CN101665824A

CN101665824A - 一种检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因的生物芯片及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101665824A
Application number: CN200910035277A
Authority: CN
Inventors: 周玉贵; 宣世海; 邵伯; 崔亚林; 周洁; 王惠民; 丛辉; 金庆辉; 景奉香
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-09-24
Filing date: 2009-09-24
Publication date: 2010-03-10
Anticipated expiration: 2029-09-24
Also published as: CN101665824B

Abstract

本发明属于基因工程及医学检验领域，涉及一种检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因的生物芯片及其制备方法和应用。该芯片是通过下列方法制备得到的：芯片片基经过醛基化处理；探针的5′端连接poly(dT)₁₀的分子臂；探针的5′端再进行氨基修饰；探针针对幽门螺杆菌23S rRNA基因的下列位置的突变：A2115G、A2142G、A2142C、A2143G、A2143C、T2182C、G2224A；将探针固定在芯片片基。该芯片具有灵敏度高、特异性好；可分辨单碱基的差别，该芯片检测成本低，适于基层单位推广使用。

Description

一种检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因的生物芯片及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程及医学检验领域，涉及一种检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因的生物芯片及其制备方法和应用。

背景技术

基因芯片(gene chip)又称DNA芯片或微阵列(microarray)，是生物芯片的一种，基因芯片技术是近年来出现的分子生物学、分析化学和微电子技术相结合的DNA分析技术，以其高通量、微型化、多样性和快速自动化等特点，成为临床诊断、基因表达分析等基因功能分析中得到广泛应用。基因芯片的原理是通过微阵列技术将高密度的DNA片段通过点样仪以一定的顺序或排列方式使其附加在固相载体表面，将组织或细胞提取的DNA进行荧光(生物素等)标记，借助碱基互补的原则与芯片杂交，然后利用共聚焦激光扫描仪系统或其他光学扫描设备进行图像分析，最后用计算机进行数据分析。

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是寄生于人体胃部的革兰氏阴性杆菌，1983年Marshall和Warren从慢性活动性胃炎患者胃粘膜活检标本中分离到幽门螺杆菌，这一发现对胃十二指肠病学的发展起了极大的推动作用。现已证实幽门螺杆菌为慢性胃炎、消化道溃疡主要病因之一，与胃癌及胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)关系密切。同时与胃外疾病如冠心病等也密切相关。

幽门螺杆菌是一种菌体细长弯曲呈螺型、S型或海鸥型的细菌，长2.5～4.0μm，宽0.5～1.0μm，革兰染色阴性。在固体培养基上生长时，除典型的形态外，有时可出现杆状或圆球状。在电子显微镜下菌体的一端可伸出2～6条鞭毛，运动活泼。幽门螺杆菌为微需氧菌，在5％O₂、10％CO₂、85％N₂的环境下生长良好，最适生长温度为35℃，相对湿度为98％，幽门螺杆菌的营养要求较高，一般需含血液或者血清才能生长。幽门螺杆菌生长缓慢，故需要在培养基中添加两性霉素、多黏菌素、万古霉素来抑制杂菌的生长。幽门螺杆菌的生化反应不活跃，不能利用糖类。脲酶试验、氧化酶试验、触酶试验阳性。幽门螺杆菌的基因组较小，约1.67×10⁶bp，DNAG+C百分含量为37mol％，其全部序列已有报道。

幽门螺杆菌感染率已达全球人口的50％以上，而且发展中国家感染率稍高。中国也是一个幽门螺杆菌感染率较高的国家，为42％～90％。由于幽门螺杆菌是胃溃疡、十二指肠球部溃疡和胃癌的主要病因之一，与胃癌及胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤关系密切。同时与胃外疾病如冠心病等也密切相关，所以，根除幽门螺杆菌不但有利于胃溃疡的治疗，而且可以降低患胃癌和粘膜相关组织淋巴瘤的风险。幽门螺杆菌根除治疗方案很多，其中PPI加两种抗生素的三联疗法仍是当前国内外推荐的一线治疗方法，目前临床最常用的抗生素有咪唑类(甲硝唑、替硝唑)、大环内酯类(克拉霉素、阿奇霉素)、β-内酰胺类(阿莫西林)和喹诺酮类。大环内酯类抗生素比如克拉霉素在体外有强大的杀菌作用，口服生物利用度高，对酸稳定。克拉霉素的抗菌机制是药物穿入菌体细胞内，与核糖体紧密结合，作用于23S rRNA V功能区的多肽转移环，抑制多肽转移酶，影响核糖体的位移过程，阻止肽链延长，从而抑制细菌的蛋白质合成。因此目前推荐的根除幽门螺杆菌的一线治疗方案是以克拉霉素为主要抗生素的三联疗法，其根除率与不含克拉霉素的三联疗法比较，可提高10％～20％。随着抗生素的广泛应用，幽门螺杆菌对这些抗生素耐药率正在逐年上升，而根治幽门螺杆菌失败的主要原因是由于幽门螺杆菌对抗生素的耐药性。

细菌的耐药可分为原发性(天然性)耐药和继发性(获得性)耐药，原发性耐药是由于细菌缺少对药物敏感的靶位，或细菌具有天然屏障使药物无法进入菌体。继发性耐药是指由于抗生素的广泛使用，细菌获得耐药基因，从敏感菌株变成耐药菌株。一般认为幽门螺杆菌的耐药多为继发性耐药。幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药机制有以下几种：1.rRNA甲基化酶引起克拉霉素失活；2.细胞膜渗透性下降使进入细菌的药物减少；3.克拉霉素排出增加；4.基因突变：主要为幽门螺杆菌23S rRNA的V区发生点突变，导致核糖体变构，克拉霉素的结合位点发生改变，使幽门螺杆菌与克拉霉素的亲合力减弱，不能阻止细菌的蛋白合成产生耐药。综合以上几点，国内外学者普遍认为幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的主要机制是23S rRNA基因突变所致，其余的机制相对作用较弱。各国学者对23S rRNA基因的突变进行的研究证实，克拉霉素耐药的幽门螺杆菌菌株的23S rRNA最常出现A2143G，A2142G，A2142C的突变，也有报道发现G2115A，T2182C突变。

幽门螺杆菌的耐药检测技术可分为表型检测和基因检测。表型检测技术是指细菌培养后做药物敏感性试验，包括琼脂扩散法、K-B法、E-test等。此类方法是建立在细菌培养基础上，其缺点为细菌培养时间长，培养要求较高，如5％O₂、10％CO₂、85％N₂，一般较难做到。琼脂扩散法、K-B法操作虽然简单，但敏感度较差。E-test成本较为昂贵。而且由于幽门螺杆菌离体在空气中不能暴露太久应立即接种培养基，以上这些方法不能完全满足临床常规工作的需求。

基因检测的方法主要有：1.限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析；2.单链构象多态性(PCR-SSCP)分析；3.DNA测序；4.PCR-线性探针分析等。

这些方法无需细菌培养，可快速得出结果，但也存在不能进行大批标本检测、只能检测单个基因突变等缺点。随着基因芯片技术的发展及其广泛应用于医学领域，应用基因芯片技术检测耐药基因突变已日趋成熟，基因芯片技术以其高通量、高敏感度、高特异性和自动化等特点广泛应用于检测细菌耐药基因的突变。目前，基因芯片按其标记方法的不同可分为荧光和非荧光标记芯片，荧光标记芯片由于判读结果时需要激光共聚焦荧光仪，不利于该方法的普及和推广，而非荧光标记(如地高辛)芯片采用地高辛抗原标记引物，碱性磷酸酶作用底物显色，普通光学扫描仪或放大镜即可观察结果，无需荧光扫描仪，大大降低了检测成本，基层医院及单位也可使用。目前市场上还没有能在基层单位使用的检测成本低的针对幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因能够快速、准确、灵敏检测的生物芯片。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因能够快速、准确、灵敏地检测且检测成本低的生物芯片。

本发明的另一个目的是提供上述芯片的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述芯片的使用方法。

本发明的技术路线是：针对幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因常出现的点突变，根据幽门螺杆菌基因(Genebank U27270)序列的保守区设计寡核苷酸探针，固定在经过醛基修饰的芯片片基(玻片)上，和幽门螺杆菌DNA杂交，根据杂交信号判断幽门螺杆菌耐药信息。

本发明的技术方案如下：

一种检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因的生物芯片，该生物芯片是通过下列方法制备得到的：

a、芯片片基(玻片)经过醛基化处理，以利于探针的固定；

b、探针的5′端连接poly(dT)₁₀的分子臂，以增加探针和芯片片基之间的距离，减少杂交时的空间位阻；

c、探针的5′端再进行氨基修饰，以便和芯片片基上的醛基产生偶联，使探针更容易固定在芯片片基上；

d、探针是针对幽门螺杆菌23S rRNA基因的下列位置的突变：A2115G、A2142G、A2142C、A2143G、A2143C、T2182C、G2224A；可包括相应野生型及质控的探针；

e、将探针固定在芯片片基。

所述的生物芯片，该探针长度为10-23个碱基，突变位点位于探针的中间位置前后各4个碱基范围内，尽量接近或位于中间位置。

所述的生物芯片，其中根据幽门螺杆菌23S rRNA基因的突变型式而设计的探针如下表所示：

所述的生物芯片，其中步骤e中将探针固定于芯片片基的方法包括下列步骤：

a、用去离子水将合成的各条探针稀释成300pmol/μl，分别取10μl点样液(750mmol/LNaCl，75mmol/L乙酸钠，5％甘油，1％聚蔗糖(Ficoll)和0.1％SDS)和10μl探针稀释液混合后置于96孔微孔板；

b、利用微阵列芯片点样仪(Cartesian公司)进行点样；点样阵列图如图1所示；

c、点样时保持室内温度为28℃，相对湿度为70％，点样后的芯片在室温放置48小时后进行步骤d；

d、室温下将点样后的芯片浸入0.2％的SDS中漂洗数分钟，再放入去离子水中洗数分钟，再浸入0.2％的SDS中洗3次，每次1分钟，再浸入100℃去离子水中5秒钟，干后备用。

所述的生物芯片的制备方法，该方法包括下列步骤：

a、芯片片基经过醛基化处理，以利于探针的固定；

e、将探针固定在芯片片基。

所述的生物芯片在检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药中的应用。

所述的应用，其中该生物芯片的使用方法如下：

1)、样品处理：取胃粘膜组织抽提基因组DNA(用Takara公司的DNA抽提试剂盒)作为模板；

2)、PCR扩增：

a.地高辛标记引物：根据23S rRNA突变位点设计引物(引物合成由上海生工生物公司完成)，用地高辛标记上游引物；所说的引物是：

上游引物：5′-ATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGC-3′(核苷酸2050-2074)，

下游引物：5′-CCAGTCAAACTACCCACCAAGCATT-3′(核苷酸2335-2311)；

b.50μl PCR反应体系中含有1.5mmol MgCI₂，dNTP各200μmol，模板DNA 5μl，1x缓冲液，l U Taq酶，上下游引物浓度各0.1μmol；PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸30sec共35个循环，72℃延伸10min；扩增DNA片段长度为286bp；

3)、芯片杂交；取PCR扩增的地高辛标记的DNA样品1μl和10μl杂交液(750mmol/LNaCl，75mmol/L乙酸钠，0.1％SDS，1μg/ml鲑精DNA，25％甲酰胺)混合，94℃变性5min后迅速冰上冷却5min，取10μl混合液滴加于上述生物芯片的点样区，盖上盖玻片，将芯片置于37℃预温杂交盒内，烘箱孵浴30min后用60℃预热的洗液I(0.2％SDS，150mmol/LNaCl，150mmol/L乙酸钠)振荡洗涤(60-100次/min)10min，洗液II(150mmol/L顺丁烯二酸，150mmol/L NaCl，0.3％Tween20，pH 7.5)漂洗1min吹干，在点样区加2500倍稀释酶标抗体(碱性磷酸酶标记地高辛抗体，Roche产品)20μl，37℃静置30min，再用洗液II荡洗30sec后加50μl平衡液(0.1M Tris-HCL，0.1M NaCl)静置1min后，取一块1cm²左右的尼龙膜，浸泡显色液(BCIP/NBT溶液，Roche公司)10sec后小心覆盖于芯片点样区，迅速倒置在湿盒中，轻轻压实，37℃避光静置30min后，取下尼龙膜，去离子水漂洗，待干后用光学扫描仪或放大镜观察结果。

本发明的有益效果：

本发明提供的酶显色芯片克服了现有的传统生物学和分子生物学方法的缺点，将人工合成的寡核苷酸探针点样在载玻片上，形成寡核苷酸探针微阵列，通过与待测幽门螺杆菌的DNA杂交，获得与幽门螺杆菌对克拉霉素耐药相关基因突变信息，来确定幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性。

1、本发明的酶显色法芯片检测幽门螺杆菌的耐药性，方法简单、快速；

2、本发明的酶显色法芯片具有灵敏度高、特异性好；可分辨单碱基的差别；

3、本发明的酶显色法芯片可以检测克拉霉素耐药等相关位点的基因突变信息；

4、本发明的酶显色法芯片采用地高辛抗原标记引物，碱性磷酸酶作用底物显色，普通光学扫描仪或放大镜甚至肉眼即可观察结果，无需荧光扫描仪，大大降低了检测成本，基层医院及单位也可使用。显色采用尼龙膜法较其他方法来讲，简便，不需昂贵的激光共聚焦仪。

附图说明：

图1本发明芯片点样阵列示意图。

A1-6：阳性质控；B6：阴性质控；C1：A2115G突变型；B1：2115野生型；C2：A2142G突变型；B2：2142、2143野生型；C3：A2143G突变型；B3：A2142C突变型；C4：2182野生型；B4：A2143C突变型；C5：2224野生型；B5：T2182C突变型；C6：G2224A突变型。

图2是本发明酶显色法芯片检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药性应用于实例样品的结果。

图3是与芯片点样阵列图镜像的膜显色示意图。

具体实施方式

实施例1、制备生物芯片

将芯片片基(玻片)经过醛基化处理，以利于探针的固定；根据幽门螺杆菌23S rRNA基因的点突变(2115、2142、2143、2182、2224)设计的探针序列，探针的5′端连接poly(dT)₁₀的分子臂，以增加探针和芯片片基之间的距离，减少杂交时的空间位阻，探针的5′端再进行氨基修饰(见表1)，以便和芯片片基上的醛基产生偶联，使探针更容易固定在芯片片基上；

表1 根据幽门螺杆菌23S rRNA基因的点突变设计的探针序列

用去离子水将合成的各个探针稀释成300pmol/μl，分别取10μl点样液(750mmol/LNaCl，75mmol/L乙酸钠，5％甘油，1％聚蔗糖和0.1％SDS)和10μl探针稀释液混合后置于96孔微孔板，用Cartesian公司的微阵列芯片点样仪按图1所示点样阵列图进行点样，点样时保持室内温度为28℃，相对湿度为70％，点样后的芯片在室温放置48小时后在室温下将芯片浸入0.2％的SDS中漂洗数分钟，再放入去离子水中洗数分钟，再浸入0.2％的SDS中洗三次(一次/分钟)后再浸入100℃去离子水中5秒钟，干后备用。

实施例2、幽门螺杆菌DNA片段的地高辛标记

胃黏膜DNA提取使用TaKaRa公司的DNA抽提试剂盒(DV811A，严格按说明书操作)，抽提的DNA置-30℃保存作为模板备用。根据23S rRNA突变位点设计一对引物(引物合成由上海生工生物公司完成)，引物序列为：5′-ATGAATGGCGTAACGAG-ATGGGAGC-3′和5′-CCAGTCAAACTACCCACCAAGCATT-3′，用地高辛标记上游引物。PCR扩增产生地高辛标记的目的DNA片段。50μl PCR扩增反应体系中含有1.5mmol MgCI₂，dNTP各200μmol，模板DNA 5μl，1x缓冲液，1U Taq酶，上下游引物浓度各0.1μmol。PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸30sec共35个循环，72℃延伸10min。扩增片段为286bp。

实施例3、标记目的DNA片段与芯片的杂交

取上述PCR扩增的地高辛标记的目的DNA样品1μl和10μl杂交液(750mmol/LNaCl，75mmol/L乙酸钠，0.1％SDS，1ug/ml鲑精DNA，25％甲酰胺)混合，94℃变性5min后迅速冰上冷却5min，取10μl混合液滴加于芯片的点样区，盖上盖玻片，将芯片置于37℃预温杂交盒内，烘箱孵浴30min后用60℃预热的洗液I(0.2％SDS，150mmol/LNaCl，150mmol/L乙酸钠)振荡洗涤(60-100次/min)10min，洗液II(150mmol/L顺丁烯二酸，150mmol/LNaCl，0.3％Tween20，pH 7.5)漂洗1min吹干，在点样区加2500倍稀释酶标抗体(碱性磷酸酶标记地高辛抗体，Roche产品)20μl，37℃静置30min，再用洗液II荡洗30sec后加50μl平衡液(0.1M Tris-HCL，0.1M NaCl)静置1min后，取一块1cm²左右的尼龙膜，浸泡显色液(BCIP/NBT溶液，Roche公司)10sec后小心覆盖于芯片点样区(不可移动膜)，迅速倒置在湿盒中，轻轻压实，37℃避光静置30min后，取下尼龙膜，去离子水漂洗后晾干。

实施例4、芯片杂交信号的检测与分析

实施例3杂交后的芯片用Epson光学扫描仪扫描，显色结果见图2(也可用放大镜甚至肉眼即可观察显色结果)，根据尼龙膜上的显色位置与点样阵列图镜像对应(见图3)，则可得出相应的突变信息。同时把芯片检测结果和DNA直接测序结果作比较(结果见表2)。

表2芯片检测结果和DNA直接测序结果的比较

由表2可见，芯片检测结果和DNA直接测序结果的符合率为100％。

实施例5、

发明人按照实施例1-4的方法检测了江苏东台市人民医院、南通大学附属医院就诊的117例胃病患者，将病人胃镜活检标抽提DNA后PCR扩增后进行芯片检测和DNA直接测序，结果显示幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因可检测到：

2115野生型116例，A2115G突变型1例；

2142野生型111例，A2142G突变型6例；

2143野生型90例，A2143G突变型27例；

2182野生型83例，T2182C突变型34例；

2224野生型117例；

以上结果基本与该地区流行病学统计分布相一致，芯片检测结果和DNA直接测序结果的符合率为100％。

<110>周玉贵宣世海邵伯崔亚林周洁王惠民丛辉金庆辉景奉香

<120>一种检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因的生物芯片及其制备方法和应用

<160>15

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对幽门螺杆菌23S rRNA基因2115野生型的探针

<400>1

aggaattttc acctccacta ca 22

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对幽门螺杆菌23S rRNA基因A2115G突变型的探针

<400>2

aggaattgtc acctccacta ca 22

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对幽门螺杆菌23S rRNA基因2142、2143野生型的探针

<400>3

cggggtcttt ccgtctt 17

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G突变型的探针

<400>4

ggggtcttcc cgtcttg 17

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142C突变型的探针

<400>5

ggggtcttgc cgtcttg 17

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对幽门螺杆菌23S rRNA基因A2143G突变型的探针

<400>6

ggggtct ctc cgtcttgc 18

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对幽门螺杆菌23S rRNA基因A2143C突变型的探针

<400>7

ggggtctgtc cgtcttgc 18

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对幽门螺杆菌23S rRNA基因2182野生型的探针

<400>8

gatattccca ttagcagtg 19

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对幽门螺杆菌23S rRNA基因T2182C突变型的探针

<400>9

gatattcccg ttagcagtg 19

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对幽门螺杆菌23S rRNA基因2224野生型的探针

<400>10

gccaaagccc ttacttcaa 19

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对幽门螺杆菌23S rRNA基因G2224A突变型的探针

<400>11

gccaaagcct ttacttcaa 19

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>阴性质控探针

<400>12

tctcgttatt ccattcat 18

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>阳性质控探针

<400>13

tctcgttacg ccattcat 18

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物

<400>14

atgaatggcg taacgagatg ggagc 25

<210>15

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物

<400>15

ccagtcaaac tacccaccaa gcatt 25

Claims

1、一种检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因的生物芯片，其特征在于该生物芯片是通过下列方法制备得到的：

a、芯片片基经过醛基化处理；

b、探针的5′端连接poly(dT)₁₀的分子臂；

c、探针的5′端再进行氨基修饰；

d、探针是针对幽门螺杆菌23S rRNA基因的下列位置的突变：A2115G、A2142G、A2142C、A2143G、A2143C、T2182C、G2224A；

e、将探针固定在芯片片基。

2、根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于探针长度为10-23个碱基，突变位点位于探针的中间位置前后各4个碱基范围内。

3、根据权利要求1或2所述的生物芯片，其特征在于根据幽门螺杆菌23S rRNA基因的突变型式而设计的探针如下表所示：

4、根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于步骤e中将探针固定于芯片片基的方法包括下列步骤：

a、用去离子水将合成的探针稀释成300pmol/μl，取10μl点样液和10μl探针稀释液混合后置于96孔微孔板；点样液组成为750mmol/L NaCl，75mmol/L乙酸钠，5％甘油，1％聚蔗糖和0.1％SDS；

b、利用微阵列芯片点样仪进行点样；

c、点样时保持室内温度为28℃，相对湿度为70％，点样后的芯片在室温放置48小时后再进行步骤d；

5、权利要求1所述的生物芯片的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

a、芯片片基经过醛基化处理；

b、探针的5′端连接poly(dT)₁₀的分子臂；

c、探针的5′端再进行氨基修饰；

e、将探针固定在芯片片基。

6、权利要求1所述的生物芯片在检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药中的应用。

7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于该生物芯片的使用方法如下：

1)、样品处理：取胃粘膜组织抽提基因组DNA作为模板；

2)、PCR扩增：

a.地高辛标记引物：根据23S rRNA突变位点设计引物，用地高辛标记上游引物；所说的引物是：

上游引物：5′-ATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGC-3′，

下游引物：5′-CCAGTCAAACTACCCACCAAGCATT-3′；

b.50μl PCR反应体系中含有1.5mmol MgCI₂，dNTP各200μmol，DNA模板5μl，1x缓冲液，1U Taq酶，上下游引物浓度各0.1μmol；PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸30sec共35个循环，72℃延伸10min；扩增DNA片段长度为286bp；

3)、芯片杂交、显色；取PCR扩增的地高辛标记的DNA样品1μl和10μl杂交液混合，94℃变性5min后迅速冰上冷却5min，取10μl混合液滴加于权利要求1所述的生物芯片的点样区，盖上盖玻片，将芯片置于37℃预温杂交盒内，烘箱孵浴30min后用60℃预热的洗液I振荡洗涤10min，洗液II漂洗1min吹干，在点样区加2500倍稀释的碱性磷酸酶标记的地高辛抗体20μl，37℃静置30min，再用洗液II荡洗30sec后加50μl平衡液静置1min后，取适当大小的尼龙膜，浸泡显色液10sec后小心覆盖于芯片点样区，迅速倒置在湿盒中，轻轻压实，37℃避光静置30min后，取下尼龙膜，去离子水漂洗，待干后用光学扫描仪或放大镜观察结果；

其中：

杂交液组成为：750mmol/L NaCl，75mmol/L乙酸钠，0.1％SDS，1μg/ml鲑精DNA，25％甲酰胺；

洗液I组成为：0.2％SDS，150mmol/L NaCl，150mmol/L乙酸钠；

洗液II组成为：150mmol/L顺丁烯二酸，150mmol/L NaCl，0.3％吐温20，pH 7.5；

平衡液组成为：0.1M Tris-HCL，0.1M NaCl；

显色液组成为：BCIP/NBT溶，Roche公司。