전형적으로, 본 발명에 유용한 펩티드는 의도하는 응용에 적당한 최대 길이를 가질 수 있다. 바람직하게는, 펩티드는 약 3 내지 100 잔기 길이이다. 일반적으로, 당업자는 여기의 교시를 고려하여 최대 길이를 쉽게 선택할 수 있다. 더욱이, 여기에 기재된 것과 같은 펩티드 시약은, 예를 들어, 합성 펩티드 는 표지, 링커, 또는 다른 화학적 부분 (예를 들어, 비오틴, Control Red나 Thioflavin 같은 아밀로이드 특이적 염료) 같은 추가의 분자를 포함할 수 있다. 이 같은 부분은 펩티드의 프리온 단백질에 대한 상호작용 및/또는 프리온 단백질의 추가적 검출을 더 증강시킬 수 있다.

펩티드 시약은, 하나 이상의 비천연 발생 아미노산을 포함하는 하나 이상의 치환, 첨가 및/또는 결실을 갖는 본 발명의 아미노산 서열의 유도체를 또한 포함할 수 있다. 바람직하게는, 유도체는 야생형 또는 대조표준 서열에 대하여 적어도 약 50% 동일성을, 바람직하게는 적어도 약 70% 동일성을, 더 바람직하게는 어떤 야생형 또는 여기에 기재된 대조표준 서열에 대하여 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 나타낸다. 서열 (또는 백분율) 동일성은 아래에 기재하는 것과 같이 측정된다. 이 같은 유도체는 폴리펩티드 발현 후 변형은, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등을 포함할 수 있다.

펩티드 유도체는 또한 폴리펩티드가 바람직한 활성을 유지하는 한, (일반적으로 자연에서 보존적인) 결실, 삽입 및 치환 같은 천연 서열에 대한 변형을 포함할 수 있다. 이들 변형은 부위 특이적 돌연변이유발을 통한 것 같은 의도적인 것이거나 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이를 통하거나 PCR 증폭에 기인한 실수 같은 우연한 것일 수 있다. 게다가, 변형은 하나 이상의 다음: 독성의 감소; 프리온 단백질에 대한 친화도 및/또는 특이성 증가; 세포 프로세싱 (예를 들어, 분비, 항원 제공 등)를 용이하게 함; 및 B-세포 및/또는 T-세포에 제공하는 것을 용이하게 하는 효과를 갖도록 제조될 수 있다. 여기에 기재된 폴리펩티드는 재조합적으로, 합성적으로 제조되거나, 천연 공급원으로부터 정제되거나 조직 배양물 내에서 제조될 수 있다.

"단편"은 여기에서 사용될 때, 자연에서 발견되는 것과 같은 완전한 전장 단백질 및 구조의 단지 일부로 구성되는 펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 단편은 단백질의 C-말단 결실 및/또는 N-말단 결실을 포함할 수 있다. 전형적으로, 단편은 단편이 유래한 전장 폴리펩티드 서열의 기능의 한 가지, 수 가지 또는 모두를 보유한다. 전형적으로, 단편은 천연 단백질의 적어도 5 개의 보존적 아미노산 잔기, 바람직하게는, 적어도 약 8 개의 보존적 아미노산 잔기; 더 바람직하게는 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 개의 보존적 아미노산 잔기를 포함할 것이다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는, 당업계에 알려진 것과 같이 핵산 분자를 의미한다. "폴리뉴클레오티드"는 이중 및 단일-가닥 서열을 포함할 수 있고 바이러스로부터의 원핵 서열, 진핵 mRNA, cDNA, 원핵 또는 진핵 mRNA, 바이러스(예를 들어, RNA 및 DNA 바이러스 및 레트로바이러스)로부터의 게놈 RNA 및 DNA 서열, 원핵 DNA 또는 진핵 (예를 들어, 포유동물) DNA, 및 특히 합성 DNA 서열을 지칭하지만 이에 제한되지 않는다. 이 용어는, 또한 DNA 및 RNA의 어떤 알려진 염기 유사체를 포함하고, 자연 서열에 대하여 (일반적으로 보존적 형태로) 결실, 삽입 및 치환 같은 변형을 포함하는 서열 또한 포함한다. 이들 변형은 부위 특이적 돌연변이 유발을 통한 것 같이 의도적인 것일 수도 있고 프리온-코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주의 돌연변이를 통한 것과 같이 우연한 것일 수도 있다.

폴리뉴클레오티드는 생물학적 활성(예를 들어, 면역원성 또는 치료적) 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드의 성질에 따라, 폴리뉴클레오티드는 10 뉴클레오티드만큼 작은 것, 예를 들어, 항원 또는 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 전형적으로, 폴리뉴클레오티드는 적어도 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 또는 더 긴 아미노산의 펩티드를 코딩한다.

"폴리뉴클레오티드 코딩 서열", 즉, 선택된 폴리펩티드를 "코딩하는" 서열은, 적당한 조절 서열 (즉 "조절 엘리먼트")의 조절 하에 놓일 때 (DNA의 경우에는) 전사되고 (mRNA의 경우에는) 폴리펩티드로 생체 내에서 번역되는 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단의 개시 코돈 및 3' (카르복시) 말단의 번역 종결 코돈에 의하여 결정된다. 전사 종결 서열은 코딩서열의 3'에 위치한다. 전형적인 "조절 엘리먼트"는 프로모터, 전사 인핸서 엘리먼트, 전사 종결 신호 및 폴리아데닐화 서열 같은 전사 조절자; 및 번역 개시의 최적화를 위한 서열, 예를 들어 샤인-달가노 (리보솜 결합 부위) 서열, 코작 서열 (즉, 번역의 최적화를 위한 서열, 예를 들어, 코딩 서열의 5'), 리더 서열 (이형 또는 천연), 번역 개시 코돈 (예를 들어, ATG) 및 번역 종결서열 같은 번역 조절자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 프로모터는 (프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석대상물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의하여 유도되는) 유도 가능한 프로모터, (프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석 대상물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의하여 유도되는) 억제 가능한 프로모터 및 구성적 프로모터를 포함할 수 있다.

"작동 가능하게 연결된"은 구성성분이 그것의 보통 기능을 수행하도록 입체적으로 구성되는 엘리먼트의 배열을 지칭한다. 그러므로, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 주어진 프로모터는 적당한 효소가 존재할 때 코딩 서열을 발현시키는 효과를 낼 수 있다. 프로모터는, 그것이 그 발현을 유도하도록 작동하기만 한다면 코딩서열과 이웃할 필요는 없다. 그러므로, 예를 들어, 전사되었지만 번역되지 않은 서열의 간섭이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고 그 프로모터 서열은 그래도 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.

"재조합" 핵산 분자는 여기에서 핵산 분자를 설명하기 위하여 사용될 때, 게놈 폴리뉴클레오티드, cDNA, 기원 또는 조작 때문에: (1) 천연적으로 결합된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부와 결합되지 않고/또는 (2) 천연적으로 연결된 것 외의 폴리뉴클레오티드에 연결된 반합성 또는 합성 기원을 의미한다. 용어 "재조합"은 단백질 또는 폴리뉴클레오티드에 관하여 사용될 때 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의하여 제조된 폴리펩티드를 의미한다. "재조합 숙주 세포", "숙주 세포", "세포", "셀라인", "세포 배양물" 및 단세포 본체로서 배양되는 원핵 미생물 또는 진핵 셀라인을 가리키는 다른 이 같은 용어는 호환하여 사용되고 재조합 벡터 또는 다른 전달 DNA에 대한 수용체로 사용될 수 있거나 사용된 세포를 가리키고 트랜스펙션된 원래의 세포의 자손을 포함한다. 자연돌연변이 또는 인공 돌연변이 때문에, 단일 부모 세포의 자손은 형태학적으로 또는 유전적 또는 전체 DNA 상보성에 있어 원래 부모와 완전히 일치할 필요는 없다는 것이 이해된다. 소망의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재 같은 적당한 성질에 의하여 특성 결정되기에 모세포와 충분하게 유사한 모 세포의 자손은 이 정의에 의하여 의도된 자손에 포함되고 상기 용어에 의하여 포괄된다.

"분리된"은, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭할 때, 지시된 분자가 자연에서 발견되는 전체 생체로부터 분리되고 구분된 것을 나타내고, 그 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 자연에서 발견되지 않을 때는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 그것의 의도한 목적에 사용될 구 있도록 충분히 다른 생물학적 고분자가 없는 것이다.

"항체"는, 당업계에서 알려진 바와 같이, 화학적 또는 물리학적 방법을 통하여 관심의 폴리펩티드의 에피토프와 결합하거나 연결될 수 있는 하나 이상의 생물학적 부분을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 병원성 프리온 입체구조와 우세하게 상호작용할 (예를 들어, 특이적으로 결합할) 수 있다. 용어 "항체"는 다클론성 및 단일클론성 제조 둘 다에 의하여 얻어지는 항체 및 다음: 하이브리드 (키메라) 항체 분자 (예를 들어, Winter 등 (1991) Nature 349 : 293-299; and U. S. Patent No. 4, 816, 567 참조); F(ab')₂ 및 F(ab) 단편; Fv 분자 (비공유성 헤테로 이량체, 예를 들어, Inbar 등 (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69: 2659-2662; 및 Ehrlich 등 (1980) Brochent 19 : 4091-4096 참조); 단일-사슬 Fv 분자 (sFv) (예를 들어, Huston 등 (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5897-5883); 이량체 및 삼량체 항체 단편 구조체; 미니바디 (예를 들어, Pack 등 (1992) Biochem 31: 1579-1584; Cumber 등 (1992) J. Immunology 149B: 120-126 참조); 인간화된 항체 (예를 들어, Riechmann 등 (1988) Nature 332: 323-327 ; Verhoeyan 등 (1988) Science 239: 1534-1536; 및 1994. 9. 21. 발행된 영국 특허 제 GB 2,276,169 호 참조); 및 이 같은 분자로부터 얻어지는 어떤 기능적 단편으로서, 그 단편은 모 항체 분자의 면역학적 결합 성질을 보유한 단편을 포함한다. 용어 "항체"는 파지 디스플레이 같은 비공유적 과정을 통하여 얻어지는 항체를 더 포함한다.

여기에서 사용될 때, 용어 "단일클론 항체"는 동형 항체 집단을 갖는 항체 조성물을 지칭한다. 이 용어는 항체의 종류나 기원에 관하여 그것이 제조되는 방식에 의하여 제한되거나 제한되려고 의도되지 않는다. 그러므로, 이 용어는 마우스 하이브리도마 뿐 아니라 마우스 하이브리도마가 아닌 사람을 사용하여 얻어지는 사람 단일클론 항체로부터 얻어지는 항체를 포괄한다. 예를 들어, Cote, 등 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,1985, p 77 참조.

만약 다클론 항체가 바람직하다면, 선택된 포유동물 (예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)이 면역원성 조성물 (예를 들어, 여기에 기재된 것 같은 펩티드 시약)로 일반적으로 면역화된다. 공지 방법 따라서 면역화된 동물로부터의 혈청이 수집되고 처리된다. 만약 선택된 펩티드 시약에 대한 다클론 항체를 포함하는 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 포함한다면, 다클론 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의하여 정제될 수 있다. 다클론 항혈청을 생산하고 처리하는 기술은 당업계 공지이고, 예를 들어, Mayer 및 Walker, eds. (1987) IMMVICTNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London) 참조.

당업자는 여기에 기재된 펩티드 시약에 대하여 유도된 단일클론 항체 또한 쉽게 제조할 수 있다. 단일클론 항체를 제조하는 일반적 방법론은 주지이다. 불사화 항체-생산 셀라인은 세포 융합 및 B-림프구를 옹코진 DNA로 직접 형질전환함, 또는 엡스텐-바 바이러스로 트랜스팩션함 같은 다른 기술에 의하여 생산될 수 있다. 예를 들어, M. Schreier 등 (1980) HYBRIDOMA TECHNIQUES ; Hammerling 등 (1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T- CELL HYBRIDOMAS ; Kennett 등 (1980) MONOCLONAL ANTIBODIES 참조; 또한, 미국 특허 제 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; 및 4,493,890호 참조.

여기에서 사용될 때, "단일 도메인 항체" (dAb)는, 지시된 항원만에 특이적으로 결합하는 VH 도메인을 포함하는 항체이다. dAb는 VL 도메인을 함유하지 않지만 다른 항원 결합 도메인, 예를 들어 카파 및 람다 도메인을 함유할 수 있다. dAb를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Ward 등 Nature 341: 544 (1989) 참조.

항체는 또한 VH 및 VL 뿐 아니라 다른 알려진 항체 결합 도메인을 포함할 수 있다. 항체의 이들 타입 및 그것을 제조하는 방법의 예는 당업계에 알려져 있고 (예를 들어, 여기에 참고문헌으로 수록된 미국 특허 제 4,816,467호 참조), 다음의 것을 포함한다. 예를 들어, "척추 동물 항체"는 일반적으로 "Y"자 입체구조로 결합하고 각 사슬들 사이에는 공유결합을 갖거나 또는 갖지 않는, 경쇄 및 중쇄를 포함하는 4량체 또는 그것의 집합체인 항체를 지칭한다. 척추동물 항체에서, 사슬의 아미노산 서열은 원위치이든 시험관 내(예를 들어, 하이브리도마에서)이든, 척추동물에서 생산되는 항체에서 발견되는 서열에 동형이다. 척추동물 항체는, 예를 들어, 정제된 다클론 항체 및 단일클론 항체를 포함하고, 그것의 제조 방법은 이하에서 기재된다.

"하이브리드 항체"는 사슬이 개별적으로 포유동물 항체 사슬에 대하여 상동이고 그것의 신규의 집합체를 나타내서, 두 개의 상이한 항원이 그 4량체에 의하여 침강되거나 응집되는 항체이다. 하이브리드 항체에서는, 한 쌍의 중쇄 및 경쇄가 제 1 항원에 대하여 만들어지는 항체에서 발견되는 것에 상동이고, 제 2 사슬 쌍은 제 2 항체에 대하여 만들어지는 항체에서 발견되는 것에 상동이다. 이 결과는 "2가"의 특성, 즉 두 가지의 항원에 동시에 결합하는 능력을 결과한다. 이 같은 하이브리드 항체는 또한 아래에 기재하는 것 같은 키메라 사슬을 사용하여 형성될 수 있다.

"키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄가 융합 단백질인 항체를 지칭한다. 전형적으로, 사슬의 아미노산 서열의 한쪽 부분은 특정 종류 또는 특정 클래스로부터 유도되는 항체 내 대응 서열에 대하여 상동이고, 사슬의 나머지 부분은 다른 종류 및/또는 클래스로부터 유도되는 서열에 대하여 상동이다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변부는 척추동물의 한 종으로부터 유도된 가변부 또는 항체를 모방하고, 불변부는 척추동물의 다른 종으로부터 유도되는 항체의 서열에 상동이다. 그러나, 이 정의는 이 특정 예에 제한되지 않는다. 기원이 상이한 클래스이든 상이한 종의 기원으로부터이든지, 그리고 융합점이 가변부/불변부의 경계에 있든지 아 니든지, 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 다가 상이한 기원의 항체에서의 서열을 모방하는 서열의 조합으로 구성되는 어떤 항체 또한 포함된다. 그러므로, 불변부도 가변부도 공지 항체 서열을 모방하지 않는 항체를 제조하는 것이 가능하다. 그리고, 예를 들어, 특정 항원에 대하여 높은 특이적 친화도를 갖는 가변부를 갖는 항체, 또는 불변부가 증강된 컴플리먼트 고정능을 끌어낼 수 있는 항체를 구성하는 것, 또는 특정 불변부가 갖는 성질의 다른 개선을 만드는 것이 가능하게 된다.

다른 예는 "변형된 항체"인데, 이것은 척추동물 항체의 천연 발생 아미노산 서열이 변화된 항체를 지칭한다. 재조합 DNA 기술을 사용하여, 항체는 소망의 성질을 얻기 위하여 재디자인될 수 있다. 가능한 변형은 다수이고, 하나 이상의 아미노산의 변화로부터 한 영역의, 예를 들어, 불변 영역의 완전한 재디자인에 이르기까지 광범위하다 불변 영역에서의 변형은 일반적으로 소망의 세포 내 프로세싱 성질, 예를 들어 컴플리먼트 고정, 막과의 상호작용 및 다른 이펙터 기능에 있어서의 변화를 얻기 위한 것이다. 가변 영역에서의 변형은 항원-결합 성질을 변화시키기 위하여 이루어질 수 있다. 항체는 또한 분자나 물질을 특이적 세포 또는 조직 부위로 특이적으로 운반하는 것을 돕기 위하여 조작될 수 있다. 소망의 변형은 분자생물학의 공지의 기술, 예를 들어, 재조합 기술, 부위 특이적 돌연변이 유발 등에 의하여 이루어질 수 있다.

또 다른 예는 "1가 항체"인데, 이것은 제 2 중쇄의 Fc (즉, 스템) 영역에 결합된 중쇄/경쇄 이량체를 포함하는 응집체이다. 이 타입의 항체는 항원적 변형을 회피한다. 예를 들어, Glennie 등 Nature 295: 712 (1982) 참조. 항체의 정의에는 항체의 "Fab" 단편 또한 포함된다. "Fab" 영역은, 중쇄 및 경쇄의 분지 부분을 포함하고 특정된 항원에 대하여 면역학적 결합을 나타내는 것으로 나타난 서열들에 대략 균등하거나 유사하지만 이펙터 Fc 부분은 결여한 중쇄 및 경쇄의 그런 부분을 지칭한다. "Fab" 영역은 (일반적으로 Fab'로 알려진) 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄의 응집체뿐 아니라, 지정된 항원 또는 항원 페밀리와 선택적으로 반응할 수 있는 (F(ab)2로 지칭되는) 2H 및 2L 사슬을 함유하는 4량체를 포함한다. Fab 항체는 상기한 것들에 유사한 서브세트로, 즉, "척추동물 Fab", "하이브리드 Fab", "키메라 Fab" 및 "변형된 Fab"로 나누어질 수 있다. 항체의 Fab 단편을 생산하는 방법은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 단백질 가수분해 및 재조합 기술에 의한 합성을 포함한다.

"항원-항체 복합체"는 항원 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체에 의하여 형성되는 복합체를 지칭한다.

펩티드 (또는 펩티드 시약)은, 그것이 특이적으로 결합하거나 비특이적으로 결합하거나 또는 특이적 및 비특이적 결합의 어떤 조합인 경우에 다른 펩티드 또는 단백질과 "상호작용한다"라고 한다. 펩티드 (또는 펩티드 시약)은, 비병원성 이소형보다 병원성 이소형에 더 큰 친화도 및/또는 더 큰 특이성으로 결합하는 경우에 감염성 프리온 단백질과 "우세하게 상호작용한다"라고 한다. 병원성 프리온 단백질에 우세하게 상호작용하는 펩티드 시약은 또한 여기에서 병원성 프리온-특이적 펩티드 시약이라고 지칭한다. 우세한 상호작용은 반드시 각 펩티드의 특이적 아미노산 잔기 및/또는 모티프 사이의 상호작용을 필요로 하는 것은 아니라는 것이 이 해될 것이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 여기에 기재된 펩티드 시약은 병원성 이소형과 유세하게 상호작용하지만, 그럼에도 불구하고 비병원성 이소형과 약하지만 검출 가능한 레벨로 결합(예를 들어, 관심의 폴리펩티드에 10% 이하로 결합)할 수 있다. 전형적으로, 약한 결합, 또는 백그라운드 결합은, 예를 들어, 적당한 대조 표준의 사용에 의하여 관심의 화합물 또는 폴리펩티드와의 우세한 결합과 쉽게 구별 가능하다. 일반적으로, 관심의 펩티드는 비병원성 형태의 10⁶ 배 과량 존재하에서도 병원성 프리온과 결합한다.

용어 "친화도"는 결합 세기를 지칭하고 해리 상수 (K_d)로서 정량적으로 표현될 수 있다. 바람직하게는, 병원성 이소형과 우세하게 상호작용하는 펩티드 (또는 펩티드 시약)은 그것이 비병원성 이소형과 상호작용하는 것보다 바람직하게는 적어도 2 배 더 큰 친화도로, 더 바람직하게는 적어도 10 배 더 큰 친화도로, 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 100 배 더 큰 친화도로 병원성 이소형과 상호작용한다. 결합 친화도 (즉 K_d)는 표준 기술을 사용하여 측정될 수 있다.

아미노산 서열 "유사성" 또는 "백분율 동일성"을 측정하는 기술은 당업계 주지이다. 일반적으로 "유사성"은, 아미노산들이 전하나 소수성 같은 동일하거나 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성을 갖는 경우, 적당한 장소에서 두 개 이상의 폴리펩티드의 아미노산 대 아미노산의 대비를 의미한다. 소위 "백분율 동일성"은 이때에 비교되는 폴리펩티드 서열들 사이에서 측정될 수 있다. 핵산과 아미노산 서열 동일성을 측정하는 기술은 당업계 주지이고, (일반적으로 cDNA 중간체를 통하여) 그 유전에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 측정하는 것 및 그것으로서 코딩되는 아미노산 서열을 측정하는 것 및 이것을 제 2 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 일반적으로 "동일성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 대응을 각각 지칭한다.

두 개 이상의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 그들의 "백분율 동일성"을 측정함으로써 비교될 수 있다. 백분율 동일성은 두 분자 (표준 서열 및 표준서열에 대하여 미지의 % 동일성을 갖는 서열) 사이의 서열 정보의 직접 비교에 의하여 측정될 수 있는데, 즉, 서열들을 정렬시키고, 두 정렬된 서열 사이의 일치된 정확한 수를 계수하고, 표준 서열의 길이로 나누고, 그 결과에 100을 곱함에 의하여 이루어진다. 분석을 돕기 위하여, 펩티드 분석을 위한 Smith 및 Waterman, Advances in Appl. Math. 2: 482-489,1981의 국소 동일성 알고리즘을 채용한 Atlas of Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoff ed. , 5 Suppl. 3: 353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC에서의 ALIGN, Dayhoff, M. O. 같은 즉시 사용 가능한 컴퓨터 프로그램이 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하기 위한 프로그램은, 역시 Smith와 Waterman 알고리즘을 기초로 하는 Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (available from Genetics Computer Group, Madison, WI) 예를 들어, the BESTFIT, FASTA and GAP 프로그램에서 이용 가능하다. 이들 프로그램은 제조자에 의하여 추천되고 상기 인용한 Wisconsin Sequence Analysis Package에 기재된 디폴트 매개변수를 사용하여 쉽게 이용할 수 있다. 예를 들어, 표준 서열에 대한 특정 뉴클레오티드 서열의 백분율 동일성은 Smith와 Waterman의 동일성 알고리즘과 디폴트 스코어링 표 및 6 뉴클레오티드 위치의 갭 페널티를 사용하여 측정될 수 있다.

본 발명의 문맥에서의 백분율 동일성을 확립하는 다른 방법은 University of Edinburgh가 저작권을 가지며, John F. Collins 및 Shane S. Sturrok에 의하여 개발되어 다수의 공급원으로부터, 예를 들어 인터넷을 통하여 구입 가능한 MPSRCH^TM 패키지를 사용하는 것이다. 이 한 벌의 패키지로부터 Smith와 Waterman 알코리즘이 적용될 수 있는데, 여기서 디폴트 매개변수는 스코어링 표 (예를 들어, 12의 갭 오픈 페널티, 1의 갭 익스텐션 페널티, 및 6의 갭)에 대하여 사용된다. 생성된 데이터로부터 "일치" 값은 "서열 동일성"을 반영한다. 백분율 동일성 또는 유사성을 계산하는 다른 적당한 프로그램은 일반적으로 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 다른 프로그램은 디폴트 매개변수와 함께 사용되는 BLAST이다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP 가 다음 디폴트 매개변수: 유전자 코드 = 표준; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrix = BLOSUM62 ; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Databases = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB +GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR를사용하여 이용될 수 있다. 이들 프로그램의 상세한 설명은 즉시 이용 가능하다.

"면역원성 조성물"은 여기에서 사용될 때 조성물을 피험체에 투여하여 피험체에서 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 진행시키는 결과를 낳는 어떤 조성물 ( 예를 들어, 펩티드, 항체 및/또는 폴리뉴클레오티드)을 지칭한다. 면역원성 조성물은 주사, 흡입, 경구, 코 안으로 또는 어떤 다른 비경구적 또는 점액 경로에 의하여 (예를 들어, 직장 안으로 또는 질 안으로) 수용체 피험체 내로 직접 도입될 수 있다.

"에피토프"는 특이적 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 의미하는데, 이 같은 에피토프를 포함하는 분자가 면역학적 반응을 나타내는 능력 또는 생물학적 샘플에 존재하는 항체와 반응하는 능력을 부여한다. 이 용어는 또한 "항원 결정자" 또는 "항원 결정 부위"와 호환적으로 사용된다. 에피토프는 에피토프 고유의 공간적 입체구조에서 3 개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일반적으로, 에피토프는 적어도 5 개의 그 같은 아미노산 및, 더 일반적으로는, 적어도 8-10 개의 그 같은 아미노산으로 구성된다. 아미노산의 공간적 입체구조를 결정하는 방법은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다. 게다가, 주어진 단백질 안의 에피토프의 동정은 소수성 연구의 사용 및 부위 특이적 혈청학에 의하는 것 같은 당업계 주지의 기술을 사용하여 쉽게 성취된다. 또한, Geysen 등 , Proc. Natl. Acad Sci. USA (1984) 81 : 3998-4002 (주어진 항원에서 면역학적 에피토프의 위치를 결정하기 위하여 펩티드를 신속하게 합성하는 일반 방법); 미국 특허 제 4,708,871 호 (항원의 에피토프를 동정하고 화학적으로 합성하는 방법); 및 Geysen 등, Molecular Immunology (1986) 23: 709-715 (주어진 항체에 대하여 높은 친화도를 갖는 펩티드의 동정 기술) 참조. 동일한 에피토프를 인지하는 항체는 다른 항체가 표적 항원에 결합하는 것을 방해 하는 한 항체의 능력을 나타내는 단순 면역분석에서 동정될 수 있다.

"면역학적 반응" 또는 "면역 반응"은, 여기에서 사용될 때, 폴리펩티드가 백신 조성물에 존재할 때 피험체에서 여기에 기재된 것 같은 펩티드에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응이 진행되는 것을 말한다. 이들 항체는 또한 감염성을 중화시키고/또는 항체-컴플리멘트 또는 항체 의존성 세포 세포독성을 매개하여 면역화된 숙주에 보호를 제공할 수 있다. 면역학적 반응성은 당업계 주지의, 경쟁 분석법 같은 표준 면역 분석법에서 결정될 수 있다.

"유전자 운반" 또는 "유전자 송달"은 관심의 DNA를 숙주 세포에 신뢰성 있게 삽입하는 방법 또는 시스템을 지칭한다. 이 같은 방법은 통합되지 않은 운반되는 DNA의 일시적 발현, 운반된 레플리콘(예를 들어, 에피솜)의 염색체 외에서의 복제 및 발현, 또는 운반된 유전 물질이 숙주의 게놈 DNA 내로 통합되는 것을 결과할 수 있다. 유전자 송달 발현 벡터는 알파바이러스, 폭스 바이러스 및 우두 바이러스로부터 유도된 벡터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 면역화에 대하여 사용될 때, 이 같은 유전자 송달 발현 벡터는 백신 또는 백신 벡터를 가리킬 수 있다.

용어 "샘플"은 생물학적 및 비생물학적 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 살아있는 또는 한때 살아있던 생체로부터 얻어지거나 유도되는 것이다. 비생물학적 샘플은 살아있는 또는 한때 살아있던 생체로부터 유래하지 않은 것이다. 생물학적 샘플은, 장기 (예를 들어, 뇌, 간, 신장 등), 전혈, 혈 분획, 혈장, 뇌척수액 (CSF), 소변, 눈물, 조직, 장기, 생검 같은 (살아있거나 죽은) 동물로부터 유래한 샘플을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 비생물학적 샘플은 약물, 식품, 화장품 등을 포함한다.

용어 "표지" 및 "검출 가능한 표지"는 방사성 동위원소, 형광물질, 냉광물질, 화학냉광물질, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 저해제, 발색단, 염료, 금속 이온, 금속 졸, 리간드 (예를 들어, 비오틴 또는 펩톤) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 검출할 수 있는 분자 지칭한다. 용어 "형광물질"은 검출 가능한 번위에서 형광을 나타낼 수 있는 물질 또는 그것의 부분을 지칭한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표지의 구체적 예는 플루오레신, 로다민, 댄실, 움벨리페론, 탁사스 레드, 루미놀, 아크라디뮴 에스테르, NADPH, 베타-갈락토시다제, 서양고추냉이 페르옥시다제, 글루코스 옥시다제, 알칼린 포스페이트 및 요소분해효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 표지는 또한 에피토프 태그 (예를 들어, His-His 태그), 항체 또는 증폭될 수 있거나 아니면 검출될 수 있는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

II. 일반 개요

예를 들어, 다른 형태와는 아니지만 한 형태와는 우선적으로 상호작용하는 것에 의해서 프리온 단백질의 병원성 및 비병원성 이소형을 구별할 수 있는 펩티드 시약(및/또는 이들 펩티드 시약을 코딩하는 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 조성물이 본원에 개시된다. 펩티드 시약을 사용하여 생성된 항체 및 이를 포함하는 조성물 및 이들 시약 및/또는 항체를 제조하고 사용하는 방법(예를 들어 병원성 프리온 단백질의 분리 및/또는 검출 방법)이 제공된다.

본 발명은 부분적으로는 프리온 단백질의 상대적으로 작은 단편이 프리온의 병원성 형태와 우선적으로 상호작용한다는 것을 발견함으로써 이루어졌다. 병원성 프리온 이소형과의 우선적인 상호작용을 나타내기 위해서 이들 단편이 더 큰 단백질 구조 또는 다른 형태의 골격 분자의 일 부분일 필요는 없다. 어떤 특별한 이론을 취하고 싶지는 않지만, 펩티드 단편은 아마도 비병원성 이소형에 존재하는 입체구조를 모방하는 것에 의해서 비병원성 프리온 이소형에는 결합하지 않지만 병원성 프리온 이소형과의 결합을 허용하는 입체구조를 자발적으로 취하는 것으로 보인다. 프리온에 대하여 증명된 이 일반적인 이론(입체구조 질환 단백질의 어떤 단편이 그 입체구조 질환의 병원성 형태와 우선적으로 상호작용한다)이 다른 입체구조 질환 단백질에도 용이하게 적용되어서 병원성 형태와 우선적으로 상호작용하는 펩티드 시약을 얻을 수 있다. 단편이 더욱 개선된 특징(예를 들어, 높은 친화성, 향상된 안정성, 향상된 가용성, 프로테아제 감도의 감소, 향상된 특이성, 합성하려는 경향 등)을 갖는 펩티드 시약을 생성하도록 단편상에서 여러 변형이 이루어질 수 있는 출발점(예를 들어, 크기 또는 서열 특징의 면에서)이 된다는 것은 당업자에게 자명한 사항이다

일반적으로, 본원에 기재된 펩티드 시약은 프리온 단백질의 병원성 형태와 우선적으로 상호작용할 수 있다. 따라서, 이들 펩티드 시약은 병원성 프리온 단백질 존재의 용이한 검출 및, 실제로 어떤 샘플에서(간 또는 뇌사 상태의 뇌, 척수, 또는 다른 신경계 조직 및 혈액을 포함하는 생물학적 또는 비생물학적 샘플) 프리온-관련 질환의 진단을 가능하게 한다.

더욱이, 본원에 기재된 펩티드 시약은 진단 또는 치료적 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 특히, 펩티드 시약 및/또는 항체가 병원성 단백질과 우선적으로 상호작용하는 경우에, 이 펩티드 시약은 예를 들어, 배열, 회합 또는 다르게는 질환 형태 단백질을 검출될 수 있는 상태로 유도함으로써 병원성 이소형의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 펩티드 시약은 혈액 함유 샘플에서 병원성 형태를 검출하는 것을 포함하여 다양한 진단 분석에서 유용하다. 항체 및/또는 펩티드 시약(또는 하나 이상의 그들의 성분 부분)은 프리온 단백질의 검출을 촉진하고/또는 프리온 단백질과의 상호작용을 향상시키도록 라벨을 붙이거나 표지화될 수 있다.

더욱이, 이에 제한되는 것은 아니지만, 신호 증폭을 위한 분지 DNA의 사용(예를 들어, U.S.특허번호 5,681,697; 5,424,413; 5,451,503; 5,4547,025; 및 6,235,483을 참조하시오); PCR, 롤링 서클 증폭, 제3의 물결 인베이더(Arruda 등, 2002 Expert. Rev. Mol. Diagn. 2:487l; U.S. 특허번호 6090606, 5843669, 5985557, 6090543, 5846717), NASBA, TMA 등(U.S.특허번호 6,511,809; EP 0544212A1)과 같은 표적 증폭 기술의 사용; 및/또는 면역-PCR 기술(예를 들어, U.S.특허번호 5,665,539; 국제공개번호 WO 98/23962; WO00/75663; 및 WO 01/31056)을 포함하는 어떤 적합한 신호 증폭 시스템이 검출을 더 촉진하는데 사용될 수 있다.

더욱이, 본원에 기재된 펩티드 시약 및 항체는 질환을 치료 또는 예방하기 위해서 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.

III. A. 펩티드 시약

입체구조 질환 단백질의 병원성 형태와 상호작용하는 펩티드 시약이 본원에 기재된다. 프리온 단백질에 의한 입체구조 질환 단백질이 본원에 예시된다.

다음 표는 2 이상의 상이한 입체구조를 나타내는 연관된 단백질을 갖는 질환의 비제한적인 예이다.

질환	입체구조 질환 단백질
프리온 질환(예를 들어, 크로이츠펠트 야콥병, 면양떨림병, 소해면뇌병증)	PrP^Sc
알츠하이머질환	APP, A* 펩티드 1-안티키모트립신, 탄, 비-A 성분
ALS	SOD 및 신경미세섬유
피크 질환	피크 소체
파킨스 질환	루이 소체
1형 당뇨병	아밀린
복수의 골수종-형질세포질환	IgGL-사슬
가족 아밀로이드성 다발신경병증	트랜스티레틴
갑상선수질암	프로칼시토닌
만성 신장부전	베타2-마이크로글로불린
울혈성 심장부전	심방 나트륨이뇨인자
노인 심장 및 전신성 아밀로이드증	트랜스티레틴
만성 염증	혈청 아밀로이드 A
죽상경화증	ApoA1
가족 아밀로이드증	겔로신

더욱이, 상기에 열거된 입체구조 질환 단백질 각각은 모두 본원발명에 포함되는 상이한 균주를 초래하는 다양한 변이체 또는 돌연변이를 포함한다. 마우스 프리온 단백질의 다양한 영역 및 서열의 기능적 분석이 하기에 제시된다. Priola(2001) Adv. Protein Chem 57:1-27을 참조하시오. 하기에 제시된 영역 및 잔기에 상응하는 마우스(Mo), 햄스터(Ha), 사람(Hu), 조류(A), 및 양(Sh)에 대한 영역 및 잔기는 표준 절차 및 본원의 교시에 따라서 다른 종들에 대하여 결정될 수 있다.

프리온 단백질(및 다른 입체구조 질환 단백질)은 동일한 아미노산 서열을 사용하여 2개의 서로 다른 3-차원 입체구조를 갖는다는 것에 주목해야만 한다. 한 입체구조는 질환 특성과 연관되어 있고 일반적으로는 불용성인 반면에 다른 입체구조는 질환 특성과 연관성이 없으며 가용성이다. 예를 들어, Wille 등, "Structural Studies of the Scrapie Prion Protein by Electron Crystallography", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99(6): 3563-3568(2002)를 참조하시오. 프리온 단백질에 관하여서만 예시되어 있지만, 본원발명이 열거된 질환, 단백질 및 균주에 한정되는 것은 아니다.

따라서, 어떤 양태에서, 본원에 기재된 펩티드 시약은 자연 발생 단백질 예를 들어, 입체구조 질환 단백질(예를 들어, 프리온 단백질) 또는 프리온 단백질에 상동성을 나타내는 모티프 또는 서열을 포함하는 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 본 발명의 펩티드 시약은 일반적으로 자연 발생 프리온 단백질로부터 유래된다. 펩티드 시약은 바람직하게는 프리온 단백질의 어떤 영역의 아미노산 서열로부터 유래된다. 이들 바람직한 영역은 마우스 프리온 서열에 관하여 (SEQ ID NO:2), 아미노산 잔기 23-43 및 85-156 영역, 및 그것의 하위영역으로 예시되어 있다. 본 발명은 마우스 서열에서 유래된 펩티드 시약에 제한되지 않으며, 본원에 기재된 것과 유사한 방식으로 사람, 소, 양, 사슴, 고라니, 햄스터를 포함하는 종에서 얻은 프리온 서열에서 유래된 펩티드 시약을 포함한다. 프리온 단백질로부터 유래된 경우에, 본원에 기재된 펩티드 시약은 폴리프롤린 II형 헬릭스 모티프를 포함할 수 있다. 다른 서열이, 특히 알라닌 테트라펩티드에서, 또한 폴리프롤린 II형 헬릭스를 형성하는 것으로 제안되었지만, 이 모티프는 전형적으로 일반 서열 PxxP(예를 들어, SEQ ID NO:1의 잔기 102-105)를 포함한다(예를 들어, Nguyen 등, Chem Biol. 2000 7:463; Nguyen 등, Science 1998 282:2088; Schweizer-Stenner 등., J. Am. Chem Soc. 2004 126:2768). PxxP 서열에서, "x"는 어떤 아미노산일 수 있으며 "P"는 자연 발생 서열에서는 프롤린이지만 본원발명의 펩티드 시약에 있어서는 프롤린 치환체에 의해서 대체될 수 있다. 이러한 프롤린 치환체는 일반적으로 펩토이드로서 언급된 N-치환 글리신을 포함한다. 따라서, PxxP 서열에 기초한 폴리프롤린 II형 헬릭스를 포함하는 본 발명의 펩티드 시약에 있어서, "P"는 프롤린 또는 N-치환 글리신 잔기를 나타내고 "x"는 어떤 아미노산 또는 아미노산 유사체를 나타낸다. 특히 바람직한 N-치환 글리신이 본원에 기재되어 있다.

더욱이, 사람, 마우스, 양 및 소를 포함하는 많은 서로 다른 종들로부터 생성된 프리온 단백질에 대한 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 공지되어 있다. 이들 서열에 대한 변이체가 또한 각 종내에 존재한다. 따라서, 본 발명에 사용된 펩티드 시약은 어떤 종 또는 변이체의 아미노산 서열의 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 어떤 구체예에서, 본원에 기재된 펩티드 시약은 도 2에 제시된 어떤 서열로부터 유래된다(SEQ ID NOS:3-11). 본원에 구체적으로 기재된 펩티드 시약의 서열은 일반적으로는 마우스 프리온 서열에 기초한다. 그러나, 당업자라면 이들을 적절한 다른 종들로부터 얻은 상응하는 서열로 치환할 수 있을 것이다. 예를 들어, 사람에게 사용될 진단제 또는 치료제를 필요로 하는 경우에, 마우스 서열을 상응하는 사람 서열의 것으로 용이하게 치환할 수 있다. 특정 예에서, 잔기 약 85에서 잔기 약 112 영역으로부터 유래된 펩티드 시약에서(예를 들어, SEQ ID NO:35, 36, 37, 40), 잔기 109에 상응하는 위치에서 루신은 메티오닌으로 치환될 수 있고, 잔기 112에 상응하는 위치에서 발린은 메티오닌으로 치환될 수 있고, 잔기 97에 해당하는 위치에서 아스파라긴은 세린으로 치환될 수 있다. 마찬가지로, 소 진단제가 필요한 경우에는, 개시된 펩티드에서 소 프리온 서열을 반영하도록 적절한 치환이 이루어질 수 있다. 따라서, 잔기 약 85에서 잔기 약 112의 영역으로부터 유래된 펩티드 시약에 대한 상기 예에서 잔기 109에 상응하는 위치에서 루신은 메티오닌으로 치환될 수 있고, 잔기 97에 상응하는 위치에서 아스파라긴은 글리신으로 치환될 수 있다. 아미노산 치환, 결실, 추가 및 이들 서열에 대한 다른 돌연변이를 포함하는 프리온 단백질의 유도체가 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, 프리온 단백질 서열과 비교할 때 어떤 아미노산 치환, 추가, 및 결실은 펩티드 시약이 병원성 형태와 상호작용하는 능력에 영향을 미치지 않는다.

본원에 기재된 펩티드 시약에 대하여 어떠한 공급원이 사용되었던지 간에, 이들 펩티드 시약은 알려진 프리온 단백질에 반드시 서열 동일성을 나타낼 필요는 없다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 본원에 기재된 펩티드 시약은 그들이 입체구조 질환 단백질의 병원성 형태와 우선적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 한, 자연 발생 프리온 단백질 또는 본원에 기재된 서열에 대하여 하나 이상의 아미노산 치환, 추가, 및 결실을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 보존적 아미노산 치환은 그들의 부사슬과 관련된 아미노산 부류 내에서 이루어지는 것이다. 유전적으로 코딩된 아미노산은 일반적으로 4가지 부류로 나누어진다: (1) 산성=아스파르테이트, 글루타메이트; (2) 염기성=리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성=알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전 극성=글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향성 아미노산으로 분류된다. 예를 들어, 루신의 이소루신 또는 발린으로의 치환, 아스파르테이트의 글루타메이트로의 치환, 트레오닌의 세린으로의 치환, 또는 아미노산의 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 보존적 치환은 생물학적 활성에 중효한 영향을 미치지 않는다는 것이 논리적으로 예견된다.

본원에 기재된 펩티드 시약을 만들기 위해서 천연 아미노산 및 비천연 아미노산 유사체의 어떤 조합이 사용될 수 있다는 것은 분명하다. 유전자 코딩되지 않은 일반적으로 사용된 아미노산 유사체는 이에 제한되는 것은 아니지만, 오르티닌(Orn); 아미노이소부티르산(Aib); 벤조티오페닐알라닌(BtPhe); 알비진(Abz); t-부틸글리신(Tle); 페닐글리신(PhG); 사이클로헥실알라닌(Cha); 노르루신(Nle); 2-나프틸알라닌(2-Nal); 1-나프틸알라닌(1-Nal); 2-티에닐알라닌(2-Thi); 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산(Tic); N-메틸이소루신(N-MeIle); 호모아르기닌(Har); Nα-메틸아르기닌(N-MeArg); 포스포티로신(pTyr 또는 pY); 피페코릴산 (Pip); 4-클로로페닐알라닌(4-ClPhe); 4-플루오로페닐알라닌(4-FPhe); 1-아미노시클로프로판카르복실신(1-NCPC); 및 사르코신(Sar)을 포함한다. 본 발명의 펩티드 시약에 사용된 어떤 아미노산은 D-, 또는 더욱 구체적으로는 L-이소머일 수 있다.

본원에 기재된 펩티드 시약을 생성하는데 사용될 수 있는 다른 비자연 발생 아미노산 유사체는 아미노산의 술폰 및 보론산 유사체(본 발명의 화합물에 또한 사용될 수 있으며, 선택적으로 아이소스티어에 의해서 대체된 하나 이상의 아미드 결합을 갖는 화합물을 포함하는 생물학적으로 기능적 등가물이다)와 같은 펩토이드 및/또는 펩티드모방 화합물을 포함한다. 본 발명의 범위 내에서, 예를 들어, --CONH--는 이들 아이소스티어에 의해서 연결된 라디칼이 --CONH--에 의해서 연결된 라디칼과 유사한 배향으로 배치되도록 --CH₂NH--, --NHCO--, --SO₂NH--, --CH₂O--, --CH₂CH₂--, --CH₂S--, CH₂SO--, --CH--CH--(시스 또는 트랜스), --COCH₂--, --CH(OH)CH₂-- 및 1,5-2치환 테트라졸에 의해서 치환될 수 있다. 본원에 기재된 펩티드 내의 하나 이상의 잔기는 펩토이드를 포함할 수 있다.

따라서, 펩티드 시약은 또한 하나 이상의 N-치환 글리신 잔기(하나 이상의 N-치환 글리신 잔기를 갖는 펩티드는 "펩토이드"로 지칭될 수 있다)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 어떤 구체예에서, 본원에 기재된 어떤 펩티드 시약의 하나 이상의 프롤린 잔기는 N-치환 글리신 잔기로 치환된다. 이런 관점에서 적합한 특정 N-치환 글리신은 이에 제한되는 것은 아니지만, N-(S)-(1-페닐에틸)글리신; N-(4-히드록시페닐)글리신; N-(시클로프로필메틸)글리신;N-(이소프로필)글리신; N-(3,5-디 메톡시벤질)글리신; 및 N-부틸글리신(예를 들어, 도 3)을 포함한다. 다른 N-치환 글리신이 또한 본원에 기재된 펩티드 시약 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하기에 적합할 수 있다. 이러한 아미노산 유사체 및 펩티드모방체의 일반 개요에 관해서는 Nguyen 등(2000) Chem Biol. 7(7): 463-473; Spatola, A.F., chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267(1983)을 참조하시오. 또한, 본원에 참고문헌으로 포함된 Spatola, A. F., Peptide Backbone Modifications(일반 개요), Vega Data, Vol.1, Issue 3,(March 1983); Morley, Trends Pharm Sci(일반적 개요), pp. 463-468(1980); Hudson, D.등, Int J Pept Prot Res, 14: 177-185 (1979)(--CH₂NH-- ,CH₂CH₂--); Spatola 등, Life Sci, 38:1243-1249 (1986)(--CH₂--S); Hann J. Chem. Soc. Perkin Trans.I, 307-314(1982)(--CH--CH--, 시스 및 트랜스); Almquist 등, J Med Chem, 23:1392-1398(1980)(--COCH₂--); Jennings-White 등, Tetrahedron Lett, 23: 2533(1982)(--COCH₂--); Szelke 등, European Appln. EP 45665 CA: 97: 39405(1982)(--CH(OH)CH₂-); Holladay 등, Tetrahedron Lett, 24:4401-4404(1983)(--C(OH)CH₂--); 및 Hruby, Life Sci, 31:189-199(1982)(--CH₂--S--)를 참조하시오. C-말단 카르복실산은 보론산 --B(OH)₂ 또는 보론 에스테르--B(OR)₂ 또는 본원에 참고문헌으로 포함된 U.S. 특허번호 5,288,707에 기재된 다른 보론산 유도체에 의해서 치환될 수 있다.

본원에 기재된 펩티드 시약은 단량체, 다량체, 고리화 분자, 분지 분자, 링커 등을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 어떤 서열의 다량체(즉 이량체, 삼량체 등) 또는 그것의 생물학적 기능적 등가물이 또한 기대된다. 다량체는 동일한 단량체로 구성된 호모다량체일 수 있다(예를 들어, 각각의 모노머가 동일한 펩티드 서열이다). 또는, 다량체는 헤테로다량체일 수 있으며, 이것은 다량체를 구성하는 단량체가 모두 동일한 것은 아니라는 것을 의미한다.

다량체는 단량체를 상호 간에 직접 부착시키는 것에 의해서 또는 예를 들어, 다수의 항원성 펩티드(MAPS)(예를 들어, 대칭 MAPS), 폴리머 골격에 부착된 펩티드(예를 들어, PEG 골격) 및/또는 스페이서 단위를 포함하거나 포함하지 않은 직렬로 연결된 펩티드를 포함하는 기질에 단량체를 직접 부착시키는 것에 의해서 형성될 수 있다.

또는, 단량체를 서로 연결시켜서 다량체를 형성하기 위해서 단량체 서열에 연결기가 첨가될 수 있다. 연결기를 사용하는 다량체의 비제한적인 예는 글리신 링커를 사용하는 직렬 반복; 링커를 통해 기질에 부착된 MAPS 및/또는 링커를 통해 골격에 부착된 선형으로 연결된 펩티드를 포함한다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 양기능성(호모양기능성 또는 헤테로양기능성) 스페이서 단위를 사용하는 연결기가 포함될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 숙신이미딜-4-(p-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부틸레이트 등과 같은 시약을 사용하여 펩티드를 서로 연결하는데 있어서 이러한 스페이서 단위를 포함시키는 많은 방법이 Pierce Immunotechnology Handbook(Pierce Chemical Co. , Rockville, Ill.)에 기재되어 있고 또한 Sigma Chemical Co.(St. Louis, Mo.) 및 Aldrich Chemical Co.(Milwaukee, Wis.)로부터 입수가능하고 "Comprehensive Organic Transformations", VCK-Verlagsgesellschaft, Weinheim/Germany(1989)에 기재되어 있다. 단량체 서열을 서로 연결하는데 사용할 수 있는 연결기의 한 예는 --Y_l--F--Y₂ 이고 Y_l 및 Y₂는 동일하거나 상이하며 0-20, 바람직하게는 0-8, 더욱 바람직하게는 0-3개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 기이고, F는 --O--, --S--, --S--S--, --C(O)--O--, --NR--, --C(O)--NR--, --NR--C(O)--O--, --NR--C(O)--NR--, --NR--C(S)--NR--, --NR--C(S)--O--과 같은 하나 이상의 작용기이다. Y₁ 및 Y₂는 히드록실, 알콕시, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노, 카르복실, 카르복실알킬 등으로 선택적으로 치환될 수 있다. 단량체의 어떤 적합한 원자가 연결기에 부착될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

더욱이, 본 발명의 펩티드 시약은 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있다. 단량체 단위는 고리화될 수 있거나 또는 서로 연결되어서 선형 또는 분지형, 고리형(예를 들어, 거대고리), 별 형상(덴드리머) 또는 볼 형상(예를 들어, 플러렌)의 다량체를 제공할 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 단량체 서열로부터 형성될 수 있는 다수의 폴리머를 용이하게 인식할 수 있을 것이다. 한 구체예에서, 다량체는 고리 이량체이다. 상기와 동일한 용어를 사용하여, 이량체는 호모이량체 또는 헤테로이량체일 수 있다.

단량체이든지 다량체이든지 고리형은 상기에 기재된 어떤 결합에 의해서 생 성될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들어, (1) 질소 및 C-말단 카르보닐 간의 직접적인 아미드 결합 형성 또는 스페이서 기의 매개(예를 들어, 엡실론-아미노 카르복실산을 이용한 축합)에 의한 N-말단 아민과 C-말단 카르복실산의 고리화; (2) 예를 들어, 아스파르테이트 또는 글루타메이트 부사슬과 리신 부사슬 간의 아미드 결합 형성 또는, 2개의 시스테인 부사슬 간의, 또는 페니실아민 및 시스테인 부사슬 간의, 또는 2개의 페니실린아민 부사슬 간의 이황화 결합 형성과 같은 2 잔기의 부사슬 간의 결합 형성에 의한 고리화; (3) 부사슬(예를 들어, 아스파르테이트 또는 리신)과 N-말단 아민 또는 C-말단 카르복실 중 어느 하나와의 아미드 결합 형성에 의한 고리화; 및/또는 (4) 짧은 탄소 스페이서 기의 매개에 의한 2개의 부사슬의 연결을 제한없이 포함한다.

바람직하게는, 본원에 기재된 펩티드 시약은 병원성 및/또는 감염성이 아니다.

본 발명의 펩티드 시약은 3 내지 약 100개 길이의 잔기(또는 그들 사이의 어떤 수치) 또는 그 이상, 바람직하게는 약 4 내지 75개의 잔기(또는 그들 사이의 어떤 수치), 바람직하게는 약 5 내지 약 63개의 잔기(또는 그들 사이의 어떤 수치), 및 더욱 바람직하게는 약 8 내지 약 30개의 잔기(또는 그들 사이의 어떤 수치)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 잔기일 수 있다.

본원에 기재된 조성물 및 방법에 유용한 펩티드 시약의 비제한적인 예는 표 1 및 표 4에 기재된 서열로부터 유래된다. 표에 기재된 펩티드 시약은 종래의 1문 자 아미노산 코드에 의해서 표시되고 왼쪽은 N-말단을 오른쪽은 C-말단을 나타낸다. 꺾음 괄호 내의 아미노산은 서로 다른 펩티드 시약 내의 동일한 위치에서 사용될 수 있는 택일적인 잔기를 나타낸다. 둥근 괄호는 잔기가 펩티드 시약에 존재하거나 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다. 어떤 프롤린 잔기는 N-치환 글리신 잔기와 치환되어서 펩토이드를 형성한다. 표에 기재된 어떤 서열은 N- 및/또는 C-말단에서 선택적으로 Gly 링커(G_n;여기서, n=1,2,3, 또는 4)를 포함한다.

한 양태에서, 본 발명의 펩티드 시약은 본원에 기재된 펩티드 각각 및 (본원에 기재된 바와 같은) 그것의 유도체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78,79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 또는 132의 펩티드로부터 유래된 펩티드 시약을 포함한다.

본 발명은 바람직하게는 SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 72, 74, 76, 77, 78, 81, 82, 84, 89, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 또는 132의 펩티드로부터 유래된 펩티드 시약을 포함한다.

어떤 바람직한 구체예에서, 펩티드 시약은 병원성 프리온 예를 들어, SEQ ID NOs: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, 또는 84의 펩티드로부터 유래된 펩티드 시약, 및 유사체(예를 들어, 하나 이상의 프롤린이 N-치환 글리신으로 치환된 것) 및 그것의 유도체에 특이적으로 결합한다.

상기에 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 펩티드 시약은 하나 이상의 치환, 추가, 및/또는 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 시약에서 하나 이상의 잔기는 다른 잔기 예를 들어, 알라닌 잔기 또는 아미노산 유사체 또는 N-치환 글리신 잔기로 치환되어서 펩토이드를 얻을 수 있다(예를 들어, Nguyen 등(2000) Chem Biol. 7(7):463-473 참조).

더욱이, 본원에 기재된 펩티드 시약은 추가의 펩티드 또는 비펩티드 성분을 포함할 수 있다. 추가의 펩티드 성분의 비제한적인 예는 스페이서 잔기를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 2 이상의 (천연 또는 유도체화) 글리신 잔기 또는 하나 또는 양 말단 상의 아미노헥사노익액시드 링커 또는 펩티드 시약을 용해하는데 도움이 될 수 있는 잔기(예를 들어, SEQ ID NOs:83, 86에 표시된 아스파르트산(Asp 또는 D)과 같은 산성 잔기)를 포함한다. 한 구체예에서, 예를 들어, 펩티드 시약은 다수의 항원성 펩티드(MAP)로서 합성된다. 전형적으로, 펩티드 시약의 다수의 카피(예를 들어, 2-10 카피)는 분지형 리신 또는 다른 MAP 담체 코어와 같은 MAP 담체 상에서 직접 합성된다. 예를 들어, Wu 등(2001) J Am Chem Soc. 2001 123(28):6778-84; Spetzler 등(1995) Int J Pept Protein Res. 45(1):78-85를 참조하시오.

본원에 기재된 펩티드 시약에 포함될 수 있는 비펩티드 성분(예를 들어, 화학 부분)의 비제한적인 예는 펩티드 시약의 말단 또는 내부 어느 하나에 있어서 하나 이상의 검출가능한 표지, 태그(예를 들어, 비오틴, His-태그, 올리고뉴클레오티드), 색소, 결합쌍 원소 등을 포함한다. 비펩티드 성분은 또한 직접적으로 또는 스페이서(예를 들어, 아미드기)를 통해서 정량 구조-활성 데이터 및/또는 비간섭형 분자 모델링에 의해서 예측된 화합물 상의 위치에 부착될 수 있다(예를 들어, 하나 이상의 표지의 공유 결합에 의한다). 본원에 기재된 펩티드 시약은 또한 아밀로이드 특이적 색소(예를 들어, Congo Red, Thioflavin 등)와 같은 프리온 특이적 화학 부분을 포함할 수 있다. 화합물의 유도(예를 들어, 표지화, 고리화, 화학 부분의 부착 등)가 결합 성질, 생물학적 기능 및/또는 펩티드 시약의 약학적 활성을 실질적으로 방해하지 않아야만 한다.

본 발명의 펩티드 시약은 일반적으로는 프리온 단백질 단편 또는 본원에 제시된 펩티드 서열에 적어도 약 50% 서열 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 펩티드 시약은 적어도 70% 서열 동일성; 더욱 바람직하게는 프리온 단백질 단편 또는 본원에 제시된 펩티드 서열에 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.

본원에 기재된 펩티드 시약은 병원성 형태와 우선적으로 상호작용하기 때문에, 분리, 정제, 검출, 진단 및 치료적 이용과 같이 다양한 분야에서 유용하다. 예를 들어, 펩티드 시약이 병원성 형태와 우선적으로 상호작용하는 구체예에서, 펩티드 시약은 그 자체로 혈액, 신경계 조직(뇌, 척수, CSF 등) 또는 다른 조직 또는 기관 샘플과 같은 샘플에서 병원성 형태를 검출하는데 사용될 수 있다. 펩티드 시약은 또한 병원성 형태와 연관된 질환의 존재를 진단하고, 병원성 형태를 분리하고 병원성 형태를 제거하는 것에 의해서 샘플을 탈오염시키는데 유용하다.

펩티드 시약과 프리온 단백질의 상호작용은 알려진 결합 분석(예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 표준 면역 분석)을 사용하여 시험될 수 있다.

본 발명의 펩티드 시약의 특이성을 시험하는 종래의 한 방법은 병원성 및 비병원성 프리온 모두를 함유하는 샘플을 선택하는 것이다. 일반적인 이러한 샘플은 병에 걸린 동물 유래의 뇌 또는 척수 조직을 포함한다. 병원성 형태에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 펩티드 시약은 (당업계에 알려진 방법에 의해서 그리고 하기에 상세히 기재된 방법에 의해서) 고체 지지체에 부착되고, 다른 샘플 성분으로부터 병원성 프리온을 분리하고("풀-다운 방식"), 고체 지지체상의 펩티드-프리온 결합 상호작용의 수와 직접 관련된 정량값을 얻는데 사용된다. 변형 및 당업계에 알려진 다른 분석법이 본 발명의 펩티드 시약의 특이성을 증명하는데 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 실시예를 참조하시오.

본원에 기재된 펩티드 시약을 사용하는 경우에 반드시 요구되는 것은 아니지만, 이들 분석은 병원성 입체구조를 갖는 프리온이 일반적으로 프로테인아제 K와 같은 어떤 프로테아제에 내성을 갖는다는 사실을 이용할 수 있다. 동일한 프로테아제가 비병원성 입체구조 프리온을 분해할 수 있다. 따라서, 프로테아제를 사용하는 경우에, 샘플은 2개의 동일한 양으로 분리될 수 있다. 프로테아제는 제2의 샘플에 참가될 수 있고 동일한 시험이 수행될 수 있다. 제2의 샘플 내의 프로테아제가 어떤 비병원성 프리온을 분해하기 때문에, 제2의 샘플 중의 어떤 펩티드-프리온 결합 상호작용은 병원성 프리온의 특징으로 여겨진다.

따라서, 결합 특이성 및/또는 펩티드 시약의 친화성을 평가하는 방법의 비제한적인 예는 표준 웨스턴 및 파-웨스턴 블로팅 기술; 표지화된 펩티드; ELISA-유사 분석; 및/또는 세포 기초 분석을 포함한다. 예를 들어, 웨스턴 블롯은 일반적으로 니트로셀룰로스 또는 PVDF상에서 일렉트로블롯팅된 "풀-다운" 분석(상기 기재 참조)으로부터 얻어진 샘플상에서 SDS-PAGE 겔로부터 변성된 프리온 단백질을 검출하는 표지된 1차 항체를 사용한다. 변성된 프리온 단백질을 인식하는 항체가 (그 중에서도 특히, Peretz 등, 1997 J. Mol. Biol. 273:164; Peretz 등, 2001 Nature 412:739; Williamson 등, 1998 J. Virol. 72:9413; U.S.특허번호 6,765,088; U.S.특허번호 6,537548에) 기재되어 있으며, 그 중 일부는 상업적으로 입수가능하다. 다른 프리온 결합 분자 예를 들어, 모티프-이식된 하이브리드 폴리펩티드(WO 03/085086), 어떤 양이온 또는 음이온 폴리머(WO 03/073106), "병원성 촉매"인 어떤 펩티드(WO 02/0974444) 및 플라스미노겐이 기재되어 있다. 그 다음, 1차 항체는 태그에 대한 프로브(예를 들어, 스트렙타비딘-결합 알칼리성 인산염, 고추냉이의 페르옥시다아제, ECL 시약, 및/또는 증폭가능한 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 검출 (및/또는 증폭)된다. 결합은 또한 표지된 친화성 태그(예를 들어, 비오틴)를 갖는 펩티드와 같은 검출 시약을 사용하여 평가될 수 있고 친화성 태그에 대한 프로브(예를 들어, 스트렙타비딘-결합 알칼리성 인산염, 고추냉이의 페르옥시다아제, ECL 시약, 또는 증폭가능한 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 증폭될 수 있다. 더욱이, 샌드위치 ELISA에 유사한 마이크로타이터 플레이트 과정(예를 들어, 본원에 기재된 프리온 특이적 펩티드 시약을 사용하여 프리온 단백질을 고체 지지체(예를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 웰, 비드 등)에 고정시킨다)이 사용될 수 있으며, 추가의 검출 시약은 이에 제한되는 것은 아니지만, 친화성을 갖는 다른 프리온 특이적 펩티드 시약 및/또는 콘쥬게이트된 알칼리성 인산염, 고추냉이의 페르옥시다아제, ECL 시약, 또는 증폭가능한 올리고뉴클레오티드와 같은 검출 표지를 포함할 수 있다. 각각의 세포에서 직접 프리온 단백질을 검출하는 경우에 (형광 기초 세포 분별, 카운팅, 또는 특이적으로 표지화된 세포의 검출을 가능하게 하는 형광으로 표시된 프리온 특이적 펩티드를 사용하는) 세포 기초 분석법이 또한 사용될 수 있다.

III.B. 펩티드 시약 생산

본 발명의 펩티드 시약은 다양한 방법으로 생산될 수 있으며, 이들 모든 방법이 당업계에 알려져 있다.

한 구체예에서, 펩티드 시약이 전체적으로 또는 부분적으로 유전적으로 코딩된 펩티드인 경우에, 펩티드는 당업계에 잘 알려진 재조합 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 당업자는 표준 방법론 및 본원의 교시를 사용하여 원하는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 용이하게 결정할 수 있다. 일단 분리되면, 재조합 펩티드는 펩티드 시약을 생산하도록 본원에 기재되고 당업계에 잘 알려진 비-유전적으로 코딩된 성분(예를 들어, 검출가능한 표지, 결합쌍 원소 등)을 선택적으로 포함하도록 변형될 수 있다.

올리고뉴클레오티드 프로브는 알려진 서열에 기초하여 설계되고 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 프로빙하는데 사용될 수 있다. 그 다음, 서열은 표준 기술 및 예를 들어, 전장 서열의 원하는 부분에서 유전자를 절단하는데 사용되는 제한효소를 사용하여 더욱 분리될 수 있다. 유사하게, 관심의 서열은 페놀 추출과 같은 알려진 기술을 사용하여 관심의 서열을 포함하는 세포 및 조직으로부터 직접적으로 분리될 수 있으며, 서열은 원하는 절단을 얻기 위해 더욱 조작된다. 예를 들어, DNA를 분리하고 얻는데 사용된 기술을 기재하고 있는 Sambrook 등, 상기참조.

펩티드를 코딩하는 서열은 예를 들어, 알려진 서열에 기초하여 합성적으로 생산될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 소망의 특정 아미노산 서열에 대한 적절한 코돈을 이용하여 설계될 수 있다. 완전한 서열은 일반적으로 표준 방법에 의해서 제조된 오버랩핑 올리고뉴클레오티드로부터 만들어지며 완전한 코딩 서열로 조합될 수 있다. 예를 들어, Edge(1981) Nature 292:756; Nambair 등(1984) Science 223:1299; Jay 등(1984) J. Biol. Chem 259:6311; Stemmer 등(1995) Gene 164:49-53 참조하시오.

재조합 기술은 청구범위에 기재된 펩티드 시약에 유용한 폴리펩티드를 코딩하는 서열(이 서열은 원하는 아미노산 코돈을 얻을 수 있도록 적절한 염기쌍의 치환에 의해서 생체외에서 돌연변이화될 수 있다)을 클로닝하는데 사용된다. 이러한 변화는 단일 아미노산에 변화를 일으키는 1개의 염기쌍을 포함할 수 있거나 또는 수개의 염기쌍 변화를 포함할 수 있다. 또는 미스매치 듀플렉스의 융해 온도 이하의 온도에서 모 뉴클레오티드 서열(일반적으로 RNA 서열에 상응하는 cDNA)에 혼성화하는 미스매치 프라이머를 사용하여 돌연변이를 일으킬 수 있다. 프라이머는 상대적으로 좁은 범위내에서 프라이머 길이 및 염기 조성을 유지함으로써 그리고 돌연변이 염기가 중앙에 위치하도록 함으로써 특이성을 가지도록 제조될 수 있다. 예를 들어, Innis 등, (1990)PCR Applications: Protocols for Functional Genomics;Zoller 및 Smith, Methods Enzymol.(1983)100: 468을 참조하시오. DNA 폴리머라제를 사용하여 프라이머를 연장하고, 생성물을 클로닝하고, 프라이머 연장된 가닥을 분리함으로써 유도된 돌연변이화된 DNA를 포함하는 클론을 선별하였다. 선별은 혼성화 프로브로서 돌연변이 프라이머를 사용하여 이루어질 수 있다. 이 기술은 또한 다수의 점 돌연변이를 생성하는데 적용가능하다. 예를 들어, Dalbie-McFarland 등. Proc. Natl. Acad. Sci USA (1982) 79: 6409를 참조하시오.

일단 코딩 서열을 분리 및/또는 합성한 다음, 이들이 발현되도록 적합한 벡터 또는 레플리콘에 클로닝될 수 있다(실시예 참조). 실시예의 교시로부터 자명한 사항이지만, 변형된 폴리펩티드를 코딩하는 다양한 벡터는 그 안에 결실 또는 돌연변이를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 다양한 조합으로 작동가능하게 연결한 발현 구조체를 제조함으로써 생성될 수 있다.

많은 클로닝 벡터가 당업자에게 알려져 있으며, 적절한 클로닝 벡터의 선택은 선택의 문제이다. 클로닝을 위한 재조합 DNA 벡터 및 형질전환할 수 있는 숙주 세포는 박테리오파지 λ(E. coli), pBR322(E. coli), pACYC177(E. coli), pKT230 (그람-네가티브 박테리아), pGV1106(그람-네가티브 박테리아), pLAFRl(그람-네가티브 박테리아), pME290(비-E. coli 그람-네가티브 박테리아), pHV14(E. coli 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), pBD9(바실러스(Bacillus)), pIJ61 (스트렙토미세스(Streptomyces), pUC6(스트렙토미세스(Streptomyces)), YIp5(사카로미세스(Saccharomyces), YCp19(사카로미세스(Saccharomyces)) 및 소 파필로마 바이러스(포유동물 세포)를 포함한다. 일반적으로, DNA Cloning:Vols. I&II, 상기참조; Sambrook 등, 상기참조; B. Perbal, 상기참조.

곤충 세포 발현 시스템(예를 들어, 바큘로바이러스 시스템)이 또한 사용될 수 있으며 당업자에게 잘 알려져 있고 예를 들어, Summers 및 Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)에 기재되어 있다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 대한 재료 및 방법은 특히 Invitrogen, San Diego CA("MaxBac" 키트)에서 키트로 입수가능하다.

식물 발현 시스템이 또한 본원에 기재된 펩티드 시약을 생산하는데 사용될 수 있다. 일반적으로는, 이러한 시스템은 이종성 유전자를 사용하여 식물 세포를 트랜스펙션하는 바이러스 기초 벡터를 사용한다. 이러한 시스템의 기재에 대해서는 Porta 등, Mol. Biotech.(1996) 5:209-221; 및 Hackland 등, Arch. Virol. (1994) 139:1-22를 참조하시오.

Tomei 등, J. Virol.(1993) 67:4017-4026 및 Selby 등, J. Gen. Virol. (1993) 74:1103-1113에 기재된 바와 같이 백신 기초 감염/트랜스펙션 시스템과 같은 바이러스 시스템이 본 발명에 사용될 것이다. 이 시스템에서, 세포는 우선 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제를 코딩하는 백시니아 바이러스 재조합체를 사용하여 생체외에서 트랜스펙션한다. 이 폴리머라제는 단지 T7 프로모터를 포함하는 주형을 전사한다는 점에서 정확한 특이성을 나타낸다. 감염 후에, 세포를 T7 프로모터에 의해서 유도된 관심의 DNA로 트랜스펙션한다. 백시니아 바이러스 재조합체 유래의 세포질에서 발현된 폴리머라제는 트랜스펙션된 DNA를 숙주 번역기에 의해서 단백질로 번역될 수 있는 RNA로 전사한다. 이 방법은 과량의 RNA 및 그것의 번역 생성물을 일시적으로 높은 수준으로 세포질에 제공한다.

유전자는 프로모터, (박테리아 발현을 위한) 리보솜 결합 부위, 및 선택적으로 오퍼레이터(본원에서는 총체적으로 "조절" 요소로 지칭한다)의 조절하에 놓이게 되며, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 발현 구조체를 포함하는 벡터에 의해서 형질전환된 숙주 세포에서 RNA로 전사된다. 코딩 서열은 단일 펩티드 또는 리더 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 발명에 있어서, 자연 발생 단일 펩티드 또는 이종성 서열 모두가 사용될 수 있다. 리더 서열은 번역 후 프로세싱에 의해서 숙주에 의해서 제거될 수 있다. 예를 들어, U.S.특허번호 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397을 참조하시오. 이러한 서열은 이에 제한되는 것은 아니지만, TPA 리더 및 꿀벌 멜리틴 신호 서열을 포함한다.

숙주 세포의 성장에 비례하여 단백질 서열의 발현을 조절하는 다른 조절 서열이 또한 바람직하다. 이러한 조절 서열은 당업자에게 알려져 있으며 그 예는 유전자의 발현이 화학 또는 물리적 자극(조절 화합물의 존재를 포함한다)에 반응하여 시작되거나 멈추도록 하는 서열을 포함한다. 다른 형태의 조절 요소가 벡터 예를 들어 인핸서 서열에 또한 존재할 수 있다.

제어 서열 및 다른 조절 서열이 벡터로 삽입되기 전에 코딩 서열에 연결될 수 있다. 또는, 코딩 서열은 제어 서열 및 적절한 제한 부위를 이미 포함하는 발현 벡터에 직접 클로닝될 수 있다.

어떤 경우에, 코딩 서열이 적절한 방향으로 제어 서열에 부착될 수 있도록 즉, 적절한 리딩 프레임을 보유하도록 코딩 서열을 변형하는 것이 필요하다. 돌연변이 또는 유사체는 단백질을 코딩하는 서열의 일부분을 결실시키는 것에 의해서, 서열을 삽입하는 것에 의해서, 그리고/또는 서열 내의 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환하는 것에 의해서 만들어질 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 기술(예를 들어, 부위 특이적 돌연변이유발)은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, Sambrook 등, 상기참조; DNA Cloning, Vols. I 및 II, 상기참조; Nucleic Acid Hybridization, 상기참조.

그 다음, 발현 벡터를 사용하여 적절한 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 많은 포유동물 세포주가 당업계에 알려져 있고 이들은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 이용가능하며 이에 제한되는 것은 아니지만, 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 갓 태어난 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 사람 간세포 암종(예를 들어, Hep G2), 베로293 세포 등과 같은 불사 세포주를 포함한다. 유사하게, E. coli, Bacillus subtilis, 및 Streptococcus spp.와 같은 박테리아 숙주가 본 발명의 발현 구조체로서 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 효모 숙주는 그 중에서도 특히, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenulapolymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe 및 Yarrowia lipolytica를 포함한다. 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용하기 위한 세포는 그 중에서도 특히 Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, 및 Trichoplusia ni를 포함한다.

발현 시스템 및 선택된 숙주에 따라서, 본 발명의 단백질은 관심의 단백질이 발현될 수 있는 조건하에서 상기에 기재된 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 증식시키는 것에 의해서 생산된다. 적절한 성장 조건의 선택은 당업계의 기술 수준의 범위내이다.

한 구체예에서, 형질전환된 세포는 폴리펩티드 생산물을 주변 배지로 분비한다. 단백질 생산물의 분비를 향상시키기 위해서 어떤 조절 서열 예를 들어, 조직 플라스미노겐 활성화인자(TPA) 리더 서열, 인터페론(γ 또는 α) 신호 서열 또는 공지된 분비 단백질 유래의 다른 신호 펩티드가 포함될 수 있다. 그 다음 분비된 폴리펩티드 생산물은 본원에 기재된 다양한 기술 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 히드록시아파타이트 수지, 컬럼 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 크기 배척 크로마토그래피, 전기영동, HPLC, 면역흡착 기술, 친화성 크로마토그래피, 면역침전 등을 포함하는 표준 정제 기술을 사용하여 분리될 수 있다.

또는, 형질전환된 세포는 화학, 물리적 또는 기계적 방법을 사용하여 파괴되고, 이 방법은 재조합 폴리펩티드는 실질적으로 완전히 유지되도록 하면서 세포를 용해한다. 세포내 단백질은 폴리펩티드가 유출되도록 세정제 또는 유기 용매를 사용하여 세포벽 또는 막 유래 성분을 제거함으로써 얻어질 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고 Protein Purification Applications: A Practical Approach,(E.L.V. Harris and S. Angal, Eds., 1990)에 기재되어 있다.

예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 세포를 파괴하는 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 음파 또는 초음파처리; 교반; 액체 또는 고체 성형; 열 처리; 동결융해; 건조; 폭발적 감압; 삼투압 쇼크; 트립신, 뉴라미니다아제 및 리소자임과 같은 프로테아제를 포함하는 용균효소를 이용한 처리; 알칼리 처리; 및 담즙산염, 소듐 도데실술페이트, 트리톤, NP40 및 CHAPS와 같은 세정제 및 용매의 사용을 포함한다. 세포를 파괴하는데 사용된 특정 기술은 대부분 선택의 문제이며 폴리펩티드가 발현되는 세포 형태, 배양 조건 및 사용된 예비처리에 따라 달라진다.

세포의 파괴 후에, 일반적으로 원심분리에 의해서 세포 찌꺼기를 제거하고, 세포내 생성된 폴리펩티드를 이에 제한되는 것은 아니지만, 컬럼 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 크기-배척 크로마토그래피, 전기영동, HPLC, 면역흡착 기술, 친화성 크로마토그래피, 면역침전 등을 포함하는 표준 정제 기술을 사용하여 더 정제된다.

예를 들어, 본 발명의 세포내 폴리펩티드를 얻는 방법은 항체(예를 들어, 미리 생성된 항체)를 사용하는 면역친화성 크로마토그래피 또는 렉틴 친화성 크로마토그래피와 같은 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 특히 바람직한 렉틴 수지는 이에 제한되는 것은 아니지만, Galarathus nivalis 응집소(GNA), Lens culinaris 응집소(LCA 또는 렌틸 렉틴), Pisum sativum 응집소(PSA 또는 완두콩 렉틴), Narcissus pseudonarcissus 응집소(NPA) 및 Allium ursinum 응집소(AUA)로부터 유래된 수지와 같은 만노스 부분을 인식하는 것이다. 적합한 친화성 수지의 선택은 당업계의 기술범위 내이다. 친화성 정제 후에, 폴리펩티드는 상기에 기재된 방법과 같은 당업계에 잘 알려진 종래의 기술을 사용하여 더 정제될 수 있다.

펩티드 시약은 예를 들어, 당업자에게 알려진 몇몇 방법에 의해서 화학적으로 용이하게 합성될 수 있다. 일반적으로, 이들 방법은 생성중인 펩티드 사슬에 하나 이상의 아미노산을 연속적으로 첨가하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제 1의 아미노산의 아미노 또는 카르복실기 중 어느 하나가 적당한 보호기에 의해서 보호된다. 그 다음, 보호되거나 유도체화된 아미노산은 아미드 결합이 형성되도록 하는 조건하에서 적절하게 보호된 상보적 기(아미노 또는 카르복실)를 갖는 서열에 다음 아미노산을 첨가하는 것에 의해서 불활성 고체 지지체에 부착하거나 또는 용액에서 이용될 수 있다. 그 다음, 보호기를 새로 첨가된 아미노산 잔기로부터 제거하고 (적절하게 보호된) 다음 아미노산을 첨가한다. 올바른 서열에 원하는 아미노산을 연결한 다음, 남아있는 보호기 (및 고체상 합성기술이 사용된 경우라면 어떤 고체 지지체)를 연속적으로 또는 동시에 제거하여 최종 폴리펩티드를 얻는다. 이 일반적 과정의 간단한 변형으로, 예를 들어, (키랄 센터를 라세미화하지 않는 조건하에서) 보호된 트리펩티드와 적절하게 보호된 디펩티드를 결합시키고 탈보호 후에 펜타펩티드를 형성하는 것과 같이, 생성중인 사슬에 한번에 하나 이상의 아미노산을 첨가하는 것이 가능하다. 예를 들어, 고체상 펩티드 형성 기술에 관하여 J.M. Stewart 및 J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis(Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1984) 및 G. Barany 및 R. B.Merrifield, The Peptides:Analysis, Synthesis, Biology, 편집인 E. Gross 및 J. Meienhofer, Vol. 2, (Academic Press, New York, 1980), pp. 3-254; 그리고 종래의 용액 형성에 관하여 M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis(Springer-Verlag, Berlin 1984) 및 E. Gross and J. Meienhofer, Eds., The Peptides:Analysis. Synthesis. Biology, Vol.1. 이들 방법은 일반적으로 상대적으로 작은 폴리펩티드 즉, 약 50-100 아미노산 이하의 길이에 사용되지만, 더 큰 폴리펩티드에도 이용가능하다.

일반적인 보호기는 t-부틸옥시카르보닐(Boc), 9-플루오르에닐메톡시카르보닐(Fmoc) 벤질옥시카르보닐(Cbz); p-톨루엔술포닐(Tx); 2,4-디니트로페닐; 벤질(Bzl); 비페닐이소프로필옥시카르복시-카르보닐, t-아밀옥시카르보닐, 이소보르닐옥시카르보닐, o-브로모벤질옥시카르보닐, 시클로헥실, 이소프로필, 아세틸, o-니트로페닐술포닐 등을 포함한다.

전형적인 고체 지지체는 가교형 폴리머 지지체이다. 이들은 디비닐벤젠 가교형 스티렌계 폴리머, 예를 들어, 디비닐벤젠-히드록시메틸스티렌 코폴리머, 디비닐벤젠-클로로메틸스티렌 코폴리머 및 디비닐벤젠-벤즈하이드릴아미노폴리스티렌 코폴리머를 포함할 수 있다.

폴리머를 포함하는 펩토이드의 합성은 U.S. 특허번호 5,877,278; 6,033,631 ; Simon 등(1992) Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 9367에 따라서 수행될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 다수 펩티드의 동시 합성법과 같은 다른 방법에 의해서 화학적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, Houghten Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 5131-5135; U.S.특허번호 4,631,211을 참조하시오.

IV. 항체

더욱이, 본 발명에 사용된 본원에 기재된 펩티드 시약은 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 이들 펩티드 시약에 대해 유발된 항체는 병원성 프리온에 대하여 특이적이다. 다른 구체예에서, 항체는 병원성 및 비병원성 형태 모두에 결합한다. 더 이상의 구체예에서, 항체는 비병원성 이소형에 대하여 특이적이다. 선택적으로, 본원에 기재된 항체는 비병원성 형태가 병원성 형태로 전환되는 것을 억제한다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 펩티드 시약 (또는 이러한 펩티드 시약을 코딩하는 폴리펩티드)을 동물에 투여하는 것에 의해서 생성된다. 방법은 또한 동물로부터 항체를 분리하는 단계를 포함한다.

본 발명의 항체는 다클론 또는 단일클론 항체 조제물, 단일특이성 항혈청, 사람 항체일 수 있거나 또는, 하이브리드 또는 키메라 항체(예를 들어, 사람화 항체), 변형된 항체(Fab')₂ 단편, F(ab) 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체, 이량체 또는 삼량체 항체 단편 또는 구조체, 미니바디, 또는 문제의 항원에 결합하는 그것의 기능적 단편일 수 있다.

항체는 당업자에게 잘 알려진 기술 및 U.S.특허번호 4,011,308; 4,722,890; 4,016,043; 3,876,504; 3,770,380; 및 4,372,745에 기재된 기술을 사용하여 생산된다. 예를 들어, 다클론 항체는 관심의 항원(예를 들어, 본원에 기재된 펩티드 시약)으로 마우스, 래트, 래빗, 양, 또는 염소와 같은 동물을 면역화하는 것에 의해서 생성된다. 면역화하기 전에 항원을 담체에 연결시켜서 면역원성을 향상시킬 수 있다. 이러한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 면역은 일반적으로 식염수, 바람직하게는 프로인트 완전 애쥬번트와 같은 애쥬번트에서 항원을 혼합하거나 에멀젼화하는 것에 의해서 그리고 비경구적으로(일반적으로는 피하내 또는 근육내) 혼합물 또는 에멀젼을 주입하는 것에 의해서 이루어진다. 식염수에서, 바람직하게는 프로인트 완전 애쥬번트를 사용하여 항원을 1회 이상 주입함으로써 2-6주 후에 동물을 추가 투여시킨다. 항체는 또한 당업계에 알려진 방법을 사용하여 체외 면역에 의해서 생성될 수 있다. 다클론 항혈청은 면역화 동물로부터 얻어진다.

다클론 항체는 일반적으로 Kohler 및 Milstein(1975) Nature 256:495-497에 기재된 방법, 또는 그것의 변형을 사용하여 제조된다. 일반적으로, 마우스 또는 래트는 상기에 기재된 바와 같이 면역화된다. 그러나, 혈청을 추출하기 위해서 동물을 출혈시키는 대신에, 비장 (및 선택적으로는 몇 개의 큰 림프절)을 제거하여 단일 세포들로 분리하였다. 필요하다면, 세포 현탁액을 항원으로 코팅된 플레이트 또는 웰에 도포하는 것에 의해서 (비특이적으로 부착된 세포를 제거한 다음) 비장 세포를 스크리닝할 수 있다. 항원에 특이적인 막-결합된 면역글로불린을 발현하는 B 세포가 플레이트에 결합할 것이고, 나머지 현탁액으로 씻겨 내려가지 않는다. 그 다음, 결과의 B 세포, 또는 모든 분리된 비장 세포가 하이브리도마를 형성하도록 골수종 세포와 융합시키고 선택 배지(예를 들어, 히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘 배지, "HAT")에서 배양한다. 희석을 제한하는 것에 의해서 결과의 하이브리도마를 플레이팅하였고 면역화 항원에 특이적으로 결합하는 (관련없는 항원에는 결합하지 않는다) 항체를 생산하는지에 대하여 분석한다. 그 다음, 선택된 단일클론 항체-분비 하이브리도마를 생체외(예를 들어, 조직 배양병 또는 속이 빈 섬유 반응기) 또는 생체내(예를 들어, 마우스의 복수에서)에서 배양한다.

사람화 및 키메라 항체가 또한 본 발명에서 유용하다. 하이브리드(키메라) 항체 분자는 일반적으로 Winter 등(1991) Nature 349: 293-299 및 U.S.특허번호 4,816,567에 기재되어 있다. 사람화 항체 분자는 일반적으로 Riechmann 등(1988) Nature 332: 323-327;Verhoeyan 등(1988) Science 239: 1534-1536; 및 U.K.특허공개번호 GB 2,276,169(1994.9.21. 공개)에 기재되어 있다. 사람화 항체를 설계하는 한 방법은 마우스-사람 항체, 사람화 항체를 생산하도록 프로모터, 리더, 및 마우스 항체 유전자 유래의 가변 영역 서열 및 사람 항체 유래의 항상 영역 엑손을 포함하는 재조합 DNA를 클로닝하는 단계를 포함한다. 일반적으로, Kuby,"Immunology, 제3판", W. H. Freeman 및 Company, New York (1998) 136p 참조하시오.

본원에 기재된 바와 같이 펩티드 시약에 대하여 유도된 항체(단일클론 및 다클론)는 특히 진단 및 치료 분야에서 유용하며, 예를 들어, 중화 항체는 수동 면역요법에 유용하다. 단일클론 항체는 특히 항-이디오타입 항체를 유발하는데 사용될 수 있다.

항-이디오타입 항체는 보호가 필요한 약제 항원의 "내부 이미지"를 갖는 면역글로불린이다. 항-이디오타입 항체를 유발하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Grzych(1985), Nature 316:74; MacNamara 등(1984), Science 226:1325, Uytdehaag 등(1985), J. Immunol. 134:1225를 참조하시오. 이들 항-이디오타입 항체는 입체구조 질환의 치료 및/또는 진단에 유용할 수 있다.

항체 단편이 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 완전한 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 나타낼 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 많은 항체 단편이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 기능적 항체 단편은 F(ab')₂ 단편이 생성되도록 예를 들어 펩신을 사용하여 항체 분자로부터 항원 결합에 영향이 없는 항상 영역을 절단함으로써 얻어질 수 있다. 이들 단편은 2개의 항원 결합 부위를 포함하지만 각각의 중쇄에서 항상 영역의 일부분이 결여되어 있다. 필요하다면, 파파인으로 다클론 또는 단일클론 항체를 절단함으로써 단일 항원 결합 부위를 포함하는 Fab 단편을 생성할 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역만을 포함하는 기능적 단편이 또한 재조합 생산 또는 면역글로불린 분자의 우선적 단백질분해 절단과 같은 표준 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 이들 단편은 Inbar 등. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci USA 69: 2659-2662; Hochman 등(1976) Biochem 15 :2706-2710; 및 Ehrlich 등(1980) Biochem 19 :4091-4096에 기재되어 있다.

단일 사슬 Fv ("sFv" 또는 "scFv") 폴리펩티드는 펩티드 코딩 링커에 의해서 연결된 V_H- 및 V_L- 코딩 유전자를 포함하는 유전자 융합으로부터 발현되는 공유결합으로 연결된 V_H-V_L 헤테로다이머이다. Huston 등. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:5879-5883. 항체 V 영역으로부터 자연적으로 응집되어 있지만 화학적으로는 분리되어 있는 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 항원 결합 부위 구조에 실질적으로 유사한 3차원 구조로 폴딩되는 sFv 분자로 전환하는 화학 구조(링커)를 식별하고 발생시키는 많은 방법이 밝혀져 있다. 예를 들어, U.S. 특허번호 5,091,513; 5,132,405; 및 4,946,778을 참조하시오. 당업계에 알려진 방법을 사용하여 sFv 분자가 생산될 수 있다. 예를 들어, Huston 등.(1988) Proc. Nat. Acad. Sci USA 85:5879-5338; U.S.특허번호 5,091, 513; 5,132,405 및 4,946,778을 참조하시오. 설계 기준은 한 사슬의 C-말단과 다른 사슬의 N-말단 사이를 포함하도록 적절한 길이를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 링커는 일반적으로 코일을 형성하지 않거나 2차 구조를 형성하지 않는 작은 친수성 아미노산 잔기로부터 형성된다. 이러한 방법은 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, U.S. 특허번호 5,091,513; 5,132,405 및 4,946,778을 참조하시오. 적합한 링커는 일반적으로 교차하는 글리신 및 세린 잔기 세트로 이루어진 폴리펩티드 사슬을 포함하고 가용성을 향상시키도록 삽입된 글루타민산과 리신 잔기를 포함할 수 있다.

"미니-항체" 또는 "미니바디"가 본 발명에 사용될 수 있다. 미니바디는 힌지 영역에 의해서 sFv로부터 분리된 그들의 C-말단에 올리고머화 도메인을 포함하는 sFv 폴리펩티드 사슬이다. Pack 등,(1992) Biochem 31:1579-1584. 올리고머화 도메인은 추가의 이황화 결합에 의해 더 안정화될 수 있는 자가 회합 α 헬릭스(예를 들어, 루신 지퍼)를 포함한다. 올리고머화 도메인은 막을 통한 벡터 폴딩(기능적 결합 단백질이 되도록 폴리펩티드의 생체내 폴딩을 촉진하는 것으로 여겨지는 과정)과 양립되도록 설계된다. 일반적으로 미니바디는 당업계에 잘 알려진 재조합 방법을 사용하여 생산된다. Pack 등, (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber 등.(1992) J. Immunology 149B: 120-126.

종래에 사용되지 않던 방법이 항체를 생성하고 분리하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 파지 전개 라이브러리는 비병원성 형태보다는 병원성 형태에 더 강한 결합력을 나타내거나 그 반대인 항체를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, Siegel, "Recombinant Monoclonal Antibody Technology", Transfus. Clin. Biol.(2002)9(1):15-22;Sidhu, "Phage Display in Pharmaceutical Biotechnology", Curr. Opin. Biotechnol.(2000)11(6):610-616; Sharon 등, "Recombinant Polyclonal Antibody Libraries", Comb. Chem. High Throughput Screen(2000)3(3) :185-196; 및 Schmitz 등, "Phage Display: A Molecular Tool for the Generation of Antibodies-Review", Placenta,(2000)21 SupplA :S106-12를 참조하시오.

상기에 언급된 바와 같이, 항체는 본원에 기재된 펩티드 시약을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 동물에 투여하는 것에 의해서 생성될 수 있다. 펩티드가 생체내에서 발현되는 경우에, 항체는 생체내에서 생성된다. 폴리뉴클레오티드 송달 방법은 아래에 기재되어 있다.

본 발명의 항체의 특이성은 펩티드 시약에 대해 상기에 기재된 바와 같이 시험될 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 병원성 입체구조를 갖는 프리온은 일반적으로 프로테인아제 K와 같은 어떤 프로테아제에 대해 내성을 갖는다. 동일한 프로테아제가 비병원성 입체구조 프리온을 분해할 수 있다. 본 발명 항체의 특이성을 시험하는 한 방법은 병원성 및 비병원성 프리온 모두를 포함하는 생물학적 샘플을 선택하는 것이다. 샘플은 2개의 동일한 양으로 분리될 수 있다. 본 발명의 항체는 (하기에 상세하게 기재된 바와 같이) 고체 지지체에 흡착되도록 첨가될 수 있으며, 고체 지지체상의 항체-프리온 결합 상호작용의 수와 직접적으로 관련된 정량값을 얻는데 사용될 수 있다. 프로테아제는 제2의 샘플에 첨가될 수 있고 동일한 시험이 수행될 수 있다. 제2의 샘플 중의 프로테아제가 비병원성 프리온을 분해하기 때문에, 제2의 샘플 중의 항체-프리온 결합 상호작용은 병원성 프리온의 특징으로 여겨진다. 변형 및 당업계에 알려진 다른 분석법이 본 발명 항체의 특이성을 증명하는데 또한 사용될 수 있다.

Ⅴ. 분석법

본 발명의 펩티드 시약은 샘플(예를 들어, 혈액, 뇌, 척수, CSF 또는 기관의 샘플과 같은 생물학적 샘플)을 선별하는 여러 가지 분석법, 예를 들어 이러한 샘플에 있는 형태 질병 단백질의 병원성 형태의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 분석법에 사용될 수 있다. 현재의 많은 프리온 진단 시약과는 달리, 본문에 기재된 펩티드 시약은 혈액 샘플, 혈액 생성물 또는 생체검사 샘플을 포함하는 거의 모든 생물학적 또는 비생물학적 샘플의 검출을 고려할 것이다.

따라서, 본 발명은 병원성 프리온 단백질에, 이것이 존재한다면, 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 본 발명의 펩티드 시약과 접촉시키는 단계; 및 펩티드 시약과 병원성 프리온의 결합에 의해 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를, 이것이 있다면, 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 사용하기 위하여, 샘플은 병원성 프리온 단백질을 함유하는 것으로 알려진 또는 의심되는 어떠한 것도 될 수 있다. 샘플은 생물학적 샘플(즉, 살아있는 또는 이전에 살아있던 유기체로부터 준비된 샘플) 또는 비생물학적 샘플이 될 수 있다. 적당한 생물학적 샘플은 기관, 온전한 혈액, 혈액 분획, 혈액 성분, 혈장, 혈소판, 혈청, 뇌척수액(CSF), 뇌조직, 신경계 조직, 근육 조직, 골수, 소변, 눈물, 비신경계 조직, 기관 및/또는 생체검사 또는 부검을 포함하지만, 여기에 제한되지는 않는다. 바람직한 생물학적 샘플은 온전한 혈액, 혈액 분획, 혈액 성분, 혈장, 혈소판 및 혈청이다.

병원성 프리온 단백질이 샘플에 존재한다면, 병원성 프리온 단백질에 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서, 샘플이 본발명의 하나 이상의 펩티드 시약과 접촉된다. 본문의 기재에 기초한 특정 조건을 결정하는 것은 충분히 기술분야에서 통상의 기술을 가진 사람의 능력 내이다. 일반적으로, 샘플 및 펩티드 시약은 결합이 일어나게 하는 적당한 시간동안(예를 들어, 약 1시간 내지 밤새), 적당 온도에서(예를 들어, 약 4℃), 약 중성 pH에서의 적당한 버퍼에서(예를 들어, pH 7.5에서 TBS버퍼) 함께 배양된다.

샘플에 있는 병원성 프리온 단백질의 존재는 펩티드 시약과 그것의 결합에 의해 검출된다. 본 발명의 펩티드 시약과 결합에 의한 병원성 프리온 단백질의 존재의 검출은 많은 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드 시약은 펩티드 시약과 병원성 프리온 단백질 사이의 제 1 복합체의 형성에 의해 병원성 프리온 단백질을 특히 "포획"하는데 사용될 수 있으며, 이러한 제 1 복합체는 샘플에 존재하는 임의의 비병원성 프리온 단백질을 포함하는 비결합 샘플 물질로부터 분리될 수 있다. 그러면 병원성 프리온 단백질은 본 발명의 하나 이상의 펩티드 시약의 첨가 및 결합에 의해 검출될 수 있고, 이러한 펩티드 시약은 검출가능하게 표지된다(즉, 표지된 펩티드 시약). 병원성 프리온 단백질은 제 1 복합체로 있는 동안 검출될 수 있거나, 또는 병원성 프리온 단백질은 본 발명의 표지된 펩티드 시약의 첨가 및 표지된 펩티드 시약과 결합 전에 제 1 복합체로부터 분리될 수 있다.

대안으로는, 본 발명의 펩티드 시약이 상기 기재된 대로 병원성 프리온 단백질을 포획하는데 사용될 때, 그리고 제 1 복합체가 비결합 샘플 물질로부터 분리될 때, 검출가능하게 표지된 프리온-결합 시약은 병원성 프리온 단백질이 제 1 복합체로 있는 동안 또는 제 1 복합체로부터 병원성 프리온 단백질의 분리 후에 병원성 프리온 단백질을 검출하는데 사용될 수 있다. "프리온-결합 시약"은 임의의 형태의 프리온 단백질과 결합한 시약이고, 일반적으로 프리온-결합 시약은 프리온 단백질의 변성된 형태에 결합될 것이다. 그러한 시약은 기재되고 예를 들어, 항프리온 항체(특히, Peretz et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 614; Peretz et al. 2001 Nature 412: 739; Williamson et al.1998 J. Virol. 72: 9413; 미국특허 제 6,765,088호; 미국특허 제 6,537,548호에 기재됨), 모티프-융합 혼성 폴리펩티드(WO03/085086 참조), 어떤 양이온성 또는 음이온성 폴리머(WO03/073106 참조), "전파 촉매"인 어떤 펩티드(WO02/0974444 참조) 및 프라스미노젠을 포함한다. 사용된 특정한 프리온-결합 시약이 프리온의 변성된 형태와 결합한다면, "포획된" 병원성 프리온 단백질은 프리온-결합 시약과 함께 검출되기 전에 변성되어야 한다는 것이 명백할 것이다.

다른 구체예에서, 프리온-결합 시약은 제 1 복합체를 형성하기 위하여 샘플에 존재하는 임의의 프리온(병원성 또는 비병원성)을 포획하는데 사용될 수 있고, 본 발명의 하나 이상의 검출가능하게 표지된 펩티드 시약은 제 1 복합체에서 또는 제 1 복합체로부터 분리후에 병원성 프리온을 검출하는데 사용될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 샘플은 고체 지지체 위에 직접(즉, 어떠한 프리온-결합 시약 없이) 포획될 수 있고, 병원성 프리온 단백질은, 이것이 존재한다면, 본 발명의 하나 이상의 검출가능하게 표지된 펩티드 시약을 사용하여 검출될 수 있다.

상기 기재된 포획 및 검출 단계는 용액에서 수행될 수 있거나, 또는 고체 지지체 안에서 또는 위에서 수행될 수 있거나, 또는 용액 및 고체상의 어떤 조합에서 수행될 수 있다. 어떤 적당한 용액상 구성은 예를 들어, 형광 관계 분광학(Giese et al. Arch. Virol. Suppl. 2000 16: 161; Bieschke et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 2000 97: 55468 참조) 및 형광 공명 에너지 전달을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 펩티드 시약은 이러한 용액상 구성에서 검출가능하게 표지될것이다. 바람직하게는, 펩티드 시약은 둘 이상의 구별가능하고 검출가능한 표지될 것이다. 병원성 프리온 단백질의 존재는 제 1 복합체에서 둘 이상의 검출가능한 표지의 일치에 의해 검출될 수 있다. 적당한 고체상 분석 구성은 본문에 기재된다. 일반적으로, 고체상 구성에서, 포획 시약(이것은 본 발명의 하나 이상의 펩티드 시약 또는 하나 이상의 프리온-결합 시약이 될 수 있음)은 고체 지지체에 부착되거나 부착되도록 개조된다. 포획 시약은 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 고체 지지체에 부착되도록 개조될 수 있으며, 예를 들어, 포획 시약과 고체 지지체는 각각 하나의 결합쌍 부위를 포함하여, 포획 시약이 고체 지지체와 접촉할 때, 포획 시약을 결합쌍 부위의 결합을 통하여 고체 지지체에 부착된다. 예를 들어, 포획 시약은 비오틴을 포함할 수 있고, 지지체는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함할 수 있다. 비오틴-아비딘 및 비오틴-스트렙타비딘 이외에, 이 구체예의 다른 적당한 결합쌍은 예를 들어, 항원-항체, 합텐-항체, 미메토프(mimetope)-항체, 수용체-호르몬, 수용체-리간드, 작용제-길항제, 렉틴-탄수화물, 단백질 A-항체 Fc을 포함한다. 포획 시약이 상기 기재된 대로 지지체에 부착되도록 개조될 때, 샘플은 포획 시약이 지지체에 부착되기 전 또는 후에 포획 시약과 접촉될 수 있다.

따라서, 본 발명은,

(a) 제 1 복합체를 형성하기 위하여, 병원성 프리온 단백질에, 이것이 존재한다면, 제 1 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제 1 펩티드 시약과 접촉시키는 단계; 및

(b) 제 1 펩티드 시약과 병원성 프리온의 결합에 의해 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를, 이것을 있다면, 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.

펩티드 시약은 본문에 기재되는 대로이며, 바람직하게는 펩티드 시약은 SEQ ID NO:12-132의 서열을 가진 펩티드로부터 유도되며, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 132 중 하나의 서열을 가진 펩티드; 또는 SEQ ID NO: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 또는 128을 가진 펩티드; 또는 SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82, 또는 84를 가진 펩티드로부터 유도된다. 펩티드 시약은 비오틴화될 수 있다. 펩티드 시약은 고체 지지체에 부착될 수 있다. 어떤 구체예에서, 펩티드 시약은 검출가능하게 표지될 수 있다.

본 발명은 또한,

(a) 제 1 복합체를 형성하기 위하여, 병원성 프리온과, 이것이 존재한다면, 제 1 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제 1 펩티드 시약과 접촉시키는 단계;

(b) 상기 제 1 복합체에서의 병원성 프리온과 제 2 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 제 1 복합체를 제 2 펩티드 시약과 접촉시키는 단계, 여기에서 상기 제 2 펩티드 시약은 검출가능한 표지를 포함; 및

(c) 제 2 펩티드 시약과 병원성 프리온의 결합에 의해 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를, 이것이 있다면, 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.

본 방법이 제 1 펩티드 시약 및 제 2 펩티드 시약을 이용할 때, 제 1 및 제 2 펩티드 시약은 동일하거나 서로 다를 수 있다. "동일"이란 제 1 및 제 2 펩티드 시약이 제 2 펩티드 시약에 검출가능한 표지를 포함하는 것에서만 서로 다르다는 것을 의미한다.

제 1 펩티드 시약 및 제 2 펩티드 시약은 프리온 단백질의 동일한 영역으로부터의 펩티드 분획 또는 프리온 단백질의 서로 다른 영역으로부터의 펩티드 분획으로부터 유도될 수 있다. 제 1 펩티드 시약 및 제 2 펩티드 시약은 각각 SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 또는 132를 가지는 펩티드로부터 유도된 펩티드 시약으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.

제 1 펩티드 시약 및 제 2 펩티드 시약은 각각 SEQ ID NO : 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, 및 84를 가지는 펩티드로부터 유도된 펩티드 시약으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.

제 1 펩티드 시약은 SEQ ID NO : 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 또는 127을 가지는 펩티드로부터 유도된 펩티드 시약으로부터 선택될 수 있고, 제 2 펩티드 시약은 SEQ ID NO : 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 또는 132, 또는 그 반대의 SEQ ID NO를 가지는 펩티드로부터 유도된 펩티드 시약으로부터 선택될 수 있다. 제 1 펩티드 시약은 SEQ ID NO : 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 또는 127을 가지는 펩티드로부터 유도된 펩티드 시약으로부터 선택될 수 있고, 제 2 펩티드 시약은 SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82, 및 84, 또는 그 반대의 SEQ ID NO를 가지는 펩티드로부터 유도된 펩티드 시약으로부터 선택될 수 있다. 제 1 펩티드 시약은 SEQ ID NO: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 또는 132를 가지는 펩티드로부터 유도된 펩티드 시약으로부터 선택될 수 있고, 제 2 펩티드 시약은 SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82, 및 84, 또는 그 반대의 SEQ ID NO를 가지는 펩티드로부터 유도된 펩티드 시약으로부터 선택될 수 있다.

제 1 펩티드 시약은 비오틴화될 수 있고 고체 지지체에 부착될 수도 있다.

본 발명은 또한,

(b) 비결합 샘플 물질을 제거하는 단계;

(c) 상기 제 1 복합체로부터 상기 병원성 프리온을 분리하는 단계;

(d) 병원성 프리온과 제 2 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 분리된 병원성 프리온을 제 2 펩티드 시약과 접촉시키는 단계, 여기에서 상기 제 2 펩티드 시약은 검출가능한 표지를 포함; 및

(e) 제 2 펩티드 시약과 병원성 프리온의 결합에 의해 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를, 이것이 있다면, 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 제 1 및 제 2 펩티드 시약은 동일하거나 서로 다를 수 있다.

본 발명은 또한,

(b) 비결합 샘플 물질을 제거하는 단계;

(d) 병원성 프리온과 프리온-결합 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 분리된 병원성 프리온을 프리온-결합 시약과 접촉시키는 단계; 여기에서 상기 프리온-결합 시약은 검출가능한 표지를 포함; 및

(e) 프리온-결합 시약과 병원성 프리온의 결합에 의해 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를, 이것이 있다면, 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 프리온-결합 시약은 항프리온 항체, 모티프-융합 혼성 폴리펩티드, 양이온성 또는 음이온성 폴리머, 전파 촉매 및 플라스미노젠, 또는 프리온 단백질을 결합시키는 것으로 공지된 임의의 다른 성분이 될 수 있다.

본 발명은 또한,

(a) 제 1 복합체를 형성하기 위하여, 병원성 프리온과, 이것이 존재한다면, 프리온-결합 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 프리온-결합 시약과 접촉시키는 단계;

(b) 비결합 샘플 물질을 제거하는 단계;

(c) 병원성 프리온과 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 제 1 복합체를 펩티드 시약과 접촉시키는 단계, 여기에서 상기 펩티드 시약은 검출가능한 표지를 포함; 및

(d) 펩티드 시약과 병원성 프리온의 결합에 의해 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를, 이것이 있다면, 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한,

(a) 제 1 펩티드 시약을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계;

(b) 병원성 프리온이, 이것이 샘플에 존재할 때, 제 1 펩티드 시약에 결합하도록 허용하는 조건하에서 고체 지지체를 샘플과 접촉시키는 단계;

(c) 제 2 펩티드 시약이 제 1 펩티드 시약에 의해 결합된 병원성 프리온에 결합하도록 허용하는 조건하에서 고체 지지체를 검출가능하게 표지된 제 2 펩티드 시약과 접촉시키는 단계; 및

(d) 제 1 펩티드 시약, 샘플로부터의 병원성 프리온 및 제 2 펩티드 시약 사이에 형성된 복합체를 검출함으로써, 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온을 검출하는 방법을 제공한다.

대안으로는, 프리온-결합 시약이 고체 지지체 상에 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명은,

(a) 프리온-결합 시약을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계;

(b) 병원성 프리온이, 이것이 샘플에 존재할 때, 프리온-결합 시약에 결합하도록 허용하는 조건하에서 고체 지지체를 샘플과 접촉시키는 단계;

(c) 고체 지지체를 검출가능하게 표지된 제 2 펩티드 시약과 접촉시키는 단계; 및

(d) 프리온-결합 시약, 샘플로부터의 병원성 프리온 및 제 2 펩티드 시약 사이에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온을 검출하는 방법을 제공한다.

분석법은 경쟁적인 구성으로 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명은,

(b) 고체 지지체를 검출가능하게 표지된 제 1 리간드와 결합시키는 단계, 여기에서 검출가능하게 표지된 제 1 리간드에 대한 제 1 펩티드 시약의 결합 친화력은 병원성 프리온에 대한 제 1 펩티드 시약의 결합 친화력보다 더 약함;

(c) 병원성 프리온이, 이것이 샘플에 존재할 때, 제 1 펩티드 시약에 결합하여 제 1 리간드를 치환하도록 허용하는 조건하에서 샘플을 고체 지지체와 결합시키는 단계; 및

(d) 제 1 펩티드 시약 및 샘플로부터의 병원성 프리온 사이에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.

일반적으로, 본문에 기재된 펩티드 시약은 샘플에 있는 프리온 단백질과 결합(예를 들어, 포획 시약으로서) 및/또는 프리온 단백질의 존재를 검출(예를 들어, 검출 시약으로서)하는데 사용된다. 포획 시약 및 검출 시약은 개별적인 분자가 될 수도 있고, 또는 대안으로는 하나의 분자가 포획 및 검출 기능 둘 모두의 역할을 할 수도 있다. 어떤 구체예에서, 포획 및/또는 검출 시약은 병원성 프리온과 우선적으로 상호작용하는 본문에 기재된 펩티드 시약이다(즉, 병원성-프리온 특이적이다). 다른 구체예에서, 포획 시약은 병원성 프리온에 대해 특이적이고, 검출 시약은 병원성 및 비병원성 형태(예를 들어 프리온 단백질에 결합하는 항체)의 모두에 결합한다. 그러한 프리온-결합 시약은 상기 본문에 기재되었다. 대안으로는, 다른 구체예에서, 포획 시약은 병원성 프리온에 특이적이 아니고, 검출 시약은 병원성 프리온에 대하여 특이적이다.

그리고, 검출의 임의의 적당한 수단은 본문에 기재된 펩티드 시약과 프리온 단백질 사이의 결합을 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본문에 기재된 분석법은 표지된 펩티드 시약 또는 항체의 사용을 포함할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위하여 적당한 검출가능한 표지는 방사성 동위원소, 형광물질, 화학 발광물질, 착색물질, 형광 반도체 나노결정, 효소, 효소 기질, 효소 공동인자, 효소 억제제, 착색물질, 염료, 금속이온, 금속졸, 리간드(예를 들어, 비오틴, 스트레타비딘 또는 합텐) 등을 포함하는 검출할 수 있는 임의의 분자를 포함하지만, 여기에 제한되는 것은 아니다. 추가적인 표지는 검출가능 범위에서 형광을 나타낼 수 있는 물질 또는 그것의 일부를 포함하는, 형광을 이용하는 것을 포함하지만, 여기에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 표지의 특별한 예는 양고추냉이 페록시다아제(HRP), 플루오레세인, FITC, 로다민, 단실, 움벨리페론, 디메틸 아크리디늄 에스테르(DMAE), 텍사스 레드, 루미놀, NADPH 및 β-갈락토시다아제를 포함하지만, 여기에 제한되는 것은 아니다. 추가로, 검출가능한 표지는 올리고뉴클레오티드 꼬리표를 포함할 수 있으며, 꼬리표는 PCR, TMA, b-DNA, NASBA 등을 포함하는 핵산 검출의 임의의 공지된 방법에 의해 검출될 수 있다.

표지된 검출 시약(상기 기재됨)의 이용에 더하여, 면역침강이 프리온 단백질(예를 들어, 병원성 프리온)과 결합된 펩티드 시약을 분리해내는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 면역침강은 침강 증진제의 첨가에 의해 촉진된다. 침강 증진제는 병원성 프리온과 결합하는 펩티드 시약의 침강을 증진 또는 증가시킬 수 있는 성분을 포함한다. 그러한 침강 증진제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 단백질 G, 단백질 A 등을 포함한다. 단백질 G 또는 단백질 A가 침강 증진제로서 사용되면, 그 단백질은 비드, 바람직하게는 자기 비드에 선택적으로 부착될 수 있다. 침강은 원심분리의 사용에 의해 또는 자기력의 이용과 함께 더 증진될 수 있다. 그러한 침강 증진제의 사용은 기술분야에 공지되어 있다.

검출 시약으로부터 신호를 증폭하는 분석법은 공지되어 있다. 그러한 예는 비오틴과 아비딘을 이용하는 분석법, 및 ELISA 분석법과 같은 효소 표지가 붙고 개재된 면역분석법이다.

본문에 기재된 분석법의 하나 이상의 단계는 용액(예를 들어, 액체 매질)에서 또는 고체 지지체 상에서 수행될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 고체 지지체는 불용성 매트릭스인 임의의 물질이 될 수 있고, 관심있는 분자(예를 들어, 본 발명의 펩티드 시약, 프리온 단백질, 항체 등)가 연결되거나 부착될 수 있는 딱딱하거나 반정도 딱딱한 표면을 가질 수 있다. 대표적인 고체 지지체는 니트로셀룰로오스, 폴리비닐클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리스티렐, 라텍스, 폴리카보네이트, 나일론, 덱스트란, 키틴, 모래, 실리카, 속돌, 아가로스, 셀룰로오스, 유리, 금속, 폴리아크릴아미드, 실리콘, 고무, 다당류, 폴리비닐플로라이드, 디아조화된 종이, 활성화된 비드, 자기적 반응성 비드, 및 고체상 합성, 친화력 분리, 정제, 혼성화 반응, 면역분석법 및 다른 적용에 대하여 사용되는 일반적인 임의의 물질을 포함하지만, 여기에 제한되지는 않는다. 지지체는 입자가 될 수 있거나, 연속적인 표현의 형태로 있을 수 있고, 막, 망, 플레이트, 작은 알, 슬라이드, 디스크, 모세관, 속이 빈 섬유, 비늘, 핀, 칩, 고체 섬유, 겔(예를 들어, 실리카겔) 및 비드(예를 들어, 구멍-유리 비드, 실리카겔, 디비닐벤젠과 선택적으로 교차결합된 폴리스티렌 비드, 융합된 코폴리 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 라텍스 비드, N,N'-비스-아크릴로일에틸렌디아민과 선택적으로 교차결합된 디메틸아크릴아미드 비드, 산화철 자기 비드, 및 소수성 폴리머로 코팅된 유리 입자)를 포함한다.

본문에 기재된 펩티드 시약은 표준 기술을 사용하여 고체 지지체에 쉽게 결합될 수 있다. 지지체에 고정은 먼저 펩티드 시약을 단백질에 결합사킴으로써 증진될 것이다(예를 들어, 단백질이 더 뛰어난 고체상-결합 특성을 가지고 있을 때). 적당한 결합 단백질은 소과 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 혈청 알부민과 같은 거대분자, 열쇠구멍 삿갓조개 혈색소, 면역글로블린 분자, 사이로글로블린, 난백알부민, 및 기술분야에서 숙련된 자에게 공지된 다른 단백질을 포함하지만, 여기에 제한되는 것은 아니다. 분자를 지지체에 결합시키는데 사용될 수 있는 다른 시약은 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머 아미노산, 아미노산 코폴리머 등을 포함한다. 그러한 분자 및 이러한 분자를 단백질에 결합시키는 방법은 기술분야에 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다. 예를 들어, Brinkley, M.A., (1992) Bioconjugate Chem., 3:2-13; Hashida et al. (1984) J. Appl.Biochem.,6:56-63; 및 Anjaneyulu and Staros (1987) Intemational J. of Peptide and Protein Res. 30:117-124 참조.

원한다면, 고체 지지체에 첨가되는 분자는 스티렌 또는 아실레이트 성분을 생성하기 위하여 쉽게 기능화될 수 있고, 따라서 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트 또는 폴리이미드, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌, 폴리비닐, 폴리디아세틸렌, 폴리페닐렌-비닐렌, 폴리펩티드, 다당류, 폴리설폰, 폴리피롤, 폴리이미다졸, 폴리티오펜, 폴리에테르, 에폭사이드, 실리카 유리, 실리카겔, 실록산, 폴리포스페이트, 히드로겔, 아가로스, 셀룰로오스 등과 같은 다른 폴리머로 분자의 혼성을 가능하게 한다.

펩티드 시약은 분자의 결합쌍의 상호작용을 통하여 고체 지지체에 부착될 수 있다. 그러한 결합쌍은 공지되어 있으며, 본문의 다른 곳에 기재되어 있다. 하나의 결합쌍 부위는 상기 기재된 기술에 의해 고체 지지체에 결합되고, 결합쌍의 다른 부위는 펩티드 시약에 부착된다(합성 전, 합성 중 또는 합성 후에). 따라서, 변경된 펩티드 시약은 샘플과 접촉될 수 있고, 병원성 프리온과, 이것이 존재한다면, 상호작용이 용액에서 일어날 수 있으며, 이후에 고체 지지체는 펩티드 시약(또는 펩티드-프리온 복합체)과 접촉될 수 있다. 이 구체예에 대한 바람직한 결합쌍은 비오틴과 아비딘, 및 비오틴과 스트렙타비딘을 포함한다.

적당한 제어제가 또한 본 발명의 분석법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, PrP^c의 부정적 제어제가 분석법에서 사용될 수 있다. PrP^Sc(또는 PrPres)의 긍정적 제어제가 또한 분석법에서 사용될 수 있다. 그러한 제어제는 선택적으로 검출가능하게 표지될 수 있다.

본 발명의 펩티드 시약을 사용하는 몇가지 변화 및 조합이 본 발명의 분석법에 적용될 수 있다. 이하의 비제한적인 예는 설명을 위하여 기재된다.

어떤 구체예에서, 분석법은 생물학적 샘플에 있는 병원성 프리온을 검출하기 위하여 기재된다. 그런 방법에서, 본 발명의 펩티드 시약은 생물학적 또는 비생물학적 샘플에 있는 병원성 프리온을 위한 포획 시약으로서 사용될 수 있다. 그런 구체예에서, 고체 지지체(예를 들어, 자기 비드)는 병원성 프리온과 우선적으로 상호작용하는 본문에 기재된 펩티드 시약과 먼저 반응하여 펩티드 시약은 지지물에 충분히 고정된다. 그런후 고체 지지체는 펩티드 시약이 병원성 프리온과 결합하도록 허용하는 조건하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉된다. 비결합 샘플 물질의 제거 후에, 결합된 병원성 프리온은 펩티드 시약으로부터 분리되고 임의의 공지된 검출 메카니즘을 사용하여 검출될 수 있으며, 이 메카니즘은 예를 들어, 하기의 실시예 및 본문에 인용된 참고문헌에 기재된, 웨스턴 블롯 및 ELISA를 포함하지만, 여기에 제한되는 것은 아니다. 대안으로는, 결합된 병원성 프리온은 펩티드 시약으로부터 분리 없이 검출될 수 있다.

대안으로는, 본 발명의 펩티드 시약은 고체 지지체에 부착되기 전에 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉될 수 있으며, 이어서 펩티드 시약이 고체 지지체에 부착된다 (예를 들어, 펩티드 시약은 비오틴화될 수 있고 고체 지지체는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함한다). 비결합 샘플 물질의 제거 후에, 병원성 프리온은 펩티드 시약으로부터 분리될 수 있고 임의의 공지된 검출 메카니즘을 사용하여 검출될 수 있으며, 이 메카니즘은 를 들어, 하기의 실시예 및 본문에 인용된 참고문헌에 기재된, 웨스턴 블롯 및 ELISA를 포함하지만, 여기에 제한되는 것은 아니다. 대안으로는, 병원성 프리온은 검출 전에 펩티드 시약으로부터 분리될 필요는 없다.

샘플에 있는 병원성 프리온의 검출은 병원성 형태와 우선적으로 상호작용하는, 본문에 기재된 펩티드 시약을 사용함으로써 달성될 수 있다. 대안으로는, 병원성 프리온은 비특이성 검출 시약(예를 들어, PrP에 일반적으로 결합하는 펩티드 또는 항체)에 의해 검출될 수 있다. 어떤 구체예에서, 고체 지지체로부터 분리 후에, 포획된 병원성 프리온은 검출 전에 변성되고, 이것은 비특이성 검출 시약의 사용을 허용함으로써 검출을 촉진시킬 수 있다. 대안으로는, 포획된 병원성 프리온은 예를 들어, 펩티드 시약이 펩티드 시약과 병원성 프리온을 공유결합시키는데 사용될 수 있는 활성화가능한 반응성기를 함유하도록 변형된다면, 펩티드 시약으로부터 분리 없이 변성될 수 있다.

Ryou et al. (2003) Lab Invest. 83(6):837-43에 기재된 ELISA와 같은 프로토콜은 고체 지지물로부터 용리되는 병원성 프리온의 양을 정량하도록 실행될 수 있다 (실시예 참조). 간략하게, 마이크로타이터 플레이트의 웰은 고체 지지체로부터 분리(용리)된 포획된 병원성 프리온으로 코팅된다. 플레이트는 비결합 성분을 제거하기 위하여 세척될 수 있고, 항프리온 항체 또는 본 발명의 펩티드 시약과 같은 검출가능한 표지된 결합 분자(포획하는데 사용된 동일한 것 또는 다른 것 중 하나)가 첨가된다. 이러한 결합 분자는 임의의 포획된 샘플 프리온, 세척된 플레이트 및 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여 검출된 존재하는 표지된 펩티드 시약 및/또는 표지된 항체와 반응하도록 허용된다. 결합 분자는 병원성 프리온 형태에 태하여 특이적일 필요는 없지만, 포획 시약이 병원성 프리온 형태에 대하여 특이적인 한, 동일형태 또는 변성된 PrP 모두에 결합될 수 있다.

다른 대표적인 분석법에서, 포획 시약 및 프리온은 검출 전에 분리되지 않는다. 예를 들어, 고체 지지체(의를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 웰)는 제 1 병원성-프리온 특이성 분자(펩티드 시약)과 연결된다. 그런후 병원성 프리온을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플이 고체 지지체에 첨가된다. 임의의 병원성 프리온이 제 1 분자에 결합하도록 허용하는 충분한 배양기간 후에, 고체 지지체가 세척되어 비결합 성분이 제거되고, 제 2 항-PrP 항체 또는 프리온-특이성 펩티드 시약과 같은 상기 기재된 검출가능하게 표지된 제 2 결합 분자가 첨가된다. 대안으로는, 병원성 및 비병원성 형태에 결합되는 분자(예를 들어, 비특이성 포획 시약)는 고체 지지체에 결합될 수 있고(예를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 웰 상에 코팅됨), 검출은 병원성 프리온-특이성 검출 시약(예를 들어, 본문에 기재된 펩티드 시약)을 사용하여 달성될 수 있다.

다른 대표적인 분석법은 "두개의 펩티드 샌드위치" 분석법이 프리온(예를 들어, 병원성 프리온)을 검출하는데 사용될 수 있다. 이 기술에서, 고체 지지체는 본문에 기재된 본 발명의 하나 이상의 반응되지 않은 제 1 펩티드 시약과 반응하고, 반응되지 않은 제 1 펩티드 시약을 제거하기 위해 세척되고, 그런후 제 1 펩티드 시약과 샘플에 존재하는 임의의 병원성 프리온 단백질 사이의 상호작용을 허용하는 조건하에서 병원성 프리온 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 테스트 샘플(예를 들어, 생물학적 샘플)에 노출된다. 반응되지 않은 샘플 성분은 제거되고, 본 발명의 하나 이상의 제 2 펩티드 시약이 제 2 펩티드 시약과 존재하는 병원성 프리온 단백질과 상호작용을 허용하는 조건하에서 첨가된다. 제 1 펩티드-프리온 단백질-제 2 펩티드 사이의 상호작용은 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 검출될 수 있다. 일반적으로 제 펩티드 시약은 검출가능한 표지를 포함한다. 이러한 분석법을 위하여, 제 1 펩티드 시약 및/또는 제 2 펩티드 시약은 병원성 프리온 단백질과 우석적으로 상호작용한다.

어떤 구체예에서, 항-PrP 항체가 프리온 단백질을 검출하는데 사용된다. 프리온, 특히 PrPc 또는 변성된 PrP에 결합되는 항체, 변형된 항체 및 다른 시약이 기재되었고, 이들 중 일부는 상업적으로 이용가능하다 (예를 들어, Peretz et al. 1997 J. Mol. Biol. 273:614; Peretz et al. 2001 Nature 412:739; Williamson et al. 1998 J. Virol. 72:9413; 미국특허 제 6,765,088호 참조. 이들 중 일부 및 다른 것은 특히, InPro Biotechnology, South San Francisco, CA, Cayman Chemicals, Ann Arbor MI; Prionics AG, Zurich로부터 상업적으로 이용가능; 또한 변형된 항체의 기재에 대하여 WO03/085086 참조).

본 발명의 펩티드 시약은 또한 경쟁 분석에 사용될 수 있다. 검출 수단은 PrP^Sc에 약하게 결합되는 리간드가 PrP^Sc에 대하여 특이성인 본문에 기재된 펩티드 시약에 의해 치환될 때를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, PrP^Sc를 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 고체 지지체 상에 흡착될 수 있다. 이어서, 고체 지지체가, 검출가능하게 표지된 리간드가 PrP^Sc에 결합되는 것과 같은 조건하에서 PrP^Sc에 결합되는 검출가능하게 표지된 리간드(예를 들어, 플라스미노젠, 라미닌 수용체 및 헤파란 설페이트)와 결합된다. 리간드-PrP^Sc 복합체가 검출된다. 그런후 본문에 기재된 PrP^Sc-결합 펩티드 시약이 첨가된다. 검출가능하게 표지된 리간드의 결합 친화력은 병원성 프리온에 대한 펩티드 시약의 결합 친화력보다 더 약하다. 따라서, PrP^Sc-결합 펩티드 시약은 표지된 리간들을 치환할 수 있고, 표지된 리간드의 검출양의 감소는 펩티드 시약과 생물학적 샘플로부터의 병원성 프리온 사이에 형성된 복합체가 검출될 수 있다는 것을 나타낸다.

본문에 기재된 펩티드 시약을 포함하는 상기 기재된 분석 시약은, 상기 기재된 검출 분석법을 수행하기 위하여, 적당한 지침과 다른 필요한 시약과 함께 키트로 제공될 수 있다. 펩티드 시약이 고체 지지체 상에 흡착되면, 키트는 추가적으로 또는 대안으로 하나 이상의 고체 지지체 상에 흡착되는 그러한 펩티드 시약을 포함할 수 있다. 키트는 상기 기재된 적당한 긍정적 및 부정적 제어제를 더 함유할 수 있다. 키트는 또한 사용한 특정 검출 분석법에 의존하여, 적당한 표지 및 다른 포장된 시약 및 물질(즉, 세척 버퍼 등)을 함유할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 병원성 프리온-특이성 펩티드 시약을 포함하는 고체 지지체에 관한 것이다. 이러한 고체 지지체를 제조하는 방법이 또한 예를 들어, (a) 고체 지지체를 제공하는 단계; 및 (b) 고체 지지체에 하나 이상의 병원성 프리온-특이성 펩티드 시약을 결합시키는 단계에 의해 제공된다.

프리온-특이성 펩티드 시약은 친화 지지체를 사용하여 병원성 프리온 단백질을 분리하는데 더 사용될 수 있다. 펩티드 시약은 프리온-선택적 결합 활성을 유지하도록, 예를 들어, 흡착, 공유결합 등에 의하여 고체 지지체에 부착된다. 선택적으로는, 예를 들어, 펩티드 시약의 결합 부위가 접근가능하게 남을 수 있도록, 스페이서기가 포함될 수 있다. 그런후 고정된 분자가 혈액, 혈장, 뇌, 척수, 다른 조직과 같은 생물학적 샘플로부터 병원성 프리온 단백질을 결합시키는데 사용될 수 있다. 결합된 펩티드 시약 또는 복합체는 예를 들어, pH의 변화에 의해 지지체로부터 회복되거나 병원성 프리온이 복합체로부터 분리될 수 있다.

본 발명에 따라서 테스트될 수 있는 샘플은 살아있거나 죽은 대상으로부터의 신경계 조직(예를 들어, 뇌, 척수, CSF 등), 혈액 및/또는 다른 조직 샘플을 포함하는, 항체 분석을 받을 수 있는 임의의 샘플을 포함한다. 상기 언급한 대로, 바람직한 구체예에서, 샘플은 살아있는 대상으로부터 얻은 혈액, 혈액 생성물 또는 조직 샘플이다.

VI. 추가 용도

A. 검출

전술한 바와 같이, 본 명세서에 기재된 펩티드는 피험체의 프리온 질환을 진단하는 데 사용할 수 있다. 또한, 전술한 펩티드 시약은 혈액 및/또는 식품 공급물 내 병원성 프리온 오염을 검출하는 데에도 사용할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 검출 분석 중 어느 것을 사용하여 개별 수집된 샘플 또는 풀링된 샘플로부터 분액을 스크리닝함으로써 병원성 프리온이 실질적으로 없는 혈액 공급물을 제조할 수 있다. 병원성 프리온으로 오염된 샘플 또는 풀링된 샘플은 이들을 조합하기 전에 제거할 수 있다. 이 방식으로, 병원성 프리온 오염이 실질적으로 없는 혈액 공급물을 제공할 수 있다. "병원성 프리온 오염이 실질적으로 없는"은 병원성 프리온이 본 명세서에 기재된 임의의 분석를 사용하여 검출되지 않는다는 것을 의미한다. 중요한 점은, 정상 조직보다 10⁶ 배 희석된 뇌 조직에서 병원성 단백질 형태를 검출하기 위해 이미 제시된, 본 명세서에 기재된 펩티드 시약이 혈중 병원성 프리온을 검출할 수 있는 유일하게 설명된 시약이라는 것이다.

따라서, 본 발명은 병원성 프리온이 실질적으로 없는 혈액 공급물의 제조 방법을 제공하며, 상기 혈액 공급물은 전혈, 적혈구, 혈장, 혈소판 또는 혈청을 포함하고, 상기 방법은:

(a) 병원성 프리온을 검출하기 위해 본 명세서에서 제공되는 임의의 검출 방법에 의해 수집된 혈액 샘플로부터 전혈, 적혈구, 혈장, 혈소판 또는 혈청의 분액을 스크리닝하는 단계;

(b) 병원성 프리온이 검출되는 샘플을 제거하는 단계; 및

(c) 병원성 프리온이 검출되지 않은 샘플을 조합하여 병원성 프리온이 실질적으로 없는 혈액 공급물을 제공하는 단계

를 포함한다.

유사하게, 식품 공급물은 병원성 프리온이 실질적으로 없는 식품을 제공하기 위하여 병원성 프리온의 존재에 대하여 스크리닝할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 사용하여, 사람 또는 동물 소비용 식품으로서 의도하는 생 유기물로부터의 샘플은 병원성 프리온의 존재에 대하여 스크리닝할 수 있다. 식품 공급물에 넣고자 하는 식품 생성물로부터 취한 샘플도 스크리닝할 수 있다. 병원성 프리온이 검출된 샘플을 확인하고, 식품 공급물에 넣고자 하는 생 유기물 또는 식품으로부터 병원성 프리온이 검출된 샘플을 식품 공급물에서 제거한다. 이 방식으로, 병원성 프리온이 실질적으로 없는 식품 공급물을 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명은 병원성 프리온이 실질적으로 없는 식품 공급물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은

(a) 병원성 프리온을 검출하기 위해 본 명세서에서 제공된 임의의 검출 방법에 의하여 식품 공급물에 넣을 생 유기물로부터 수집한 샘플 또는 식품 공급물에 넣고자 하는 식품으로부터 수집한 샘플을 스크리닝하는 단계;

(b) 병원성 프리온이 검출된 샘플을 제거하는 단계; 및

(c) 병원성 프리온이 검출되지 않은 샘플을 조합하여 병원성 프리온이 실질적으로 없는 식품 공급물을 제공하는 단계

를 포함한다.

B. 정제

또한, 본 발명의 펩티드는 병원성 프리온의 분리 목적(예컨대, 검출 전에 프리온 단백질을 농축시키기 위하여) 및 병원성 프리온을 샘플에서 제거하기 위한 목적(예컨대, 병원성 프리온이 실질적으로 없는 샘플을 제거하는 수단으로서)을 위하여 병원성 프리온을 샘플에서 제거하는 데 사용할 수 있다. 이러한 방법에서, 펩티드 시약은 통상적으로 고형 지지체 상에 제공된다. 펩티드 시약을 포함하는 고형 지지체는 프리온을 펩티드 시약에 결합하는 조건 하에서 병원성 프리온을 함유하는 샘플과 접촉한다. 목적이 병원성 프리온을 분리하기 위한 것이라면, 미결합 샘플은 제거되고, 프리온을 함유하는 고형 지지체는 수집되며; 목적이 프리온을 샘플에서 제거하는 것이라면, 미결합 샘플이 수집된다.

따라서, 본 발명은 병원성 프리온을 샘플에서 분리하는 방법이 제공되며, 상기 방법은

(a) 본 발명에 따른 펩티드 시약을 포함하는 고형 지지체를 제공하는 단계;

(b) 병원성 프리온 단백질이 상기 샘플에 존재하는 경우, 이를 상기 제 1 펩티드 시약에 결합시켜서 제 1 복합체를 형성하는 조건 하에서 상기 샘플을 상기 고형 지지체에 접촉시키는 단계; 및

(c) 미결합 샘플 물질을 제거하는 단계

를 포함한다.

다른 구체예에서, 상기 병원성 프리온 단백질은 상기 제 1 복합체로부터 해리시킬 수 있다. 이 해리는 단백질 정제 분야에 널리 알려진 기술에 의하여 달성될 수 있다.

또한, 본 발명은 병원성 프리온 단백질을 샘플에서 제거하는 방법을 제공하며, 상기 방법은

(b) 병원성 프리온 단백질이 존재하는 경우, 이를 펩티드 시약에 결합시키는 조건 하에서 상기 고형 지지체를, 병원성 프리온 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 샘플에 접촉시키는 단계; 및

(c) 미결합 샘플 물질을 제거하는 단계

를 포함한다.

C. 조성물

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 펩티드 시약 및/또는 항체(및 이러한 펩티드 시약 및/또는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 조성물, 이러한 조성물을 치료제에 사용하는 방법 및 프리온 관련 질환의 치료 또는 방지를 위한 예방용 조성물에 관한 것이다. 또한, 항체, 펩티드 시약(및 이러한 항체 및/또는 펩티드 시약을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)도 예방(즉, 발병 방지) 또는 치료(감염 후 질환 치료) 목적을 위하여 개별적으로 또는 조합하여 조성물에 사용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 조성물이 질환을 치료 또는 예방하도록 작용하는 정확한 메카니즘은 중요하지 않다. 한 이론에 얽매이고 싶지 않지만, 본 명세서에 기재된 조성물은 다음 메카니즘 중 어느 하나에 의하여 구조 질환을 치료 또는 예방하도록 작용할 수 있다: 피험체에게서 면역 반응을 유발하여 질환 상태를 치료 또는 예방; 비병원성 형태와의 상호작용(예컨대, 결합)하여 비병원성 형태로의 전환 방지; 병원성 형태로 결합하여 병원성 결과 방지; 및/또는 병원성 형태로 결합하여 병원성 형태가 다른 비병원성 형태를 질환 형태로 전환시키는 것을 방지(예컨대, Perez et al. (2001) Nature 412: 739-743 프리온 전파를 억제하는 특정 Fab 능력의 분석 참조).

조성물은 펩티드 시약, 항체 및/또는 폴리뉴클레오티드 중 1 이상의 혼합물을 포함할 수 있다. 이러한 분자는 다양한 공급원, 예를 들면 재조합 생성된 단백질, 합성 생성된 단백질 등으로부터 구할 수 있다. 또한, 조성물은 다른 분자, 예를 들면 항원 및 면역조절제, 예컨대 면역글로불린, 시토킨, 림포킨 및 케모킨, 예를 들면 한정하는 것은 아니지만 IL-2, 변성 IL-2(cys125-ser125), GM-CSF, IL-12, 알파- 또는 감마-인터페론, IP-10, MIP1 및 RANTES와 함께 투여될 수 있다. 조성물은 바이러스 벡터(예컨대, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터) 또는 비바이러스 벡터(예를 들면, 핵산 또는 단백질로 코팅된 입자)를 사용하여 폴리펩티드로서, 또는 대안으로 노출된 핵산(예컨대, DNA)로서 투여될 수 있다.

또한, 조성물은 펩티드 시약 및 핵산의 혼합물을 포함할 수 있으며, 동일하거나 상이한 방식 및/또는 비히클을 사용하여 전달될 수 있다. 동일하거나 상이한 조성물은 1회 이상으로 제공되어(예컨대, "프라임" 투여 후 1 이상의 "추가 투여") 소정의 효과를 달성할 수 있다. 동일한 조성물이 프라임으로서, 그리고 1 이상의 추가 투여로서 투여될 수 있다. 대안으로, 상이한 조성물을 프라임 및 추가 투여로 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능하고, 약리학적으로 허용 가능한 것이 바람직하다. 특히, 바람직하게는 조성물은 생물학적이 아니거나 바람직하지 않은 것이 아닌데, 즉 물질은 오염된 조성물의 어느 성분과 유해한 방식으로 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하거나 또는 상호작용하지 않으면서 제제 또는 조성물로 개체에게 투여될 수 있다.

통상적으로, 본 명세서에 기재된 조성물은 치료학적 유효량의 분자(펩티드 시약) 또는 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 이러한 분자에 대한 항체 및 필요에 따라서 전술한 성분 이외의 것을 포함한다. "치료학적 유효량"이란, 이것이 투여된 미감염, 감염 또는 미노출 피험체에게서 보호 및/또는 치료 반응을 유발하는 양을 의미한다. "치료학적 유효량"은 일상 시험을 통하여 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 있다. 정확한 필요량은 다른 인자 중에서 치료하고자 하는 피험체; 치료하고자 하는 개체의 연령 및 일반 상태; 항체를 합성하는 개체의 면역 시스템 능력; 요망되는 보호 정도; 치료하고자 하는 상태의 심각도; 선택된 특정 조성물 및 그 투여 방식에 따라 달라질 것이다.

특정 구체예에서, 펩티드 시약은 면역원성이고, 본 발명의 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 펩티드 시약, 병원성 프리온에 특이적인 항체 및/또는 펩티드 시약 또는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명에 사용되는 면역원성 조성물은 이들 성분의 면역학적 유효량을 포함하는 것이 바람직하다. "면역학적 유효량"은 포유류가 프리온 단백질, 바람직하게는 병원성 프리온에 대한 면역 반응을 상승시키기에 충분한 양이다. 일반적으로, 면역 반응은 분비 기관, 세포 및/또는 항체 매개 면역 반응을 피험체에게서 생성시킨다. 보통, 그러한 반응은, 한정하는 것은 아니지만, 다음 효과 중 하나 이상을 포함한다: 임의의 면역학적 부류, 예컨대 면역글로불린 A, D, E, G 또는 M으로부터의 항체 생성; B 및 T 림프구의 증식; 면역학적 세포의 활성화, 성장 및 분화 시그널의 조건; 헐퍼 T 세포, 억제인자 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포의 팽창. 생성된 항체의 양은 사용된 동물, 보조제의 존재 등을 비롯한 몇 가지 인자에 따라 변한다.

본 발명의 조성물은 1 이상의 보조제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적당한 보조제는 다음 중 1 이상을 포함한다:

- 이. 콜리 열 불안정성 장독소("LT") 또는 그것의 탈독소화 돌연변이체, 예컨대 K63 또는 R72 돌연변이체;

- 콜레라 독소("CT") 또는 그것의 탈독소화 돌연변이체;

- 생분해성 및 비독성인 물질(예컨대, 폴리(α-히드록시산), 폴리히드록시부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리무수물, 폴리카프로락톤 등)로부터 형성된 마이크로입자(즉, ~100 nm 내지 ~150 ㎛ 직경, 보다 바람직하게는 ~200 nm 내지 ~30 ㎛ 직경, 가장 바람직하게는 ~500 nm 내지 ~10 ㎛ 직경의 입자);

- 폴리옥시에텔렌 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 에스테르(국제 특허 출원 WO 99/52549호 참조);

- 옥톡시놀과 조합한 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(국제 특허 출원 WO 01/21207호 참조) 또는 1 이상의 추가 비이온성 계면활성제, 예컨대 옥톡시놀과 조합한 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 에스테르 계면활성제(국제 특허 출원 WO 01/21152호 참조);

- 키토산(예컨대, 국제 특허 출원 WO 99/27960호);

- 면역자극성 올리고뉴클레오티드(예컨대, CpG 올리고뉴클레오티드) 및 사포닌(국제 특허 출원 WO 00/62800호 참조);

- 면역자극성 이중 가닥 RNA;

- 알루미늄 화합물(예컨대, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 히드록시인산알루미늄, 옥시히드록시드, 오르토포스페이트, 술페이트 등(예컨대, Vaccine design 제8장 및 제9장: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press (ISBN 0-306-44867-X) 참조(이하, "Vaccine design")) 또는 상이한 알루미늄의 화합물(상기 화합물은 적당한 형태, 예컨대 겔, 결정, 비정질 등을 취함; 흡착이 가장 바람직함);

- MF59(5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈 80 및 0.5% 스팬 85, 마이크로유동화기를 사용하여 미크론 이하 단위의 입자로 조제함)(Vaccine design 제 10장 참조; 또한 국제 특허 출원 WO 90/14837호 참조);

- 리포솜(Vaccine design 제 13장 및 제 14장 참조);

- ISCOM(Vaccine design 제23장 참조);

- 미크론 이하 단위의 에멀션으로 마이크로유동화되거나, 더 큰 입도의 에멀션을 생성하도록 와동 처리된, 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉 블록 코폴리머 L121 및 thr-MDP를 함유하는 SAF(Vaccine design 제 12장 참조);

- 2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80, 및 모노포스포릴리피드 A(MPL), 트레할로스 디마이콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS)으로 구성된 군 중에서의 1 이상의 박테리아 세포벽 성분, 바람직하게는 MPL + CWS(Detox^TM)을 함유하는 Ribi^TM 보조제 시스템(RAS)(Ribi Immunochem);

- 사포닌 보조제, 예컨대 Stimulon^TM으로도 알려진 QuilA 또는 QS21(Vaccine design 제22장 참조);

- 추가의 세제가 없을 수도 있는 ISCOM(국제 특허 출원 WO 00/07621호);

- 완전 프로인트 보조제(CFA) 및 불완전 프로인트 보조제(IFA);

- 시토킨, 예컨대 인터루킨(예를 들면, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 등), 인터페론(예컨대, 인터페론-γ), 대식세포 콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자 등(Vaccine design 제27장 및 제28장 참조);

- 모노포스포릴 리피드 A(MPL) 또는 3-O-탈아크릴화 MPL(3dMPL)(예컨대, Vaccine design 제21장);

- 3dMPL과 예를 들면, QS21 및/또는 수중유 에멀션의 조합(유럽 특허 출원 제0835318호, 제0735898호 및 제0761231호);

- CpG 모티프를 포함하는(Krieg (2000) Vaccine, 19: 618-622; Krieg (2001) Curr. Opin. Mol. Ther., 2001, 3: 15-24; WO 96/02555호, WO 98/16247호, WO 98/18810호, WO 98/40100호, WO 98/55495호, WO 98/37919호 및 WO 98/52581호 등), 즉 1 이상의 CG 디뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드;

- 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 에스테르(국제 특허 출원 WO 99/52549호);

- 옥톡시놀과 조합한 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(국제 특허 출원 WO 01/21207호) 또는 1 이상의 추가 비이온성 계면활성제, 예컨대 옥톡시놀과 조합한 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 에스테르 계면활성제(국제 특허 출원 WO 01/21152호);

- 면역자극성 올리고뉴클레오티드(예컨대, CpG 올리고뉴클레오티드) 및 사포닌(국제 특허 출원 WO 00/62800호);

- 면역자극인자 및 금속 염의 입자(국제 특허 출원 WO 00/23105);

- 사포닌 및 수중유 에멀션(국제 특허 출원 WO 599/11241호); 및

- 사포닌(예컨대, QS21) + 3dMPL + IL-12(임의로, + 스테롤)(국제 특허 출원 WO 98/57659호).

무라밀 펩티드로는, 한정하는 것은 아니지만, N-아세틸무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루아틈(nor-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루아트민일-L-알라닌-2-(1',2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)에틸아민(MTP-PE) 등이 있다.

점막 또는 비경구 투여에 적합한 다른 보조제도 이용 가능하다(예를 들면, Vaccine design 제7장: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X).

LT의 돌연변이체, 특히 "K63" 및 "R72" 돌연변이체(예컨대, 국제 특허 출원 WO 98/18928호 참조)가 향상된 면역 반응을 생성하기 때문에 바람직한 보조제(예컨대, 점막 보조제)이다.

마이크로입자도 유용하며, 폴리(α-히드록시산), 특히 폴리(락티드)("PLA"), D,L-락티드와 글리콜리드 또는 글리콜산의 코폴리머, 예컨대 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)("PLG" 또는 "PLGA") 또는 D,L-락티드와 카프로락톤의 코폴리머로부터 유도되는 것이 바람직하다. 마이크로입자는 다양한 분자량, PLG와 같은 코폴리머의 경우, 다양한 락티드:글리콜리드 비율을 가진 다양한 중합체 출발 물질 중 임의의 것으로부터 유도될 수 있으며, 그 선택은 대부분 선택사항이다. 본 발명의 프리온, 항체 및/또는 폴리뉴클레오티드는 마이크로입자 내에 포획될 수있거나, 또는 이것에 흡착될 수 있다. PLG 마이크로입자 내에 포획되는 것이 바람직하다. PLG 마이크로입자는 문헌(Morris et al., (1994), Vaccine, 12:5-11, chapter 13 of Mucosal Vaccines, eds. Kiyono et al., Academic Press 1996 (ISBN 012410587) 및 vaccine desing 제 16장 및 제 18장: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X))에 상세하게 논의되어 있다.

LT 돌연변이체는 마이크로입자 포획된 항원과 조합하여 사용될 수 있으며, 상당히 증강된 면역 반응을 생성한다.

알루미늄 화합물 및 MF59는 바람직한 비경구용 보조제이다.

통상적으로, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서의 주사제로서 제조할 수 있으며; 주사 전 비히클 중의 용액, 현탁액, 액체에 적합한 고체 형태도 제조할 수 있다. 또한, 제제는 상기 논의된 바와 같이 증강된 보조제 효과를 위한 리포솜에 유화 또는 캡슐화될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 액체 또는 부형제, 예컨대 물, 염수, 글리세롤, 덱스트로스, 에탄올 등을 단독으로, 또는 조합하여, 뿐만 아니라 습윤제, 유화제 또는 pH 완충제와 같은 물질을 함유할 수 있다. 담체는 조성물을 수용하는 개체에 유해한 항체의 생성을 그 자체로 유발하지 않는 분자인 담체가 임의로 존재한다. 적당한 담체는 통상적으로 크고, 느리게 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산, 아미노산 코폴리머, 지질 응집물(예컨대, 유적 또는 리포솜) 및 비활성 바이러스 입자이다. 그러한 담체는 당업자에게 널리 알려져 있다. 더욱이, 조성물 중의 1 이상의 폴리펩티드는 박테리아 톡소이드, 예컨대 디프테리아, 파상풍, 콜레라 등으로부터의 톡소이드와 콘쥬게이트될 수 있다.

D. 전달

본 발명의 조성물은 단일 투약 또는 투여 섭생의 일부로서 투여될 수 있다. 핵산 및/또는 펩티드는, 한정하는 것은 아니지만, 근육내, 점막내, 피하, 피내, 경피, 질내, 장내, 경구 및/또는 정맥내를 비롯한 임의의 적당한 방법에 의해 투여될 수 있다. 투약 섭생은 프라임 및 추가 투약을 포함할 수 있으며, 이는 저막내, 비경구 또는 이들의 다양한 조합으로 투여될 수 있다.

특정 구체예에서, 조성물의 1 이상의 성분은 비경구 또는 점막 투여된다. 비경구 투여의 적당한 경로로는 근육내(IM), 정맥내, 복강내, 피내, 경피 및 피부통과(예컨대, 국제 특허 출원 WO 98/20734호) 경로, 뿐만 아니라 조직의 세포간 공간으로의 전달이 있다. 적당한 점막 투여 경로로는 비내, 위내, 폐, 장, 결장, 눈 및 질 경로가 있다. 조성물은 점막 투여에 적합할 수 있다. 예를 들면, 조성물이 경구 투여용인 경우, 이것은 임의로 장용 코팅된 정제 또는 캡슐, 액체, 트랜스제닉 플랜트 등의 형태일 수 있다. 조성물이 장내 투여인 경우, 이것은 비내 스프레이, 점비제, 겔 또는 분말 형태일 수 있다. 투약 처치는 단일 투약 스케줄 또는 다중 투약 스케줄일 수 있다.

또한, 조성물(또는 그 성분)은 미립자 담체로 캡슐화되거나, 흡착되거나, 회합될 수 있다. 그러한 담체는 면역 시스템에 선택된 항원의 다중 사본을 제공하고, 국소 림프절 내 항원의 포획 및 체류를 촉진한다. 입자는 대식세포에 의해 식균작용화될 수 있고, 시토킨 방출을 통하여 항원 제시를 향상시킬 수 있다. 미립자 담체의 예로는 폴리메틸 메타크릴레이트 폴리머로부터 유도된 것, 뿐만 아니라 폴리(락티드) 및 PLG로 알려진 폴리(락티드-코-글리콜리드)로부터 유도된 마이크로입자가 있다. 예를 들면, 문헌(Jeffery et al., Pharm. Res. (1993) 10: 362-368; McGee J.P., et al., J. Microencapsul. 14(2): 197-210, 1997; O'Hagan D.T. et al., Vaccine 11(2): 149-54, 1993)을 참조할 수 있다. 또한, 적당한 마이크로입자는 음이온 또는 양이온 세제와 같은 하전된 세제의 존재 하에 제조하여 순 음전하 또는 순 양전하를 가진 표면을 갖춘 마이크로입자를 얻을 수 있다. 예를 들면, 음전하 세제, 예컨대 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)로 제조된 마이크로입자, 즉 CTAB-PLG 마이크로입자는 DNA와 같은 음전하를 띠는 거대 분자를 흡착한다(예컨대, 국제 출원 번호 PCT/US99/17308호 참조).

더욱이, 다른 미립자 시스템 및 폴리머는 생체내 또는 생체외 전달에 사용될 수 있다. 예를 들면, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리오르니틴, 스페르민, 스페르미딘과 같은 폴리머, 뿐만 아니라 이들 분자의 콘쥬게이트는 관심대상의 핵산을 전사하는 데 유용하다. 유사하게, DEAE 덱스트란 매개 트랜스펙션, 인산칼슘 침전 또는 인산스트론튬, 규산알루미늄, 예컨대 벤토나이트 및 카올린, 산화크롬, 규산마그네슘, 탈크 등과 같은 다른 무기염을 사용하는 침전은 기존의 방법에서 용도를 찾아볼 수 있다. 예를 들면, 유전자 전사에 유용한 전달 시스템의 검토를 위하여, 문헌(Felgner, P.L., Advanced Drug Delivery Reviews (1990) 5: 163-187)을 참조할 수 있다. 또한, 펩토이드(Zuckerman, R.N., et al., 1998년 11월 3일 특허된 미국 특허 제5,831,005호, 본 명세서에서 참고 인용함)도 본 발명의 구조물 전달에 사용할 수 있다.

전술한 바와 같이, 펩티드(또는 항체)도 이들 분자를 암호화하는 핵산에 전달될 수 있다. 소정의 서열은 선택된 컨트롤 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서 등)를 함유하는 단일 시스트론 또는 다중 시스트론 벡터에 삽입한다. 완성되면, 구조물은, 예를 들면 통상의 주사기를 사용하는 주사(예컨대, 미국 특허 제5,399,346호, 제5,580,859호, 제5,589,466호) 또는 유전자총, 예컨대 Accell® 유전자 전달 시스템(PowederJect Technologies, Inc., 영국 옥스포드 소재)를 비롯한 표준 유전자 전달 프로토콜; 바이러스계 시스템, 예컨대 미국 특허 제5,219,740호에 기재된 바와 같은 레트로바이러스 시스템, 아데노바이러스 시스템(Barr et al., Gene Therapy (1994) 1: 51-58; Berkner, K.L. BioTechniques (1988) 6: 616-629; 및 Rich et al., Human Gene Therapy (1993) 4: 461-476), 아데노 관련 바이러스(AAV) 시스템(미국 특허 제5,173,414호 및 제5,139,941호), 수두 바이러스 시스템, 우두 바이러스 전달 시스템(예컨대, 국제 공보 WO 94/26911호 참조), 조류폭스 바이러스 시스템, 예컨대 계두 및 카나리폭스 바이러스, 알파바이러스 전달 시스템(미국 특허 제5,843,723호, 제5,789,245호, 제6,342,372호, 제6,329,201호)뿐만 아니라 다른 바이러스 시스템; 비바이러스 시스템, 예컨대 하전 또는 비하전 리포솜(예컨대, Hug and Sleight, Biochim, Biophys. Acta. (1991) 1097: 1-17; Straubinger et al., Methods of Enzymology (1983), Vol. 101, pp. 512-527; Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 7413-7416 참조); 및/또는 문헌(Papahadjopoulos et al., Biochem. Biophys. Acta. (1975) 394: 483-491)에 기재된 것과 유사한 코킬레이트 지질 조성물을 사용하여 전달될 수 있다. 또한, 미국 특허 제4,663,161호 및 제4,871,488호를 참조할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 척추 동물 피험체에게 직접 전달되거나, 또는 대안으로 피험체로부터 유도된 세포 및 피험체에게 재이식된 세포로 체외 전달될 수 있다.

본 발명의 방법은 본 발명의 항체의 유효량을 포함하는 조성물을 동물에게 투여함으로써 프리온 관련 질환을 치료 또는 예방하는 단계를 더 포함한다.

치료 방법은 본 명세서에 기재된 조성물 중 어느 것, 예를 들면 펩티드 함유 조성물 및/또는 항체 조성물을 조합할 수 있다. 다양한 성분을 함께 또는 별도로 투여할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용하기에 적당한 동물로는 사람 및 다른 영장류, 예컨대 침팬지와 같은 비사람 영장류 및 다른 유인원 및 원숭이종; 사육 동물, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말, 가축,예컨대 개 및 고양이; 설치류를 비롯한 실험실 동물, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 및 기니 피그; 가금류, 야생조류 및 엽조류를 비롯한 조류, 예컨대 닭, 칠면조 및 다른 가금, 오리, 거위 등이 있다. 본 발명에 사용하기에 적당한 동물은 성인 및 영아를 비롯한 임의의 연령일 수 있다. 트랜스게닉 동물도 본 발명에 사용할 수 있다. 일반적으로, 프리온 관련 질환에 현재 사용되는 트랜스게닉 동물의 논의에 대해서는 문헌(Prusiner "Prions" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95: 13363-13383)을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 프리온 관련 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용할 수 있다. 그러한 프리온 관련 질환은 전체적으로 또는 부분적으로 병원성 프리온 단백질(PrP^Sc)에 의한 질환 원인을 포함한다. 프리온 관련 질환으로는 면양 떨림병, 소 해면양 뇌병증(BSE), 광우병, 고양이 해면양 뇌병증, 쿠루, 크로이츠펠트-야콥병(CJD), 게르스트만-슈트라슬러-샤인커병(GSS) 및 치명적 가족성 불면증(FFI)이 있다.

하기는 본 발명을 수행하기 위한 특정 구체예의 실시예이다. 실시예는 단지 설명의 목적으로 제공되며, 어떤 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다.

사용된 수(예를 들어, 양, 온도 등)에 관한 정확성을 보증하기 위한 노력을 하였으나, 얼마간의 실험적 오차 및 편차는 물론 허용되어야 한다.

실시예 1: 펩티드 시약 생성

프리온 단백질의 펩티드 단편을 본질적으로 [Merrifield (1969) Advan. Enzymol. 32: 221 and Holm and Medal(1989), Multiple column Peptide synthesis, p. 208E, Bayer and G. Jung (ed.), Peptides 1988, Walter de Gruyter & Co. Berlin-N.Y]에서 설명한 바와 같이, 표준 펩티드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성하였다. 펩티드를 HPLC에 의해 정제시키고 서열을 질량 분석법에 의해 확인하였다.

특정한 경우에, 합성된 펩티드는 예를 들어, GGG 잔기와 같은 N 또는 C 말단에 추가적 잔기를 포함하였으며/포함하였거나 야생형 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하였다.

A. 펩토이드 치환

또한, SEQ ID NO:14 (QWNKPSKPKTN, SEQ ID NO:2의 잔기 97 내지 107에 대응), SEQ ID NO:67 (KKRPKPGGWNTGG, SEQ ID NO:2의 잔기 23-36에 대응) 및 SEQ ID NO:68 (KKRPKPGG, SEQ ID NO:2의 잔기 23-30에 대응)에 존재하는 펩티드에서 펩토이드 치환을 하였다. 특히, 이들 펩티드의 하나 이상의 프롤린 잔기를 다양한 N-치환된 펩토이드로 치환시켰다. 어떤 프롤린에 대하여 치환될 수 있는 펩토이드에 대한 도 3을 참조. 펩토이드를 모두가 본원에서 참고로서 인용되는 미국 특허 제 5,877,278호 및 제 6,033,631호; [Simon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9367]에서 설명되는 바와 같이 제조 및 합성하였다.

B. 다중결합체 형성

또한, 특정한 펩티드 시약을 예를 들어, 직렬 반복(예를 들어, GGG와 같은 링커를 통하여 펩티드의 다수의 사본들과 연결함), 다중 항원 펩티드(MAPS) 및/또는 선형-연결 펩티드를 제조합으로써, 다중결합체로서 제조하였다.

특히, MPS를 본질적으로 문헌[Wu et al. (2001) J Am Chem Soc. 2001 123 (28): 6778-84; Spetzler et al. (1995) Int J Pept Protein Res. 45(1):78-85]에서 설되는 바와 같이, 표준 기술을 사용하여 제조하였다.

또한, 선형 및 분지형 펩티드(예를 들어, PEG 링커 다중결합체 형성)를 표준 기술을 사용하여 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커를 사용하여 제조하였다. 특히, 분지형 다중펩티드 PEG 스캐폴드를 하기 구조를 포함하여 생성하였다: 비오틴-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys(펩티드 없는 대조군) 및 비오틴-PEG-Lys (펩티드)-PEG-Lys(펩티드)-PEG-Lys(펩티드)-PEG-Lys(펩티드)-PEG-Lys(펩티드). 또한, Lys 결합에 대한 펩티드를 제조하였다: Lys-ε-NH-CO-(CH2)3-Mal-S-Cys-펩티드. 도 5 참조.

C. 비오틴화

펩티드를 합성 및 정제 이후에 표준 기술을 사용하여 비오틴화하였다. 비오틴을 N- 또는 C-말단의 펩티드에 첨가하였다.

실시예 2: 결합 분석

A. 풀-다운

본원에서 설명한 바와 같은 펩티드 시약을 자기 비드 풀다운 분석을 사용하여 프리온 단백질에 특이적으로 결합하기 위한 그들의 능력에 대하여 테스트하였 다. 이 분석을 위해, 펩티드 시약을 비오틴으로 표지하였으며, 이것은 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드에 부착을 허용하였다.

뇌 호모제네이드를 RML PrP^sc+ 및 PrP^c+ Balb-c 마우스로부터 제조하였다. 요약하면, 1% TW20 및 1% 트리톤 100을 포함하는 5 mL의 TBS 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.5 및 37.5mM NaCl)을 무게 ~0.5 g까지 첨가하여 10% 호모지네이트를 생성하였다. 뇌 슬러리를 큰 파편이 사라질때까지 가압파쇄(dounce)하였다. 200 μl의 분액을 완충액 중 1:1로 희석하고 미리 냉각시킨 에펜돌프 튜브에 첨가하고 샘플을 각각 몇초의 몇번의 반복 동안 초음파 처리하였다. 샘플을 500x에서 10-15분 동안 원심분리 시키고 상청액을 제거하였다.

프로테이나제 K 소화의 효과를 테스트하기 위해, 특정한 상청액을 2개의 샘플에 나누고 4μl의 프로테이나제 K를 하나의 샘플에 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 회전시켰다. 8 마이크로리터의 PMSF를 프로테이나제 K 관에 첨가하여 소화를 멈추고 튜브를 4℃에서 최소 1시간 동안 배양하였다.

호모지네이트를 추가적 사용시까지 4℃에서 저장하고 필요하다면 상기 설명한 바와 같이 다시 초음파처리 하였다. 뇌 호모지네이트의 10% w/v PrP^c+ 또는 PrPS^c+ 제조물을 비오틴-표지된 펩티드 시약과 함께 4℃에서 밤새 배양한 후, 400μl의 완충액, 50μl의 추출물 및 5μl의 비오틴-표지된 펩티드 시약(10 mM 원액)을 함유하는 관을 제조하였다. 관을 플랫폼 락커 상에서 실온에서 최소 2시간 또는 4℃에서 밤새 배양하였다.

배양 이후에, 50μl의 SA-비드(Dynal M280 스트렙타비딘 112.06)를 첨가하고 관을 소용돌이에 의해 혼합사였다. 관을 실온에서 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 흔들면서(VWR, 락킹 플랫폼, 모델 100) 배양하였다.

샘플을 진탕기로부터 제고하고, 자기장에 두어 첨가된 펩티드 시약 및 프리온과 함께 자기 비드를 수집하고 1 ml 분석 완충액을 사용하여 5-6번 세척하였다. 샘플을 즉시 사용하거나 하기 설명되는 웨스턴 블롯팅 또는 ELISA까지 -20℃에서 저장하였다.

B. 웨스턴 블롯팅

웨스턴 블롯팅 분석을 다음과 같이 수행하였다. 상기 설명되는 바와 같이 침전된 비드-펩티드-프리온 복합체를 25-30 μl의 SDS 완충액(Novex Tris-Glycine SDS-샘플 완충액 2X)을 첨가함으로써 최종 세척한 후 변성시키고 각각의 관에 첨가하였다. 관을 모든 비드가 현탁될 때까지 소용돌이에 의해 혼합하였다. 관을 상단이 열리기 시작할 때까지 끓이고, 표준 SDS-겔 상에서 작업하고 WB 분석을 위한 고체막으로 옮겼다.

막을 실온에서 5% 우유/TBS-T[50 ml 1 M Tris pH 7.5; 37.5 ml 4M NaCl, 1-10 mL Tween은 부피를 우유와 함께 1L에 이르게 함]에서 30분 동안 차단시켰다. "프리온 키메라 및 그것의 사용"이라는 명칭의 2003년 9월 30일자로 출원된 국제 출원 제 PCT/US03/31057호에서 설명된 바와 같이 10 내지 15 ml의 항-프리온 폴리클론 항체를 막으로 1:50 배 희석으로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 막을 TBS-T에서 여러번 세척하였다. 세척 후, 알칼리 포스파타제(AP)에 결합된 2차 항체(염소 항-토끼 IgG(H+L) 항체(Pierce))를 1:1000(TBS-T 중)으로 첨가하고 실온에서 20분 동안 배양하였다. 막을 TBS-T에서 여러번 세척하였다. 알칼리 포스파타제 침전 시약(1-단계 NBT/BCIP (Pierce)를 첨가하고 배경이 사라지거나 신호가 뚜렷할때 까지 진행시켰다.

C. ELISA

최종 세척 후, 상기 설명된 비드-펩티드 복합체를 구아니딘 티오시안산염으로 변성싱키고 ELISA를 문헌 [Ryou et al.(2003) Lab Invest. 83 (6): 837-43]에서 이미 설명한 바와 같이 변성 단백질 상에서 수행하였다. 블랭크 대조군 이상의 O.D. 값(.172-.259의 범위)을 양성으로 간주하였다.

D. 결과

웨스턴 블롯팅 및 ELISA 결합 분석의 결과를 표 2에서 요약한다. 요약하면, 뇌 호모지네이트의 프로테이나제 K 소화가 펩티드 시약의 PrP^sc에 대하여 결합하는 본원에서 설명되는 바와 같은 펩티드 시약의 특이적 결합을 검출하기위해 필수적이지는 않다. 도 4에서 나타낸 바와 같이, 어떤 경우에도 펩티드 시약이 특이적으로 PrP^Sc에 대하여 결합되는 것을 나타내는 야생형 뇌 호모지네이트에 대한 결합이 관찰되지 않았다. 더욱이, 상기 설명되는 웨스턴 블롯팅 분석은 4 로그 희석 이상에서 상기 검출된 PrP^Sc를 설명한 반면 ELISA는 웨스턴 블롯팅 보다 적어도 10X 빈감하였다.

알라닌 스캐닝을 또한 결합에 포함된 잔기를 동정하기 위해 수행하였다. 결과는 표 3에서 나타낸다.

또한, 표 4에서 나타내는 바와 같이, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO: 67 및 SEQ ID NO:68을 갖는 펩티드 시약에 의한 PrP^SC에 대한 결합은 다수의 N-치환 글리신(펩토이드)에 의해 프롤린 잔기에서 치환에 의해 더 증가시켰다.

더욱이, PrP^Sc-결합 펩티드 시약의 다중결합체 형성은 또한 PrP^Sc에 대한 친화성을 향상시켰다. 특히, 직렬 반복은 단일 사본 보다 더 강한 신호(웨스턴 블롯팅에 의해 측정되는 바와 같음)를 제공하였다. 사전-유도체화 MAP는 특정 경우에 최대 2-배의 증가된 결합을 비드 상에서 형성한다. 그러나, MAP 형태는 용액 중 펩티드의 침전을 야기하였다. 선형-결합 펩티드를 또한 침전을 야기하지 않고서 결합을 증가시키는 그들의 능력에 대하여 테스트하였다.

실시예 3: 항체 생산

다음은 본 발명의 펩티드 시약에 대한 항체를 생성하는데 사용될 수 있는 프로토콜의 예를 제공한다.

마우스를 0일에 IM(근육내) 또는 IP(복막내)로 본원에서 설명되는 바와 같이 펩티드 시약을 포함하는 조성물로 면역화 시킨 다음(예를 들어, SEQ ID NO: 12-108 중 어떤 한가지, 바람직하게는 SEQ ID NO:14, 35, 50, 51, 56, 57, 65, 66, 67, 68, 72, 73, 77, 81, 82 중 어떤 한가지), 2주에 한번 이하의 빈도의 간격으로 추가 투여한다. 혈액을 첫번째 면역화 전에 수집한 후 각각의 추가 투여 7일 후 항원에 대한 체액성 반응을 모니터링하였다. 6 오비탈 눈 출혈을 각 출혈 당 약 0.1 ml 이하를 각 동물(각각의 눈으로부터 3)로부터 취한다. 최종 추가 투여를 IV(정맥 내) 주사에 의해 송달시킨다. 최종 추가 투여 3일 후, 마우스를 CO₂ 또는 이소플루오란에 노출시킴으로써 안락사시킨후 경부 탈구시킨다. 후속하여 비장을 하이브리도마 생산을 위해 취한다.

완전한 프룬드(Freund) 애쥬번트를 첫번째 주사를 위한 애쥬번트로서 사용한 다음 IV 주사를 제외하고 나머지 주사에 대하여 불완전한 프룬드 애주번트를 사용한다. IV 주사는 식염수로 제조한다.

주제 발명의 바람직한 구체예가 얼마간 상세히 설명되지만, 명백한 변화는 본원에서 정의되는 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 이해된다.

Claims

입체구조 질환 단백질의 비병원성 형태와 비교하여 입체구조 질환 단백질의 병원성 형태와 우세하게 상호작용하는 단리 펩티드 시약.
제 1 항에 있어서, 입체구조 질환은 프리온-관련 질환이고, 병원성 단백질은 PrP^SC이며, 비병원성 형태는 PrP^C인 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 2 항에 있어서, 펩티드 시약은 프리온 단백질의 단편으로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 3 항에 있어서, 펩티드 시약은 폴리프롤린 유형 II 헬릭스 모티프를 함유하는 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 1 항에 있어서, 펩티드 시약은 서열 모티프 PXXP를 함유하고, 여기서 P는 프롤린 또는 N-치환된 글리신이며 X는 어떤 아미노산인 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 2 항에 있어서, 펩티드 시약은 서열 모티프 PXXP를 함유하고, 여기서 P는 프롤린 또는 N-치환된 글리신이며 X는 어떤 아미노산인 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 1 항에 있어서, 상기 펩티드 시약은 유전적으로 코딩되는 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 2 항에 있어서, 펩티드 시약은 SEQ ID NOs: 12-132를 갖는 펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 펩티드로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 8 항에 있어서, 펩티드 시약은 SEQ ID NOs: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82, 및 84를 갖는 펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 펩티드로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 8 항에 있어서, 펩티드 시약은 SEQ ID NO: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 또는 127을 갖는 펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 펩티드로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 8 항에 있어서, 펩티드 시약은 N-말단 끝 및/또는 C-말단에서 아미노산 서열(G)_n을 포함하며, 여기서 n=1, 2, 3 또는 4인 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 펩티드 시약은 비오틴화되는 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 8 항에 있어서, 펩티드 시약은 SEQ ID NO: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 및 132를 갖는 펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 펩티드로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 13 항에 있어서, 펩티드 시약은 N-말단 끝 및/또는 C-말단에서 아미노산 서열(G)_n을 포함하며, 여기서 n=1, 2, 3 또는 4인 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 펩티드 시약은 비오틴화되는 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 8 항에 있어서, 펩티드 시약은 SEQ ID NO: 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 129, 130, 131 및 132를 갖는 펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 펩티드로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 16 항에 있어서, 펩티드 시약은 비오틴화되는 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 8 항에 있어서, 펩티드 시약은 SEQ ID NO: 56, 57, 65, 82, 및 84를 갖는 펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 펩티드로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 18 항에 있어서, 펩티드 시약은 비오틴화되는 것을 특징으로 하는 펩티드 시약.
제 7 항에 따르는 펩티드 시약을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 2 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 시약 및 병원성 프리온 단백질을 포함하는 복합체.
(a) 제 1 복합체를 형성하기 위하여, 병원성 프리온과, 이것이 존재한다면, 제 1 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제 2 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 10 항, 제 13 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 제 1 펩티드 시약과 접촉시키는 단계;

(b) 제 1 펩티드 시약과 병원성 프리온의 결합에 의해 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를, 이것이 있다면, 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 제 1 펩티드 시약을 검출가능하게 표지시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 제 1 펩티드 시약을 비오틴화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 제 1 펩티드 시약을 고체 지지체에 부착시키는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 제 1 복합체를 형성하기 위하여, 병원성 프리온과, 이것이 존재한다면, 제 1 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제 2 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 10 항, 제 13 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 제 1 펩티드 시약과 접촉시키는 단계;

(b) 상기 제 1 복합체의 병원성 프리온과 제 2 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 제 1 복합체를 제 2 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 10 항,제 13 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 제 2 펩티드 시약과 접촉시키는 단계, 여기에서 상기 제 2 펩티드 시약은 검출가능한 표지를 포함; 및

(c) 제 2 펩티드 시약과 병원성 프리온의 결합에 의해 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를, 이것이 있다면, 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 제 1 펩티드 시약 및 상기 제 2 펩티드 시약은 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 제 1 펩티드 시약 및 상기 제 2 펩티드 시약은 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 제 1 펩티드 시약을 고체 지지체에 부착시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 제 1 펩티드 시약은 비오틴화되는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 제 1 복합체를 형성하기 위하여, 병원성 프리온과, 이것이 존재한다면, 제 1 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제 2 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 10 항, 제 13 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 제 1 펩티드 시약과 접촉시키는 단계;

(b) 비결합 샘플 물질을 제거하는 단계;

(c) 상기 제 1 복합체로부터 상기 병원성 프리온을 분리하는 단계;

(d) 병원성 프리온과 제 2 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 분리된 병원성 프리온을 제 2 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 10 항,제 13 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 제 2 펩티드 시약과 접촉시키는 단계, 여기에서 상기 제 2 펩티드 시약은 검출가능한 표지를 포함; 및

(e) 제 2 펩티드 시약과 병원성 프리온의 결합에 의해 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를, 이것이 있다면, 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법.
(a) 제 1 복합체를 형성하기 위하여, 병원성 프리온과, 이것이 존재한다면, 제 1 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제 2 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 10 항, 제 13 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 제 1 펩티드 시약과 접촉시키는 단계;

(b) 비결합 샘플 물질을 제거하는 단계;

(c) 상기 제 1 복합체로부터 상기 병원성 프리온을 분리하는 단계;

(d) 병원성 프리온과 프리온-결합 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 분리된 병원성 프리온을 프리온-결합 시약과 접촉시키는 단계; 여기에서 상기 프리온-결합 시약은 검출가능한 표지를 포함; 및

(e) 프리온-결합 시약과 병원성 프리온의 결합에 의해 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를, 이것이 있다면, 검출하는 단계를 포함하는 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법.
제 32 항에 있어서, 상기 프리온-결합 시약을 항프리온 항체, 모티프-융합 혼성 폴리펩티드, 양이온성 또는 음이온성 폴리머, 전파 촉매 및 플라스미노젠으로 구성되는 군으로부터 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 제 1 복합체를 형성하기 위하여, 병원성 프리온과, 이것이 존재한다면, 프리온-결합 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 병원성 프리온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 프리온-결합 시약과 접촉시키는 단계;

(b) 비결합 샘플 물질을 제거하는 단계;

(c) 병원성 프리온과 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 제 1 복합체를 제 2 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 10 항, 제 13 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 시약과 접촉시키는 단계, 여기에서 상기 펩티드 시약은 검출가능한 표지를 포함; 및

(d) 펩티드 시약과 병원성 프리온의 결합에 의해 샘플에 있는 병원성 프리온 의 존재를, 이것이 있다면, 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법.
(a) 제 2 항,제 8 항,제 9 항, 제 10 항, 제 13 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 제 1 펩티드 시약을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계;

(b) 병원성 프리온이, 샘플에 존재할 때, 제 1 펩티드 시약에 결합하도록 허용하는 조건하에서 고체 지지체를 샘플과 접촉시키는 단계;

제 2 펩티드 시약이 제 1 펩티드 시약에 의해 결합된 병원성 프리온에 결합하도록 허용하는 조건하에서 고체 지지체를 제 2 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 10 항, 제 13 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 검출가능하게 표지된 제 2 펩티드 시약과 접촉시키는 단계; 및

(C) 제 1 펩티드 시약, 샘플로부터의 병원성 프리온 및 제 2 펩티드 시약 사이에 형성된 복합체를 검출함으로써, 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온을 검출하는 방법.
(a) 프리온-결합 시약을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계;

(b) 병원성 프리온이, 이것이 샘플에 존재할 때, 프리온-결합 시약에 결합하도록 허용하는 조건하에서 고체 지지체를 샘플과 접촉시키는 단계;

(c) 고체 지지체를 제 2 항, 제 8 항, 제 9 항,제 10 항, 제 13 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 검출가능하게 표지된 제 2 펩티드 시약과 접촉시키는 단계; 및

(d) 프리온-결합 시약, 샘플로부터의 병원성 프리온 및 제 2 펩티드 시약 사이에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온을 검출하는 방법.
(a) 제 2 항,제 8 항, 제 9 항, 제 10 항, 제 13 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 제 1 펩티드 시약을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계;

(b) 고체 지지체를 검출가능하게 표지된 제 1 리간드와 결합시키는 단계, 여기에서 검출가능하게 표지된 제 1 리간드에 대한 제 1 펩티드 시약의 결합 친화력은 병원성 프리온에 대한 제 1 펩티드 시약의 결합 친화력보다 더 약함;

(c) 병원성 프리온을, 이것이 샘플에 존재할 때, 제 1 펩티드 시약에 결합하여 제 1 리간드를 치환하도록 허용하는 조건하에서 샘플을 고체 지지체와 결합시키는 단계; 및

(d) 제 1 펩티드 시약 및 샘플로부터의 병원성 프리온 사이에 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 방법.
제 25 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 니트로셀룰로오스, 폴리스티렌 라텍스, 폴리비닐 플로라이드, 디아조화된 종이, 나일론 막, 활성화된 비드, 및 자기적 반응성 비드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항에 있어서, 샘플은 생물학적 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
제 39 항에 있어서, 생물학적 샘플을 기관, 전혈, 혈액 일부분, 혈액 구성성분, 혈장, 혈소판, 혈청, 뇌척수액(CFS), 뇌 조직, 신경계 조직, 근육 조직, 골수, 소변, 눈물, 비신경계 조직, 기관, 및/또는 생검 또는 부검으로 구성되는 군으로부터 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 40 항에 있어서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈장, 혈소판, 혈액 일부분, 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 10 항, 제 13 항 또는 제 16 항 중 어느 한항에 따른 적어도 하나의 펩티드 시약을 포함하는 고체 지지체.
(a) 제 42 항에 따른 고체 지지체; 및

기타 필요한 시약 및, 선택적으로, 양성 및 음성 대조군을 포함하는 샘플에 있는 병원성 프리온의 존재를 검출하는 키트.
제 2 항, 제 8 항, 제 9 항,제 10 항, 제 13 항 또는 제 16 항 중 어느 한항에 따른 펩티드 시약을 포함하는 조성물.
제 20 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
제 44 항에 따른 하나 이상의 조성물을 동물에 투여하는 것을 포함하는 프리온 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
제 46 항에 있어서, 피험체는 동물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 47 항에 있어서, 포유동물은 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
제 46 항에 있어서, 조성물을 근육내, 점막내, 비내, 피하, 피내, 경피, 질내, 장내, 경구 또는 정맥내로 투여시키는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 프라임 단계에서 제 44 항 중 어떤 것에 따른 조성물을 포함하는 제 1 조성물을 투여하는 단계 및

(b) 피험체에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로, 추가 투여로서, 제 44 항 중 어떤 것에 따른 조성물을 포함하는 2차 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 프리온 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
(a) 제 2 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 10 항, 제 13 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 시약을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계;

(b) 제 1 복합체를 형성하기 위하여, 병원성 프리온과, 이것이 존재한다면, 상기 제 1 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 샘플을 상기 고체 지지체와 접촉시키는 단계 및

(b) 비결합 샘플 물질을 제거하는 단계를 포함하는 샘플로부터 병원성 프리온 단백질을 단리시키는 방법.
제 51 항에 있어서, 상기 제 1 복합체로부터 상기 병원성 프리온 단백질을 분리시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 제 2 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 10 항, 제 13 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 시약을 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계;

(b) 병원성 프리온 단백질과, 이것이 존재한다면, 펩티드 시약의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 고체 지지체를 병원성 프리온 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시키는 단계; 및

(c) 비결합 샘플 물질을 제거하는 단계를 포함하는 샘플로부터 병원성 프리온 단백질을 제거하는 방법.
병원성 프리온이 실질적으로 없는 혈액 공급물의 제조 방법으로서, 상기 혈액 공급물은 전혈, 적혈구, 혈장, 혈소판 또는 혈청을 포함하고, 상기 방법은:

(a) 제 22 항의 방법에 의하여 제공되는 임의의 검출 방법에 의해 수집된 혈액 샘플로부터 전혈, 적혈구, 혈장, 혈소판 또는 혈청의 분액을 스크리닝하는 단계;

(b) 병원성 프리온이 검출되는 샘플을 제거하는 단계; 및

(c) 병원성 프리온이 검출되지 않은 샘플을 조합하여 병원성 프리온이 실질적으로 없는 혈액 공급물을 제공하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
병원성 프리온이 실질적으로 없는 식품 공급물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은

(a) 제 22 항의 방법에 의하여 식품 공급물에 넣을 생 유기물로부터 수집한 샘플 또는 식품 공급물에 넣고자 하는 식품으로부터 수집한 샘플을 스크리닝하는 단계;

(b) 병원성 프리온이 검출된 샘플을 제거하는 단계; 및

(c) 병원성 프리온이 검출되지 않은 샘플을 조합하여 병원성 프리온이 실질적으로 없는 식품 공급물을 제공하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.