CN105648084B - 一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，这里，碱基连续突变序列是指序列中相邻位置两个或者两个以上碱基发生单碱基序列突变，具体步骤为：（1）制备待测序列的单链DNA模板；（2）将测序引物与单链DNA模板结合；（3）对待测序列进行两核苷酸合成焦磷酸测序反应，通过有选择的几种具体的两核苷酸交替加入，完成连续的多个两核苷酸实时合成测序反应。该步骤中，根据分析样本所有可能的突变序列，设计两核苷酸加入类型和顺序，使得每一种具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，然后按照设计的两核苷酸加入类型和顺序对分析样本进行合成测序，比较测序图谱、确定突变类型。

Description

一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法
技术领域
本发明涉及一种低成本单碱基核酸序列连续变化的实时合成测序检测方法，尤其涉及一种从可能的多位点变化中确定具体单碱基变化检测方法，属于生物技术领域。
技术背景
随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。就基因序列分析而言，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。在诸多基因变异中，突变和SNP是研究基因遗传与变异时一种高效的量化标志。通过获得与该疾病相关基因信息，对疾病预防、用药选择、新药研发、疾病预后等诸多个体化医药学领域具有十分关键的影响。因此，生物科技紧接着面临如何快速、可靠地对已知突变和SNP位点进行检测的问题，因此，这将标记着巨大的商业机会蕴涵在其中，并成为为众多商家看好的潜在的巨大市场。
与为数有限的蛋白质测序和DNA序列分析方法相比，基因突变(包括SNP)分析的基本方法在数量上已达20余种。种类繁多的分析方法，既反映了研究基因突变(包括SNP)分析方法在生物学和医学领域所受到的重视程度，也反映出任一单个方法尚无法满足后基因时代对基因突变(包括SNP)分析的要求。目前绝极大部分的分析方法均是针对单个位点进行分析，对于间隔很近的连续多个变化序列大部分的技术均无能为力，而这种碱基连续变化的序列数量也很多。例如Kras基因编码12、13位点的序列，对于所有人而言，除了正常序列外，还有7种突变的序列。然而，对于具体的一个人而言，它可能是只有一种正常(未突变)的DNA序列，或者除了正常(未突变)一种DNA序列外、还有一种突变(七种中可能的一种)DNA序列。因此，对一个具体样本而言，如何从8种可能的类型中快速、准确的判断出具体的分型，对于临床诊断无疑是有积极意义的。现有的分析方法中，Sanger测序无疑是这类核酸序列分析的“金标准”，但在定量分析上对丰度低于10％的核酸片段也无能为力；另外，其相对复杂的操作、仪器及其使用价格的相对昂贵也很难进行临床检测推广。DNA芯片组合延伸检测碱基连续突变的方法(肖鹏峰，等.中国发明专利：ZL 201210128598.3)虽然能对这类序列进行并行分析，但DNA芯片制备耗时过长，其总操作时间超过10小时，这样这个方法只适合大样本的科研分析，而不适合快速诸如临床诊断类的分析。焦测序技术是继Sanger测序后的测序技术，相对于Sanger测序，除了测序长度处于弱势外，在自动化程度，操作简易、价格上均有优势，便宜、且检测限更低，容易推广、十分适合临床检测上使用。现有的焦测序技术原理上如果能够通过优化核苷酸的加入顺序，使每种类型具有唯一、特征的测序图谱也就能够完成对这类序列的分析。然而，现有焦测序单个核苷酸的加入方式一方面由于受到单体(及其四个单体试剂仓)的限制，根据不同的序列很难优化出符合要求的单核苷酸加入顺序，另一方面即使优化出符合要求的加入顺序，其反应次数也可能很多，增加了分析的费用。
本发明针对现有技术分析碱基连续突变序列的不足，提出一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，通过设计两核苷酸加入类型和顺序，使每一种具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，从而确定分析样本的具体突变类型。该方法能够通过一次测序操作将样本在可能发生连续多个单碱基突变的某个具体突变确定，简化了操作步骤，减少分析费用。
发明内容
本发明所解决的技术问题是：提供一种低成本单碱基核酸序列连续变化的实时合成测序检测方法，从可能的多位点变化中确定具体单碱基变化。通过设计两核苷酸加入类型和顺序，使每一种具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，从而确定分析样本的具体突变类型。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：提供一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，包括如下步骤：
(1)制备单链DNA模板；
(2)测序引物杂交：将测序引物与单链DNA模板结合；
(3)利用两核苷酸对目的片段进行两核苷酸合成焦磷酸测序反应，所述的两核苷酸为从非标记或者标记的dATPαS、dCTP、dTTP、dGTP、以及ddATPαS、ddCTP、ddTTP、ddGTP中选择的两种不同的核苷酸，通过设计两核苷酸加入类型和顺序，使得每一种具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，然后按照设计的两核苷酸加入类型和顺序对分析样本进行合成测序；
(4)每个测序反应得到的测序信息包括加入的两核苷酸信息、以及核苷酸合成的数目信息，连续多个两核苷酸合成焦测序反应的测序信息构成测序图谱，由测序图谱确定分析样本的突变类型。
所述碱基连续突变序列是指相邻位置两个或者两个以上碱基发生单碱基序列突变。
所述步骤(1)制备单链DNA模板按照如下方法进行：
(1-1)采用一个5’端修饰生物素的引物对目的DNA片段进行PCR扩增；
(1-2)将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠进行反应，生物素修饰的DNA链则固定到所述磁珠上，得到单链DNA模板；
当待测序列除了含有一种野生型DNA序列外，还含有一种突变型DNA序列时，选定两种序列相同的一个或者多个碱基作为一个峰高的基准，这个基准峰既可以选择单个核苷酸加入、也可以选择两个核苷酸加入的测序反应来确定，通过基准峰高及每个反应的峰高值计算待测序列中野生型DNA序列与突变型DNA序列的含量。
所述的一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，步骤(3)中不同dNTPs、ddNTPs合成插入到DNA链后释放出相同的检测分子、且释放出检测分子的量与核苷酸合成的数目成线性关系，其检测分子是化学发光检测的焦磷酸盐，电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光信号。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，实现了分析的序列片段中可能包含多个位置的碱基连续变化的同时检测，快速判断一个具体样本确定样本是否发生突变、以及突变发生的位点类型。由于一般DNA片段序列除了特定位置的碱基序列不同外，其它序列均为已知的，因此只需要从几种可能中判断出正确序列即可。因此，如果能够通过设计两核苷酸加入类型和顺序，使每一种具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，然后按照设计的两核苷酸加入类型和顺序对分析样本进行合成测序，比较测序图谱、确定突变类型。此外，本发明在保持现有基于合成测序检测方法的准确性、灵敏度的前提下，能够快速、简单地实现不同样本的并行检测。由连续多个测序“峰”构成的测序图谱不仅能够实现定性分析，还能够实现定量分析，可以用于低丰度突变DNA序列的分析。
具体实施方式
本发明提供一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，这里，碱基连续突变序列是指序列中相邻位置两个或者两个以上碱基发生单碱基序列突变，由于一般DNA片段序列除了特定位置的碱基序列不同外，其它序列均为已知的，因此只需要从几种可能中判断出正确序列即可。因此，如果能够通过设计两核苷酸加入类型和顺序，使每一种具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，然后按照设计的两核苷酸加入类型和顺序对分析样本进行合成测序，比较测序图谱、确定突变类型。具体步骤为：(1)制备待测序列的单链DNA模板；(2)将测序引物与单链DNA模板结合；(3)对待测序列进行两核苷酸合成焦磷酸测序反应，通过有选择的几种具体的两核苷酸交替加入，完成连续的多个两核苷酸实时合成测序反应。该步骤中，根据分析样本所有可能的突变序列，设计两核苷酸加入类型和顺序，使得每一种具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，然后按照设计的两核苷酸加入类型和顺序对分析样本进行合成测序，比较测序图谱、确定突变类型。
以下将结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例一
表1是采用本发明一种两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法来分析拟订序列3’-AGCA突变为(GGCA、CGCA、TGCA、ACCA、AACA、ATCA)设计的一种两核苷酸加入类型和顺序、以及每种具体的突变类型对应的唯一、特征测序图谱。表中3’-AGCA为野生型序列，GGCA、CGCA、TGCA、ACCA、AACA、ATCA为突变型序列(其中下划线字母表示突变碱基)。而一个具体的分析样本要么只含有一种野生型DNA序列，或者除了含有一种野生型DNA序列外，还含有一种突变型DNA序列(六种种的任意一种)，这样一共7种可能的序列分析对象。在只有一种野生型DNA序列的情况下，按照(dT+ddC)、(dC+ddG)、(dA+ddT)顺序加入的两核苷酸合成测序分别得到的核苷酸数目为2、0、0；而当含有一种野生型DNA序列和一种突变型DNA序列的情况下，它有六种可能。假定野生型DNA序列含量为x1、突变型DNA序列含量xi(i＝2、3、4、5、6、7)，很明显(x1+xi＝1)。这样这六种DNA序列分析的测序图谱如表1所示，它们均有唯一的对应关系，即根据测序图谱可以推知分析样本是否发生突变，发生突变的位置、以及含量。一种特殊情况，当x1+xi＝1中，x1＝0、即xi＝1时，表明发生100％突变。
表1：序列AGCA突变为NNCA分析的两核苷酸加入类型、顺序及其测序图谱
对于上述拟订序列3’-AGCA突变的分析，也可以按照(dA+ddG)、(dT+ddC)、(dG+ddA)顺序加入，通过表2给出的七种不同特征图谱来区分七种可能类型。
因此，两核苷酸类型和加入顺序并不具有唯一性，只要达到每种类型具有唯一的对应图谱这个目的，任何类型和顺序都是可接受的。但图谱区别特征最大、反应步骤最少的核苷酸类型和加入顺序则是最优的。
表2：序列AGCA突变为NNCA分析的另一种两核苷酸加入类型、顺序及其测序图谱
实施例二单样本K-ras基因12、13密码子7种常见突变的检测
1、DNA提取：将所有需检测的样本处理后提取DNA用作扩增模板；
2、PCR:50μL的PCR扩增体系包括:200ng基因组DNA，0.2mM dNTP，0.8μM正向引物，如SEQ ID NO:1所示：5’-bio-TTTTTTTTTCGTCTGCAGTCAACTGGAATT，0.8μM反向引物如SEQ IDNO:2所示：5’-CCTGACATACTCCCAAGGAAA，1U Taq DNA聚合酶,1×扩增缓冲液,1.8mM MgCl2。扩增条件为：95℃起始变性5分钟，40个热循环：95℃变性20秒，53℃退火30秒，72℃延伸20秒；最后72℃延伸7分钟；
3、单链DNA模板的制备：每个样本用5μL的链霉亲和素包裹的磁珠和五倍体积的结合反应缓冲液清洗两遍，弃上清。再加入5μL链霉亲和素包裹的磁珠和五倍体积的结合反应缓冲液在斡旋振荡仪上振荡使磁珠悬浮。在45μL的PCR产物中加入50uL结合反应缓冲液和磁珠的混合物，震常温震荡混合15分钟，使生物素标记的PCR样本和链霉亲和素包裹的磁珠进行连接。利用真空样本制备系统将磁珠释放到96孔样本板，得到单链的测序模板。
4、测序引物杂交：测序引物如SEQ ID NO:3所示(5’-GTTCCGTGAGAACGGAT)与结合磁珠的单链DNA模板缓冲液的混合物在加热板上80℃加热2分钟，使测序模板和测序引物进行结合，以进行焦磷酸测序。
5、两核苷酸合成焦测序：在试剂仓中加入测序所需的各种试剂(PyroMark GoldQ96SQA Reagents(5×96)(QIAGEN公司)，将包含磁珠固定PCR样本的96孔板和试剂仓放入测序仪中，并设定测序参数。如表3所示列出Kras基因编码12、13位点相邻3个碱基位置发生突变的所有突变类型，表中下划线字母表示突变碱基。设计两核苷酸加入类型和顺序，使每一种具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，本实施例中，假定野生型DNA序列含量为x1、突变型DNA序列含量xi(i＝2、3、4、5、6、7、8)。一般情况下，按照(dC+ddT)、(dA+ddT)、(dC+ddG)、(dA+ddT)、(dC+ddG)顺序加入的两核苷酸合成测序分别得到(1+2)、(1+3)、(1+4)、(1+5)、(1+6)、(1+7)、(1+8)七种测序图谱；特殊情况下，x1＝1时、即为未突变得野生型序列、其测序图谱为1；而当x1+xi＝1中，x1＝0、即xi＝1时，表明发生100％突变。如表3所示，所有上述类型，它们均有唯一、特征的测序图谱。因而根据实验得到的测序结果便可以推知分析样本是否发生突变，发生突变的位置、以及含量。
为了准确定量，一般需要选定两种序列相同的一个或者多个碱基作为一个峰高的基准，这个基准峰既可以选择单个核苷酸加入、也可以选择两个核苷酸加入的测序反应来确定。表3中加入dG的测序反应在所有序列中合成的核苷酸数目都是1，即可以作为基准峰。
6、按照表3的方式将单体加入进行连续焦测序反应，记录每个测序反应加入的核苷酸信息、峰高信息(可以换算成核苷酸合成的数目)，得到样本的测序图谱。
7、样本突变的判断：根据实验得到的测序图谱与表3中八种不同的测序图谱的核苷酸信息及其峰高值比较，确定分析样本是否发生突变，发生突变的位置、以及含量。
表3.Kras基因编码12、13位点序列的两核苷酸合成焦测序分析
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种非诊断治疗的两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)制备单链DNA模板；(2)测序引物杂交：将测序引物与单链DNA模板结合；(3)利用两核苷酸对目的片段进行两核苷酸合成焦磷酸测序反应，所述的两核苷酸为从非标记或者标记的dATPaS、dCTP、dTTP、dGTP、以及ddATPaS、ddCTP、ddTTP、ddGTP中选择的两种不同的核苷酸，通过设计两核苷酸加入类型和顺序，使得每一种具体的突变类型均有唯一、特征的不同测序图谱，然后按照设计的两核苷酸加入类型和顺序对分析样本进行合成测序；(4)每个测序反应得到的测序信息包括加入的两核苷酸信息、以及核苷酸合成的数目信息，连续多个两核苷酸合成焦测序反应的测序信息构成测序图谱，由测序图谱确定分析样本的突变类型。
2.根据权利要求1所述一种非诊断治疗的两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，其特征在于，所述碱基连续突变序列是指相邻位置两个或者两个以上碱基发生单碱基序列突变。
3.根据权利要求1所述一种非诊断治疗的两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，其特征在于，步骤(1)制备单链DNA模板按照如下方法进行：(1-1)采用一个5’端修饰生物素的引物对目的DNA片段进行PCR扩增；（1-2）将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠进行反应，生物素修饰的DNA链则固定到所述磁珠上，得到单链DNA模板。
4.根据权利要求1所述一种非诊断治疗的两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，其特征在于，当待测序列除了含有一种野生型DNA序列外，还含有一种突变型DNA序列时，选定两种序列相同的一个或者多个碱基作为一个峰高的基准，这个基准峰既可以选择单个核苷酸加入、也可以选择两个核苷酸加入的测序反应来确定，通过基准峰高及每个反应的峰高值计算待测序列中野生型DNA序列与突变型DNA序列的含量。
5.根据权利要求1所述一种非诊断治疗的两核苷酸实时合成测序检测碱基连续突变序列的方法，其特征在于，不同dNTPs、ddNTPs合成插入到DNA链后释放出相同的检测分子、且释放出检测分子的量与核苷酸合成的数目成线性关系，其检测分子是化学发光检测的焦磷酸盐，电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光信号。
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