JP2003531356A

JP2003531356A - プリオンタンパク質結合タンパク質及びそれらの使用

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Publication number: JP2003531356A
Application number: JP2001505942A
Authority: JP
Inventors: ネイルアール．キャシュマン; ビンセントドデュレット; ユスタッシェパラミティオティ
Original assignee: マクギルユニバーシティー; キャプリオンファーマシューティカルズインコーポレイテッド
Priority date: 1999-06-29
Filing date: 2000-06-29
Publication date: 2003-10-21
Also published as: WO2001000235A1; EP1210110A1; AU5778400A; CA2376914A1; EP1210110A4

Abstract

(57)【要約】一般に、本発明は、プリオンタンパク質結合タンパク質(PrPBP)と、それらの診断用途、治療用途および除染用途とに関する。本発明はまた、PrPBP単離のための融合タンパク質試薬を特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景本発明は、プリオンタンパク質結合タンパク質、核酸、及びそれらの使用に関
する。

【０００２】プリオン疾患とは、急速に進行する致命的な治療不可能な神経変性症候群の群
である。ヒトプリオン障害には、非経口治療剤（例えば、屍体から抽出された下
垂体ホルモン）及び移植組織（例えば、角膜及び硬膜の移植物）の不慮の汚染に
より伝播しうるクロイツフェルト-ヤコブ（Creutzfeldt-Jakob）病（CJD）が含
まれる。後にCJDを発症したドナーまたは家族が疾患を有していたドナーからの
汚染の可能性のため、カナダ赤十字（Canadian Red Cross）は、現在までに、12
00万ドルを越える血液製剤をカナダ市場から回収した。さらに、ヒツジ及びヤギ
のスクレイピーは、イギリスにおけるウシ海綿状脳症と同様に、北米における一
般的な経済的に重要なプリオン関連疾患である。ウシ海綿状脳症は、人間による
牛肉摂取、及びこの種由来の生物学的製品の調製とも、健康的及び経済的に大き
く関係している。

【０００３】プリオン疾患は、病理学的には、スポンジ状変化（即ち、脳の微小空洞形成、
通常灰白質に多い）、ニューロン細胞の損失、ニューロン損失と釣り合わない星
状膠細胞の増殖、及び異常なアミロイド形成タンパク質の蓄積により特徴付けら
れ、これらは脳内の別々の斑において起こることもある。プリオン疾患における
神経変性は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、及びパーキンソン病のよ
うな、他のより一般的な神経変性症候群と共通の基本メカニズムを有している可
能性がある。

【０００４】これらの疾患を伝播させる病原体は、感染性材料中に、核酸成分の化学的また
は物理的な証拠が再現可能に検出されないという点で、ウイルス及びウイロイド
とは著しく異なる（Prusiner、Science 216:136〜144、1982）。プロテイナーゼ
K消化を利用したスクレイピー病原体の精製法により、スクレイピー罹患ハムス
ターの脳において27〜30kDのプロテアーゼ抵抗性タンパク質が発見され、それは
PrP27-30と名付けられた（Boltonら、Science 218:1309〜1311、1982）。スクレ
イピー病原体活性と共に精製されたPrP27-30は、後に、伝播性病原体の主要な（
または唯一の）高分子であることが示された（McKinleyら、Cell 35:57〜62、19
83）。PrP27-30は、後に、やはり疾患を伝播させることができる、33〜37kDの完
全型のスクレイピー病原体タンパク質（PrP^Scと名付けられた）のタンパク質分
解による消化産物であることが決定された。

【０００５】 PrP27-30の部分アミノ酸配列が決定され、cDNAがクローニングされた際、この
タンパク質をコードする遺伝子が宿主由来であることが見い出された（Oeschら
、Cell 40:735〜746、1985）。この細胞性タンパク質は、正常な脳から単離され
ており、それは、PrP^Scとは異なり、プロテアーゼ感受性であり、かつスクレイ
ピー疾患発症活性とは関連していない（Bendheimら、Ciba Found.Symp.164〜177
、1988）。感染性粒子関連PrP^Scは、正常細胞性前駆体PrP^Cに由来するという仮
説が立てられた（Prusiner、Science 252:1515〜1522、1991）。最近、細胞の非
存在下でPrP^ScによりPrP^CからPrP^Scへの変換が触媒されることが報告された（Ko
ciskoら、Nature 370:471〜473、1994）。プロテアーゼ感受性の正常細胞性アイ
ソフォームPrP^Cは、進化上保存された膜タンパク質であるが、その機能は不明で
ある。最近、グリコシル-ホスファチジルイノシトール（GPI）関連タンパク質で
あるPrP^Cが、コンカナバリンA刺激により誘導されるT細胞活性化を修飾すること
が示され（Cashmanら、Cell 61:185〜182、1990）、このタンパク質が重要な機
能的役割を有することが示唆された。

【０００６】種間のプリオン疾患の伝播は、PrPアミノ酸配列により主に決定される「種の
障壁」により制限されている。さらに、最近のトランスジェニック実験により、
やはりプリオン病原体形成に関与するPrPとは別の種特異的高分子の役割も示唆
されている。プリオン疾患を有するヒトからの脳抽出物を接種された、ヒトPrP^C を高レベルに発現するトランスジェニックマウスは、ヒトプリオンに対して耐性
であった。ヒトプリオンに対する感受性は、マウスPrP遺伝子を切除するか、ま
たはヒト-マウスキメラプリオン遺伝子を発現させた場合にのみ起こった。これ
らの知見からは、ヒトプリオンタンパク質に対する親和性よりもマウスプリオン
タンパク質に対する親和性の方が高い種特異的結合タンパク質が存在する可能性
が示唆される（Tellingら、Cell 83:79〜90、1995）。現在、ヒトプリオン疾患
の高感度の診断のための検査法は市場に出ておらず、治療のための治療法は存在
しない。

【０００７】発明の概要一般に、本発明は、実質的に純粋なプリオンタンパク質結合タンパク質（PrPB
P）を特徴とする。これらのタンパク質は、飽和可能かつ置換可能な様式でプリ
オンタンパク質（PrP）と結合することを特徴とする。好ましくは、結合は高親
和性でもあり、適当な機能的シグナル（例えば、細胞増殖の阻害、または細胞死
レベルの増強）の生成をもたらす。2つのPrPBPが以下に示され、マウス細胞から
単離されるこれらのタンパク質は、細胞表面タンパク質である。これらのPrPBP
をコードする遺伝子のクローニング及び特徴決定が、本明細書に記載される。他
の好ましいPrPBPは、任意の生物に由来する細胞試料または組織試料から単離さ
れうるが、哺乳動物、特にヒト及び任意の家畜またはペットの種が好ましい起源
である。

【０００８】 PrPBPをコードする精製された核酸；それらの核酸を含有するベクター及び細
胞；PrPBPと特異的に結合する抗体；並びに細胞における発現のため位置するPrP
BPをコードするDNAで形質転換された細胞を提供する段階と、DNAを発現させるた
めの条件下で形質転換細胞を培養する段階と、組換えPrPBPを回収する段階とを
含む組換えPrPBPを作製する方法もまた、本発明に含まれる。

【０００９】そのようなPrPBPは、プリオン関連疾患及び非プリオン関連疾患、例えば筋ジ
ストロフィーのような変性症候群、及び異常な細胞増殖または異常な細胞死を含
む障害の検出及び治療のため有用である。これらのPrPBPは、プリオンタンパク
質を含有することが既知であるか、またはそのように推測される試料の除染のた
めにも有用である。

【００１０】もう一つの局面において、本発明は、PrP部分とアルカリホスファターゼ部分
とを有する融合タンパク質も含む。好ましくは、このタンパク質には、PrPドメ
インの結合的及び機能的な能力が完全に維持されている。そのようなPrP-AP融合
タンパク質は、細胞、組織、体液、またはその他の生物試料中のPrPBPまたはPrP^Sc の標識、検出、または同定のための有用なアフィニティ試薬を提供する。

【００１１】さらに、PrP-AP融合タンパク質は、細胞試料中のPrPBPタンパク質の同定及び
アフィニティ精製を容易にし、PrPBPコード配列のクローニングも容易にする。
本発明に係る一つの特定の方法においては、最小限のバックグラウンド表面PrPB
Pを発現するカエル卵母細胞に、cDNAのライブラリープールまたはクローンから
インビトロ転写されたmRNAを注入し、PrP-AP融合タンパク質と接触させ、PrP-AP
が結合するタンパク質を発現する細胞を同定し、それにより、PrPBPをコードす
るcDNAクローンを明確に同定することができる。それらの細胞からcDNAを精製す
ることにより、PrPBPコード配列が容易に回収されうる。

【００１２】関連した局面において、本発明は、生物試料中のPrP^Scを検出するための方法
及びキットを特徴とする。好ましい態様において、本方法には、（a）生物試料
とPrPBPまたはその断片もしくは類似体とを接触させる段階；及び（b）PrP特異
的（即ち、PrP^CまたはPrP^Scのいずれかと特異的に結合する抗体）またはPrP^Sc特
異的のいずれかでありうる二次PrP抗体を使用して、PrPBPと該生物試料中のPrP^S ^c との複合体形成を検出する段階が含まれる。PrP特異的抗体を使用する場合には
、PrP^C対照からの閾値シグナルを確立し、この閾値を越えるシグナルを、PrP^Sc
陽性試料の指標とする。PrP^Sc特異的抗体を使用する場合には、PrP^Sc陽性試料は
陽性シグナルを生じるが、正常対照はバックグラウンドシグナルしか示さないた
め、この対照段階は不要である。

【００１３】生物試料中のPrP^Scを検出するためのもう一つの好ましい態様においては、（a
）生物試料とPrPBPとを接触させる段階；（b）（例えば、タンパク質分解により
）生物試料中のPrP^Cを破壊する段階；及びc）PrPBPと生物試料中のPrP^Scとの複
合体形成を検出する段階が含まれる。そのような複合体形成の検出は、生物試料
中のPrP^Scの存在の指標として扱われる。検出アッセイ法において使用されるPrP
BPは、融合タンパク質（例えば、PrPBP-AP）、またはPrP^Scと結合するPrPBPの断
片もしくは類似体でありうる。好ましい態様において、複合体形成は、直接標識
されたPrPBP（または、その断片もしくは類似体）を使用して検出される。もう
一つの好ましい態様において、複合体形成は、例えばPrPBP（または、その断片
もしくは類似体）に対する抗体を使用することにより、間接的に検出される。さ
らにもう一つの態様において、PrP^Scの検出は、生物試料中に存在する非標識PrP^Sc によるPrPBPP: PrP^Sc複合体内の標識PrP^Scの置換を測定することにより決定さ
れる。または、生物試料中のPrP^Scは、（a）限定された量の標識PrP（例えば、P
rP-AP、コンフォメーション依存的PrP-アルカリホスファターゼ融合タンパク質
）の存在下で生物試料とPrPBPとを接触させる段階；（b）（例えば、タンパク質
分解により）生物試料中のPrP^Cを破壊する段階；及び（c）生物試料中の非標識P
rP^ScによるPrPBP複合体からの標識PrPの置換を検出する段階により検出されうる
。そのような置換の検出（即ち、PrP^Sc-PrPBP複合体形成の検出）は、生物試料
中のPrP^Scの存在の指標として扱われる。

【００１４】もう一つの関連する局面において、本発明は、生物試料からPrP^Scを除染する
ための方法及びキットを特徴とする。好ましい態様において、本方法は、（a）P
rPBP：PrP^Sc複合体形成の形成が許容されるよう、十分な時間、PrPBP（または、
その断片もしくは類似体）またはPrPBP融合タンパク質により生物試料を処理す
る段階；及び（b）生物試料からPrPBP：PrP^Sc複合体を回収する段階を含む。そ
のような除染法は、PrP^Scの除去または不活化のための、PrPBP（または、その断
片もしくは類似体）による生物試料（例えば、移植用に調製された細胞または臓
器）の灌流の使用も含む。

【００１５】もう一つの態様において、PrPBP（または、その断片）と結合したPrP^Scは、抗
PrP抗体により検出されうる。

【００１６】 PrP^Scと結合するPrPBPは、診断またはその他のアッセイ法においてPrP^Scを定
量するために使用されうる。

【００１７】あるPrPBPがPrP^Scと結合せず、代わりにPrP^Cとのみ結合する場合、そのPrPBP
は、PrP^Sc及びPrP^Cの両方を含有する試料からPrP^Cを除去するために使用されう
る。次いで、PrP^Sc及びPrP^Cの両方と結合する抗体が、試料中に残存しているPrP^Sc を検出するために使用されうる。

【００１８】さらにもう一つの関連する局面において、本発明は、動物（例えば、ヒト）に
おけるプリオン疾患を治療または予防する方法を特徴とする。好ましい態様にお
いて、本方法は、PrPBP: PrP^Sc複合体形成と拮抗するか、PrP^CからPrP^Scへの変
換を遮断するか、またはPrPBP: PrP^Sc複合体により媒介される生物学的活性を阻
害する、治療的に有効量の化合物を動物へ投与することを含む。さらにもう一つ
の好ましい態様において、本方法は、PrP^CからPrP^Scへの変換に拮抗する治療的
に有効量の化合物を動物へ投与することを含む。

【００１９】もう一つの治療法において、本発明は、動物におけるPrPBP: PrP^Sc複合体によ
り媒介される生物学的活性を抑制する方法を特徴とする。好ましい態様において
、本方法は、PrPBP: PrP^Sc複合体相互作用を阻害する化合物（例えば、PrPBPに
対する抗体、PrPBP、またはその断片もしくは類似体）を、動物へ投与すること
を含む。さらに、PrPBPによる処理は、PrP^CとPrP^Scとの相互作用を予防すること
により、体内の細胞毒性シグナルの生成を遮断しうる。

【００２０】もう一つの局面において、本発明は、PrPBP（または、その断片もしくは類似
体）とPrPとの結合相互作用を減少させる能力について化合物を同定する方法を
特徴とする。好ましい態様において、本方法は、（a）化合物とPrPBP及びPrPと
を混合する段階；（b）化合物の存在下でPrPBPとPrPとの結合を測定する段階；
並びに（c）化合物が、対照試料と比して、PrPBPとPrPとの結合を減少させるか
否かを同定する段階を含む。

【００２１】もう一つの治療法において、本発明は、PrPBPの機能的活性化を抑制すること
により、神経変性性症候群を治療する方法を特徴とする。好ましい態様において
、本方法は、PrPBPからの細胞内シグナルの生成を遮断または増強する化合物、
例えば低分子のアンタゴニストもしくはアゴニスト、ペプチド、またはペプチド
模倣体（peptidomimetic）を動物へ投与することを含む。

【００２２】ある種の疾患、例えば、神経変性疾患、癌、及び免疫学的障害は、PrPBPであ
るカドヘリンとPrP^Cとの相互作用を増加または減少させる分子を投与することに
より治療されうる。例えば、カドヘリンの全部またはPrP結合部分が、内因性カ
ドヘリンとPrP^Cとの相互作用を妨害するために使用されうる。さらに、神経変性
疾患、癌、及び免疫学的障害の治療にとって有用な化合物は、選択された試験化
合物が、カドヘリンとPrP^Cとの結合を増加または減少させるか否かを決定するこ
とにより同定されうる。

【００２３】「プリオン結合タンパク質」または「PrPBP」とは、飽和可能かつ置換可能な
様式で「プリオンタンパク質」または「PrP」と結合する任意のタンパク質を意
味する。好ましくは、この結合はまた、通常の生理学的条件下で「高親和性」で
あり、かつコンフォメーション依存的である。本発明に係るPrPBPは、好ましく
は、それらの通常の細胞内存在時間の少なくとも一部にわたり、細胞表面に存在
するが、その時間の全部または一部にわたり、宿主細胞の細胞質、細胞質小器官
、または核に天然に存在してもよい（または存在するよう操作されていてもよい
）。PrPBPは、特定の細胞、組織、または臓器に、タンパク質ファミリーとして
存在してもよく、任意の生物（特に、ヒト、または家畜、例えばヒツジ、ウシ、
ネコ、及びヤギのような哺乳動物）に由来するPrPBPが、本発明に含まれる。

【００２４】「高親和性」とは、100μM未満、10μM未満、1μM未満、100nM未満、好ましく
は10nM未満、より好ましくは2nMまたはさらには1nM未満の（プリオンタンパク質
とPrPBPとの）親和性定数を意味する。

【００２５】「飽和可能な」結合とは、ある一定の最大レベルに達した後、増加が停止する
（プリオンタンパク質とPrPBPとの）結合を意味する。それは、タンパク質のう
ちの1つの結合部位の数に限界があること、及びこれらの結合部位が特異的であ
ることを示している。これは、非特異的に細胞表面と接着するタンパク質に特徴
的な、非特異的な、継続的に増加する結合とは対照的である。

【００２６】「コンフォメーション依存的な結合」とは、正常な生理学的結合特徴が完全に
維持されるよう、適切に翻訳後修飾され、折り畳まれ、輸送された非変性タンパ
ク質において起こる結合を意味する。

【００２７】「競合的」結合とは、非標識型のタンパク質のうちの1つ（例えば、PrP）の濃
度を増加させることにより漸進的に阻害される（プリオンタンパク質とPrPBPと
の）結合を意味する。

【００２８】「プリオン疾患」とは、急速に進行する致命的な治療不可能な脳変性障害の群
であり、ヒトのクロイツフェルト-ヤコブ病（CJD）、クールー、ゲルストマン-
シュトロイスラー（Gerstmann-Straussler）症候群、及び致命的家族性不眠症（
Prusiner、Science 252:1515〜1522、1991）、ヒツジ及びヤギのスクレイピー、
並びにウシ海綿状脳症を含み、最近記載されたその他の反芻動物及びネコのプリ
オン疾患も含むが、これらに限定されることはない。

【００２９】「プリオン疾患の治療」とは、プリオン疾患と関連した任意の症状、特に海綿
状変化、ニューロン細胞損失、星状膠細胞増殖、PrP^Scタンパク質の蓄積、痴呆
、及び死亡を引き起こすものを減少させるか、予防するか、またはそれらの開始
を遅延させる能力を意味する。

【００３０】「実質的に純粋な」とは、少なくとも60重量（乾燥重量）％が対象となる化合
物である調製物を意味する。好ましくは、調製物は、少なくとも75重量％、より
好ましくは少なくとも90重量％、最も好ましくは99重量％が対象となる化合物で
ある。純度は、任意の適切な方法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動また
はHPLC分析により測定されうる。

【００３１】「精製されたDNA」とは、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおい
て直接連続しているコード配列（5'末端上に1個及び3'末端上に1個）の両方と直
接連続していないDNAを意味する。従って、その用語は、例えば、ベクター；自
律複製性のプラスミドもしくはウイルス；または原核生物もしくは真核生物のゲ
ノムDNAへ組み込まれている組換えDNA、または他の配列と無関係な別個の分子（
例えば、PCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により作製されたcDNAもしく
はゲノムDNA断片）として存在する組換えDNAを含む。それは、付加的なポリペプ
チド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも含む。「形
質転換された細胞」とは、組換えDNA技術により、（本明細書において使用され
るように）PrPBPをコードするDNA分子が導入されている細胞（またはそのような
細胞の子孫）を意味する。

【００３２】「発現のため位置している」とは、DNA分子が、配列の転写及び翻訳を指図す
る（即ち、例えばPrPBPの産生を容易にする）DNA配列と近接して位置しているこ
とを意味する。

【００３３】「精製された抗体」とは、それが天然に会合しているタンパク質及び天然に存
在する有機分子が排除されている、少なくとも60重量％の抗体を意味する。好ま
しくは、調製物は、少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも90重量％、
最も好ましくは少なくとも99重量％が抗体、例えばPrPBP特異的抗体である。精
製されたPrPBP抗体は、例えば、組換え作製されたPrPBPを使用したアフィニティ
クロマトグラフィ及び標準的な技術により入手されうる。

【００３４】「特異的に結合する」とは、PrPBPを認識し、それと結合するが、天然にPrPBP
を含んでいる試料、例えば生物試料中の他の分子を認識し、それと結合すること
は実質的にない抗体を意味する。

【００３５】「アルカリホスファターゼ」とは、検出可能なシグナルを生成させることがで
きるアルカリホスファターゼタンパク質の任意の部分を意味する。

【００３６】前述のように、本発明は、プリオン疾患の診断及び治療のための2つの極めて
重要な進歩を提供する。第一に、本発明は、PrPBPを同定し単離するため、そし
てこれらのPrPBPをコードする遺伝子またはcDNAをクローニングするために使用
されうるPrP融合タンパク質を提供する。特に、一つの好ましいPrP融合タンパク
質は、アルカリホスファターゼ融合を使用する。このPrP-APタンパク質は、多数
の利点を有する。例えば、PrP-APタンパク質は、PrPBPとの結合（特に、高親和
性の結合）にとって必要でありうるPrPの正常な構造への影響を最小限にすると
いう利点を有する。また、PrP-AP融合体は、従来のPrP発現構築物よりも優れた
利点である、正常な細胞性PrP機能を誘発する能力を保持している。おそらく最
も重要なこととして、本発明のPrP-AP融合タンパク質は、PrPBPと特異的に、か
つ高親和性で結合することができる。従って、この融合タンパク質は、組織起源
からPrPBPを分離または単離するための有用なアフィニティ試薬を提供する。こ
れは、新規なPrPBPを同定するための手段を提供し、且つタンパク質微量配列決
定のため、及びcDNA配列またはゲノム配列のクローニングのための（例えば、ゲ
ル上の新規タンパク質バンドとして）これらのタンパク質の迅速な精製を許容す
るため、有利である。一つの特定の技術において、PrP-AP融合タンパク質は、cD
NAライブラリーからインビトロ転写されたmRNAを微量注入したカエル卵母細胞を
スクリーニングし、融合タンパク質との特異的結合を示すクローンを選択するこ
とによる、新規PrPBPの同定及びクローニングのため使用されうる。このPrPBPス
クリーニングの方法は、通常は細胞において極めて低いレベルで発現しているPr
PBP、または通常はPrP-AP結合に接近不可能であるかもしれないPrPBPの同定を許
容するため、有利である。さらに、PrP-AP融合タンパク質は、容易に測定可能な
酵素であるアルカリホスファターゼを含むため、この融合タンパク質は、実験的
または診断的な条件下でのPrPBPの定量及び可視化のための有用なツールを提供
する。

【００３７】もう一つの重要な局面において、本発明は、初めて、飽和可能かつ置換可能な
様式でプリオンタンパク質と結合するプリオンタンパク質結合タンパク質を提供
する。そのようなPrPBPは、多数の利点を有する。第一に、これらのタンパク質
はPrPと特異的に結合するため、検出可能マーカーで標識され、細胞、組織、ま
たは生物学的体液の中のPrP^Scの存在についてアッセイするための容易な手段を
提供しうる。また、これらのタンパク質は、標識された場合、PrPと結合する他
の薬剤の同定のための薬物スクリーニングプロトコール（例えば、競合的結合ア
ッセイ法）において使用されうる。また、PrP^Scとの特異的かつ飽和可能な結合
親和性のため、PrPBPは、二次的な分離技術によりPrP^Scを除去することによる、
または体内のPrP^Scの動員活性を中和することによる、感染した細胞、組織、ま
たは生物学的体液の治療のための優れた候補を提供する。PrPBPは、また、プリ
オン疾患に罹患した患者を治療するために使用され得るという点でも有利である
。例えば、PrPBP、それらのペプチド断片、または類似体は、体内へ注入された
場合、いずれかのプリオンタンパク質と結合することにより、PrP^CからPrP^Scへ
の変換を予防するために使用されうる。

【００３８】前記利点に加え、本明細書において同定されたPrPBPのうちの少なくとも1個は
、種選択的でなく、ヒト、マウス、及びウシを含む多数の異なる種に由来するPr
Pと結合することが示されている。本明細書に記載されたPrPBPが様々な種に由来
するPrPと結合するのは、PrPBPとの結合を担っているPrPエピトープが、高度に
保存されていることが示されているアミノ末端配列に由来するという事実による
可能性が高い。

【００３９】本発明のその他の特徴及び利点は、記載された説明及び特許請求の範囲より明
らかになると思われる。

【００４０】詳細な説明 PrP-AP融合タンパク質は、PrPBPのマーカーおよび「アフィニティー試薬」と
して働くように構築した。新規PrPBPは選択したマウス細胞株の表面上で検出し
た。これらのPrPBPは、PrP-AP融合タンパク質のPrP部分と高親和性で、競合的、
飽和的でコンフォメーション依存的に結合した。

【００４１】PrP結合タンパク質検出系の開発 PrPBP検出系を開発するために、プリオンタンパク質およびアルカリホスファ
ターゼ部分を含む可溶性組換え融合タンパク質（PrP-APと命名する）は、選択し
たヒト胎盤熱安定性APのインフレームでのマウスPrP遺伝子から構築した（図1A
）。マウスPrP断片(Lochtら、PNAS 83: 6372〜6、1986; GenBankアクセッション
番号M13685)はマウス脳cDNAから標準的なPCRによって作製し、開始メチオニン（
従ってPrPリーダー配列を含有する）からGPIアンカー結合シグナル配列の開始部
のArg²²⁹（従ってGPIアンカーの結合を除去する）までのオープンリーディング
フレーム全体を含んだ。この配列を増幅するために使用したPCRプライマーを以
下に示す：これらのプライマーは、カセット挿入部位の下流にAP遺伝子を含有するAPtag-2
発現ベクター(ChengおよびFlanagan、Cell 79: 157〜168、1994)のHinfIII-BglI
I部位へ後にライゲーションするために適当な制限酵素切断部位（フォワード：H
indIII、リバース：BamHI）を含有するように設計された。PCR産物がこのベクタ
ーにライゲーションされると、BamHI-BglII結合が融合タンパク質のプリオン部
分とアルカリホスファターゼ部分の間にGly-Ser-Ser-Glyリンカーを生じる。APt
ag-2発現ベクターはSV40複製起点およびCMVプロモーターを含有し、COS細胞にお
けるベクター増幅および高レベルの融合タンパク質産生を可能にする。融合タン
パク質のAP部分のみへのタンパク質結合の可能性を検出するために、CMVプロモ
ーターおよびSV40起点を含有するpCDNA1ベクター(Invitrogen, San Diego, CA)
に由来する、それ自身のリーダー配列を有するAPが発現され、CMV/SEAPと命名さ
れた（図1B）。

【００４２】PrP-AP融合タンパク質はPrP^cおよびAPの免疫学的決定基を含有する COS細胞は、標準的なDEAE-デキストラン技法によってPrP-AP融合タンパク質ベ
クターまたはCMV/SEAPベクターのいずれかをトランスフェクトされた。予測され
るように、³⁵[S]-メチオニンと共にインキュベーションし、標準的な技法により
（「抗体実験マニュアル（Antibodies, A Laboratory Manual）」Harlow & Lane
、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY、1988）、APモノ
クローナル抗体(MIA 1801, ヒト胎盤；Medix Biotech, San Carlos, CA;レーン3
)で免疫沈降させたPrP-AP-トランスフェクトCOS細胞上清（図2、レーン3および4
）はAPの存在およびPrP-APベクターの設計に一致する97 kDの顕著なバンドを示
した。同じ上清とPrPウサギポリクローナル抗体(Bendheimら、Nature 310: 418
〜21、1984;レーン4)との免疫沈降でも、97 kDのバンドを生じ、PrP-AP-トラン
スフェクトCOS細胞は、APおよびPrP抗体両方に免疫反応性である97 kDタンパク
質を分泌したことを示した。予測されるように、³⁵[S]-メチオニンと共にインキ
ュベーションし、上記のように（レーン1）抗AP抗体で免疫沈降させたCMV/SEAP-
トランスフェクトCOS細胞上清（図2、レーン1および2）は、APの分子量および免
疫反応性に一致する67 kDタンパク質を示した。これらの同じCOS細胞上清を、Pr
Pに対するポリクローナル抗体で免疫沈降すると、67 kDタンパク質は検出されず
、CMV/SEAPタンパク質内にプリオン部分が存在しないことが示された。

【００４３】 PrP-APおよびAPは、上清1mlあたり約5 μgの濃度でトランスフェクトしたCOS
細胞によって発現および分泌され、共に同様の上清AP活性を示した(ChenおよびF
lanagan、Cell 79: 157〜168、994に記載されているように測定した)。トランス
フェクトされていないCOS細胞およびmock-トランスフェクトCOS細胞の上清は検
出可能なAP活性または免疫検出可能なPrP^cを含有しなかった。このデータは、Pr
P-AP結合タンパク質の分布、機能および分子的なアイデンティティーを決定する
ために使用したPrP-AP「アフィニティー試薬」の構築および発現の成功を実証し
た。

【００４４】選択した細胞株の表面のPrPBPの検出 PrP-APタンパク質が細胞のPrPBPを検出することができるかどうかを判定する
ために、マウス、ヒト、霊長類および神経/神経芽細胞腫細胞系から誘導したも
のを含むいくつかの異なる細胞株を60 mmプレートで集密化するまで（約100,000
細胞）DMEM/10%ウシ胎児血清(FCS)と共に培養した。これらの細胞をリン酸緩衝
生理食塩液(PBS)で洗浄し、PrP-AP融合タンパク質もしくはCMV/SEAPタンパク質
（すなわち、PrP部分を欠損する）をDMEM/5%FCSに加えたものを含有する3mlのCO
S細胞上清またはmock-トランスフェクトCOS細胞の馴化培地(conditioned media)
と共に室温において75〜90分間インキュベーションした。PrP-AP-トランスフェ
クト細胞上清は平均500 OD単位/時間のAP活性を発現し(ChengおよびFlanagan（
上記)）、約5 μg/mlのPrP-AP融合タンパク質の存在を示した。その後、細胞を
洗浄し、溶解し、65℃において10分間加熱して内因性ホスファターゼを不活性化
し、上記のようにPrP-APの熱安定性アルカリホスファターゼ活性を測定した。特
に、AP活性は、ELISAリーダー(EAR 400 AT Easy Reader, SLT Instruments, Aus
tria)によって405 nmにおいて測定したとき、p-ニトロフェニルホスフェートの
黄色産物への変換によって測定した。

【００４５】 3種の異なるマウス細胞株から得られた結果を図3に例示する。NIH 3T3およびL
929細胞は胎仔線維芽細胞由来であり、G8細胞は筋芽細胞腫（筋系統）である。

【００４６】ヒト神経芽細胞腫株SK-N-SHおよびSK-N-MC並びに神経膠腫細胞株U87およびU37
3、ヒト腎内皮(HEK)細胞、霊長類COS細胞、マウスおよびヒト末梢リンパ球、並
びにマウスおよびヒト解離性脳細胞も陽性である。PrPBPは実際には偏在的であ
り、種制限的な結合を示すとは思われない。しかし、それらは末梢赤血球および
アフリカツメガエル卵母細胞から欠損している。

【００４７】 PrP-AP-トランスフェクトCOS細胞の上清から誘導したPrP-AP融合タンパク質と
共にインキュベーションした場合に、熱処理したG8、NIH 3T3およびL929細胞株
において高レベルのAP活性が検出された（図3の「prpap」）。この結果は、PrPB
PはG8、NIH 3T3およびL929細胞型の表面に大量に存在して、PrP-AP融合タンパク
質由来のPrPと高親和性で結合することができることを示している。これらのマ
ウス細胞株をmock-トランスフェクトCOS細胞上清に由来する馴化培地と共にイン
キュベーションしたとき、AP活性はほとんどまたは全く検出されなかった（すな
わち、PrP-AP融合タンパク質が存在しない場合、図3の「対照」を参照）。また
、これらの細胞株をCMV/SEAP-トランスフェクトCOS細胞の上清と共にインキュベ
ーションした場合に、AP活性はほとんどまたは全く検出されなかった。これは、
G8、NIH 3T3およびL929細胞株においてAP活性の増加が検出されることは特異的
なPrPBPの検出によるものであり、PrP-AP融合タンパク質のAP部分だけへの他の
タンパク質の結合によらないことを示している。これらの実験において、SEAPお
よびPrP-AP上清は等しいアルカリホスファターゼ活性(1時間あたり〜500 OD単位
／時間)を含有した。筋細胞が高レベルのPrPBPを発現したという事実は、PrP^cを
過剰発現するトランスジェニック動物における選択的な脆弱性に一致している(W
estawayら、Cell 76: 117〜129、1994)。

【００４８】異なる技法を使用してPrPBPを検出し、それらの細胞内局在化を測定するため
に、懸濁状態の細胞をPrP-AP融合タンパク質で標識し、間接的免疫蛍光アッセイ
法を使用した。プロテアーゼを使用しないで細胞を機械的に分離し、ハンクス液
（Hank's Buffered Salt solution：HBSS)中で粉砕し、PrP-APまたはAPタンパク
質と共に60分間室温においてインキュベーションし、氷冷HBSSで3回洗浄し、次
いで抗APモノクローナル抗体(MIA 1801、ヒト胎盤、Medix Biotech, San Carlos
, CA)と共に氷上で30分間インキュベーションした。その後、細胞を4℃において
維持し、再度洗浄し、フルオレセインイソチオシアネートに結合したヤギ抗マウ
スIgG(Jackson Immunoresearch, Philadelphia, PA)と共にインキュベーション
し、洗浄し、蛍光顕微鏡(Orthoplan fluorescence microscope)またはフローサ
イトメトリー(Facscan; Becton Dickinson, Oakville, Ontario, Canada)によっ
て調査した。

【００４９】 G8細胞（マウス筋細胞株）の蛍光顕微鏡の結果を図4に例示する。細胞表面の
明らかな標識化がPrP-APタンパク質と共にインキュベーションしたG8細胞におい
て検出されたが（図4、左側のパネル）、APタンパク質単独の場合には検出され
なかった（図4、右側のパネル）。これらの結果は、特異的なマウスPrPBPがG8細
胞の細胞表面に存在することを示した。COS細胞、NIH 3T3およびL929細胞を含む
他の細胞株はG8について記載するものと同様の結果を示した。

【００５０】 N末端の10〜20アミノ酸を欠損するPrP-AP調製物（偶発性タンパク質分解によ
る）は細胞表面に結合せず、受容体への結合にPrP N末端を必要としている。こ
の所見はペプチド競合実験によって裏付けられた（以下参照）。

【００５１】 G8および他の細胞株の表面のPrPBPに結合しているPrP部分を同定するために、
上記のものと等価であるが、PrPタンパク質の選択されたドメインに特異的であ
る遮断性ドメイン抗体の存在下において実験を行う。この目的に有用な特定の遮
断性ドメイン抗体には、例えば、PrPカルボキシル末端に特異的な抗体（「タン
パク質X」によって種特異的な結合を決定すると仮定；Tellingら、Cell 83: 79
〜80、1995）、中央のコドン領域96〜176位に特異的な抗体（PrP^cからPrP^Scへの
認識-変換およびPrP^cペプチドのアポトーシス特性に重要であると仮定；Forloni
ら、Nature 362: 543〜546)およびアミノ末端オクタペプチド反復領域（家族性C
JDに主に出現する；Prusiner、Ann. Rev. Microbiol. 48: 655〜686、1994）の
抗体が挙げられる。次いで結合ドメインの構造的な特徴およびアミノ酸配列を利
用して、PrPBPに高親和性で結合する他の化合物を開発する。

【００５２】 EDTAおよびEGTAに対して透析したPrP-APは細胞表面への結合を示さず、これは
1mMの硫酸銅の添加によって回復した。N末端の10〜20アミノ酸を欠損するPrP-AP
調製物にCuSO₄を添加しても、銅結合に関与するオクタペプチドドメインが保持
されていても細胞表面結合を回復しなかった。これらのデータは、結合反応が銅
自体によって媒介されるのではなく、結合を容易にするためのPrPのN末端の銅誘
導性のなんらかの構造変化によって媒介されることを示唆した。

【００５３】 PrP-APはグリコシル-ホスファチジルイノシトール変異細胞JY5(表面PrP^cを欠
損する)に、JY25細胞（細胞細胞表面PrP^cを保有する）に対するのと同様に等し
く結合する。従って、PrP^cが同種（自己-自己）結合に関与する場合には、これ
はPrP-APの細胞表面受容体だけではありえない。

【００５４】PrPBP結合の特徴付け PrPBPが競合的にPrPに結合するかどうかを判定するために、³⁵[S]-標識PrP-AP
を、PrP-AP結合活性を以前に示した細胞株で評価した。35 mmの培養皿で集密化
するまで増殖した細胞を、以前に記載したように、予め³⁵[S]-メチオニンを代謝
的に標識しておいたPrP-AP融合タンパク質をトランスフェクトしたCOS細胞の上
清と共にインキュベーションした。その後、細胞を洗浄し、溶解し、β-カウン
ト法により結合放射活性を定量した。

【００５５】 NIH 3T3細胞の結果を図5に示す。³⁵[S]-標識PrP-APとPrPBPとの結合は、非標
識PrP-APの濃度を増加させてインキュベーションすることによって阻害され、非
標識PrPによる標識PrPの競合的な置換を実証している。さらに、PrPBPへの結合
（³⁵[S]-標識PrP-APによる）はCMV/SEAP融合タンパク質由来のAPの濃度を増加さ
せてインキュベーションしても阻害されず、これは結合が融合タンパク質のPrP
部分を介して生じており、AP部分を介していないことを示している。

【００５６】 PrPBPとPrPの結合親和性並びに所定の細胞集団に存在する総結合部位数を測定
するために、G8細胞を使用してChengおよびFlanagan(Cell 79: 157〜168, 1994)
の技法の改良法によりScathard分析を実施した。PrP-APおよびCMV/SEAPをトラン
スフェクトしたCOS細胞の上清をアミコン限外濾過細胞（Amicon ultrafiltratio
n cell）中で濃縮し、次にHBHA緩衝液(0.5mg/mlのBSA、0.1 % NaN₃、20 mMのHEP
ES(pH 7.0)を添加したハンクス液)で連続希釈を行った。一連のリガンド希釈液
と共に平衡インキュベーションした後、細胞をHBHAですみずみまで洗浄し、溶解
し、上記のように結合AP活性について熱量的にアッセイした。結合PrP-APおよび
総PrP-APをK_dアフィニティー検討のために測定した；B_max測定値（細胞あたりの
結合部位数）はAPの比活性（1 pmolのPrP-APはアッセイ条件およびインキュベー
ション期間下において約3 OD単位に相当する）から算出した。コンピュータプロ
グラムLIGANDを使用してScatchardデータをプロットし、解析した。G8細胞は〜1
×10⁵PrP-AP結合部位を有し、解離定数(K_d)は1.48×10^-9M〜25×10^-9Mの範囲で
あることが見いだされた。この高親和性の結合は特異的な受容体-リガンド相互
作用に一致している。

【００５７】 PrPのコンフォメーションがPrPBPへの高親和性結合に重要であるかどうかを判
定するために、³⁵[S]-標識PrP-APを100℃において5分間煮沸して、そのコンフォ
メーションを破壊した。この処理は完全にNIH 3T3細胞への結合をなくし、PrPタ
ンパク質のコンフォメーションがPrPBPへの高親和性結合にとって重要であるこ
とを示した。

【００５８】PrPのPrPBPとの結合は、細胞増殖および生存度に影響を与えるものなどの生理的シグナルを伝達する PrPBPの生理学的機能を測定するために、PrPBPを有することが既知なG8筋肉細
胞株をPrP-APまたはAPタンパク質と共にインキュベーションし、細胞増殖を測定
した。24ウェルプレート中の姉妹G8培養物を、25% v/vのPrP-APまたはAPを含有
するCOS細胞中で3日間インキュベーションした。2つの発現タンパク質と共に3日
間インキュベーションした後、8倍視野で培養ウェル中の細胞を計数した。結果
は、G8筋原細胞株の自然増殖は、AP単独(283±24.5細胞；p=0.002、マン・ホイ
ットニーのノンパラメトリック検定法)と比較して、PrP-AP(64±9.8SEM細胞)の
存在下では抑制されることを示した。

【００５９】質的には、PrP-APに暴露したG8細胞培養物はAP暴露培養物より小型で相が暗く
(phase dark)非結合の細胞が多いと思われ、増殖の減少は細胞死の増加によるこ
とが示唆された（図6）。PrP-APに暴露したG8細胞培養物に観察された細胞数の
低下は、PrPBPとPrP-APとの結合が、細胞増殖を阻害するまたは細胞死を促進す
るシグナルを伝達することを強く示唆している。

【００６０】PrPBPの特徴付け上記のPrPBPが実際にタンパク質であることを明らかにするために、姉妹NIH 3
T3細胞培養物を0.25%トリプシンの存在下または非存在下においてカルシウム不
含HBSS中で室温において30分インキュベーションし、その後PrP-APとインキュベ
ーションし、先に記載したように結合AP活性の熱量的評価を実施した。この比較
的軽度なタンパク質分解は表面PrP-AP結合をバックグラウンドレベルまで完全に
除くのに十分であった(対応のあるt検定によりP<0.001)。これらの結果は、PrPB
Pが実際にタンパク質であるか、または少なくともタンパク質骨格に存在すると
いう知見に一致していた。

【００６１】ライブラリーの作製 2種類のpcDNA3.1プラスミドライブラリーを以下のようにG8細胞から作製した
。総RNAはTRIzol(GIBCO BRL)を用いて抽出し、ポリA⁺mRNAはオリゴテックス（Ol
igotex）dT(Qiagen)を使用して単離した。2本鎖cDNAの合成は、dTまたはランダ
ムヘキサマープライマーを用いたタイムセイバー（Time Saver）cDNAキット(Pha
rmacia)を使用して実施した。次いで、cDNAをT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化
し、Bam HIオリゴで調整し、S-500カラム（Pharmacia）でサイズ分画した。次い
で、サイズ選択したcDNAをpcDNAaにライゲーションし、このライブラリーを標準
的な技法によって高効率コンピテント大腸菌(E. coli)細胞(Invitrogen)にエレ
クトロポレーションした。

【００６２】プラスミドの作製、インビトロにおける転写およびマイクロインジェクション両pcDNA3.1プラスミドライブラリーは約0.5×10⁶の独立クローンを含んだ。Pr
PリガンドのmRNA量は「中の下」（転写物の0.01%の範囲）であり、適切な配向の
全長cDNAが細胞の対応するmRNAの約1/10の頻度でpCDNA3にうまくクローニングさ
れたと仮定して、本発明者らは、1つの陽性クローンを同定するためには1-5×10⁵ クローンを調査しなければならないだろうと控えめに推定した。ライブラリー
を大腸菌(E. coli)中で増幅して各々1,500〜2,000クローンのプールを得た。個
々のプールをレプリカプレートにして、一方のフィルターを増殖させてプラスミ
ドDNAを作製するために使用し、他方を保存した。プールからのプラスミドはプ
ラスミドMIDIキット（Qiagen）を用いて作製し、mRNAをインビトロで転写し、mM
essage mMachine(Ambion, Austin TX)を使用してプールから作製した。アフリカ
ツメガエル卵母細胞は先に記載されているように調製し（Seguela P.ら、J. Neu
rosci. 16: 448〜455、1996）、ナノリッターインジェクター(World Precision
Instruments)を用いて卵母細胞あたり50 nL（75〜125 ngのmRNA）をマイクロイ
ンジェクションした。

【００６３】PrP-BPsのクローニングおよび特徴付け本発明者らは、10〜20卵母細胞は、PrP-AP結合を容易に検出することができる
500,000個のG8細胞の膜領域を有すると推定した。卵母細胞は、室温においてPrP
-AP上清と共にインキュベーションすることによってインジェクションの48時間
後のPrPBP発現についてモニターした。次いで卵をHBHAで6回洗浄した。内因性細
胞ホスファターゼを不活性化するための均一な加熱を65℃の加熱用ブロック中で
実施した。結合AP活性は、0.33mg/ml NBTおよび0.17mg/ml BCIPをAP緩衝液（100
mM Tris-HCl、pH 9.5、100 mM NaCl、5 mM MgCl₂）に加えたものと共に0.5〜12
時間インキュベーションすることによって検出した。

【００６４】インジェクションシリーズの全てにおいて、ベクター(pcDNA3.1、Invitrogen)
単独をインジェクションした卵を含む陰性対照およびELF-1プラスミドクローン(
Changら、79: 157〜168、1994)から調製し、MEK-4-AP融合タンパク質を使用して
検出したmRNAをインジェクションした卵を含む陽性対照を含んだ。任意の有意な
PrP結合を示さなかった33プール（約660の個別のアフリカツメガエル卵母細胞を
含む）をスクリーニングすることにより、34番目のプールがPrP-AP結合に対して
陽性であることが見いだされた。以降のプールはPrP結合も陰性であった。適当
なストック細菌培養物の希釈物によって、約200個のcDNAクローンを各々含有す
る10個のプールにプール34を分画化した。1つの陽性クローンが単離されるまで
、これらのうち、最も高レベルのPrP結合を示すプールをさらに分画化するため
に選択した。結合活性について試験した32の個々のcDNAクローンのうち、クロー
ン6がバックグラウンドと比較して最も高いレベルのPrP-AP結合活性を示した。
クローン7は中程度のPrP-AP結合を示した。

【００６５】配列決定クローン6および7のcDNAインサートを標準的な方法を使用して配列決定した。

【００６６】相同性を検索するために、EMBLおよびGENBANK核酸データベースの最新版をBLA
STネットワークサーバー(National Library of Medicine)を使用して検索し、タ
ンパク質データベースをBLASTおよびBLITZネットワークサーバー(Heidelberg)の
両方を使用して調査した。

【００６７】クローン6のcDNAインサートはプロトカドヘリン-43の一部(プロトカドヘリン-
43のアミノ酸67〜252位)をコードした。クローン6のこの部分の核酸および推定
アミノ酸配列を図7Aおよび図7Bに示す。プロトカドヘリン-43はSanoら(EMBO J.
12: 2249〜2256、1993)によって記載されている。プロトカドヘリン-43の配列情
報は入手可能である：GENBANK L11373（プロトカドヘリン-43）。

【００６８】クローン7のcDNAインサートはOB-カドヘリン-1の一部（アミノ末端カドヘリン
反復）をコードした。OB-カドヘリン-1（カドヘリン11としても周知である）はO
kazakiら(J. Biol. Chem 269: 12092〜12098、1994)によって記載されている。O
B-カドヘリン-1の配列情報は入手可能である：DBJ D21253（マウスOB-カドヘリ
ン）（配列番号：7および配列番号：8）およびSwissProt P55287（ヒトOB-カド
ヘリン）（配列番号：9）。

【００６９】一次および二次スクリーニング基準を満足するクローンが同定されたら、一連
の実験を実施する。例えば、ハイブリダイゼーションするmRNA種のサイズを明ら
かにし、異なるサイズの多数の関連転写物が存在するかどうかを判定するために
ノーザンブロット分析を実施する。異なる細胞、器官、および種のノーザンブロ
ット、並びに異なる発育状態および疾患状態（特にマウススクレイピー）由来の
組織を使用するブロットは細胞の特異性およびPrPBPの調節に関する重要な情報
を提供する。細胞表面PrP-AP結合とPrPBP発現の矛盾は、PrPBPを可溶性の種とし
て発現する細胞もあることを示唆していると思われる。また、アミノ酸配列を使
用して、PrPBPに対する有用な抗体プローブの作製を容易にする免疫原性配列を
同定する。生理的に適当なPrPBPの配列を同定することにより、プリオン疾患お
よび他の神経変性疾患の理解をより深め、これらの疾患の治療法として相互作用
を遮断するまたはこの伝達分子を不活性化する低分子治療薬の開発を可能にする
数多くの検討も可能になる。

【００７０】別法において、PrP-APアフィニティーカラムおよび標準的なカラム精製技法を
使用してPrPBPタンパク質を精製することによってPrPBPをクローニングすること
ができる。有用なPrPBP源には組織、細胞または膜ホモジネートが含まれる。カ
ラム単離後、PrPBPを生化学的に特徴付け、分子量、pKおよびグリコシル化など
の特性についての情報を得る。また、タンパク質を微細配列決定し、データベー
ス検索および変性オリゴヌクレオチドを使用するcDNAクローニング並びにハイブ
リダイゼーションスクリーニングまたはPCR増幅の標準的な技法を容易にする。

【００７１】カドヘリンカドヘリンは、最初、組織の発生的形成および維持における細胞-細胞認識お
よび接着現象において、他の接着分子ファミリーのメンバー（インテグリン、免
疫グロブリンファミリー接着分子、およびセレクチンを含む）と協力する、カル
シウム依存的でホモフィリック(homophilic)な細胞-細胞接着分子として認識さ
れた。

【００７２】カドヘリンスーパーファミリーは、免疫グロブリン折り畳みのいくつかの三次
構造特徴を共有する反復ドメインに折り畳まれる、細胞外「カドヘリンモチーフ
」（約110アミノ酸を有する）の所有によって規定される異なる群のタンパク質
を含む。一方、カドヘリンの細胞質ドメインは顕著に異なり、一部にはこれらの
分子の広範に異なる機能を反映している。配列相同性分析は、カドヘリンスーパ
ーファミリーが少なくとも2つのサブファミリー、典型的なカドヘリンおよびプ
ロトカドヘリンと考えられることを示唆している。カドヘリンを4つの機能的な
サブグループ、典型的なカドヘリン、デスモソーム型カドヘリン、プロトカドヘ
リン、および他のカドヘリン関連タンパク質に分類されると総説している他の研
究者もいる（Suzuki, J. Cell. Biochem. 61: 531〜542、1996）。脳特異的なカ
ドヘリンの新たなファミリーが最近同定され、カドヘリン関連神経受容体(CNR)
と命名され、非受容体チロシンキナーゼfynを介してシグナル伝達する。

【００７３】最初に認識されたカドヘリンは、初期発生段階において分割球のカルシウム依
存的圧密を媒介することが見いだされているE-カドヘリンまたはウボモルリンで
あった。最初の典型的なカドヘリンは全てホモフィリックな接着分子で、5つの
細胞外カドヘリンドメインを有する。このグループ分けにはM-カドヘリン、N-カ
ドヘリン、P-カドヘリン、およびR-カドヘリンが含まれる。さらに最近発見され
た典型的なカドヘリン（サブファミリーを構成することもある）にはカドヘリン
5〜13が含まれる。これらの新たな異型の「典型的な」カドヘリンのいくつか（
カドヘリン5および8を含む）はL細胞にトランスフェクトされたときにホモフィ
リックな結合活性を示すとは思われないが、それらは細胞-細胞接触点において
カルシウム依存的な局在化を示し、ヘテロフィリック(heterophilic)なリガンド
の存在を示唆している(Suzuki, J. Cell. Biochem. 61: 531〜542、1996)。ホモ
フィリックな結合を示す典型的なカドヘリンでさえも、E-カドヘリンへのインテ
グリンαEβ7の結合(Cepek, Nature 372: 190〜193、1994)およびN-カドヘリン
への線維芽細胞増殖因子受容体結合によって示唆されているようにヘテロフィリ
ック(heterophilic)結合リガンドを有する可能性がある。

【００７４】カドヘリンの多数のヘテロフィリック(heterophilic)リガンドも同定しなけれ
ばならないと思われる。本発明者らは、検出試薬としてPrP-AP融合タンパク質お
よびカエル卵母細胞発現系を使用して、プリオンタンパク質がカドヘリンタンパ
ク質の新規リガンドとして作用することを実証した。

【００７５】典型的なカドヘリンの接着性で、特異性決定部位は、ほとんどのカドヘリンN
末端ドメイン、EC1に含有されていると言われている(Shapiroら、Nature 374: 3
27〜337、1995)。典型的なカドヘリンのほとんどの細胞質ドメインのC末端部は
十分に保存されており、カテニンへのそれらの結合を反映している(Ozawaら、19
90, Hiranoら、1992)。この規則の例外はT-カドヘリン（カドヘリン-13）および
カドヘリン-8のスプライシング変異体である。カドヘリン-13は膜貫通ドメイン
を有さないが、プリオンタンパク質と同様に、グリコシル-ホスファチジルイノ
シトール末端を介して細胞表面に固定され、カドヘリン8は、任意の種類の膜固
定を完全に欠損している可溶性アイソフォームとして細胞より分泌されうる(Suz
ukiら、1996)。

【００７６】プロトカドヘリンは、細胞外カドヘリンドメインの所有により典型的なカドヘ
リンとの相同性を有する大型で完全には特徴付けされていない群のタンパク質で
ある。しかし、特徴付けられたプロトカドヘリンは全て、典型的なカドヘリンの
EC3およびEC5ドメインと最も顕著な類似性を有する5つより多くのカドヘリンド
メインを有すると思われる(Sanoら、EMBO J., 12: 2249〜2256、1993)。従って
、典型的なカドヘリンのEC1結合モチーフはプロトカドヘリンに共有されない；
結果として、プロトカドヘリンのホモフィリックな接着活性はこのファミリーの
タンパク質の全ての既知のメンバーに共有されない。

【００７７】プロトカドヘリンはまた、典型的なカドヘリンのものとは異なる細胞質ドメイ
ンも有し、互いから、プロトカドヘリンの特殊化された機能的役割を示唆してい
る。従って、プロトカドヘリンは新規であり現在未知のヘテロフィリック(heter
ophilic)な分子に結合することが仮定されている。

【００７８】カドヘリンの機能は現在完全には知られていない。明らかには、いくつかの典
型的カドヘリンが発生段階における細胞層分離および形態形成に関与している。
N-カドヘリンは軸索伸長に重要な役割を果たしている。カドヘリンはまた成熟組
織における細胞-細胞認識の維持に関与しており、転移癌などの認識が欠失して
いる疾患に関与する可能性がある。腫瘍発生における作用は、β-カテニンのwnt
プロト-癌遺伝子産物の競合によって示唆されている。天疱瘡は、デスモソーム
型カドヘリンの免疫認識によって媒介される自己免疫疾患である。カドヘリンは
また神経変性疾患、筋疾患、および免疫疾患に関与する可能性もある。カドヘリ
ンに結合する際のプリオンタンパク質の関与により、カドヘリン機能に対するプ
リオンタンパク質の作用またはプリオン機能に対するカドヘリンの作用を妨害ま
たは増強する薬剤の開発が可能になる。

【００７９】有用なPrP-結合カドヘリンには、E-カドヘリン（ウボモルリン）、M-カドヘリ
ン、N-カドヘリン、P-カドヘリン、R-カドヘリン、カドヘリン5、カドヘリン6、
カドヘリン7、カドヘリン8（溶解型で分泌されうる）、カドヘリン9、カドヘリ
ン10、カドヘリン11(OB-カドヘリン）、カドヘリン12、カドヘリン13(T-カドヘ
リン、細胞内ドメインを欠損し、GPI-結合している）、PC-1(プロトカドヘリン-
42）、PC-2(プロトカドヘリン-43)、プロトカドヘリン3、プロトカドヘリン4(Pc
dh3;GenBankアクセッション番号：AF131761およびAAD20038）、プロトカドヘリ
ン5、プロトカドヘリン6、プロトカドヘリン7(BHプロトカドヘリン；GenBankア
クセッション番号：AB006755、AB006756、AB006757およびAF04364)、プロトカド
ヘリン8(GenBankアクセッション番号：AF061573)、プロトカドヘリン9(AA858832
)、OL-プロトカドヘリン（マウス;MMU88549)、カドヘリン関連神経受容体、Cnr1
(D86919)、Cnr2(D86917)、Cnr3(AB008179)、Cnr4(AB008180)、Cnr5(AB008181)、
Cnr6(AB008182)、Cnr7(AB008183)およびCnr8(AB008184)、並びにショウジョウバ
エ、マウス、およびヒト(X87241)由来のFAT遺伝子が含まれるが、これらに限定
されることはない。これらのタンパク質のいくつかは、例えば、Sanoら、EMBO J
., 12: 2249〜2256、1993)およびSuzuki, J. Cell. Biochem. 61: 531〜542、19
96に記載されている。

【００８０】PrPへのPrPBPの結合はカルシウム依存的である典型的なカドヘリンは最初に、カルシウム依存的であるホモフィリックな細胞
-細胞接着反応への関与に関して認識された。さらに別の研究では、カルシウム
が接着相互作用自体には必要とされないが、カドヘリン折り畳みのカルシウム結
合部位と反応して、分子を細胞表面でより強固で安定にすることが示された(Sha
piroら、Nature 374: 327〜337、1995)。ホモフィリックな結合相互作用に関与
しないカドヘリンファミリーメンバーでさえも、細胞-細胞接触点に局在化され
るカルシウムによって誘導されることがある（ヘテロフィリック(heterophilic)
なリガンドへの、カルシウム媒介性の結合を示唆している）。

【００８１】 G8細胞およびCOS細胞の表面で最初に同定されたPrPBPがカドヘリンタンパク質
の主要な特徴（即ち、カルシウム依存的な結合）を有するかどうかをさらに検討
するために、以下の実験を実施した。PrP-AP上清を2 mMのEDTAと共に室温におい
て2時間インキュベーションして培地中のカルシウムをキレート結合させた。同
時に、集密化したCOS細胞およびG8細胞を1 mM EDTAを含有するPBS中で5分間細胞
がプレートの底から持ち上がるまでインキュベーションした。次いで、細胞をDM
EM 5% FCSで1回洗浄し、対照細胞は1.3 mMのCaCl₂および1 mMのMgCl₂だけを含有
するHBHA中でインキュベーションしたが、実験細胞は1mM EDTAを含有するPBS中
で室温において30分間インキュベーションして培地中のカルシウムを除去した。
第1の群の陰性対照細胞をペレット化し、DMEM5%(PrP-APを含有しない)で再懸濁
した。第2群の陽性対照細胞（培地にカルシウムが存在する）および第3群の実験
細胞（EDTAで処理）はEDTA処理したPrP-AP中で室温において1.5時間再懸濁させ
、次に冷却したHBHAで3回洗浄した。次いで、以前に記載されているように細胞
を溶解し、それらの上清をPrP-AP活性について調査した。

【００８２】 COS細胞およびG8細胞とPrP-APとの結合はカルシウムキレート剤EDTAの存在下
では有意に低下し（COS細胞およびG8細胞共にP<0.0001、N=6）、最適な結合のた
めにはCa²⁺などの2価陽イオンの存在の必要性を示している。

【００８３】PrPへのPrPBPの結合はカルシウム依存的なトリプシン抵抗性を示すカルシウムの結合は、おそらくプロテアーゼ感受性部位を遮蔽するコンフォメ
ーション変化を誘導することにより、トリプシン消化から一部のカドヘリンを保
護する(Takeichi, J. Cell. Biol. 75: 464:474, 1977)。G8細胞およびCOS細胞
の表面において最初に同定されたPrPBPがカドヘリンタンパク質の主要な特性（
即ち、カルシウムの存在下におけるタンパク質分解）への抵抗性を有するかどう
かを判定するために、以下の実験を実施した。集密化したCOS細胞およびG8細胞
を0.25%トリプシンおよび10 mMCaCl₂を含有するPBS中で37℃において20分間イン
キュベーションするか、または0.25%トリプシンおよび1 mMEDTAを含有するPBS中
でインキュベーションし、次いでDMEM5%FCSで3回洗浄した。エッペンドルフチュ
ーブあたり約1×10⁶細胞を分布させ、これらをHBHA培地で2回洗浄した。次いで
、細胞をPrP-AP上清と共に室温において1.5時間インキュベーションし、その後
冷却したHBHA中で3回洗浄した。次いで、細胞を50 mM Tris、150 mM NaCl、1%
トリトン-X100、0.02% NaN₃、pH 8.0中で氷上で溶解した。溶解物を微量遠心分
離し、上清を加熱用ブロック上で12分間均一に65℃までの温度に加熱して、内因
性細胞ホスファターゼを不活性化した。結合AP活性は、NBTおよびBCIPをAP緩衝
液(100 mM Tris-HCl、pH 9.5、10.0 mM NaCl、5 mM MgCl₂、0.5〜12時間)に加え
たものと共にインキュベーションすることによって検出した。

【００８４】 Ca²⁺イオンの存在下では、PrP-APとのインキュベーションの前に細胞をトリプ
シンで処理したにもかかわらず、COS細胞およびG8細胞へのPrP-AP結合は維持さ
れた。Ca²⁺が存在しない場合には、トリプシン処理はPrP-AP結合を有意に低下さ
せた(COS細胞はP<0.001、G8細胞はP<0.05、N=4)。このデータは、カドヘリン分
子の既知の特徴である、COS細胞およびG8細胞の表面上のPrPBP種がCa²⁺の存在下
においてトリプシンのタンパク質分解から保護されることを示している（Takaha
shiら、Oncogene 8: 2925〜2929、1993）。従って、このデータは、PrPがカドヘ
リンファミリーメンバーに結合するという知見を裏付ける。

【００８５】ヒトPrPBPの単離およびクローニングヒトPrPBPは、マウス相同物について上記のように単離することができる。特
に、組換えヒトPrP-AP融合タンパク質は、マウスPrP遺伝子の代わりにKretzschm
arら(DNA 5: 315〜324、1986)によって記載されているヒトPrP cDNAを使用して
本質的に上記のように構築される。ヒトPrP断片は、以下のプライマーを使用し
た標準的なPCR増幅によって作製される：次いで、この断片をAPtag-2発現ベクターにインフレームでクローニングする（C
hengおよびFlanagan、前記）。このベクターから発現される融合タンパク質産物
を使用して、ヒトPrPBPを上記のアフィニティー技法のいずれかによって単離す
る（例えば、ヒトPrPBP産生細胞からの沈殿による）。単離されたタンパク質が
実際にヒトPrPBPであるという証明も上記のように実施することができる。

【００８６】一旦単離されたら、ヒトPrPBPタンパク質を微量配列決定することができ、ア
ミノ酸配列をハイブリダイゼーションスクリーニングまたは任意の適当なヒトcD
NAまたはゲノムDNAライブラリーからヒトPrPBPコード配列を増幅するためのPCR
プライマーのためのオリゴヌクレオチドを設計するために使用することができる
。

【００８７】または、ヒトPrP-AP融合タンパク質を使用して、pcDNA3.1クローニング系およ
び上記の技法を使用してヒトPrPBP発現cDNAクローンを単離する。または、好ま
しくは、さらに別の技法では、プローブとしてマウスPrPBPコード配列（上記）
を使用してヒト脳cDNAライブラリーにおいて低ストリンジェンシーのスクリーニ
ングを実施する。また、マウスPrPBP配列をハイブリダイゼーションプローブと
して使用しても、または異なる種間で保存されている可能性のあるマウスPrPBP
配列の領域に基づいてPCRプライマーをしてもよく、ヒト配列の増幅に使用して
もよい。最後に、望ましい場合には、上記のように、マウスPrPBPの相同物をPrP
-APアッセイ法において活性を試験することができる。

【００８８】PrPBPタンパク質発現一般的に、本発明のPrPBPは、適した発現媒体におけるPrPBPコードcDNA断片の
全てまたは一部による適当な宿主細胞の形質転換によって産生してもよい。

【００８９】分子生物学の分野の当業者は、組換えタンパク質を提供するために多様ないか
なる発現系を用いてもよいことを理解すると思われる。用いられる正確な宿主細
胞は本発明にとって重要ではない。PrPBPは、原核細胞宿主（例えば、大腸菌）
または真核細胞宿主（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces ce
revisiae）、昆虫細胞、例えばSf21細胞、または哺乳動物細胞、例えばNIH 3T3
、HeLa、もしくは好ましくはCOS細胞）において産生してもよい。そのような細
胞は、広範な供給源から入手可能である（例えば、アメリカンタイプカルチャー
コレクション(American Type Culture Collection)、ロックランド、メリーラン
ド州；同様に、例えばアウスユベール（Ausubel）ら、「分子生物学の現行プロ
トコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ウィリー＆
サンズ、ニューヨーク、1994も参照のこと）。形質転換またはトランスフェクシ
ョン法、および発現媒体の選択は、選択した宿主系に依存すると考えられる。形
質転換およびトランスフェクション法は、例えば、アウスユベール（Ausubel）
ら（上記）に記載されており；発現媒体は、例えば、「ベクターのクローニング
：実験マニュアル（Cloning Vectors：A Laboratory Manual）」（P.H. Pouwels
ら、1985、補則1987）に提供される媒体から選択してもよい。または、PrPBPは
、安定的にトランスフェクトした哺乳動物細胞株によって産生してもよい。哺乳
動物細胞の安定的なトランスフェクションに適した多くのベクターが公的に利用
でき、例えばパウエルズ（Pouwels）ら（上記）を参照のこと。そのような細胞
株を構築する方法も、例えば、アウスユベール（Ausubel）ら（上記）に記載の
ように公的に利用できる。一つの例において、PrPBPをコードするcDNAを、ジヒ
ドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子を含む発現ベクターにクローニングする。
プラスミドの組み込み、したがって、宿主細胞染色体へのPrPBPコード遺伝子の
組み込みは、細胞培養培地に0.01〜300 μMメソトレキセートを含めることによ
って選択される（Ausubelら（上記））。この優性選択は、ほとんどの細胞タイ
プにおいて行うことができる。組換えタンパク質発現は、トランスフェクトした
遺伝子のDHFRを介した増幅によって増加させることができる。遺伝子増幅を有す
る細胞株を選択する方法は、アウスユベール（Ausubel）ら（上記）に記載され
ている；そのような方法は一般的に、メソトレキセートの漸増レベルを含む培地
において長期間培養することを含む。この目的のために一般的に用いられるDHFR
含有発現ベクターには、pCVSEII-DHFRおよびpAdD26SV(A)が含まれる（Ausubelら
（上記））。上記の宿主細胞のいずれか、または好ましくはDHFR欠損CHO細胞株
（例えば、CHO DHFR細胞、ATCCアクセッション番号CRL 9096）は、安定的にトラ
ンスフェクトした細胞株のDHFR選択またはDHFRを介した遺伝子増幅にとって好ま
しい宿主細胞株である。

【００９０】組換えPrPBPが発現されると、それを例えば、アフィニティクロマトグラフィ
ーまたはイオン交換クロマトグラフィーを用いて単離する。一つの例において、
抗PrPBP抗体（例えば、本明細書において産生される）をカラムに結合させて、
これを用いてPrPBPを単離してもよい。アフィニティクロマトグラフィーを行う
前に、標準的な方法によってPrPBP含有細胞の溶解および分画を行ってもよい（
例えば、アウスユベール（Ausubel）ら（上記）を参照のこと）。

【００９１】単離されれば、組換えタンパク質は、望ましければ、例えば、高速液体クロマ
トグラフィーによってさらに精製することができる（例えば、Fisher、「生化学
と分子生物学の実験技術（Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecu
lar Biology）」、ワーク＆バードン（Work & Burdon）編、エルゼビア、1980を
参照のこと）。

【００９２】本発明のポリペプチド、特に短いPrPBP断片はまた、化学合成（例えば、「固
相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis）」第二版、1984年ピアスケ
ミカル社、ロックフォード、イリノイ州に記載された方法）によって産生するこ
とができる。

【００９３】ポリペプチド発現および精製に関するこれらの一般的な技法はまた、有用なPr
PBP断片または類似体（本明細書に記載）を産生および単離するために用いるこ
とができる。

【００９４】本発明の特に有用な断片には、細胞外PrPBPドメイン、例えば、プロトカドヘ
リン-43（PC2）アミノ酸29〜244位と共に、より小さい断片EC1（アミノ酸29〜13
5位）およびEC2（アミノ酸136〜244位）が含まれる。

【００９５】抗PrPBP抗体 PrPBP特異的抗体を産生するために、PrPBPコード配列をグルタチオン-S-トラ
ンスフェラーゼ（GST）とのC末端融合体として発現させてもよい（Smithら、Gen
e 67：31〜40、1988）。融合タンパク質は、グルタチオン-S-セファロースビー
ズ上で精製して、グルタチオンによって溶出し、トロンビンによって切断して（
操作された切断部位で）、ウサギの免疫にとって必要な程度に精製する。一次免
疫は、フロイントの完全アジュバントを用いて行い、その後、フロイントの不完
全アジュバントを用いて免疫する。抗体の力価は、GST-PrPBP融合タンパク質の
トロンビン切断PrPBPタンパク質断片を用いて、ウェスタンブロットおよび免疫
沈降によってモニターする。免疫血清をCNBr-セファロースカップリングしたPrP
BPタンパク質を用いてアフィニティ精製する。抗血清の特異性は、無関係なGST
タンパク質のパネルを用いて決定する。

【００９６】 GST融合タンパク質の代わりとして、または補助免疫原として、PrPBPの比較的
独自の免疫原性領域に対応するペプチドを作製して、導入されたC末端リジンに
よってキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）にカップリングしてもよい。
これらのペプチドのそれぞれに対する抗血清は、BSAに結合したペプチド上で同
様にアフィニティ精製し、ペプチド結合体を用いるELISAとウェスタンブロット
、ならびにGST融合タンパク質として発現されるPrPBPを用いるウェスタンブロッ
トおよび免疫沈降によって特異性を調べる。

【００９７】または、上記のPrPBPおよび標準的なハイブリドーマ技術を用いてモノクロー
ナル抗体を調製してもよい（例えば、Kohlerら、Nature 256：495、1975；Kohle
rら、Eur. J. Immunol 6：511、1976；Kohlerら、Eur. J. Immunol. 6：292、19
76；Hammerlingら、「モノクローナル抗体とT細胞ハイブリドーマ（Monoclonal
Antibodies and T Cell Hybridomas）」、エルセビア、ニューヨーク州、1981；
Ausubelら、上記を参照のこと）。産生した後、モノクローナル抗体はまた、ウ
ェスタンブロットまたは免疫沈降分析によって特異的PrPBP認識に関して調べる
（Ausubelら、上記の方法によって）。PrPBPを特異的に認識する抗体は、本発明
において有用であると見なされる；そのような抗体は、例えばイムノアッセイ法
において用いて、哺乳動物によって産生されたPrPBPレベルをモニターしてもよ
い（例えば、PrPBPの量または細胞内位置を決定する）。または、モノクローナ
ル抗体は、上記のPrPBPおよびファージディスプレイライブラリーを用いて調製
してもよい（Vaughanら、Nature Biotech. 14：309〜314、1996）。

【００９８】好ましくは、本発明の抗体は、一般的に保存された領域外に存在し、荷電残基
が高頻度で存在するというような基準によって抗原性である可能性があるように
思われるPrPBPの断片を用いて産生する。一つの特定の例において、そのような
断片は、PCRの標準的な技術によって産生され、pGEX発現ベクターにクローニン
グされる（Ausubelら、上記）。融合タンパク質を大腸菌において発現させ、ア
ウスユベール（Ausubel）ら（上記）が記述したようにグルタチオンアガロース
アフィニティマトリクスを用いて精製する。抗血清の低親和性または特異性に関
して起こりうる問題を最小限にするために、各タンパク質についてそのような融
合物質を２個または３個作製し、各融合体を少なくとも２羽のウサギに注入する
。抗血清は、好ましくは少なくとも３回の追加免疫注射を含む、一連の注射によ
って作製する。

【００９９】交叉種PrPBP結合上記のように、本明細書において同定された例としてのPrPBPの少なくとも一
つ、すなわちPC2（プロトカドヘリン-43とも呼ぶ）は、種選択的ではなく、ヒト
、マウスおよびウシを含む多くの動物からのPrPに結合する。同様に、下記のよ
うに、このことは、このPrPBPが非常に保存されたアミノ末端PrPペプチドに結合
するという事実によって起こる可能性がある。

【０１００】本発明者らの実験において、ペプチド競合試験から、プリオンタンパク質の遠
位アミノ酸末端に由来するこの非常に保存された11個のアミノ酸のペプチドが、
PrPBPに富むことが示されているCOS細胞およびG8細胞表面に対するPrP-AP結合を
有意に阻害できることが示された。これらの試験において、G8細胞を約100,000
個／ウェルの割合で６ウェルプレートに播種した。10 mg/mlの保存溶液から、Pr
Pの11量体ペプチド（KKRPKPGGWNT）または対照シュメルリンクペプチド（PrPア
ミノ酸100〜130位）いずれか200 μlを、グレース培地で10倍希釈したPrP-AP 1.
9 mlに加えた。10倍希釈マウスPrP-APの最終容量２ml中に１mg/mlペプチドを含
むこの混合物をG8細胞含有ウェルに加え、室温で90分インキュベートした。次に
、細胞をHBHA２mlによって６回洗浄し、溶解緩衝液（100 mM NaCl、10 mM EDTA
、0.5％ノニデットP-40、0.5％デオキシコール酸ナトリウムのトリス塩酸溶液、
pH 7.4）400 ml中で室温にて15分溶解した。次に、混合物を氷中で15分インキュ
ベートした後、遠心して細胞破片を除去した。上清を新しい試験管に移して、65
℃で12分間インキュベートして、内因性AP活性を不活化した。PrP-APを、BCPIP
基質（カークガード）と共にインキュベートすることによって可視化し、これに
よって着色反応産物が生成され、これを620 nmで定量する。COS細胞に対するPrP
-APの競合的結合は、以下の例外を除いて、同様の方法で実施した：96ウェルプ
レート中の１ウェルあたり5000個の細胞を播種し、PrP 11量体ペプチドの滴定は
、１ mg/mlから始めて連続３倍希釈で減少させる濃度を用いて行った。

【０１０１】 PrPの11量体は、G8細胞に対してPrP-AP結合の90％と競合したのに対し、対照
シュメルリンクペプチドはいかなる作用も示さなかった（図8A）。さらに、PrP
11量体によるPrP-AP結合の競合は用量依存的であり、用いたPrPペプチドの量を
漸減させると、競合は次第に減少した（図8B）。これらの結果は、PrPのこの11
個のアミノ酸鎖が、その細胞表面受容体へのPrPの結合に関係していることを示
した。

【０１０２】ウシPrPに対するヒトPrPBP、PC2の結合全ての実験において用いられる可溶性のヒトPrPBP、可溶性PC2は、その膜貫通
ドメインを欠損するPC2遺伝子を含むプラスミドをCOS細胞に一過的にトランスフ
ェクトさせることによって作製した。このプラスミドは、Hu-PC43 3' trunc/PC-
1 neoと呼ばれた。これは、PC2の細胞外ドメイン６個全てと、選択マーカーとし
てネオマイシン抵抗性遺伝子を含む。培養上清を培養５日後に回収して、ELISA
によってPC2の有無を調べた。次に、陽性上清を少量採取して、−80℃で凍結し
た。マウスPrP-APは、SF9細胞のバキュロウイルス感染後に産生され、これを上
清として用いた。

【０１０３】飽和結合曲線を作製するために、１mM Ca²⁺およびMg²⁺を含むダルベッコPBSで
1/3に希釈したPC2上清50 μlを、96ウェルイムノロン1Bプレート（ダイネックス
社）に加えて４℃で一晩インキュベートした。対照として、無関係なタンパク質
（mek4-AP）を含むCOS上清の1/3希釈液も同様に加えた。一晩インキュベートし
た後、非特異的結合部位を、1ウェル当たり５％粉乳を含むトリス緩衝液（50 mM
トリス塩酸、pH 8.0、150 mM NaCl、１mM Ca²⁺）100 μlによって室温で２時間
ブロッキングした。次に、ウェルを1ウェル当たり0.05％ツイーンを含むトリス
緩衝液200 μlによって５回洗浄し、1ウェル当たり、プロテアーゼ阻害剤（シグ
マ社、P8340）を含むトリス緩衝液に溶解した組換えウシPrP（rbPrP、プリオニ
クス社）50 μlを加えた。用いたrbPrPの濃度は2000 ng/mlから始めて、1500 ng
/ml、そして２倍希釈で1.6 ng/mlに達するまで行った。最後のウェルにはrbPrP
を加えなかった。各濃度は、１試料あたり３本ずつ実施し、インキュベーション
は、室温で２時間実施した。次に、ウェルを1ウェル当たり0.05％ツイーンを含
むトリス緩衝液200 μlによって10回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を含むトリス
緩衝液で5000倍希釈した6H4抗PrPモノクローナル抗体（プリオニクス社）50 μl
と共に室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを1ウ
ェル当たり0.05％ツイーンを含むトリス緩衝液200 μl/ウェルによって10回洗浄
して、ヤギ抗マウスIg-HRP結合体（ジャクソン社、10,000倍希釈）のプロテアー
ゼ阻害剤を含むトリス緩衝液溶液と共に室温で40分インキュベートした。1ウェ
ル当たり0.05％ツイーンを含むトリス緩衝液200 μlによってさらに10回洗浄し
た後、ウェルにABTS酵素基質（ベーリンガー社）100 μlを30〜60分、室温にて
加え、溶液の吸光度を405 nmで測定した。特異的結合はPC-2含有ウェルからの結
果をmek4-AP（無関係タンパク質）ウェルからの結果と比較することによって決
定した。実験あたり１試料３個ずつ行った他の対照は、プロテアーゼ阻害剤を含
むトリス緩衝液で10,000倍希釈した抗PC2モノクローナル抗体を用いてウェルあ
たり捕獲したPC2を、室温で１時間、直接測定する段階、その後、洗浄する段階
、および上記のようにヤギ抗マウスIg-HRP結合体と共にインキュベートする段階
を含んだ。

【０１０４】図９は、可溶性ヒトPC2に対するrbPrPの結合が飽和可能であったことを示して
いる。飽和可能な結合は、特異的リガンド受容体相互作用の特徴の一つである。
飽和結合曲線を４回繰り返した。データから、ヒト可溶性PC2が、ウシ組換えPrP
に統計学的に有意かつ飽和可能に結合することが示された。さらに、rbPrPの飽
和結合が約200 ng/mlに達した場合の、可溶性ヒトPC2とrbPrPとの親和性は、こ
のデータから約４nMであると推定されうる。代表的な飽和結合曲線を図９に示す
。

【０１０５】アフリカツメガエル卵母細胞におけるヒトPrPBP、PC2の発現およびマウスPrP-AP 融合タンパク質による検出全長ヒトPC2を含むプラスミドを制限酵素消化によって直鎖状にして、PC2 RNA
をアンビオンメッセージマシーンキットを用いてインビトロで転写した。PC2 RN
A 15 ngを新しく調製したアフリカツメガエル卵母細胞にマイクロインジェクシ
ョンした。各卵20個のプール８個にPC2 RNAを注入して、卵20個のプール２個に
同様に調製した陽性対照、elf RNAを注入し、および卵20個のプール２個に陰性
対照として緩衝液のみを注入した。卵を18℃でバース培地で５日間インキュベー
トして、タンパク質を発現させた。この期間の後、卵のプールを回収して、24ウ
ェルプレートに播種して、グレース培地で10倍希釈したマウスPrP-AP融合タンパ
ク質と共に室温で４時間、穏やかに振盪しながらインキュベートした。陽性対照
は希釈していないmek4-AP上清と共にインキュベートし、偽注射対照はPrP-APと
共にインキュベートした。次に、卵母細胞を全て1.5 ml試験管に移して、冷HBHA
緩衝液で６回洗浄し、50 mMトリス、pH 8.0、150 mM NaCl、0.02％アジド、１％
トリトンX-100によって氷中で15分溶解して、上清を遠心によって回収した。次
に、上清をアルカリホスファターゼ基質、発色産物を生成するBCPIP（カークガ
ード）、または蛍光産物を生じるフルオレセイン二リン酸（F-dP、モレキュラー
プローブス社）と共にインキュベートした。各試料の吸光度は、620 nmで測定す
るか、または各試料の蛍光を535 nmで測定した。

【０１０６】マウスPrP-AP融合タンパク質は、アフリカツメガエル卵母細胞に導入されたヒ
トPC2に結合して、その細胞表面で発現されることが判明した。既知のリガンド
受容体分子対を用いる制御された系において、elf RNAをマイクロインジェクシ
ョンした卵母細胞は、緩衝液のみを注入した卵母細胞と比較してmek4-AP融合タ
ンパク質に対して統計学的に有意な結合を示した（p値＝0.026、図10）。同様に
、PC2 RNAをマイクロインジェクションした卵母細胞に対するマウスPrP-APの統
計学的に有意な結合が認められた（p値0.001、図10）。

【０１０７】マウスPrPに対するヒトPrPBP、PC2の結合これらの実験を実施するために、マウスPrP-AP融合タンパク質および可溶性ヒ
トPC2を上記のようにそれぞれ、バキュロウイルス発現系および一過性のCOS細胞
感染から産生した。飽和結合曲線実験は、brPrPを未希釈および最終希釈300倍で
終了する連続３倍希釈を用いるマウスPrP-AP上清に置換したことを除き、ウシPr
Pについて記述したように実施した。

【０１０８】マウスPrP-Apは、アフリカツメガエル卵母細胞の細胞表面に発現される全長ヒ
トPC2に結合することが知られていた。この実験は、マウスPrP-APが、膜貫通ド
メインを欠損するヒトPC2の遺伝子操作された可溶性型に結合できることを証明
した。実際に、マウスPrP-APは、可溶性ヒトPC2に対する飽和結合を示し、これ
はBSA対照より優れており、統計学的に有意であった（全てのデータポイントに
関してp値＜0.001、図11）。飽和結合はマウスPrP-AP上清の３倍希釈液で達し、
その希釈液はマウスPrP-AP約３μg/mlを含むと推定された。最大結合の半分は、
上清の10倍希釈液で得られ、これによってPC2に関するPrP-APの推定親和性は低
いナノモル範囲であった。双方の結合パートナーが、上清型で用いられること、
その正確な各濃度が不明であり、したがって一つまたは他の成分が限られた量存
在する可能性があることに注目すること。

【０１０９】ウシ海綿状脳症感染ウシ抽出物におけるPrPの検出ウシ海綿状脳症（BSE）と診断されたウシおよびニュージーランド（すなわち
、ウシ海綿状脳症が発生していない）由来の対照ウシからの脳ホモジネートを10
％（w/v）溶液として調製した。ウシ脳をダウンスホモジナイザー（テフロンの
乳棒を有する）において冷溶解緩衝液（100 mM NaCl、10 mM EDTA、0.5％ノニデ
ットP-40、0.5％デオキシコール酸ナトリウムのトリス緩衝液溶液、pH 7.4）２
容量中で破砕した。試料を氷中で20分インキュベートしてから、ホモジナイザー
でさらに15回粉砕した。可溶性の破片を４℃、3000 rpmで15分間の遠心によって
除去した。上清を少量に分けて、−70℃で保存した。上清のタンパク質含有量を
定量したが、この技法は濃度〜10 mg/mlのホモジネートを一貫して生成した。

【０１１０】結合をアッセイするため、ポリソルプELISAプレート（ヌンク社）のウェルを
、上記のように調製したPC2-含有細胞上清（0.1 M重炭酸緩衝液、pH 9.6）によ
って４℃で一晩コーティングした。ウェルを、0.05％ツイーン20を含むPBSで４
回洗浄して、ウェルに５％脱脂乳のPBS溶液を満たし、プレートを室温で２時間
インキュベートすることによってブロッキングした。プレートを洗浄して、脳ホ
モジネート（PBSで希釈）を指定されたウェルに加えて、室温で1.5時間インキュ
ベートした。ウェルをPBSTで４回洗浄した。6H4（70 ng）を適当なウェルに加え
て、室温で１時間でインキュベートした後、抗ウサギIgG/西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ結合体を5000倍希釈で含む、１％脱脂乳含有PBST溶液100 μlと共にさら
に0.5時間インキュベートした。ウェルをPBSTによって４回洗浄した。ABTS（ベ
ーリンガー・マンハイム社）をウェルに加えた後、シグナルを405 nmでモニター
した。

【０１１１】このアッセイ法から、脳抽出物における成分とポリソルプELISAプレート上に
コーティングされたsPC2含有上清とが相互作用することが示された（図12）。用
量反応作用は、sPC2上清と脳ホモジネートの双方について認められた。さらに、
結合レベルの増加は、正常（NZ）脳からの抽出物と比較してBSE脳からの抽出物
について認められ、PC2がPrP^Scに対してより強く結合する可能性があることを示
唆している。これらの実験において、予めブロッキングしたウェルに結合した脳
ホモジネート上のシグナルは、バックグラウンドを越えず、このことは、非特異
的タンパク質・タンパク質相互作用が最小であることを示唆している。

【０１１２】PC2リンパ球分布 PC2の役割をよりよく理解するために、リンパ系におけるその分布を調べた。
末梢血白血球（PBL）をフィコール遠心によって全血から単離した。PBLを、2.5
％FBSを添加したダルベッコPBSによって２回洗浄した。ウェル当たり約１×10⁶
個の細胞を丸底96ウェルプレートに播種して、遠心によって沈降させた。細胞を
、10 μg/mlの抗体を2.5％FBSを含むダルベッコPBSに含む抗PC2モノクローナル
抗体溶液に再懸濁させた。陰性対照集団をアイソタイプマッチ無関係抗体と共に
インキュベートした。細胞を、氷中で抗体と共に15分インキュベートして、ダル
ベッコPBS、2.5％FBS 200 μlによって２回洗浄した。次に、細胞を二次抗体、
抗ヤギマウスIg FITC結合体（ジャクソン社）と共に氷中で15分間インキュベー
トして、先の記述と同様に洗浄した後、FITC結合二次抗体上での遊離の抗体結合
部位をブロッキングするために、20倍希釈した正常マウス血清（シグマ社）と共
にインキュベートした。次に、B細胞に対して対比染色したウェルをPE結合抗ヒ
トCD19（ベクトンディッキンソン社）と共にインキュベートして、T細胞に関し
て対比染色したウェルをPE結合抗ヒトCD3（ベクトンディッキンソン社）と共に
インキュベートした。細胞をベクトン・ディッキンソンFACスキャンによって分
析した。10,000個の肝細胞からの蛍光放出を回収した。

【０１１３】図13Aおよび図13Bに示したデータは、PC2が専らCD19⁺細胞（B細胞）と共に発
現されるが、細胞表面CD3を有する細胞（T細胞）には発現されていないことを明
確に示した。この知見は、末梢での接種後にPrP^Scが脳へ移動することにB細胞が
関係していることを示す最近の結果を考慮すれば有意である（Kleinら、Nature
390：687、1997）。プリオン感染症の初期段階においてこれらの細胞にPC2とPrP^Sc の両者が存在することは、PC2が高親和性でPrP^Scに結合し、正常細胞のPrP^Cか
らPrP^Scへの変換、および末梢のリンパ様組織から脳への移動に関係する可能性
があるという考え方の信頼性を増加させるものである。

【０１１４】プリオン疾患検出アッセイ法 PrPBPは、プリオン疾患または病態の検出またはモニタリングにおいて一般的
に診断的に用いられる。例えば、PrPBPは、標準的な検出アッセイ法を用いて生
物試料において（例えば、組織生検または体液）PrP^Scの有無をモニターするた
めに用いてもよい。そのような検出アッセイ法には、検出可能に標識された成分
、例えば、標識PrPBP、標識PrPBP融合タンパク質、標識PrP^C、または標識PrP^Sc
によるアッセイ法が含まれるがこれらに限定されることはない。本発明のアッセ
イ法は、PrP^Scの直接検出を含んでもよく、または間接的検出（例えば、PrPBPと
PrPとの結合、およびPrPBP、PrP、またはPrP^Scに対して作製された標識二次抗体
を用いる複合体の検出による）を含んでもよい。これらの検出アッセイ法におい
て用いられるPrPBP（例えば、マウスまたはヒトPrPBP）は、いかなる細胞におい
て組換え的に産生してもよいが、COS細胞が好ましい宿主細胞である（例えば、C
ullen、Meth. Enzymol. 152：684〜704、1988）。または、PrPBPは、PrP-APタン
パク質および標準的な技術を用いてアフィニティ精製によって単離してもよい。
一つの特定の好ましい態様において、可溶性PrPBP結合ドメインを発現させて、
本発明の検出方法において用いる。もう一つの好ましい態様において、PrPBP結
合ドメインを、マウスおよびヒトPrPBPコード配列の双方を含む融合タンパク質
として発現させる。この場合も、これらの融合タンパク質を本明細書に記載の検
出方法において用いる。

【０１１５】一つの作業例として、プリオン物質を含むことが既知である、または疑われる
生物試料を以下のように試験する。試料を、既知濃度で存在する、検出可能に標
識したPrPBP（またはその断片もしくは類似体）またはPrPBP融合タンパク質のい
ずれかと共にインキュベートする。PrPBPとのインキュベーション後、生物試料
を標準的な技法に従ってプロテアーゼによって処理し（例えば、Prusinerら、Sc
ience 216：136〜144、1982）、得られた複合体を、例えば、フィルター結合、
免疫沈降、ゲル電気泳動分離、沈降、または濾過によって単離または同定する。
次に、単離された複合体を標準的な方法に従って分析および測定する。放射性、
蛍光性、発色性（例えば、アルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキ
シダーゼ）もしくは化学発光性の標識、または標識されたハプテン特異的抗体も
しくは他の結合パートナー（例えば、アビジン）を用いて可視化されるハプテン
（例えば、ジゴキシゲニンもしくはビオチン）を含むがこれらに限定されること
はない、直接的または間接的に可視化される任意の適当な標識をこれらの検出ア
ッセイ法において用いてもよい。免疫学に基づいてアッセイする場合、複合体形
成を測定するために、PrPBP（上記のように）またはPrP（Bendheimら、Nature 3
10：418〜21、1984）に対して作製したポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体を、いかなる標準的なイムノアッセイフォーマット（例えば、ELISA、ウ
ェスタンブロット、またはRIAアッセイ法）において用いてもよい。そのような
イムノアッセイ法の例は、例えば、アウスユベール（Ausubel）ら（上記）に記
載されている。適当な対照試料と比較して標識化合物の増加レベルを含むことが
判明した試料は、プリオンタンパク質の存在を示すものとして見なし、このよう
に、プリオン関連疾患の指標となる。その上、正常レベルのPrP^Cを含む細胞を対
照として用いてもよいため、PrPに対して作製された標識二次抗体も同様に、プ
ロテアーゼ処理を行わずに用いてもよく、PrP^C閾値を超えるシグナルは、生物試
料中にPrP^Scが測定されたこととして検出された。プロテアーゼ処理を必要とし
ないさらにもう一つの方法において、PrPBPを、生物試料中でプリオンタンパク
質と複合体を形成させ、PrP^Sc複合体を標識二次PrP^Sc特異的抗体試薬を用いて特
異的に検出してもよい。

【０１１６】もう一つの検出アッセイ法において、生物試料中のPrP^Scを、固相支持体（例
えば、ニトロセルロース、イムノビロン、アガロースビーズ、シアン活性化アガ
ロース、または組織培養ウェル）に捕獲して、PrPBPによる結合（または断片も
しくはその類似体）またはPrPBP融合タンパク質を検出する。もう一つの方法と
して、PrPBPまたはPrPBP融合タンパク質を固相支持体に結合させて、PrP^Scの結
合を検出する。これらのアッセイフォーマットにおいて、検出は、上記のような
標準的な方法によって行い、例えば固相支持体に会合したPrP^Scの検出は、上記
のようにPrPBPを用いて直接的または間接的に行う。または、捕獲されたPrP^Sc：
PrPBP複合体中のPrP^Scを、PrP^Scに対して作製された抗体を用いて検出してもよ
い（Bendheimら、Nature 310：418〜21、1984）。この場合も、適当な標識を利
用してもよく、例えばいかなる放射性マーカーもしくは蛍光性マーカーも用いて
もよく、またはアルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼを
含むがこれらに限定しないいかなる酵素マーカーを利用してもよく、検出は、発
色または蛍光原基質を加えることによって行ってもよい。

【０１１７】上記のように、PrP^Cに結合するがPrP^Scには結合しないPrPBPを用いて、生物試
料からPrP^Cを除去することができる。試料中に残っているPrP^Scは、例えば、PrP^Sc とPrP^Cの双方に結合する抗体などの試薬に結合させることによって定量するこ
とができる。このように、PrP^Cに結合するがPrP^Scに結合しないPrPBPであっても
PrP^Scに関するアッセイ法に用いることができる。

【０１１８】もう一つの検出アッセイ法において、検出可能に標識したPrP^ScをPrPBPと共に
インキュベートした後、PrP^Scを含むことが疑われる生物試料と共にインキュベ
ートする。次に、得られた複合体を上記のような従来の方法に従って測定および
定量する。このアッセイフォーマットにおいて、試料中に存在する非標識PrP^Sc
は複合体に存在する標識PrP^Scと競合的に置換されるために、PrPBP：PrP^Sc複合
体に存在する標識PrP^Scの量が対照試料と比較して減少していれば、PrP^Scが生物
試料中に存在することの指標として見なされる。PrPBP-PrP複合体形成後にプロ
テアーゼ処理段階と組み合わせた同様のアプローチを用いてもよい。この場合、
標識PrPのいかなる形を利用してもよく、この場合も標識化合物のレベルが減少
（試料の非存在下での対照と比較して）していれば、アッセイすべき生物試料中
にPrP^Scが存在することの指標として見なされる。

【０１１９】プリオンの除染本明細書に記載の方法および組成物は、プリオンタンパク質に汚染されている
ことが既知である、または疑われる生物試料の除染のために有用である。特に、
PrPBPは、PrP^Scに対して結合することができるため、生物試料をPrPBPと共にイ
ンキュベートしてもよく、PrPBP複合体を標準的な方法、例えば、二次分離、ま
たは分離方法を用いて除去してもよい。または、PrPBPは、PrPと複合体を形成さ
せ、それによってPrPの作用を阻害するために、生物試料と共に単にインキュベ
ートしてもよい。

【０１２０】プリオン関連疾患と他の神経変性疾患の治療本発明の方法および組成物はまた、ヒトを含む哺乳動物においてプリオン疾患
を治療または予防する手段を提供する。この治療は、PrPBP：PrP^Sc複合体形成に
関連した生物学的事象を破壊、抑制、減弱、または中和する化合物（例えば、ア
ンタゴニストまたはアゴニスト）を、直接的に、例えば動物に処理することによ
って行ってもよい。そのようなアンタゴニストは、本発明の分子および上記の機
能的アッセイ法を用いて単離してもよい。例えば、本発明は、PrPBP：PrP^Sc複合
体相互作用に拮抗することができる化合物（例えば、ペプチド、低分子阻害剤、
または模倣剤）を同定する手段を提供する。そのようなアンタゴニストには、Pr
PBPと相互作用して、PrPBP：PrP複合体形成を阻害し、そのような複合体形成に
起因する関連する生物活性を破壊するPrP^Sc、抗PrPBP抗体、またはPrP、PrP^Scも
しくはPrP^Cの断片もしくは類似体に結合してその生物活性を不活化するPrPBP、P
rPBP断片または類似体；またはPrP^Sc、PrPBP、もしくはPrPBP：PrP^Sc複合体形成
に関連した生物活性を妨害および阻害する薬剤、ならびに例えば細胞抽出物、哺
乳動物血清、もしくは哺乳動物細胞を培養した増殖培地に認められる薬剤を含む
ペプチドもしくは非ペプチド分子が含まれるがこれらに限定されることはない。

【０１２１】本発明において有用なアンタゴニスト分子には、PrP^Scに対して高親和性で結
合し、PrP^Cから自身のより多くコピーを動員することができないようにするか否
かに関して選択した分子；PrP^Cに対して高親和性で結合して、PrP^Scへの変換を
遮断することができる分子；PrP^CとPrP^Scまたはその複合体との相互作用を防止
することによって細胞障害性シグナルの産生を阻害することができる分子；PrP^C を発現する隣接細胞によって可溶性の毒性メディエータ（例えば、反応性酸素種
、および腫瘍壊死因子の発現）の産生を阻害することができる分子；またはこれ
らの上記のメカニズムの組み合わせ、が含まれる。

【０１２２】例えばPrPBPなどの候補アンタゴニストの有効性は、プリオンタンパク質との
その相互作用能に依存する。そのような相互作用は、任意の数の標準的な結合技
術およびその他の機能的アッセイ法（例えば、本明細書に記載のアッセイ法）を
用いて容易にアッセイすることができる。一つの特定の例において、候補アンタ
ゴニストを、PrP^Scとの相互作用に関してインビトロで試験してもよく、それら
のPrP^Scを介した生物活性の調節能を、本明細書に記載のいかなる機能的試験に
よってアッセイしてもよい。

【０１２３】 PrPBP：PrP^Sc複合体形成の減少、またはインビトロでのPrPBP：PrP^Scを介した
生物活性の減少を促進する分子は、本発明において有用であると見なされ、その
ような分子は、例えば、プリオン疾患を治療または発病を予防する治療薬として
用いることができる。

【０１２４】試験アンタゴニストが、プリオン疾患の発症に対して保護を付与するか否かの
評価は、一般的に、そのような疾患を発症することが知られている動物を用いる
ことを含む（例えば、Chandler、Lancet 6：1378〜1379、1961；Eklundら、J. I
nfectious Disease 117：15〜22、1967；Field、Brit. J. Exp. Path. 8：129〜
239、1969）。適当な動物（例えば、マウスまたはハムスター）を標準的な方法
に従って試験化合物によって処置し、無処置対照動物と比較したプリオン関連疾
患の発生率の減少または発症の遅延を保護の指標として検出する。試験化合物は
、プリオン物質を予め注射した動物に投与してもよく、またはプリオンと化合物
とを予めインキュベートして、試験動物にプリオン／化合物混合物を注射するこ
とによって、試験化合物のプリオン物質中和能を試験してもよい。プリオン疾患
を治療または予防するために用いられる分子（例えば、上記のようなアンタゴニ
スト）は、「抗プリオン治療物質」と呼ばれる。

【０１２５】本発明に係る抗プリオン治療物質は、薬学的に許容される希釈剤、担体、また
は賦形剤と共に単位投与財形で投与してもよい。例えば、従来の薬学の実践を用
いて、そのような抗プリオン治療物質を、プリオン疾患を有する、もしくは前症
候を有する、またはプリオン疾患を発症するリスクを有する動物に投与するため
に適した製剤または組成物を提供してもよい。いかなる適当な投与経路、例えば
、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼内、脳室内、嚢内、脊髄
内、槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、または経口投与を用いてもよい。

【０１２６】製剤を作製するために当技術分野で周知の方法は、例えば、「レミントンの製
薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」に認められる。非経口投与
のための製剤は例えば、賦形剤、滅菌水または生理食塩液、ポリエチレングリコ
ールのようなポリアルキレングリコール、植物性油、硬化ナフタレンを含みうる
。生体適合性の、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー
、またはポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンコポリマーを用いて、化合
物の放出を制御することができる。抗プリオン治療化合物にとってその他のおそ
らく有用な非経口送達系には、エチレン・酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポ
ンプ、埋め込み型注入系、およびリポソームが含まれる。吸入用製剤は、賦形剤
、例えば、乳糖を含みうる、または例えばポリオキシエチレン-9-ラウリルエー
テル、グリココール酸塩、またはデオキシコール酸塩を含む水溶液となりうる、
または点鼻液、またはゲルの剤形で投与するための油性溶液となりうる。

【０１２７】本発明の方法は、任意の動物、例えば、ヒト、家畜用ペット、または家畜にお
いて本明細書に記載の疾患を減少または予防するために用いてもよい。ヒト以外
の動物を治療する場合、用いられる抗プリオン治療物質は、好ましくはその種に
対して特異的である。

【０１２８】その他の態様一般的に、本発明には、PrP-AP融合タンパク質を用いて本明細書に記載のよう
に単離される可能性があるPrPBP、または上記のマウスPrPBPを用いて相同性スク
リーニングもしくはPCR増幅によって容易に単離されるPrPBPも含まれる。同様に
、その結合活性を完全に破壊しないように改変された（例えば、本明細書に記載
したようにアッセイする）PrP-AP融合タンパク質およびPrPBPも本発明に含まれ
る。そのような変化は、特定の変異、欠失、挿入、または翻訳後修飾を含んでも
よく、またはより大きい融合タンパク質の一つの成分としてタンパク質（例えば
、PrPBP）を含めることを含んでもよい。

【０１２９】このように、他の態様において、本発明には、PrPBPポリペプチドと実質的に
同一であり、適当なPrPに結合する（例えば、明細書に記載のようにアッセイす
る）いかなるタンパク質も含まれる。そのような相同体には、他の実質的に純粋
な天然に存在する哺乳動物PrPBPと共に、対立遺伝子変種；天然変種；誘導変種
；高ストリンジェンシー条件またはあまり好ましくはないが低ストリンジェンシ
ー条件で（例えば、少なくとも40ヌクレオチドのプローブ長で40℃で２×SSCに
よって洗浄）マウスPrPBP DNA配列とハイブリダイズするDNAによってコードされ
るタンパク質；およびPrPBPに対する抗血清によって特異的に結合するタンパク
質が含まれる。用語にはまた、PrPBP部分を含むキメラポリペプチドが含まれる
。

【０１３０】本発明はさらに、天然に存在するPrPBPポリペプチドの類似体を含む。類似体
は、天然に存在するPrPBPタンパク質とは、アミノ酸配列の差によって、翻訳後
修飾によって、またはその双方によって異なっていてもよい。この場合も、本発
明に係るPrPBP類似体は、PrPとの結合能を保持していなければならない。本発明
の類似体は、一般的に天然に存在するPrPBPアミノ酸配列の全てまたは一部と少
なくとも85％、より好ましくは90％、最も好ましくは95％、またはさらに99％同
一性を示すと思われる。配列比較の長さは、少なくとも15個のアミノ酸残基、好
ましくは少なくとも25個のアミノ酸残基、およびより好ましくは35個のアミノ酸
残基である。改変には、インビボおよびインビトロ化学誘導、例えばアセチル化
、カルボキシル化、リン酸化またはグリコシル化が含まれる；そのような改変は
、ポリペプチド合成、プロセシングまたは単離された改変酵素によるその後の処
理の際に起こってもよい。類似体はまた、一次配列の変化によって天然に存在す
るPrPBPとは異なりうる。これらには、天然および誘導型の遺伝子変種が含まれ
る（例えば、Sambrook、FritschおよびManiatis、「分子のクローニング：実験
マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」、第二版、CSH出版
、1989年、またはAusubelら、（上記）のような、放射線照射もしくはエタンメ
チルスルフェートに対する暴露によるランダム変異誘発、または部位特異的変異
誘発の結果として）。同様に、例えばβもしくはγアミノ酸のような、例えばD-
アミノ酸または天然に存在しないアミノ酸または合成アミノ酸を含む、環状ペプ
チド、分子、および類似体も含まれる。

【０１３１】全長のポリペプチドの他に、本発明はまた、PrPBP断片を含む。本明細書にお
いて用いられるように、「断片」という用語は、少なくとも３個の連続するアミ
ノ酸、好ましくは少なくとも５個の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくと
も20個の連続するアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも30個の連続するア
ミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも50個の連続するアミノ酸、および最も
好ましくは少なくとも60もしくは80またはそれ以上の連続するアミノ酸を意味す
る。PrPBP断片は、当業者に既知の方法によって作成することができ、または正
常なタンパク質プロセシングの結果であってもよい（例えば、生物活性にとって
必要でない未完成ポリペプチドからのアミノ酸の除去、またはオルタナティブmR
NAスプライシングもしくはオルタナティブタンパク質プロセシング事象によるア
ミノ酸の除去）。

【０１３２】本明細書において言及した全ての出版物および特許出願は、それぞれの独立し
た出版物または特許出願が特におよび個々に参照として本明細書に組み入れられ
ることを示されるのと同程度に参照として本明細書に組み入れられる。

【０１３３】その他の態様は特許請求の範囲内である。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】マウスPrP-AP融合タンパク質発現ベクターの略図である。

【図１Ｂ】分泌型アルカリホスファターゼを発現する対照プラスミドの略
図である。

【図２】 PrP-AP融合タンパク質がPrP^cおよびAP両方の免疫学的決定基を含
有することを例示するオートラジオグラフの写真を示す。APを発現するCMV/SEAP
ベクター(レーン1およびレーン2)またはPrP-APを発現するAPtagベクター(レーン
3および4)をトランスフェクトした³⁵[S]-メチオニン標識COS細胞上清を、成熟タ
ンパク質のN末端の17アミノ酸に対する抗APモノクローナル抗体(レーン1および
レーン3)またはPrPウサギポリクローナル抗体で免疫沈降した。等価な活性のAP
を各免疫沈降反応物に添加した。

【図３】 PrP-APがPrP^cドメインを介して選択された細胞株に特異的に付着
することを例示する棒グラフである。3種の異なるマウス細胞株を60 mmプレート
で集密化するまで培養し（約100,000細胞）、室温において90分、3mlのCOS細胞
試験上清と共にインキュベーションし、洗浄し、溶解し、以下に記載するように
アルカリホスファターゼ活性を測定した。対照：検出可能なアルカリホスファタ
ーゼ活性を含有しないmock-トランスフェクトCOS細胞に由来する馴化培地(condi
tioned media)。SEAP：CMV/SEAP構築物をトランスフェクトしたCOS細胞の上清、
であり、対照と比較して表面結合を示さない。PrP-AP：PrP-AP構築物をトランス
フェクトしたCOS細胞の上清、であり、表面結合を示す。SEAPおよびPrP-AP上清
は等しいアルカリホスファターゼ活性を含有した（約500 OD単位/時間）。

【図４】 PrP-APが細胞表面分子を認識するが、APは認識しないことを「間
接的免疫蛍光」プロトコールによってを示す2種類の写真パネルシリーズである
。G8細胞(マウス筋肉細胞株)はプロテアーゼを使用しないで、機械的に分離し、
PrP-APタンパク質またはAPタンパク質と共にインキュベーションし、洗浄し、抗
APモノクローナル抗体と共にインキュベーションし、洗浄し、フルオレセインイ
ソチオシアネートで標識したヤギ抗マウス免疫グロブリンと共にインキュベーシ
ョンし、洗浄し、蛍光顕微鏡で調査した。AP-インキュベーション細胞(右のパネ
ル)と比較したPrP-AP-インキュベーション細胞（左パネル）の蛍光シグナルは、
PrP-AP融合タンパク質のPrPドメインを介する特異的細胞表面結合を示す。

【図５】 PrP-AP結合は競合的で、そのPrP^cドメインを介して移動可能であ
ることを例示するグラフである。35 mmのプレートのNIH 3T3細胞は、上記のよう
に、予め³⁵[S]-メチオニンを代謝的に標識しておいたPrP-AP構築物をトランスフ
ェクトしたCOS細胞由来の上清と共にインキュベーションした。その後、細胞を
洗浄し、溶解し、結合放射能をβ-カウント法で測定した。結合³⁵[S]-PrP-APは
、「コールド」非標識PrP-APの濃度増加に伴って漸次競合されたが、CMV/SEAP-
トランスフェクト細胞COS細胞の同様の濃度のAPでは競合されなかった。

【図６】 PrP-APに暴露したG8筋細胞株培養物の細胞数の減少を例示する2
種類の写真パネルシリーズである。24ウェルプレートの姉妹G8培養物を、25% v/
vのAPを含有するCOS細胞上清、または25% v/vのPrP-APを含有するCOS細胞上清中
で3日間インキュベーションした。PrP-APに暴露した細胞培養物はAP暴露培養物
より常に密度が低く、PrPBP結合が細胞増殖および/または生存度に影響を与える
ことを示唆している。

【図７Ａおよび７Ｂ】クローン6のPrPBPの核酸配列（配列番号：1）およ
び推定アミノ酸配列（配列番号：2）である。

【図８Ａおよび８Ｂ】 PrPのN末端領域の11量体ペプチドが細胞表面のPrP-
APの結合と競合しうることを例示するグラフである。図８Aは、1mg/mlのPrPの11
量体ペプチドがPrP-AP結合の90%を妨害するのに十分であることを示す。一方、
ほぼ同じ量の別のPrPペプチド(Schmerlingペプチド、PrPのアミノ酸100〜130位)
はPrP-AP結合に影響を与えなかった。図８Bは、PrP-AP結合活性を、競合に使用
するPrPの11量体ペプチドの濃度の関数として示す。

【図９】可溶性ヒトプロトカドヘリン-43(PC2)に対する組換えウシPrPの
飽和結合曲線を示すグラフである。

【図１０】アフリカツメガエル卵母細胞における全長ヒトPC2の発現およ
びマウスPrP-AP融合タンパク質による検出を示すグラフである。水（陰性対照）
および全長PC2 RNA（PC2）を注射した卵母細胞をPrP-APでプロービングし、蛍光
性アルカリホスファターゼ（AP）基質で可視化した。陽性対照として、elf RNA
（elf）を注射し、そのリガンドmek-4-APでプロービングし、同様の方法で可視
化した。

【図１１】可溶性ヒトPC2に対するマウスPrP-AP融合タンパク質の飽和結
合曲線を示すグラフである。

【図１２】 PC2アッセイ結果を示すグラフである。2種類のPC2上清希釈液
を使用して、BSE脳および正常(NZ)脳の抽出物をアッセイした。405 nmでとった
吸光度値をバックグラウンドに対して標準化し(PC2-ve)、平均+/-SD、n=5として
表した。

【図１３Ａおよび１３Ｂ】リンパ球上のPC2分布を示すグラフである。図
１３Aは、図１３Bの末梢血T細胞(CD3陽性)とは異なり、末梢血B細胞(CD19陽性)
はPC2を同時発現することを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 29/00 １０１Ａ６１Ｐ 35/00 35/00 37/00 37/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 19/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 1/68 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 ＺＮＡ 33/50 ＺＧ０１Ｎ 27/447 33/566 33/15 33/68 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/68 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｋ３２５Ａ３２５Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ドデュレットビンセントカナダ国ケベック州モントリオールクラークストリート 4826 (72)発明者パラミティオティユスタッシェカナダ国ケベック州ブシェルビルアルフレッドラリベルト 208 Ｆターム(参考） 2G045 AA13 BA11 CA26 CB01 DA36 FB03 FB12 GC15 4B024 AA01 BA31 CA04 DA02 DA12 EA04 GA11 HA01 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ43 QQ79 QR32 QR55 QS32 QS33 4C084 AA02 AA06 AA07 ZA01 ZA16 ZA18 ZA94 ZA96 ZB07 ZB15 ZB26 ZC54 4H045 AA10 AA30 BA10 BA41 CA40 DA86 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の段階を含む、プリオンタンパク質結合タンパク質（Pr
PBP）を同定する方法： a）細胞または生物試料と検出可能なプリオンタンパク質（PrP）融合タンパク質
とを、該融合タンパク質とPrPBPとの複合体形成を可能とする条件下で接触させ
る段階；及び b）該複合体を検出し、それにより該PrPBPを同定する段階。
【請求項２】検出可能なPrP融合タンパク質が高親和性でPrPBPと結合する
、請求項1記載の方法。
【請求項３】検出可能なPrP融合タンパク質がコンフォメーション依存的
にPrPBPとの結合を示す、請求項1記載の方法。
【請求項４】検出可能なPrP融合タンパク質がアルカリホスファターゼと
融合したプリオンタンパク質を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】 PrPBPが、ヒト、家畜、またはペットの種に由来する、請求
項1記載の方法。
【請求項６】 PrPBPが哺乳動物に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項７】哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、マウス、またはヤギである、請
求項6記載の方法。
【請求項８】 PrPBPが競合的にPrPまたはPrP融合タンパク質と結合するか
否かを決定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】 PrPBPがPrPまたはPrP融合タンパク質と結合する親和性を決
定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】 PrPまたはPrP融合タンパク質とPrPBPとの結合が、細胞増
殖を阻害するか、または細胞死を促進するか否かを決定する段階をさらに含む、
請求項1記載の方法。
【請求項１１】以下の段階を含む、PrPBPをコードする核酸分子を同定す
る方法： a）核酸分子のプールを発現し、通常は細胞表面にPrPを発現していない細胞集団
を提供する段階； b）該細胞集団を検出可能に標識されたPrPに曝す段階；及び c）検出可能に標識されたPrPと結合する細胞を同定し、それによりPrPBPをコー
ドする核酸分子を含む細胞を同定する段階。
【請求項１２】核酸分子がcDNAである請求項11記載の方法。
【請求項１３】核酸分子が哺乳動物核酸分子である、請求項11記載の方法
。
【請求項１４】細胞がカエル卵母細胞である、請求項11記載の方法。
【請求項１５】検出可能なタンパク質と共有結合したPrPを含むプリオン
タンパク質融合タンパク質。
【請求項１６】高親和性でPrPBPとの結合を示す、請求項15記載の融合タ
ンパク質。
【請求項１７】コンフォメーション依存的にPrPBPとの結合を示す、請求
項15記載の融合タンパク質。
【請求項１８】検出可能なタンパク質がアルカリホスファターゼである、
請求項15記載の融合タンパク質。
【請求項１９】プリオンタンパク質が、ヒト、家畜、またはペットの種に
由来する、請求項15記載の融合タンパク質。
【請求項２０】プリオンタンパク質が哺乳動物に由来する、請求項15記載
の融合タンパク質。
【請求項２１】哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、マウス、またはヤギである、
請求項20記載の融合タンパク質。
【請求項２２】可溶性である、請求項15記載の融合タンパク質。
【請求項２３】分泌型タンパク質である、請求項15記載の融合タンパク質
。
【請求項２４】以下の段階を含む、生物試料中のPrP^Scを検出する方法：
a）生物試料とPrPBPまたはそのPrP結合断片もしくは類似体とを接触させる段階
；及び b）該PrPBPと該生物試料中のPrP^Scとの複合体形成を検出し、該複合体形成を該
生物試料中のPrP^Scの存在の指標とする段階。
【請求項２５】検出段階が、標識PrP特異的抗体を使用して実施され、PrP^Sc を欠く対照試料によって生成したシグナルよりも大きいシグナルを、該生物試
料中のPrP^Scの存在の指標とする、請求項24記載の方法。
【請求項２６】検出段階が、標識PrPBPを使用して実施され、PrP^Scを欠く
対照試料によって生成したシグナルよりも大きいシグナルを、該生物試料中のPr
P^Scの存在の指標とする、請求項24記載の方法。
【請求項２７】検出段階が、標識PrP^Sc特異的抗体を使用して実施される
、請求項24記載の方法。
【請求項２８】接触段階の後であり、且つ検出段階の前に、生物試料中の
PrP^Cを破壊する段階をさらに含む、請求項24記載の方法。
【請求項２９】 PrP^Cがタンパク質分解により破壊される、請求項28記載の
方法。
【請求項３０】 PrPBPが検出可能である、請求項24記載の方法。
【請求項３１】 PrPBPが検出可能な融合タンパク質である、請求項30記載
の方法。
【請求項３２】 PrPBP融合タンパク質がPrPBP-アルカリホスファターゼ融
合タンパク質である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】 PrPBPが、放射性、蛍光性、発色性、もしくは化学発光性
の標識、またはハプテンで標識されている、請求項30記載の方法。
【請求項３４】複合体形成が標識PrPBP特異的抗体を使用して検出される
、請求項24記載の方法。
【請求項３５】複合体形成が、フィルター結合、免疫沈降、ゲル電気泳動
分離、遠心沈降、または濾過により検出される、請求項24記載の方法。
【請求項３６】 PrP^Scが固相支持体上に固定化されている、請求項24記載
の方法。
【請求項３７】 PrPBPまたはそのPrP結合断片もしくは類似体が固相支持体
上に固定化されている、請求項24記載の方法。
【請求項３８】複合体形成がPrP特異的抗体を使用して検出される、請求
項37記載の方法。
【請求項３９】以下の段階を含む、生物試料中のPrP^Scを検出する方法：
a）生物試料とPrPBP：標識PrP複合体とを接触させる段階、 b）生物試料中のPrP^Cを破壊する段階；及び c）生物試料中に存在する非標識PrP^Scによって該PrPBP：PrP複合体内の標識PrP
の置換を検出し、該置換を該生物試料中のPrP^Scの存在の指標とする段階。
【請求項４０】標識PrPが標識PrP^Scである、請求項39記載の方法。
【請求項４１】標識PrPがPrP融合タンパク質である、請求項39記載の方法
。
【請求項４２】 PrP融合タンパク質が、PrP-アルカリホスファターゼ融合
タンパク質である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】 PrP^Cがタンパク質分解により破壊される、請求項39記載の
方法。
【請求項４４】複合体またはPrP^Scが固相支持体上に固定化されている、
請求項39記載の方法。
【請求項４５】 PrPが、放射性、蛍光性、発色性、もしくは化学発光性の
標識、またはハプテンで標識されている、請求項39記載の方法。
【請求項４６】複合体が、フィルター結合、免疫沈降、ゲル電気泳動分離
、遠心沈降、または濾過により検出される、請求項39記載の方法。
【請求項４７】以下の段階を含む、生物試料中のPrP^Scを検出する方法：
a）生物試料とPrPBP：標識PrP複合体とを接触させる段階；及び b）生物試料中に存在する非標識PrP^Scによって該PrPBP：PrP複合体内の標識PrP
の置換を検出し、PrP^Scを欠く対照試料と比した複合体会合標識の減少を、該生
物試料中のPrP^Scの存在の指標とする段階。
【請求項４８】 PrPBPが、ヒト、家畜、またはペットの種に由来する、請
求項24または39記載の方法。
【請求項４９】 PrPBPが哺乳動物PrPBPである、請求項24または39記載の方
法。
【請求項５０】哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、マウス、またはヤギである、
請求項49記載の方法。
【請求項５１】生物試料が、ヒト、家畜、またはペットの種に由来する、
請求項24または39記載の方法。
【請求項５２】 PrPBPが可溶性である、請求項24または39記載の方法。
【請求項５３】 PrPBPがカドヘリンである、請求項24または39記載の方法
。
【請求項５４】カドヘリンがプロトカドヘリン-43である、請求項53記載
の方法。
【請求項５５】カドヘリンがOB-カドヘリン-1である、請求項53記載の方
法。
【請求項５６】カドヘリンが配列番号：2記載の配列を有する、請求項54
記載の方法。
【請求項５７】カドヘリンが配列番号：8または9記載の配列を有する、請
求項55記載の方法。
【請求項５８】 PrPBPまたはそのPrP結合断片もしくは類似体を含む、生物
試料中のPrP^Scを検出するキット。
【請求項５９】 PrP特異的抗体をさらに含む、請求項58記載のキット。
【請求項６０】 PrP特異的抗体がPrP^Sc特異的抗体である、請求項59記載の
キット。
【請求項６１】 PrPBPが検出可能である、請求項58記載のキット。
【請求項６２】 PrPBPが検出可能な融合タンパク質である、請求項61記載
のキット。
【請求項６３】 PrPBPがPrPBP-アルカリホスファターゼ融合タンパク質で
ある、請求項62記載のキット。
【請求項６４】 PrPBPが、放射性、蛍光性、発色性、もしくは化学発光性
の標識、またはハプテンで標識されている、請求項61記載のキット。
【請求項６５】 PrPBPが固相支持体上に固定化されている、請求項58記載
のキット。
【請求項６６】標識PrPをさらに含む、請求項58記載のキット。
【請求項６７】 PrPBPが、ヒト、家畜、またはペットの種に由来する、請
求項58記載のキット。
【請求項６８】 PrPBPが哺乳動物PrPBPである、請求項58記載のキット。
【請求項６９】哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、マウス、またはヤギである、
請求項68記載のキット。
【請求項７０】 PrPBPがカドヘリンである、請求項58記載のキット。
【請求項７１】カドヘリンがプロトカドヘリン-43である、請求項70記載
のキット。
【請求項７２】カドヘリンがOB-カドヘリン-1である、請求項70記載のキ
ット。
【請求項７３】カドヘリンが配列番号：2記載の配列を有する、請求項71
記載のキット。
【請求項７４】カドヘリンが配列番号：8または9記載の配列を有する、請
求項72記載のキット。
【請求項７５】プリオン疾患の治療のための可能性のある治療用化合物を
同定する方法であって、 a）試験化合物の存在下で選択されたPrPBPとPrP^ScまたはPrP^Cとの結合を測定す
る段階；及び b）試験化合物の非存在下で選択されたPrPBPとPrP^ScまたはPrP^Cとの結合を測定
する段階を含み、試験化合物の非存在下で選択されたPrPBPとPrP^ScまたはPrP^Cとの結合のレベル
よりも低い、試験化合物の存在下での選択されたPrPBPとPrP^ScまたはPrP^Cとの結
合のレベルを、試験化合物がプリオン疾患の治療のための可能性のある治療用化
合物であることの指標とする方法。
【請求項７６】選択されたPrPBPがカドヘリンである、請求項75記載の方
法。
【請求項７７】カドヘリンがプロトカドヘリン-43である、請求項76記載
の方法。
【請求項７８】カドヘリンがOB-カドヘリン-1である、請求項76記載の方
法。
【請求項７９】選択されたPrPBPが配列番号：2記載の配列を有する、請求
項77記載の方法。
【請求項８０】選択されたPrPBPが配列番号：8または9記載の配列を有す
る、請求項78記載の方法。
【請求項８１】プリオン疾患が、ヒト、家畜、またはペットの種に影響を
与えるものである、請求項75記載の方法。
【請求項８２】プリオン疾患が、ヒト、ウシ、ヒツジ、またはヤギに影
響を与えるものである、請求項75記載の方法。
【請求項８３】生物試料中のPrP^Scを阻害する方法であって、生物試料とP
rPBPとを、PrP^Scと該PrPBPとの複合体形成を可能にする条件下で接触させる段階
を含む方法。
【請求項８４】生物試料からPrP^Sc：PrPBP複合体を回収する段階をさらに
含む、請求項83記載の方法。
【請求項８５】哺乳動物におけるプリオン疾患を治療する方法であって、
治療的に有効量のPrPBPの全部またはPrP結合部分を、該哺乳動物に投与する段階
を含む方法。
【請求項８６】 PrPBPがカドヘリンである、請求項85記載の方法。
【請求項８７】カドヘリンがプロトカドヘリン-43である、請求項86記載
の方法。
【請求項８８】カドヘリンがOB-カドヘリン-1である、請求項86記載の方
法。
【請求項８９】 PrPBPが配列番号：2記載の配列を有する、請求項87記載の
方法。
【請求項９０】 PrPBPが配列番号：8または9記載の配列を有する、請求項8
8記載の方法。
【請求項９１】哺乳動物における望ましくないPrP^CとPrPBPとの相互作用
レベルと関連した障害を治療する方法であって、治療的に有効量のPrPBPの全部
またはPrP結合部分を、該哺乳動物に投与する段階を含む方法。
【請求項９２】 PrPBPがカドヘリンである、請求項91記載の方法。
【請求項９３】障害が癌である、請求項91記載の方法。
【請求項９４】障害が神経変性疾患である、請求項91記載の方法。
【請求項９５】障害が免疫学的障害である、請求項91記載の方法。
【請求項９６】障害が免疫グロブリンの異常な増殖または分泌を含む、請
求項91記載の方法。
【請求項９７】障害がリンパ腫、多発性骨髄腫、単一クローン性高ガンマ
グロブリン血症、B細胞関連自己免役疾患、重症筋無力症、または慢性関節リウ
マチである、請求項91記載の方法。
【請求項９８】カドヘリンがプロトカドヘリン-43である、請求項92記載
の方法。
【請求項９９】カドヘリンがOB-カドヘリン-1である、請求項92記載の方
法。
【請求項１００】 PrPBPが配列番号：2記載の配列を有する、請求項98記載
の方法。
【請求項１０１】 PrPBPが配列番号：8または9記載の配列を有する、請求
項99記載の方法。
【請求項１０２】哺乳動物が、ヒト、家畜、またはペットの種である、請
求項91記載の方法。
【請求項１０３】哺乳動物が、ヒト、ウシ、ヒツジ、またはヤギである、
請求項91記載の方法。
【請求項１０４】以下の段階を含む、生物試料中のBリンパ球を検出する
方法： a）生物試料とPrPBPまたはそのPrP結合断片もしくは類似体とを接触させる段階
；及び b）該PrPBPと該生物試料との複合体形成を検出し、該複合体形成を該生物試料中
のBリンパ球の存在の指標とする段階。
【請求項１０５】生物試料が血液試料である、請求項104記載の方法。
【請求項１０６】 PrPBPがカドヘリンである、請求項104記載の方法。
【請求項１０７】カドヘリンがプロトカドヘリン-43である、請求項104記
載の方法。
【請求項１０８】 PrPBPが配列番号：2記載の配列を有する、請求項107記
載の方法。
【請求項１０９】 PrPBPを含む、Bリンパ球を検出するキット。
【請求項１１０】 PrPBPがカドヘリンである、請求項109記載のキット。
【請求項１１１】カドヘリンがプロトカドヘリン-43である、請求項110記
載のキット。
【請求項１１２】 PrPBPが配列番号：2記載の配列を有する、請求項111記
載のキット。