CN111910011A - 一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒，涉及分子生物学技术领域，包括gyrA基因87位点突变检测反应液、gyrA基因91位点突变检测反应液、23SrRNA基因突变检测反应液、片段富集反应液、gyrA外控反应液、23S rRNA外控反应液、Taq DNA聚合酶、阳性质控和阴性质控。本发明操作简单，检测效率高，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，本发明涉及一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylroi，简称H.pylori或HP)是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的细菌。1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中分离成功，是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类。HP能够引起慢性胃炎、胃溃疡等消化道相关疾病，是WHO癌症协会规定的原核生物中唯一的I类致癌因子。全世界有超过半数的人感染HP，而在我国的感染率为59％，因此根除Hp可以减少Hp相关疾病的发生和发展。以质子泵抑制剂(proton pump inhibitor，PPI)结合阿莫西林和克拉霉素(或者喹诺酮)等抗生素的三联疗法或四联治疗等，是国内外公认的一线抗HP感染治疗组合。然而，由于克拉霉素和喹诺酮的耐药率的不断上升，这种疗法的成功率正在逐渐的下降。
目前，临床上用于幽门螺杆菌耐药检测的方法主要有培养药敏法，测序法。培养药敏法需先对幽门螺杆菌进行培养，然后再进行药敏实验，步骤复杂耗时长，且不容易培养出幽门螺杆菌。测序法操作复杂，检测周期长，且检测的灵敏度较低，只能达到10％的突变检出率。且上述方法对于感染度较低的样本均不能很好地检测出结果。
因此，急需一种操作简单，检测效率高，灵敏度高的检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒。
发明内容
为了解决现有检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒的问题，本发明提供一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒。
本发明提供了如下的技术方案：
一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒，包括gyrA基因87位点突变检测反应液、gyrA基因91位点突变检测反应液、23SrRNA基因突变检测反应液、片段富集反应液、gyrA外控反应液、23S rRNA外控反应液、Taq DNA聚合酶、阳性质控和阴性质控；
gyrA基因87位点突变检测反应液的特异性引物及特异性探针的DNA序列分别为：
引物SQ1：5’-ACTAGCGCATCATAAACCGC-S-T-3’
引物SQ2：5’-ACTAGCGCATCATAAACCGC-S-C-3’
引物SQ3：5’-CGATGCATGAATTAGGCCTTACTTC-3’
探针SQ4：5’-FAM-AAGCGCTAGGATCGTGG-MGB-3’；
gyrA基因91位点突变检测反应液的特异性引物及特异性探针的DNA序列分别为：
引物SQ5：5’-CGCCATTCTCACTAGCGCAT-S-A-3’
引物SQ6：5’-CGCCATTCTCACTAGCGCAT-S-T-3’
引物SQ7：5’-CGCCATTCTCACTAGCGCA-S-C-3’
引物SQ8：5’-CGATGCATGAATTAGGCCTTACTTC-3’
探针SQ9：5’-FAM-AAGCGCTAGGATCGTGG-MGB-3’；
23S rRNA基因检测反应液的特异性引物及特异性探针的DNA序列分别为：
引物SQ10：5’-CCGCGGCAAGACGG-S-G-3’
引物SQ11：5’-CCGCGGCAAGACGGA-S-G-3’
引物SQ12：5’-CAGTCAAACTACCCACCAAGCATTG-3’
探针SQ13：5’-FAM-ACAACTTAGCACTGCTAAT-MGB-3’；
片段富集反应液的特异性引物的DNA序列分别为：
引物SQ14：5’-CTTATTCCATGAGCGTGATCATAG-3’
引物SQ15：5’-GCCTTAGTCATTCTGGCTTCAGTG-3’
引物SQ16：5’-TCAGTCGCAAGATGAAGCGTTG-3’
引物SQ17：5’-CAGTCAAACTACCCACCAAGCATTG-3’；
gyrA外控反应液的特异性引物及特异性探针的DNA序列分别为：
引物SQ18：5’-CCATCAATAGAGCCAAAGTTGC-3’
引物SQ19：5’-CGATGCATGAATTAGGCCTTACTTC-3’
探针SQ20：5’-FAM-AAGCGCTAGGATCGTGG-MGB-3’；
23S rRNA外控反应液的特异性引物及特异性探针的DNA序列分别为：
引物SQ21：5’-AACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTG-3’
引物SQ22：5’-CAGTCAAACTACCCACCAAGCATTG-3’
探针SQ23：5’-FAM-ACAACTTAGCACTGCTAAT-MGB-3’。
优选的,gyrA基因87位点突变检测反应液、gyrA基因91位点突变检测反应液、23SrRNA基因突变检测反应液、片段富集反应液、gyrA外控反应液和23S rRNA外控反应液中均含有dNTP、镁离子和PCR扩增使用的buffer。
优选的,gyrA基因87位点突变检测反应液、gyrA基因91位点突变检测反应液、23SrRNA基因突变检测反应液、gyrA外控反应液和23S rRNA外控反应液中均含有内控引物和探针。
优选的，
内控引物序列为：SQ26：5’-CCATCCTGCGTCTGGACCT-3’
SQ27：5’-CCGTGGTGGTGAAGCTGTAG-3’
探针序列为：SQ28：5’-VIC-ACTACCTCATGAAGATCCT-MGB-3’。
优选的,片段富集扩增条件为：95℃预变性5min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，扩增反应20个循环；突变位点检测的扩增条件为：95℃预变性8min，95℃15s，60℃60s，采集荧光，扩增反应40个循环。
优选的,阳性质控中含有插入幽门螺杆菌特定DNA序列SQ24和SQ25的载体质粒，序列SQ24如下：
SQ24:CTTATTCCATGAGCGTGATCATAGGGCGCGCTTTACCGGACGCTAGAGATGGCTTAAAGCCCGTGCATAGGCGTATTTTGTATGCGATGCATGAATTAGGCCTTACTTCAAAAGTCGCTTACAAAAAAAGCGCTAGGATCGTGGGTGATGTGATTGGTAAATACCACCCCCATGGCGATAATGCGGTTTATGATGCGCTAGTGAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCGTTTGGAATTAGTGGATGGGCAGGGCAACTTTGGCTCTATTGATGGCGATAACGCCGCAGCGATGCGTTACACTGAAGCCAGAATGACTAAGG
序列SQ25如下：
SQ25:TCAGTCGCAAGATGAAGCGTTGAATTGAAGCCCGAGTAAACGGCGGCCGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAATTCCTTGTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGATGTTTCTGTTAGCTAACTGGCCTGTGTTATCCACAGGCAGGACAATGCTTGGTGGGTAGTTTGACTG。
本发明的有益效果是：gyrA基因87位点突变检测反应液可同时检测N87K，gyrA基因91位点突变检测反应液可同时检测D91N/Y/D突变，23SrRNA基因突变检测反应液可同时检测A2143G和A2142G突变，检测效率高；使用基因富集的方法可以从粪便和胃组织样本中检测幽门螺杆菌耐药基因gyrA和23S rRNA的突变，即使对极少数基因拷贝的样本也可以达到良好的检测结果；采用扩增阻遏方法，在引物中引入了硫代基团(-S-)，可以更好地对突变位点进行检测，突变的检测灵敏度可以达到1％；采用荧光PCR平台技术，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化，可实时观察结果，且产物不需要凝胶电泳检测，操作简单。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是外控反应通道的FAM和VIC荧光曲线、检测反应通道的VIC荧光曲线图；
图2是检测反应通道的△Ct值＜临界值时，外控反应通道的FAM荧光曲线、检测孔的FAM荧光曲线图；
图3是检测反应通道的△Ct值＞临界值时，外控反应通道的FAM荧光曲线、检测孔的FAM荧光曲线图。
具体实施方式
实施例1
试剂盒的制备
S1.引物和探针设计与合成
本实施例根据gyrA基因和23SrRNA基因序列的特性设计引物和探针，其数据均来源于GenBank中的序列，引物和探针由life technologies公司合成。
S2.阳性质控品的制备
本实例中含有gyrA序列质粒和23SrRNA序列作为阳性质控品。
使用引物：5’-CTTATTCCATGAGCGTGATCATAG-3’和引物：5’-GCCTTAGTCATTCTGGCTTCAGTG-3’扩增gyrA基因靶序列，将经过纯化的PCR产物连接到pGM-T载体上；然后转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经过筛选构建好的重组质粒作为阳性质控品，将构建的重组质粒经双向DNA测序鉴定，提取质粒，紫外分光光度计定量，并保存于-20℃。
使用引物：5’-TCAGTCGCAAGATGAAGCGTTG-3’和引物：5’-CAGTCAAACTACCCACCAAGCATTG-3’扩增23S rRNA基因靶序列，将经过纯化的PCR产物连接到pGM-T载体上；然后转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，同上，经过筛选构建好的重组质粒作为阳性质控品。
S3.反应液的组成如表1
表1
试剂盒的使用
Ⅰ.试剂准备
a.试剂提前取出并平衡至室温，各组分充分融解，震荡混匀，快速离心10s；
b.确定反应数N，按表2进行反应体系配制(以片段富集反应液为例)；
表2
| 组分 | 加量/每人份×N |
| 片段富集反应液 | 18.8μl×N |
| DNA聚合酶 | 0.2μl×N |
| 每管总体积 | 19μl |
注：其gyrA基因87位点突变检测反应液、gyrA基因91位点突变检测反应液、23SrRNA基因突变检测反应液、gyrA外控反应液、23S rRNA外控反应液体系的配制均参照片段富集反应液配制。
c.反应体系分管：准备相应数量的PCR反应管，将上述混合液震荡30s，瞬时离心5s，按19μL/管的量分装至各个PCR管中。将分装好的PCR管转移至样本准备区。
Ⅱ.样本准备
待测样本的提取采用商品化的核酸提取试剂盒，具体操作详见该核酸提取试剂盒说明书。
Ⅲ.加样与富集扩增
分别取1μl待测样本、阳性对照和阴性对照分别加入到已分装的“片段富集反应液”中并进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，扩增反应20个循环。扩增完成后在gyrA基因87位点突变检测反应液、gyrA基因91位点突变检测反应液、23S rRNA基因突变检测反应液、gyrA外控反应液和23S rRNA外控反应液中均加入1μl扩增后的模板。盖紧PCR反应管盖后瞬时离心，进行荧光PCR扩增。
Ⅳ.突变位点的检测
a.取准备好的PCR反应管，放置在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序；
b.打开参数窗口设置循环条件，反应程序如表3所示：
表3
Ⅴ.阳性判断值
不同位点突变△Ct值的临界值如表4所示：
表4
| 突变位点 | △Ct值临界值 |
| 87密码子 | 9 |
| 91密码子 | 9 |
| 23SrRNA | 9 |
△Ct＝|检测反应孔Ct值-外控Ct值|。
Ⅵ.结果判断
本试剂盒中各突变类型的报告荧光为FAM，内标的报告荧光为VIC。
实验结束后，按下列步骤分析和判断：
各突变类型的报告荧光为FAM，内标的报告荧光为VIC。
a.阳性对照：FAM和VIC通道检测均有扩增曲线，Ct值<40；
b.阴性对照：FAM和VIC通道检测均无扩增曲线；
c.样本的检测结果判断：如图1所示，外控反应通道的FAM和VIC荧光曲线均正常，检测反应通道的VIC荧光曲线正常，计算△Ct值。如图2所示，当样本检测反应通道的△Ct值＜临界值时判断为阳性，突变类型为对应的检测反应孔突变；如图3所示，当样本检测反应通道的△Ct值＞临界值时判断为阴性。临界值表参照“阳性判断值”的内容。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒，其特征在于，包括gyrA基因87位点突变检测反应液、gyrA基因91位点突变检测反应液、23SrRNA基因突变检测反应液、片段富集反应液、gyrA外控反应液、23S rRNA外控反应液、Taq DNA聚合酶、阳性质控和阴性质控；
gyrA基因87位点突变检测反应液的特异性引物及特异性探针的DNA序列分别为：
引物SQ1：5’-ACTAGCGCATCATAAACCGC-S-T-3’
引物SQ2：5’-ACTAGCGCATCATAAACCGC-S-C-3’
引物SQ3：5’-CGATGCATGAATTAGGCCTTACTTC-3’
探针SQ4：5’-FAM-AAGCGCTAGGATCGTGG-MGB-3’；
gyrA基因91位点突变检测反应液的特异性引物及特异性探针的DNA序列分别为：
引物SQ5：5’-CGCCATTCTCACTAGCGCAT-S-A-3’
引物SQ6：5’-CGCCATTCTCACTAGCGCAT-S-T-3’
引物SQ7：5’-CGCCATTCTCACTAGCGCA-S-C-3’
引物SQ8：5’-CGATGCATGAATTAGGCCTTACTTC-3’
探针SQ9：5’-FAM-AAGCGCTAGGATCGTGG-MGB-3’；
23S rRNA基因检测反应液的特异性引物及特异性探针的DNA序列分别为：
引物SQ10：5’-CCGCGGCAAGACGG-S-G-3’
引物SQ11：5’-CCGCGGCAAGACGGA-S-G-3’
引物SQ12：5’-CAGTCAAACTACCCACCAAGCATTG-3’
探针SQ13：5’-FAM-ACAACTTAGCACTGCTAAT-MGB-3’；
片段富集反应液的特异性引物的DNA序列分别为：
引物SQ14：5’-CTTATTCCATGAGCGTGATCATAG-3’
引物SQ15：5’-GCCTTAGTCATTCTGGCTTCAGTG-3’
引物SQ16：5’-TCAGTCGCAAGATGAAGCGTTG-3’
引物SQ17：5’-CAGTCAAACTACCCACCAAGCATTG-3’；
gyrA外控反应液的特异性引物及特异性探针的DNA序列分别为：
引物SQ18：5’-CCATCAATAGAGCCAAAGTTGC-3’
引物SQ19：5’-CGATGCATGAATTAGGCCTTACTTC-3’
探针SQ20：5’-FAM-AAGCGCTAGGATCGTGG-MGB-3’；
23S rRNA外控反应液的特异性引物及特异性探针的DNA序列分别为：
引物SQ21：5’-AACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTG-3’
引物SQ22：5’-CAGTCAAACTACCCACCAAGCATTG-3’
探针SQ23：5’-FAM-ACAACTTAGCACTGCTAAT-MGB-3’。
2.根据权利要求1所述的一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒，其特征在于,gyrA基因87位点突变检测反应液、gyrA基因91位点突变检测反应液、23SrRNA基因突变检测反应液、片段富集反应液、gyrA外控反应液和23S rRNA外控反应液中均含有dNTP、镁离子和PCR扩增使用的buffer。
3.根据权利要求1所述的一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒，其特征在于,gyrA基因87位点突变检测反应液、gyrA基因91位点突变检测反应液、23SrRNA基因突变检测反应液、gyrA外控反应液和23S rRNA外控反应液中均含有内控引物和探针。
4.根据权利要求3所述的一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒，其特征在于，
内控引物序列为：SQ26：5’-CCATCCTGCGTCTGGACCT-3’
SQ27：5’-CCGTGGTGGTGAAGCTGTAG-3’
探针序列为：SQ28：5’-VIC-ACTACCTCATGAAGATCCT-MGB-3’。
5.根据权利要求1所述的一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒，其特征在于,片段富集扩增条件为：95℃预变性5min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，扩增反应20个循环；突变位点检测的扩增条件为：95℃预变性8min，95℃15s，60℃60s，采集荧光，扩增反应40个循环。
6.根据权利要求1所述的一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒，其特征在于,阳性质控中含有插入幽门螺杆菌特定DNA序列SQ24和SQ25的载体质粒，
序列SQ24如下：
SQ24:CTTATTCCATGAGCGTGATCATAGGGCGCGCTTTACCGGACGCTAGAGATGGCTTAAAGCCCGTGCATAGGCGTATTTTGTATGCGATGCATGAATTAGGCCTTACTTCAAAAGTCGCTTACAAAAAAAGCGCTAGGATCGTGGGTGATGTGATTGGTAAATACCACCCCCATGGCGATAATGCGGTTTATGATGCGCTAGTGAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCGTTTGGAATTAGTGGATGGGCAGGGCAACTTTGGCTCTATTGATGGCGATAACGCCGCAGCGATGCGTTACACTGAAGCCAGAATGACTAAGG
序列SQ25如下：
SQ25:TCAGTCGCAAGATGAAGCGTTGAATTGAAGCCCGAGTAAACGGCGGCCGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAATTCCTTGTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGATGTTTCTGTTAGCTAACTGGCCTGTGTTATCCACAGGCAGGACAATGCTTGGTGGGTAGTTTGACTG。
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