CN109750103A - 基于飞行时间质谱的高度近视基因检测试剂盒、芯片及高度近视检测方法 - Google Patents
基于飞行时间质谱的高度近视基因检测试剂盒、芯片及高度近视检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种基于飞行时间质谱的高度近视基因检测试剂盒、芯片及高度近视检测方法，该试剂盒包括，用于检测与高度近视相关的24个位点的基因型的多重PCR扩增引物对和延伸引物。本发明根据现有高度近视相关的24个基因位点设计特异性引物，测定这些位点的基因型，通过数据分析获得高度近视的风险值。
Description
技术领域
本发明涉及生物基因芯片领域，具体涉及一种基于飞行时间质谱的高度近视基因检测试剂盒、芯片及高度近视检测方法。
背景技术
高度近视又称病理性近视，被定义为一种折射误差为-6.00度或更少的视觉情况，它影响3％的世界人口。近视在亚洲更为常见。这个进展性疾病的并发症包括黄斑变性、白内障、视网膜脱离、脉络膜新生血管等，这些并发症已经成为主要的视力障碍和致盲原因，严重影响个人生活质量。
全基因组关联研究(GWAS)成为研究常见复杂疾病遗传易感基因的主要手段，而高度近视具有较高的遗传度。迄今为止，已有多项GWAS对近视眼相关表型，如屈光不正或内表型，如眼轴长度、角膜曲率的遗传易感基因单核苷酸多态性(SNP)进行探索和研究，并在亚洲和高加索人群中鉴定出多个与近视眼及其屈光表型发病风险相关的易感位点，极大地更新了对近视眼遗传构架的认识。然而，目前还没有有效的技术精准地计算高度近视患病风险。
发明内容
本申请提供一种基于飞行时间质谱的高度近视基因检测试剂盒、芯片及高度近视检测方法，根据现有高度近视相关的24个基因位点设计特异性引物，测定这些位点的基因型，通过数据分析获得高度近视的风险值。
根据第一方面，一种实施例中提供一种基于飞行时间质谱的高度近视基因检测试剂盒，该试剂盒包括用于检测如下24个位点的基因型的如下多重PCR扩增引物对和延伸引物：
rs7839488：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2；和SEQ ID NO:3；
rs10453441：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5；和SEQ ID NO:6；
rs1401327：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8；和SEQ ID NO:9；
rs8027411：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11；和SEQ ID NO:12；
rs1254319：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14；和SEQ ID NO:15；
rs560766：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17；和SEQ ID NO:18；
rs4455882：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20；和SEQ ID NO:21；
rs10034228：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23；和SEQ ID NO:24；
rs7837791：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26；和SEQ ID NO:27；
rs9318086：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29；和SEQ ID NO:30；
rs2730260：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:32；和SEQ ID NO:33；
rs6469937：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:35；和SEQ ID NO:36；
rs17648524：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38；和SEQ ID NO:39；
rs939661：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41；和SEQ ID NO:42；
rs17183295：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:44；和SEQ ID NO:45；
rs1881492：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47；和SEQ ID NO:48；
rs11145465：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:50；和SEQ ID NO:51；
rs4395927：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53；和SEQ ID NO:54；
rs13382811：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:56；和SEQ ID NO:57；
rs7042950：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59；和SEQ ID NO:60；
rs7744813：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:62；和SEQ ID NO:63；
rs3138144：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65；和SEQ ID NO:66；
rs10882165：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:68；和SEQ ID NO:69；
rs11601239：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71；和SEQ ID NO:72。
在优选实施例中，所述试剂盒还包括如下一种或多种组分：
(1)多重PCR扩增组分，其包括dNTP混合物、PCR缓冲液、MgCl2和Taq酶中的一种或多种；
(2)虾碱性磷酸酶及其缓冲液中的至少一种；
(3)延伸反应组分，其包括延伸酶(iPLEX enzyme)、终止混合物(iPLEXTermination mix)和延伸缓冲液(iPLEX Buffer Plus)中的一种或多种；
(4)用于纯化DNA的阳离子交换树脂；和
(5)HPLC级水。
在优选实施例中，所述试剂盒还包括基因组DNA提取试剂盒。
在优选实施例中，所述基因组DNA提取试剂盒是用于从血液或者口腔细胞中提取DNA的试剂盒。
根据第二方面，一种实施例中提供一种基于飞行时间质谱的高度近视基因检测芯片，该芯片包括光谱晶片(Spectro Chip)和固定于所述光谱晶片上的纯化的DNA产物，其中所述DNA产物通过如下方法制得：
(1)使用第一方面的试剂盒中的多重PCR扩增引物对对受检者基因组的所述24个位点进行多重PCR扩增；
(2)利用虾碱性磷酸酶(SAP酶)消化所述多重PCR扩增的产物中多余的dNTP；
(3)加入第一方面的试剂盒中的延伸引物，通过单碱基延伸ddNTP得到小片段DNA产物；和
(4)使用阳离子交换树脂纯化所述小片段DNA产物，再将纯化后的产物点到所述光谱晶片上，形成共结晶薄膜。
根据第三方面，一种实施例中提供一种分析高度近视基因的基因型的方法，该方法包括：
(1)获取第二方面的高度近视基因检测芯片；和
(2)使用飞行时间质谱仪发出的激光照射所述芯片，使所述芯片上的DNA产物电离，并在电场作用下加速后匀速飞过飞行时间质谱仪的飞行管道，根据到达检测器的飞行时间计算所述DNA产物的分子量，并对所述分子量进行分析获取所述24个位点的基因型。
根据第四方面，一种实施例中提供一种非诊断性的基于飞行时间质谱检测高度近视的方法，该方法包括：
(1)获取第二方面的高度近视基因检测芯片；
(2)使用飞行时间质谱仪发出的激光照射所述芯片，使所述芯片上的DNA产物电离，并在电场作用下加速后匀速飞过飞行时间质谱仪的飞行管道，根据到达检测器的飞行时间计算所述DNA产物的分子量，并对所述分子量进行分析获取所述24个位点的基因型；和
(3)根据所述位点的基因型对高度近视的权重，依据权重公式计算与高度近视相关的分值，并根据所述分值分析高度近视情况。
在优选实施例中，所述权重公式如下：
分值(Score)＝GDJS-002*0.11109+GDJS-004*0.08976-0.15712*GDJS-006-0.15991*GDJS-008+0.15818*GDJS-009-0.15097*GDJS-010+0.15943*GDJS-012+0.32315*GDJS-019-0.26467*GDJS-020-0.21814*GDJS-024+0.03491*受检者年龄+0.34432；
其中，GDJS-002、GDJS-004、GDJS-006、GDJS-008、GDJS-009、GDJS-010、GDJS-012、GDJS-019、GDJS-020和GDJS-024分别表示rs10453441、rs8027411、rs560766、rs10034228、rs7837791、rs9318086、rs6469937、rs13382811、rs7042950和rs11601239位点基因型的赋值。
在优选实施例中，所述高度近视情况根据所述分值与临界值比较得到，所述分值高于所述临界值提示高度近视，所述分值低于所述临界值提示非高度近视。
在优选实施例中，所述临界值是1.45。
本发明根据现有高度近视相关的24个基因位点设计特异性引物，测定这些位点的基因型，通过数据分析获得高度近视的风险值。特别值得一提的是，相对于其他的高度近视基因型检测方法，本发明基于飞行时间质谱检测高度近视，具有以下技术优势：
(1)高度近视位点多，覆盖率高：本发明同时对高度近视相关的24个基因位点进行基因型检测，针对24个基因位点设计多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物，解决了同时对高度近视相关的24个基因位点同时进行检测的多重PCR扩增引物和单碱基延伸的问题。本领域公知的事实是，从单一PCR到多重PCR，并非多个单一PCR引物简单地叠加，其实验设计的难度随之成倍增加。然而，本发明人经过艰苦努力和创造性劳动得到的引物组合既不互相结合，也不与模板DNA上靶点以外的区域结合，克服了多重PCR扩增中问题，特别是解决了多个靶点扩增条件不兼容的问题。从而保证了本发明的引物组合的高特异性和高灵敏度，而这一点对于基于飞行时间质谱检测基因位点基因型的技术至关重要。
(2)检测通量高，操作简单周期短：本发明的方法主要包括多重PCR扩增和单碱基延伸两步反应，操作过程简单，其引物扩增产物在芯片基底上形成共结晶薄膜，阵列密度高，适合于人群中进行大规模、大范围的高度近视基因型和风险筛查。
(3)高准确率，高稳定性：本发明的基于飞行时间质谱检测方法直接检测单碱基延伸产物的分子量，通过分子量的变化直接判读分型结果，不需要荧光标记，避免了荧光标记的质量对结果的影响，而且检测系统为非杂交依赖性，不存在潜在杂交错配的干扰。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
时间飞行质谱技术全称基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术。PCR扩增后的产物，加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基。然后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，而后用瞬时纳秒(10-9s)强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight TOF)检测器来检测，离子质量越小，就越快到达。
本发明中，SNP分型主要采用的是Agena Bioscience公司的Massarray System机器。用于基因分型的基本步骤为：第一，针对拟检测目标基因位点的区域设计特异性扩增引物对与延伸引物；第二，对目标基因区域进行多重PCR扩增，扩增出含目标SNP的DNA片段；第三，向扩增反应后的体系中加入虾碱性磷酸酶进行消化反应，去除多余的dNTP；第四，向体系中加入对应的延伸引物混合液，进行引物单碱基延伸ddNTP得到小片段DNA产物；第五，用阳离子交换树脂，对延伸反应产物进行树脂纯化，纯化完成后使用微量点样仪点样，并使样本与芯片(例如与DNA有极大亲和力的光谱晶片Spectro Chip)上的基质共结晶，形成共结晶薄膜；最后，利用MALDI-TOF-MS直接对延伸引物产物的分子量进行检测，判读结果需要通过软件实现，具体而言，用一定强度的激光照射样品(DNA)与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品子电离，电离的样品在电场作用下加速后匀速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即根据待测离子的质量电荷之比(M/Z)与离子的飞行时间成正比的计算公式来检测样品分子的分子量，分析的过程中用MassARRAYTM RT软件分析样品质量及分型。
本发明的检测技术要求样本为DNA，肉眼观察液体澄清无杂物。从受检者血液或者口腔细胞中提取DNA，DNA浓度大于10ng/μL，DNA溶液体积大于10μL。本发明中使用的DNA样品，可以采用从血液或者口腔细胞中提取DNA的方法，全血基因组DNA可以采用例如北京天根公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行提取。本发明中使用的DNA样品，也可以口腔拭子基因组DNA提取方法，口腔拭子基因组DNA可以采用北京天根公司的口腔拭子基因组DNA提取试剂盒进行提取。本发明中可以使用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测提取的DNA浓度及纯度，提取DNA样本需要进行分装并置于-20℃长期保存。
本发明的技术利用多重PCR原理，对拟测定位点进行引物设计，通过参数调整优化，获得最优引物对组合。本发明中多重PCR扩增引物的设计原则如下：引物序列应设计在相对保守区域，避开SNP位点，除满足基本PCR引物的设计要求外，需要注意各引物的退火温度应尽量一致。对于突变位点相对集中的位置，可以考虑设计一对PCR扩增引物。多重扩增的引物应充分考虑引物之间的相互干扰和引物二聚体的形成。需要说明的是，必须通过实验验证引物的特异性和灵敏度，特别是引物之间的相互干扰和引物二聚体的形成情况，仅根据设计原理通过软件设计得到的引物并不一定符合这些要求。
单碱基延伸引物的设计要求：延伸引物的长度一般来讲应在17～28bp之间，3’端的一段(例如10bp)范围内的碱基必须与参考序列完全匹配，引物覆盖区域避免出现SNP位点，可以通过调整引物在突变位点到上游或者下游来获得符合要求的引物。质谱分析要求单碱基延伸产物的分子量差异大于15Da，允许在延伸引物的5’端加上1～5个与参考序列不匹配碱基以保证分子量能区分开。
本发明至关重要的难点是获得同时对高度近视相关的24个基因位点进行检测的多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物。每个位点需要两条多重PCR扩增引物和一条单碱基延伸引物。24个基因位点需要共72条多重PCR扩增引物和单碱基延伸引物，这些引物既不能互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合。此外，多重PCR中的不同扩增片段还会互相竞争资源，其结果是高丰度模板能够被很容易的检测到，而低丰度的模板彻底沦为背景。
本发明人经过艰苦努力和创造性劳动得到的引物组合既不互相结合，也不与模板DNA上靶点以外的区域结合，克服了多重PCR扩增中问题，特别是解决了多个靶点扩增条件不兼容的问题。从而保证了本发明的引物组合的高特异性和高灵敏度，而这一点对于基于飞行时间质谱检测基因位点基因型的技术至关重要。
表1示出了本发明中高度近视相关的24个基因位点的飞行时间质谱扩增引物及单碱基延伸引物序列。
表1
实验过程包括如下步骤：
1.稀释引物和质检
(1)将接收到的待稀释引物和延伸引物稀释单拿进试剂准备区，先把管壁上的引物名称抄写在管盖上；将引物按顺序放入离心机中，14000rpm离心2min，离心完毕后将引物按顺序放回引物盒；多重PCR引物按管壁上nmol数乘以10的加水量稀释；延伸引物按稀释单的加水量稀释。稀释完毕后于漩涡振荡器振荡20s，再6000rpm离心30s，并按顺序放回引物盒；将稀释好的引物放进4℃冰箱暂存，引物长期保存需存放于-20℃
(2)配制引物mix：稀释好的引物放4℃冰箱静置5～6个小时后才能配制引物mix，若急用，则每隔30分钟振离一次，4次后方可以配制引物mix。从试剂准备区的4℃冰箱或冰柜拿出需要配制mix的引物母液，室温溶解后于漩涡振荡器振荡数秒，再6000rpm离心2s；配制引物mix前先计算好各种引物的用量和加水量，并写在引物配制记录本上。配好后于漩涡振荡器振荡10s，6000rpm离心2s，放入相应项目的冻存盒，-20℃保存。
(3)引物测试：新订购的延伸引物配制引物mix后要做引物测试，以确定该延伸引物的浓度是否符合质谱实验。引物测试的mix统一为：2μL延伸引物mix加水52μL。先触底加水后贴液面加延伸引物mix，配好后于漩涡振荡器振荡10s，再6000rpm离心数秒。之后进行引物测试，引物测试结果判断，查看引物条数是否齐全，每条引物的分子量是否正确；查看引物峰图是否符合标准，整体引物的峰高要均匀。
2.多重PCR扩增反应
(1)从-20℃冰箱中取出试剂、待测DNA样本等置于室温融化，涡旋振荡15s，瞬时离心，确保管壁无液滴残留。PCR酶需要始终置于冰浴中。
(2)PCR反应体系见表2。
表2
(3)PCR反应程序见表3。
表3
3.SAP酶消化反应
(1)取出上步反应产物，室温融化，4000rpm离心1min。
(2)取出SAP反应试剂，SAP酶需始终置于冰浴中，其它试剂置于室温融化，涡旋振荡15s后瞬时离心。
(3)SAP酶混合液反应体系见表4。
表4
(4)SAP酶混合液反应程序见表5。
表5
4.单碱基延伸反应
(1)取出上步反应产物，室温融化，4000rpm离心1min。
(2)从-20℃冰箱中取iPLEX延伸反应试剂，将iPLEX酶需始终置于冰浴中，其它试剂置于室温融化，涡旋振荡15s后瞬时离心，去除管壁的液体。
(3)iPLEX反应体系配制见表6。
表6
(4)iPLEX反应程序见表7。
表7
5.iPLEX单碱基延伸产物脱盐，树脂纯化
完成上一步后，将产物板在天平上与配平板配平，4000rpm离心2min。取出一瓶树脂，取适量树脂到纯化板相应位置左侧，所涂布的位置等同于产物板翻转180度时，反应孔对应在纯化板的位置。用刮刀从左向右，单方向多次刮动，将树脂涂布于纯化板的相应孔中，确保其每个孔都铺满树脂。将涂布好的树脂，室温干燥10～20分钟，干燥后颜色会由深黄色变为浅黄色。产物板放在水平桌面上，一只手按紧产物板，另一只手慢慢揭开封口膜。调移液器量程至16μL，用200μL吸头往相应的反应孔中加入超纯水。加水完毕后，用封口膜严紧封上产物板，用刮膜工具先刮孔上面，再刮四周，确保封口膜与产物板严密结合，在天平上与配平板配平，离心4000rpm，1min。将产物板正确倒放在树脂纯化板上；对好产物板和树脂纯化板并使之固定在一起，拿稳、轻轻颠倒，让产物板在下，树脂纯化板在上；然后轻敲树脂纯化板四周边缘，确保所有树脂掉下来，若还有个别孔的树脂没掉下来，应将树脂倒到干净的PE手套上，用干净吸头挑入对应的孔中。所有产物孔内均已加入树脂后，用封口膜封上产物板，用刮膜工具先刮孔上面，再刮四周，确保封口膜与产物板严密结合，在静音混匀器上，室温，沿着长轴360°旋转，旋转产物板30min，并且记录混匀开始时间。混旋结束后，在天平上与配平板配平，离心4000rpm，2min。
6.芯片点样
芯片点样依照说明书进行.
7.Mass Array上机分析
单碱基延伸产物通过质谱检测，获得延伸产物的分子量，分析软件计算延伸引物自身的分子量以及延伸产物可能的分子量的差值，与软件内预先设定好的每个位点延伸引物及可能碱基ddNTP的分子量进行比对。分析的过程中用MassARRAYTM RT软件分析样品质量及分型。
以下通过实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例
在本发明的实施例中，采用本发明的引物设计(表1)、样本制备、上机测序以及和数据分析结合的方法，对收集到的DNA样本进行检测，获得样本中24个位点的突变信息。
第一阶段，收集14个阳性样本，28个阴性样本，测定其基因型。
第二阶段，根据文件检索整理的数据库(表8)，计算样本对应基因型的分值。
第三阶段，使用线性回归模型，对其进行拟合，获得以下公式：
分值(Score)＝GDJS-002*0.11109+GDJS-004*0.08976-0.15712*GDJS-006-0.15991*GDJS-008+0.15818*GDJS-009-0.15097*GDJS-010+0.15943*GDJS-012+0.32315*GDJS-019-0.26467*GDJS-020-0.21814*GDJS-024+0.03491*受检者年龄+0.34432；
其中，GDJS-002、GDJS-004、GDJS-006、GDJS-008、GDJS-009、GDJS-010、GDJS-012、GDJS-019、GDJS-020和GDJS-024分别表示rs10453441、rs8027411、rs560766、rs10034228、rs7837791、rs9318086、rs6469937、rs13382811、rs7042950和rs11601239位点基因型的赋值(分值)。
第四阶段，将分值标准化：标准化分值(Score)＝exp(Score)。
根据目标数值设定最小值＝0.16；最大值＝2.5；临界值＝1.45。低于临界值1.45为低风险，高于临界值1.45为高风险。
表8
本实施例中，募集1名高度近视者(S1)和2名无高度近视者(S2、S3)。采用本发明的引物设计、文库制备、上机测序以及和数据分析结合的方法，对收集到的DNA样本进行检测，获得样本中24个位点的突变信息。
S1：上机测序结果(表9)，收样时记录年龄28岁，代入分值(Score)公式，计算分值为2.5738，大于1.45，是高风险，与其高度近视表型一致。
S2：上机测序结果(表10)，收样时记录年龄30岁，代入分值(Score)公式，计算分值为1.1218，小于1.45，是低风险，与其无高度近视表型一致。
S3：上机测序结果(表11)，收样时记录年龄27岁，代入分值(Score)公式，计算分值为1.1939，小于1.45，是低风险，与其无高度近视表型一致。
表9
表10
| 位点名称 | 基因型 | 赋值 |
| GDJS-001 | GG | 0 |
| GDJS-007 | AA | 0 |
| GDJS-011 | GT | 1 |
| GDJS-012 | GG | 0 |
| GDJS-018 | CC | 0 |
| GDJS-002 | GG | 0 |
| GDJS-022 | GG | 2 |
| GDJS-020 | GG | 2 |
| GDJS-023 | AA | 0 |
| GDJS-013 | GG | 0 |
| GDJS-016 | GG | 0 |
| GDJS-006 | AG | 1 |
| GDJS-014 | AG | 1 |
| GDJS-003 | GG | 0 |
| GDJS-017 | CC | 0 |
| GDJS-004 | GT | 1 |
| GDJS-005 | GG | 0 |
| GDJS-008 | CT | 1 |
| GDJS-009 | TT | 0 |
| GDJS-010 | AA | 2 |
| GDJS-015 | CC | 0 |
| GDJS-019 | CC | 0 |
| GDJS-021 | AA | 2 |
| GDJS-024 | CG | 1 |
表11
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳乐土生物科技有限公司
<120> 基于飞行时间质谱的高度近视基因检测试剂盒、芯片及高度近视检测方法
<130> 18I27497
<160> 72
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgttggatg ttgagttggc attgcaaacc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgttggatg gttgtataac ttggaggagc 30
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttgcaaaccg cccct 15
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acgttggatg agtggaatca gggtctccca 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acgttggatg acttcatgat catcacctcg 30
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agttggaggt gctga 15
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acgttggatg acaaacaaac acctcttcc 29
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acgttggatg catcttccaa aatactaccc g 31
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tccaacccaa atggag 16
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acgttggatg aaaccaccac aggtaaggac 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acgttggatg agccttgctt gatcactcag 30
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggagcttgag gacaaa 16
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acgttggatg gtaaagccat cttctccttc 30
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
acgttggatg gaagagcatg atattgtaat g 31
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cccttctggc ttctcaa 17
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acgttggatg gttcttctac tttccccttg 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
acgttggatg ttgcctgtct cctagttacg 30
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ccccttggtt taaggct 17
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
acgttggatg atctactatg tgccaggagt 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
acgttggatg ccagataatg ctaggttcac 30
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tgtgccagga gttataat 18
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
acgttggatg gagtggtgca ttttcatgac 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
acgttggatg tttgactgtg gttatgaggg 30
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ccactgccac actaacaaa 19
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
acgttggatg cattgagaga catatggtcc 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
acgttggatg catctgaggt gacaaaatat 30
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
agacatatgg tcctttccc 19
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
acgttggatg cacaggagga tatagaagcc 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
acgttggatg ggtccatctg gaaggatata 30
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tagaggagta cttctgtca 19
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
acgttggatg cacaggtgga ttatggacag 30
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
acgttggatg cttgagtcct cttaagaaat c 31
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tggattatgg acagaaacat 20
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
acgttggatg ttctggctct cacacatccc 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
acgttggatg actcttcctg gagggatgac 30
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ccttcaaagt tccctcaatc t 21
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
acgttggatg caatcactat aggccagacc 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
acgttggatg ccaacgaaat caaggtggtg 30
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
aggccagacc ttctatcctt g 21
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
acgttggatg agtgggtata ccaagtgcag 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
acgttggatg tctcttcttg gtgacctgac 30
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
aattaagaag accatcacct g 21
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
acgttggatg catcatttgc tacgggttac 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
acgttggatg actgtcacaa gacagaaacc 30
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ggtgagctag acttattggc at 22
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
acgttggatg gtgggcagct tttcttcaac 30
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
acgttggatg tgctctccat atctcgccag 30
<210> 48
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
ccccccgctt ctgagttctc tat 23
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
acgttggatg ggtgcgaagt accacattac 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
acgttggatg tgtgcttcct ggagtacttg 30
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
tcgaagtacc acattactgt cat 23
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
acgttggatg agatgagtca aggccatcag 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
acgttggatg tttctttctg gaggcgctac 30
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
aagataagat taagatcctt tct 23
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
acgttggatg tcaagtggat caacggactg 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
acgttggatg ggttgcgaaa agagaactgg 30
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
ttgttaatag tcattaggcc ttca 24
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
acgttggatg gccaagctac cctaatatag 30
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
acgttggatg cactgtgcat aagcagaaag 30
<210> 60
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
agatacccta atatagcagc agac 24
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
acgttggatg aatggtcaac tcactagagc 30
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
acgttggatg aatgatctgt catctgtcac 30
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
gaatttgaaa caatcaagta gaat 24
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
acgttggatg caaccatggc tcatctgttc 30
<210> 65
<211> 30
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<213> 人工序列
<400> 65
acgttggatg tctggctcat gtggttttag 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
gggagagcaa agatgtgggc agac 24
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<213> 人工序列
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acgttggatg ctgtgtttag gtcttagagg 30
<210> 68
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
acgttggatg cactgttgat gggagtgttc 30
<210> 69
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
tcgtccacaa tggttgaact aattcc 26
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
acgttggatg tagcctgatg gcaaagatcc 30
<210> 71
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
acgttggatg gtgacttttc tgacttaaa 29
<210> 72
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
aaaagatcct taaaattaag tgaata 26
Claims (10)
1.一种基于飞行时间质谱的高度近视基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测如下24个位点的基因型的如下多重PCR扩增引物对和延伸引物：
rs7839488：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2；和SEQID NO:3；
rs10453441：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5；和SEQ ID NO:6；
rs1401327：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8；和SEQID NO:9；
rs8027411：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:10，SEQ ID NO: 11；和SEQ ID NO:12；
rs1254319：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:13，SEQ ID NO: 14；和SEQ ID NO:15；
rs560766：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17；和SEQ ID NO:18；
rs4455882：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20；和SEQ ID NO:21；
rs10034228：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23；和SEQ ID NO:24；
rs7837791：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26；和SEQ ID NO:27；
rs9318086：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29；和SEQ ID NO:30；
rs2730260：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:32；和SEQ ID NO:33；
rs6469937：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:35；和SEQ ID NO:36；
rs17648524：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:37，SEQ ID NO: 38；和SEQ ID NO:39；
rs939661：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41；和SEQ ID NO:42；
rs17183295：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:44；和SEQ ID NO:45；
rs1881492：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47；和SEQ ID NO:48；
rs11145465：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:50；和SEQ ID NO:51；
rs4395927：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53；和SEQ ID NO:54；
rs13382811：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:56；和SEQ ID NO:57；
rs7042950：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59；和SEQ ID NO:60；
rs7744813：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:62；和SEQ ID NO:63；
rs3138144：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65；和SEQ ID NO:66；
rs10882165：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:68；和SEQ ID NO:69；
rs11601239：多重PCR扩增引物对和延伸引物分别是：SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:71；和SEQ ID NO:72。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下一种或多种组分：
（1）多重PCR扩增组分，其包括dNTP混合物、PCR缓冲液、MgCl2和Taq酶中的一种或多种；
（2）虾碱性磷酸酶及其缓冲液中的至少一种；
（3）延伸反应组分，其包括延伸酶、终止混合物和延伸缓冲液中的一种或多种；
（4）用于纯化DNA的阳离子交换树脂；和
（5）HPLC级水。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基因组DNA提取试剂盒。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述基因组DNA提取试剂盒是用于从血液或者口腔细胞中提取DNA的试剂盒。
5.一种基于飞行时间质谱的高度近视基因检测芯片，其特征在于，所述芯片包括光谱晶片和固定于所述光谱晶片上的纯化的DNA产物，其中所述DNA产物通过如下方法制得：
（1）使用权利要求1的试剂盒中的多重PCR扩增引物对对受检者基因组的所述24个位点进行多重PCR扩增；
（2）利用虾碱性磷酸酶消化所述多重PCR扩增的产物中多余的dNTP；
（3）加入权利要求1的试剂盒中的延伸引物，通过单碱基延伸ddNTP得到小片段DNA产物；和
（4）使用阳离子交换树脂纯化所述小片段DNA产物，再将纯化后的产物点到所述光谱晶片上，形成共结晶薄膜。
6. 一种分析高度近视基因的基因型的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）获取权利要求5所述的高度近视基因检测芯片；和
（2）使用飞行时间质谱仪发出的激光照射所述芯片，使所述芯片上的DNA产物电离，并在电场作用下加速后匀速飞过飞行时间质谱仪的飞行管道，根据到达检测器的飞行时间计算所述DNA产物的分子量，并对所述分子量进行分析获取所述24个位点的基因型。
7.一种非诊断性的基于飞行时间质谱检测高度近视的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）获取权利要求5所述的高度近视基因检测芯片；
（2）使用飞行时间质谱仪发出的激光照射所述芯片，使所述芯片上的DNA产物电离，并在电场作用下加速后匀速飞过飞行时间质谱仪的飞行管道，根据到达检测器的飞行时间计算所述DNA产物的分子量，并对所述分子量进行分析获取所述24个位点的基因型；和
（3）根据所述位点的基因型对高度近视的权重，依据权重公式计算与高度近视相关的分值，并根据所述分值分析高度近视情况。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述权重公式如下：
分值= GDJS-002 * 0.11109 + GDJS-004 * 0.08976 - 0.15712 * GDJS-006 -0.15991 * GDJS-008 + 0.15818 * GDJS-009 - 0.15097 * GDJS-010 + 0.15943 *GDJS-012 + 0.32315 * GDJS-019 - 0.26467* GDJS-020 - 0.21814 * GDJS-024 +0.03491 * 受检者年龄 + 0.34432；
其中，GDJS-002、GDJS-004、GDJS-006、GDJS-008、GDJS-009、GDJS-010、GDJS-012、GDJS-019、GDJS-020和GDJS-024分别表示rs10453441、rs8027411、rs560766、rs10034228、rs7837791、rs9318086、rs6469937、rs13382811、rs7042950和rs11601239位点基因型的赋值。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述高度近视情况根据所述分值与临界值比较得到，所述分值高于所述临界值提示高度近视，所述分值低于所述临界值提示非高度近视。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述临界值是1.45。
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Denomination of invention: High myopia gene detection kit, chip, and high myopia detection method based on time-of-flight mass spectrometry Effective date of registration: 20230925 Granted publication date: 20221004 Pledgee: Luohu sub branch of Shenzhen Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: SHENZHEN LETU BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023980058624 |
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