CN109609612A - 一种基因组特定区域的dna测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,具体为一种基因组特定区域的DNA测序方法。本发明根据参考基因组序列设计多重延伸引物,再以待测基因组序列为模板将延伸引物延长一个碱基,最终根据测定的延伸产物序列拼接待测区域的DNA序列。本发明能够发挥MassArray飞行质谱或SNaPshot等高通量基因型分析手段的优势,适用于精确测定已知基因组序列发生自然或人工突变后的DNA序列信息。此外,本发明提供的方法还可以应用于变化随机多样的基因编辑产物的序列测定中,该方法不仅可以定性地检测靶标区域是否发生了编辑,也可以对编辑后序列进行精确地测定,而且由于其多重分析的特点,使得对编辑后靶标区域基因型的分析更加高效精准。本发明相比传统的Sanger测序提高了测序工作的通量、精准度和速度,降低了成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体为一种基因组特定区域的DNA测序方法。
背景技术
基因组变异是物种性状变化的原因,也是生物适应环境变化的分子基础。此外,人工诱导基因组变异(包括辐射或化学诱变、基因编辑等)能够在物种中产生新的性状变化,从而可以筛选到优异的性状并通过遗传的方式固化下来,这也成为了动植物育种的基本流程。无论是自然突变还是人工突变,测定特定区域的DNA序列成为研究性状变异的分子基础,明确变异分子机制的重要环节。传统的测序方法是通过PCR扩增等方法获得突变的靶标区域,再利用Sanger测序等方法获得具体的DNA序列。然而这种方法通量太低,对于大量样本的序列测定效率有限。而高通量的全基因组测序方式更是成本高昂。
基因编辑技术是通过靶定基因组特定目标区域,并对该区域进行随机碱基修饰的技术。通常情况下,基因编辑技术可导致目标区域内出现1个或多个碱基的缺失、替换或插入。因为碱基修饰方式的随机性,无法预测编辑产物的基因型序列信息(Cong L,Ran F A,Cox D,et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science,2013,339(6121):819-23;Mali P,Yang L,Esvelt K M,et al.RNA-guided human genomeengineering via Cas9[J].Science,2013,339(6121):823-6.)。
目前尽管已经开发了诸如PCR/限制性酶切分析、融解曲线分析、特异探针分析和Sanger测序等检测基因编辑产物的方法,但这些技术耗时、费力,很多方法不能准确测定编辑后的序列,严重影响了基因编辑技术的应用范围。此外,由于一次编辑操作会对特定基因组区域产生成百上千种基因型变化,因此迫切需要能够高通量、低成本、精确测定编辑区域序列的方法。
MassArray和SNaPshot等技术是近年来发展起来的高通量基因分型工具。
MassArray即飞行时间质谱生物芯片系统,是使用质谱分析方法来精确测定PCR产物的非荧光检测平台。质谱分析与终点法PCR相结合,在通用的循环条件下实现了高度多重性的反应,以提供精确、快速且经济高效的分析(Leushner J and Chiu N H.Automatedmass spectrometry:a revolutionary technology for clinical diagnostics[J].MolDiagn,2000,5(4):341-8.)。
MassArray系统的基本原理为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MAL-DI-TOFMS)技术。基本过程为PCR扩增后的产物,加入SNP序列特异延伸引物,并在反应体系中以ddNTP替代dNTP,使延伸引物仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止。然后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶,将该晶体放入质谱仪的真空管,再用瞬时纳秒强激光激发,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子,产生的离子多为单电荷离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能,进而在一非电场漂移区内按照其质荷比加以分离,在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间(time-of-flight,TOF)检测器来检测,离子质量越小,就越快到达。
基于MassArray的分子量阵列平台最高可以设计40多重PCR反应和基因型检测,而且在几秒内就能检测完一个反应孔,因此通量极高;此外,由于质谱仪检测的是分子量这个分子最本质的特征,因此分型结果的准确性很高。此外,MassArray系统还具有实验设计灵活,操作简单、兼容性好、污染率低等一系列优势。MassArray系统已经成为靶向基因型检测的独特解决方案。
此外,SNaPshot技术是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术,通过在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中,将引物延伸一个碱基即终止,经ABI测序仪检测后,根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点,根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类,从而确定该样本的基因型(Makridakis N M and Reichardt J K.Multiplex automated primer extensionanalysis:simultaneous genotyping of several polymorphisms[J].Biotechniques,2001,31(6):1374-80.)。与MassArray技术类似,SNaPshot也能够运行多重PCR反应体系,从而大幅提高基因分型的通量。
然而,传统的MassArray或SNaPshot系统只能对已知的特定一种或多种基因型进行鉴定,对像人工诱变、基因编辑产物这样特定基因组区域但基因型未知的样品,现在的MassArray或SNaPshot系统无法准确获得其基因型DNA序列信息。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种基因组特定区域的DNA测序方法,包括如下步骤:
1)根据参考基因组序列设计多重延伸引物;
2)以待测基因组序列为模板将延伸引物延长一个碱基;
3)根据测定的延伸产物序列拼接待测区域的DNA序列。
具体的,上述特定区域为基因组发生自然或人工突变的位置,突变方式包括但不限于不同种质间的自然突变,人工辐射或化学诱变、基因编辑等;上述的参考基因组为突变发生前的已知基因组序列,包括但不限于某一个特定种质的基因组序列,辐射或化学诱变、基因编辑的受体基因组序列等。
具体的,上述述多重延伸引物具体如下:
第一重延伸引物的序列与待测区域参考基因组第一个碱基之前的序列相同,第二重延伸引物的序列与待测区域参考基因组第二个碱基之前的序列相同,以此类推,直到延伸引物全部覆盖待测区域参考基因组最后一个碱基之前的序列,即第n重延伸引物的序列与待测区域参考基因组倒数第一个碱基之前的序列相同。
具体的,CRISPR-Cas9基因编辑产物的待测区域为距离PAM基序第4至第7个碱基。
具体的,上述引物延长通过加入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)来实现;上述延伸产物序列测定方法采用MassArray飞行质谱或SNaPshot等高通量基因分型工具检测实现。
具体的,上述基因组为玉米基因组。
本发明提供的方法的优势在于:
(1)实验设计简单。本发明提供的方法根据已知的参考基因组序列信息设计多重延伸引物,延伸引物覆盖待测区域,再根据延伸产物的序列拼接待测区域的序列。因此实验的设计相对简单,序列拼接仅需要通过简单的多重比对即可实现。
(2)测定通量高。一次可以设计几十重PCR反应或基因型检测。可以一次性获得多个突变样本特定区域的DNA序列信息。
(3)操作简单、数据准确度高。本发明提供的方法延伸产物的测定采用MassArray飞行质谱或SNaPshot等高通量基因分型工具检测实现。可以更好地发挥这些系统操作简单、数据准确度高的技术优势。
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明,术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等,其中的全部内容整体并入本文作为参考。
除非另有所指,核酸以5’至3’方向从左向右书写;氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。如本文所用,“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种,包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞,所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。
下面对本发明的技术方案作进一步说明,但并不局限于此,凡采用对本发明技术方案同等替换或修改,而不脱离本发明技术原理及主旨,均应涵盖在本发明要求的保护范围内。
实施例1:对玉米基因组编辑植株基因型的检测
利用CRISPP/Cas9基因编辑技术对作物基因组进行遗传修饰,可以精准改变那些控制重要性状的基因功能,从而实现对作物性状的改良优化。经过编辑操作的受体物种需要通过分析靶标区域的基因组序列以确认编辑成功与否,同时需要根据编辑后的基因型序列信息预测基因功能发生的变化以及目标性状的改变。因此,尽早明确目标植株靶标区域的编辑后序列信息是影响总体性状改良效率的关键。
通常情况下,基因编辑技术可导致目标区域内出现1个或多个碱基的缺失、替换或插入。因为碱基修饰方式的随机性,无法预测编辑产物的基因型序列信息。
目前尽管已经开发了诸如PCP/限制性酶切分析、融解曲线分析、特异探针分析和Sanger测序等检测基因编辑产物的方法,但这些技术耗时、费力。应用本发明提供的方法,可以根据编辑前受体的基因型序列信息,设计多重延伸引物覆盖预测的靶标编辑区域,然后利用MassArray或SNaPshot系统获得延伸产物序列信息,通过对延伸反应产物进行多重序列比对最终获得靶标编辑区域的基因型序列信息。
本实施例以玉米基因编辑植株的基因型检测为例,具体展示使用本发明提供的方法,并基于MassArray系统分析编辑后基因型序列的方法。需要说明的是,该方法并不会局限于某个特定物种或者某种序列形式。对于拥有参考序列的目标区域基因型变异分析均可以采用本方法实现。具体步骤如下。
1、确定基因组编辑位置的参考序列信息。
根据基因编辑操作时的gRNA序列,通过与参考基因组的序列比对确定发生基因组编辑的位置和序列信息。本实施例中的gRNA序列为其中方框标识的AGG为PAM基序,下划线标识的序列为可能发生变异的位置。通过序列比对分析可知,该位置位于玉米第5染色体2361077-2361098处。
2、设计扩增引物和延伸引物。
在编辑区域(chr05:2361077-2361098处)两侧设计扩增引物F:5’-CAAAGACGACTCTGGCTTCA-3’和R:5’-AGAACCGGCGGAACCCGCG-3’。
最经常发生的编辑区域位于NGG前第4至7碱基的4bp范围内(下划线标识),因此设计4重延伸引物,1:ACGAGTGCCC、2:CGAGTGCCCG、3:GAGTGCCCGT、4:AGTGCCCGTC。同时,为了更精确的测定编辑区域的序列信息,以编辑区域的互补链为模板,再设计4重延伸引物,5:ATATCCTTGC、6:TATCCTTGCC、7:ATCCTTGCCG、8:TCCTTGCCGA。
多重引物设计通过MassArray ADS(Assay Design Suite)引物设计软件进行。运行第1步设计序列的文档,调整相关参数,设计引物,设计参数选择如下:在高级设置中改Identify Optimal Primer Areas(确定最佳的引物区域)中Amplicon Length minimum(最小扩增长度)为200,Amplicon Length maximum(最大扩增长度)为700,并选择DesignableSequences Retained(设计保留序列)为0and 1×Mapped(匹配);设置Design Assays(设计分析)中Amplicon Length(扩增长度)为200-700,并设置Minimum Multiplex Level(最小多重水平)为1;最后点击运行,从ADS软件导出设计好的扩增引物序列、延伸引物序列以及延伸引物分子量等相关参数与文件。
3、芯片点样样品的制备。
依据步骤(2)设计得到的扩增引物序列和延伸引物序列,制备相应的扩增引物和延伸引物;使用引物对进行PCR扩增,得到PCR产物,进行碱性磷酸酶消化后加入延伸引物进行延伸,将延伸产物脱盐,得到芯片点样样品;
其中,引物制备采用化学合成方法得到。
PCR扩增体系为:10×PCR缓冲液0.5μL、浓度为25mM的MgCl2溶液0.4μL、浓度为25mM的dNTPs溶液0.1μL、浓度为5U/μL的PCR酶0.2μL、浓度为0.5μM的引物对混合液1μL、浓度为10ng/μL的待检测基因组DNA 2μL,水补足至5μL。
PCR扩增条件为:94℃2min;94℃30sec、56℃30sec、72℃1min,45个循环;72℃5min。
碱性磷酸酶消化的体系为:在5μL PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0.3μL、SAP缓冲液0.17μL、水补足至7μL。
碱性磷酸酶消化的条件为:37℃40min,85℃5min。
延伸反应体系为:在7μL碱性磷酸酶消化后的产物中加入10×Typeplex缓冲液0.2μL、10×Typeplex终止混合液0.2μL、浓度为33U/μL的Typeplex热测序酶0.041μL、延伸引物混合液适量、H2O补足至9μL;其中,延生引物的加入量依据步骤(2)导出文件中显示的延伸引物分子量计算。
延伸的条件为:94℃30sec;94℃5sec、52℃5sec、80℃5sec、52℃5sec、80℃5sec、52℃5sec、80℃5sec、52℃5sec、80℃5sec、52℃5sec、80℃5sec,35个循环;72℃3min,进行延伸反应。
脱盐的步骤为:在9μL延伸产物中加入水41μL和清洁树脂(Clean Resin)15mg(96孔板的操作)或加入水16μL和清洁树脂6mg(384孔板的操作),旋转板15min进行脱盐去离子防干扰处理;3200g离心5min。
4、点样扫描。
使用MassArray系统Nanodispenser点样仪将步骤(3)制备的芯片点样样品进行芯片点样,利用Analyzer分析仪芯片扫描;扫描结果以Typer4.0软件分析延伸产物序列。
5、拼接靶标位点编辑后序列。
根据延伸产物序列拼接靶标位点编辑后序列。拼接方法和结果见表1。根据表1内容可知,该发明方法对1个或多个碱基的缺失、替换或插入的编辑形式均可以测定序列信息。
表1基因编辑产物的延伸引物设计和序列测定方法
表1基因编辑产物的延伸引物设计和序列测定方法(续表)
6、进行多轮测定拼接大片段插入缺失的序列。
如果拼接完序列后发现是大片段插入缺失的情况,则需要根据已经拼接后的序列信息再次设计延伸引物并重复3-5步,直到最终获得所有插入序列。大片段插入的拼接方法和结果见表2。根据第一轮测定并推测的编辑后序列设计第二轮延伸引物序列1:AGTGCCCGTG、2:TCCTTGCCGA。根据测定序列拼接编辑后序列。
表2大片段插入序列的多轮测定拼接
实施例2:不同种质玉米基因组多态性序列测定
基因组变异是物种性状变化的原因,也是生物适应环境变化的分子基础。研究物种内不同个体的基因组变异情况是解析个体性状变异的分子基础、梳理物种进化路径、发现有价值的基因型的重要研究内容。通常,物种基因组特定位置变异已知的情况下,使用传统的Sanger测序或常规MassArray、SNaPshot等方法可以测定其多态性。然而,如果不同个体间多态性变异未知,则上述方法无法有效或高效的测定变异序列。
应用本发明提供的方法,可以根据参考基因组的序列信息,设计多重延伸引物覆盖发生变异的特定区域,然后利用MassArray或SNaPshot系统获得延伸产物序列信息,通过对延伸反应产物进行多重序列比对最终获得目标区域的基因型序列信息。
本实施例以玉米基因不同种质间基因组特定区域同时存在不同变异的检测为例,具体展示使用本发明提供的方法,并基于MassArray系统测定基因组多态性序列的方法。需要说明的是,该方法并不会局限于某个特定物种或者某种序列形式。对于拥有参考序列的目标区域基因型变异分析均可以采用本方法实现。具体步骤如下。
1、确定基因组目标区域的参考序列信息。
本实施例中的变异区域为玉米内源基因PHD17中的一段序列,参考基因组序列为:5’-CTTTGCCTGAGGTGATAGTGCGCCT-3’,其中下划线标识的序列为目标变异区域。通过序列比对分析可知,该位置位于玉米第8染色体135539155-135539179处。
2、设计扩增引物和延伸引物。
在变异区域(chr08:135539155-135539179处)两侧设计扩增引物F:5’-GGTTGTCTGATGGAATGCTG-3’和R:5’-GAACAGAATTGCAGACGATA-3’。
目标区域同时存在两个多态性变异位点(下划线标识),因此设计3重延伸引物,1:CTTTGCCTGA、2:TTTGCCTGAG、3:GCCTGAGGTG。同时,为了更精确的测定编辑区域的序列信息,以目标区域的互补链为模板,再设计3重延伸引物,4:AGGCGCACTA、5:CGCACTATCA、6:GCACTATCAC。
多重引物设计通过MassArray ADS(Assay Design Suite)引物设计软件进行。运行第1步设计序列的文档,调整相关参数,设计引物,设计参数选择如下:在高级设置中改Identify Optimal PrimerAreas(确定最佳的引物区域)中Amplicon Length minimum(最小扩增长度)为200,Amplicon Length maximum(最大扩增长度)为700,并选择DesignableSequences Retained(设计保留序列)为0and 1×Mapped(匹配);设置Design Assays(设计分析)中Amplicon Length(扩增长度)为200-700,并设置Minimum Multiplex Level(最小多重水平)为1;最后点击运行,从ADS软件导出设计好的扩增引物序列、延伸引物序列以及延伸引物分子量等相关参数与文件。
3、芯片点样样品的制备。
依据步骤(2)设计得到的扩增引物序列和延伸引物序列,制备相应的扩增引物和延伸引物;使用引物对进行PCR扩增,得到PCR产物,进行碱性磷酸酶消化后加入延伸引物进行延伸,将延伸产物脱盐,得到芯片点样样品;
其中,引物制备采用化学合成方法得到。
PCR扩增体系为:10×PCR缓冲液0.5μL、浓度为25mM的MgCl2溶液0.4μL、浓度为25mM的dNTPs溶液0.1μL、浓度为5U/μL的PCR酶0.2μL、浓度为0.5μM的引物对混合液1μL、浓度为10ng/μL的待检测基因组DNA 2μL,水补足至5μL。
PCR扩增条件为:94℃2min;94℃30sec、56℃30sec、72℃1min,45个循环;72℃5min。
碱性磷酸酶消化的体系为:在5μLPCR产物中加入核酸外切酶SAP 0.3μL、SAP缓冲液0.17μL、水补足至7μL。
碱性磷酸酶消化的条件为:37℃40min,85℃5min。
延伸反应体系为:在7μL碱性磷酸酶消化后的产物中加入10×Typeplex缓冲液0.2μL、10×Typeplex终止混合液0.2μL、浓度为33U/μL的Typeplex热测序酶0.041μL、延伸引物混合液适量、H2O补足至9μL;其中,延生引物的加入量依据步骤(2)导出文件中显示的延伸引物分子量计算。
延伸的条件为:94℃30sec;94℃5sec、52℃5sec、80℃5sec、52℃5sec、80℃5sec、52℃5sec、80℃5sec、52℃5sec、80℃5sec、52℃5sec、80℃5sec,35个循环;72℃3min,进行延伸反应。
脱盐的步骤为:在9μL延伸产物中加入水41μL和清洁树脂(Clean Resin)15mg(96孔板的操作)或加入水16μL和清洁树脂6mg(384孔板的操作),旋转板15min进行脱盐去离子防干扰处理;3200g离心5min。
4、点样扫描。
使用MassArray系统Nanodispenser点样仪将步骤(3)制备的芯片点样样品进行芯片点样,利用Analyzer分析仪芯片扫描;扫描结果以Typer4.0软件分析延伸产物序列。
5、拼接靶标位点编辑后序列。
根据延伸产物序列拼接靶标位点变异后序列。拼接方法和结果见表3。根据表3内容可知,该发明方法可同时对1个或2个碱基的缺失或替换的变异形式测定序列信息。
表3基因编辑产物的延伸引物设计和序列测定方法
以上实施例中的延伸产物测定过程也可以应用SNaPshot系统实现,达到的效果相同。上述实施例仅就本发明的技术方案作进一步说明,但并不局限于此,凡采用对本发明技术方案同等替换或修改,而不脱离本发明技术原理及主旨,均应涵盖在本发明要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一种基因组特定区域的DNA测序方法,其特征在于:包括如下步骤:
1)根据参考基因组序列设计多重延伸引物;
2)以待测基因组序列为模板将延伸引物延长一个碱基;
3)根据测定的延伸产物序列拼接待测区域的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的基因组特定区域的DNA测序方法,其特征在于:所述的特定区域为基因组发生自然或人工突变的位置,突变方式包括但不限于不同种质间的自然突变,人工辐射或化学诱变、基因编辑等;所述的参考基因组为突变发生前的已知基因组序列,包括但不限于某一个特定种质的基因组序列,辐射或化学诱变、基因编辑的受体基因组序列等。
3.根据权利要求1所述的基因组特定区域的DNA测序方法,其特征在于:所述多重延伸引物具体如下:
第一重延伸引物的序列与待测区域参考基因组第一个碱基之前的序列相同,第二重延伸引物的序列与待测区域参考基因组第二个碱基之前的序列相同,以此类推,直到延伸引物全部覆盖待测区域参考基因组最后一个碱基之前的序列,即第n重延伸引物的序列与待测区域参考基因组倒数第一个碱基之前的序列相同。
4.根据权利要求3所述的所述的多重延伸引物,其特征在于:CRISPR-Cas9基因编辑产物的待测区域为距离PAM基序第4至第7个碱基。
5.根据权利要求1所述的基因组特定区域的DNA测序方法,其特征在于:所述引物延长通过加入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)来实现;所述延伸产物序列测定方法采用MassArray飞行质谱或SNaPshot等高通量基因分型工具检测实现。
6.根据权利要求1-5所述任一种基因组特定区域的DNA测序方法,其特征在于:所述的基因组为玉米基因组。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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