KR102269770B1 - 낭충봉아부패병 바이러스를 포함하는 꿀벌의 바이러스 질병 진단 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌의 바이러스 질병 진단 방법 및 진단 키트 - Google Patents

낭충봉아부패병 바이러스를 포함하는 꿀벌의 바이러스 질병 진단 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌의 바이러스 질병 진단 방법 및 진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 꿀벌의 바이러스 질병 진단 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌의 바이러스 질병 진단 방법 및 진단 키트에 관한 것으로서, 서열번호 1 내지 12의 염기서열 핵산분자를 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 꿀벌의 바이러스 질병 진단 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌의 바이러스 질병 진단 방법 및 진단 키트를 제공함으로써, 꿀벌의 주요 바이러스성 질병을 동시에 진단하면서도, 고민감도, 고특이도 및 고정밀도(고반복성, 고재현성)로 꿀벌의 바이러스성 질병을 효과적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 그에 소모되는 시간과 비용 절감이 가능하기 때문에, 다양한 시료의 병성감정에 유용하게 이용할 수 있는 효과가 있다.

Description

낭충봉아부패병 바이러스를 포함하는 꿀벌의 바이러스 질병 진단 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌의 바이러스 질병 진단 방법 및 진단 키트 {A primer set for virus disease diagnosis of bees including sacbrood virus, a method for diagnosing virus diseases of bees using the same, and a diagnostic kit}
본 발명은 낭충봉아부패병 바이러스를 포함하는 꿀벌의 바이러스 질병 진단 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌의 바이러스 질병 진단 방법 및 진단 키트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 낭충봉아부패병 바이러스(SBV, sacbrood virus), 여왕벌흑색병바이러스(BQCV, black queen cell virus), 날개 불구병 바이러스(DWV, deformed wing virus) 또는 이스라엘 급성 마비병 바이러스(IAPV, Israelii Acute Paralysis Virus)와 같은 꿀벌의 주요 바이러스성 질병을 검출 가능한 꿀벌의 바이러스성 질병 진단용 프라이머 세트를 이용하여, 꿀벌의 주요 바이러스성 질병을 동시에 진단하는 방법 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 진단용 키트에 관한 것이다.
꿀벌은 다양한 식물자원의 수분에 중요한 역할을 하며 벌꿀과 로얄제리, 프로폴리스 등의 생산으로 농가 소득을 증대시킬 수 있는 산업가축으로도 유용한 곤충이다.
꿀벌(Apis mellifera)은 수만 개체가 좁은 장소에서 집단생활을 하는 특성에 따라 각종 전염병의 발병 가능성이 매우 높다. 또한 감염성 또는 기생성 질병은 일단 발병하는 경우 집단생활의 특성상 봉군 전체에 급속히 전파되고, 치료 행위가 수행되지 않는 한, 개별 봉군의 피해 뿐 아니라 인근 봉군까지 전파되어 피해를 크게 확대시킬 수 있다.
양봉농가에서 문제시 되는 꿀벌 바이러스성 질병의 원인체로는 낭충봉아부패병바이러스(SBV, sacbrood virus), 여왕벌흑색병바이러스(BQCV, black queen cell virus), 날개불구병바이러스(DWV, deformed wing virus), 이스라엘급성마비병(IAPV, Israelii Acute Paralysis Virus), 급성꿀벌마비증바이러스(ABPV, acute bee paralysisvirus), 만성꿀벌마비증바이러스(CBPV, chronic bee paralysisvirus), 케시미어병바이러스(KBV, kashmir beevirus) 등이 있다.
상기 낭충봉아부패병(SBV, sacbrood virus)의 원인체는 직경 20 nm 정도 크기의 공모양의 삭브로드바이러스 (Sacbrood virus)이다. 이 바이러스는 발굽을 가진 동물의 가장 치명적인 바이러스성 질병인 구제역과 같은 피코르나비랄레스(Picornavirales)이며, 이프라비리데 (Iflaviridae), 이프라바이러스(Iflavirus)에 속한다. RNA 바이러스이며, 동양형 (Eastern type), 서양형(Western type), 남아공형 (South african type) 등 3개의 타입이 있다
낭충봉아부패병은 세계적으로 발생하고 있다. 우선, 동양형 낭충봉아부패병 바이러스에 의해서는 동양종꿀벌 (Apis cerana)에 발생하고 있는데, 인도, 네팔, 베트남, 중국, 일본, 말레이시아, 러시아 등의 나라에서 극심한 피해가 있어왔고 현재까지도 우리나라를 비롯한 여러 나라에서 많은 피해를 주고 있다. 특히, 동양형 바이러스에 의한 토종벌 낭충봉아부패병은 바이러스의 고병원성때문인지 아니면 토종벌의 과민한 청소능력때문인지는 명확한 증거는 없으나, 질병의 전파속도가 빨라 봉군을 빠른 시간내에 궤멸시켜 양봉농가에서는 공포의 대상이 되고 있는 질병이다.
낭충봉아부패병 바이러스는 다른 바이러스의 병리발생기전과 마찬가지로 숙주세포에 부착, 핵산합성과 복제, 바이러스 방출 등의 과정을 거치며 숙주에 증상을 나타낸다. 낭충봉아부패병 바이러스는 애벌레의 수용체에 부착한 후, 캡시드내에 있는 RNA가 애벌레 세포의 세포질내로 들어간다. 그런 다음, 낭충봉아부패병 단백질 합성과 RNA 복제가 일어난다. 세포가 용해되면서 새로운 조합의 바이러스가 방출된다. 낭충봉아부패병 바이러스는 애벌레의 장상피세포에 잘 부착하는 것으로 알려져 있고, 장상피세포내에서 증식하면서 수포를 형성하고 그 영향으로 애벌레가 짓무르는 증상을 보이게 된다. 일벌, 숫벌 등은 감염되나 증상이 없다. 여왕벌도 특별한 증상을 보이지 않으나, 낭충봉아부패병 바이러스에 감염된 여왕벌이 낳은 알이 낭충봉아부패병 바이러스를 가지고 태어날 수 있다.
상기 여왕벌흑색병바이러스(BQCV, black queen cell virus)는 꿀벌, 특히 꿀벌 Apis mellifera, Apis florea, and Apis dorsata를 감염시키는 바이러스이다. 1977년에 처음으로 설명되었지만, 게놈은 2000년까지 배열되지 않았다. BQCV는 현재 호주 및 남 아프리카 일부 지역에서 가장 흔하게 발견되고 있다. BQCV은 여왕벌의 번데기에 눈에 띄게 영향을 주어 처음에는 노란 색으로 변하고 그 다음에는 검게 변하고, 결국 죽게 만든다.
번데기는 여왕벌로부터 태어나는데, 그것은 건강해 보이고 이 바이러스에 감염된 징후를 보이지 않는다. 왜냐하면 유충에서만 육안으로 증상확인이 가능하기 때문이다. 유충들만 이 병에 눈에 띄게 영향을 받는 것이 아니라, 성인벌들도 감염될 수 있지만, 자각증상은 없다. BQCV는 또한 먹이를 줄 때, 그리고 벌들이 그들 사이를 이동할 때 그리고 감염된 여왕벌이 다른 벌집에 분포될 때, 벌들로부터 유충들로 옮겨질 수 있다. 이 바이러스에 감염된 벌들을 치료할 수 있는 백신이나 치료법이 없기 때문에, 위생시설의 예방 즉, 벌집의 빗(honeycomb)을 교체하는 하는 것과 다시 치기를 포함한 전염을 예방하는 것이 최선의 방법이다.
BQCV 감염은 여왕 번데기가 노란색으로 변하고 번데기의 피부가 새까맣게 변한다. 감염 후반 단계에서 죽은 여왕벌은 갈색 - 검정색으로 변할 수 있다. 여왕 벌 세포의 벽은 또한 더 어둡고 갈색 검정색이 된다. BQCV는 종종 Nosema apis 감염과 관련이 있다.
상기 날개 불구병 바이러스(DWV, deformed wing virus)는 꿀벌에게 영향을 주는 22개의 알려진 바이러스 중 하나인 RNA바이러스이다. 꿀벌인 Apis Mellifera가 감염되는 경우가 가장 흔하지만, 이는 또한 서양 뒤영벌(bombus terrestris) 같은 다른 종에서도 기록되어 있어, 이전에 예상된 숙주의 특이성이 있을 수 있음을 보여 준다.
이 바이러스는 1980년대 초 일본에서 처음 꿀벌 샘플로부터 분리되어 현재 전 세계에 분포되어 있다. A. mellifera의 주요한 매개체는 바로아응애(Varroa mite)이다. 이것은 벌의 번데기 앞에서 유발하는 가장 명백한 기형의 이름을 따서 지은 것인데, 쪼그라들어 지고 변형된 날개 및 종종 다른 발달한 기형으로 나타난다.
상기 이스라엘 급성 마비병 바이러스(IAPV, Israelii Acute Paralysis Virus)는 2000년에 이스라엘 양봉가에 Picornaviridae 과의 일부인 dicitroviridae 계통에 속하는 이스라엘 급성 마비 바이러스 때문에 곤혹을 치렀다. 이 바이러스는 Acute Bee Paralysis 및 Kashmir Bee Paralysis Virus를 유발하는 바이러스와 매우 유사하지만 다르다. 이스라엘 급성 마비 바이러스는 유명한 식민지 붕괴 장애의 원인 중 하나로 알려져 있으며, 2007년에 IAPV에 감염된 19개 이상의 미국 주와 프랑스 영토에서 확인되었는데, 양봉가들은 벌들의 수에 거의 90 %를 잃게 된 보고가 있다.
이스라엘 급성 마비병 바이러스(IAPV, Israelii Acute Paralysis Virus)에 걸린 꿀벌은 며칠 안에 마비로 인해 날개를 떨면서 죽게 된다. 감염 후 죽은 벌은 벌집 외부에서 발견되며, 벌집에서 기어 다니거나 죽음이 다가오면, 다른 꿀벌에 의해 끌려 나가게 된다.
이러한 다양한 바이러스성 질병에 의하여 봉군전체가 피해를 입을 수도 있으며, 많은 경우 우선 그 생산성에 결정적 피해를 입힐 수 있다.
그런데, 꿀벌의 질병에서 꿀벌 자신의 방어력으로 항생 펩타이드 등이 존재하는 것으로 알려져 있는데, 질병의 발생은 기본적 방어력을 넘어선 것으로 성공적 양봉을 위하여 인간의 질병제어 노력은 필수적으로서, 꿀벌의 질병 제어에서 가장 근간이 되는 것은 신속하고 정확한 진단과 올바른 처치라 할 것이다.
그 동안 꿀벌 질병의 진단은 많은 부분 경험과 직관에 의존하여 왔는데, 이는 많은 오진을 야기시키고, 결과적으로 경험에 의존한 처치방안으로 가장 손쉬운 항생제의 대량 사용을 하게 되었으며, 이는 또한 항생제 내성이 생긴 병원균이 출현하여 더욱 질병의 제어를 어렵게 만들고 있다.
기존의 꿀벌질병 진단법으로는 MLPA(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) 분석법(analysis, 마이크로어레이(microarray), PCR(Ploymerase chain reaction) 등이 있으며 그 중 MLPA 분석, 마이크로어레이를 이용한 진단법은 매우 정교한 기술과 많은 비용이 요구된다.
이에 비하여, PCR법은 간단하고 대부분의 실험실에서 수행 가능한 실험법이며, 꿀벌의 질병을 진단하기 위해서 주로 사용해 왔다. 그리고 일반적인 PCR법은 1종의 프라이머 세트를 사용하여 한 종의 질병만 진단할 수 있는 Single target RT-PCR 법을 사용하기 때문에 하나의 시료 내 여러 종의 꿀벌의 질병을 진단하기 위해서 각각의 질병에 대한 PCR법을 여러 번 수행하여야 하는 바, 좀 더 빠른 질병 진단법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
대한민국 공개특허공보 제10-2010-0024539호
Korean J. Apiculture 23(2);153-159 (2008) 한국양봉학회지 제23권 제4호 통권48호 pp.241-249 (2008); 한국가축위생학회지 제36권 제2호 pp.147-150 (2013) De Smet L1, Ravoet J, de Miranda JR, Wenseleers T, Mueller MY, Moritz RF, de Graaf DC.,2012, BeeDoctor, a versatile MLPA-based diagnostic tool for screening bee viruses.Plos ONE 7(10):e47953. doi: 10.1371/journal.pone.0047953. Glover RH1, Adams IP, Budge G, Wilkins S, Boonham N.,2011.Detection of honey bee (Apis mellifera) viruses with an oligonucleotide microarray.J Invertebr Pathol. 2011 Jul;107(3):216-9.
본 발명의 목적은, 꿀벌의 질병에 특이적인 프라이머 세트를 확립하여 4종의 프라이머 사이의 간섭현상을 줄이면서도, 적은 양의 시료에서도 병성감정이 가능한 실시간 중합효소연쇄반응(real time-PCR)법의 최적 조건을 확립함으로써, 꿀벌에 질병을 일으키는 주요 바이러스성 병원체 4종(SBV, BQCV, DWV 및 IAPV)을 정확하고, 신속하며, 효과적으로 진단할 수 있는 꿀벌의 질병에 특이적인 프라이머 세트를 제공하면서, 이를 이용한 진단방법과 진단 키트를 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 꿀벌 바이러스 질병 진단 프라이머 세트 및 이를 이용한 꿀벌 바이러스 질병 진단방법을 제공한다.
꿀벌 바이러스 질병 진단 프라이머 세트는 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트, 서열번호 4의 정방향 프라이머와 서열번호 5의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 제2 프라이머 세트, 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 프로브로 이루어진 제3 프라이머 세트 또는 서열번호 10의 정방향 프라이머와 서열번호 11의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 프로브로 이루어진 제4 프라이머 세트로 이루어진 군에서 하나 이상의 프라이머 세트를 선택할 수 있다.
상기 꿀벌 바이러스 질병 진단 프라이머 세트를 이용하여 꿀벌에서 채취한 시료를 RT-PCR 수행하면 꿀벌의 바이러스 질병인 낭충봉아부패병(SBV, sacbrood virus), 여왕벌흑색병바이러스(BQCV, black queen cell virus), 날개 불구병 바이러스(DWV, deformed wing virus), 또는 이스라엘급성마비병(IAPV, Israelii Acute Paralysis Virus)을 진단할 수 있다.
또한 본 발명의 또 다른 형태에 따라 상기 꿀벌 바이러스 질병 진단 프라이머 세트를 포함하는 꿀벌 바이러스 질병 진단용 키트를 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 꿀벌에 질병을 일으키는 주요 바이러스성 병원체 4종(SBV, BQCV, DWV 및 IAPV)을 정확하고, 신속하며, 효과적으로 진단할 수 있는 꿀벌의 질병에 특이적인 프라이머 세트를 제공한다. 또한 이를 이용한 진단방법과 진단 키트를 제공함으로써, 꿀벌의 주요 바이러스성 질병을 동시에 진단하면서도, 고민감도, 고특이도 및 고정밀도(고반복성, 고재현성)로 꿀벌의 바이러스성 질병을 효과적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 그에 소모되는 시간과 비용 절감이 가능하기 때문에, 다양한 시료의 병성감정에 유용하게 이용할 수 있는 효과가 있다.
도 1a는 낭충봉아부패병(SBV)의 민감도 시험 결과, 도 1b는 여왕벌흑색병바이러스(BQCV)의 민감도 시험 결과, 도 1c는 날개 불구병 바이러스(DWV)의 민감도 시험 결과, 도 1d는 이스라엘급성마비병(IAPV)의 민감도 시험 결과를 도시하였다.
도 2a는 낭충봉아부패병(SBV)의 특이도 시험 결과, 도 2b는 여왕벌흑색병바이러스(BQCV)의 특이도 시험 결과, 도 2c는 날개 불구병 바이러스(DWV)의 특이도 시험 결과, 도 2d는 이스라엘급성마비병(IAPV)의 특이도 시험 결과를 도시하였다.
도 3a는 낭충봉아부패병(SBV)의 정밀도(반복성) 시험 결과, 도 3b는 여왕벌흑색병바이러스(BQCV)의 정밀도(반복성) 시험 결과, 도 3c는 날개 불구병 바이러스(DWV)의 정밀도(반복성) 시험 결과, 도 3d는 이스라엘급성마비병(IAPV)의 정밀도(반복성) 시험 결과를 도시하였다.
도 4a는 낭충봉아부패병(SBV)의 정밀도(재현성) 1차 시험 결과, 도 4b는 낭충봉아부패병(SBV)의 정밀도(재현성) 2차 시험 결과, 도 4c는 낭충봉아부패병(SBV)의 정밀도(재현성) 3차 시험 결과를 도시하였다.
도 5a는 여왕벌흑색병바이러스(BQCV)의 정밀도(재현성) 1차 시험 결과, 도 5b는 여왕벌흑색병바이러스(BQCV)의 정밀도(재현성) 2차 시험 결과, 도 5c는 여왕벌흑색병바이러스(BQCV)의 정밀도(재현성) 3차 시험 결과를 도시하였다.
도 6a는 날개 불구병 바이러스(DWV)의 정밀도(재현성) 1차 시험 결과, 도 6b는 날개 불구병 바이러스(DWV)의 정밀도(재현성) 2차 시험 결과, 도 6c는 날개 불구병 바이러스(DWV)의 정밀도(재현성) 3차 시험 결과를 도시하였다.
도 7a는 이스라엘급성마비병(IAPV)의 정밀도(재현성) 1차 시험 결과, 도 7b는 이스라엘급성마비병(IAPV)의 정밀도(재현성) 2차 시험 결과, 도 7c는 이스라엘급성마비병(IAPV)의 정밀도(재현성) 3차 시험 결과를 도시하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 형태에 따라 꿀벌 바이러스 질병 진단 프라이머 세트를 제공한다.
상기 꿀벌 바이러스 질병 진단 프라이머 세트는 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트, 서열번호 4의 정방향 프라이머와 서열번호 5의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 제2 프라이머 세트, 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 프로브로 이루어진 제3 프라이머 세트 또는 서열번호 10의 정방향 프라이머와 서열번호 11의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 프로브로 이루어진 제4 프라이머 세트로 이루어진 군에서 하나 이상의 프라이머 세트를 선택할 수 있다.
상기 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트는 낭충봉아부패병 바이러스(SBV, sacbrood virus)를 검출할 수 있다.
상기 서열번호 4의 정방향 프라이머와 서열번호 5의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 제2 프라이머 세트는 여왕벌흑색병바이러스(BQCV, black queen cell virus)를 검출할 수 있다.
상기 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 프로브로 이루어진 제3 프라이머 세트는 날개 불구병 바이러스(DWV, deformed wing virus)를 검출할 수 있다.
상기 서열번호 10의 정방향 프라이머와 서열번호 11의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 프로브로 이루어진 제4 프라이머 세트는 이스라엘급성마비병(IAPV, Israelii Acute Paralysis Virus)을 검출할 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 서열번호 12의 염기서열은 하기 표 1에 도시하였다.
서열
번호		 Primer name Sequences Fluoreacent Dye Tm
1 SBV-S TCACCATTACAGACGGGA FAM 62
2 SBV-AS AAGTACCTATAACATCCATTTG 57
3 SBV-P GTCAGTGGAACTTTGTACGACATACCCG 71
4 BQCV-S TAATCTCGATATAGCCACTTCACC JOE 63
5 BQCV-AS AACTGGGCCGTTTGAGAT 64
6 BQCV-P TACAGGGCGGCGTACCGATAAAGATG 72
7 DWV-S GGTAGAAGGAACGACGAA TexasRed 61
8 DWV-AS GGATGGGGTCCTGAATATTTTAATTAT 62
9 DWV-P ATTGGGTCGTCGTACAGCAACC 70
10 IAPV-S TGACCCTAATAACGAACTTGGT Cy5 63
11 IAPV-AS AATTGCGTCAGTCGTCTTC 62
12 IAPV-P GCTGGATTGCCGCAAACATACC 70
상기 서열번호 3의 프로브, 상기 서열번호 6의 프로브, 상기 서열번호 9의 프로브 또는 상기 서열번호 12의 프로브는 형광염료와 결합할 수 있다.
상기 형광염료는 FAM, JOE, TexasRed, Cy5 중에서 선택하여 결합시킬 수 있으나, 상기 서열번호 3의 프로브, 상기 서열번호 6의 프로브, 상기 서열번호 9의 프로브 또는 상기 서열번호 12의 프로브는 서로 동일한 형광염료를 선택할 수는 없다. 왜냐하면 각각의 형광염료는 파장이 달라서, 여러 가지 병원체를 동시에 진단하기 위해서는 각기 다른 파장의 형광염료를 선택해서 사용해야한다. 한 튜브 내에서 여러 가지 병원체의 진단이 이루어지기 때문에 다른 형광염료를 사용하지 않으면 병원체를 구분할 수 없기 때문이다. 만약 동일한 형광염료를 선택하는 경우 4종의 꿀벌 바이러스 질병을 검출하는데 있어서 서로 다른 바이러스가 검출되더라도 동일한 파장에서 검출되어서 각각 4종의 꿀벌 바이러스 질병을 구별할 수 없어 진단에 어려움이 있기 때문이다.
본 발명의 다른 형태에 따라 꿀벌의 바이러스 질병을 진단하는 방법을 제공한다.
상기 꿀벌의 바이러스 질병을 진단하는 방법은 (a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계, (b) 상기 (a)단계에서 추출한 DNA를 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트, 서열번호 4의 정방향 프라이머와 서열번호 5의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 제2 프라이머 세트, 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 프로브로 이루어진 제3 프라이머 세트 또는 서열번호 10의 정방향 프라이머와 서열번호 11의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 프로브로 이루어진 제4 프라이머 세트로 이루어진 군에서 하나 이상 프라이머 세트를 포함하는 꿀벌의 질병 진단 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 단계, 및 (c) 상기 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행 후 Ct 값을 확인하는 단계를 포함한다.
상기 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트는 낭충봉아부패병 바이러스(SBV, sacbrood virus)를 검출할 수 있다.
상기 서열번호 4의 정방향 프라이머와 서열번호 5의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 제2 프라이머 세트는 여왕벌흑색병바이러스(BQCV, black queen cell virus)를 검출할 수 있다.
상기 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 9의 프로브로 이루어진 프라이머 쌍은 날개 불구병 바이러스(DWV, deformed wing virus)를 검출할 수 있다.
상기 서열번호 10의 정방향 프라이머와 서열번호 11의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 프로브로 이루어진 제4 프라이머 세트는 이스라엘급성마비병(IAPV, Israelii Acute Paralysis Virus)을 검출할 수 있다.
상기 서열번호 3의 프로브, 상기 서열번호 6의 프로브, 상기 서열번호 9의 프로브 또는 상기 서열번호 12의 프로브는 형광염료와 결합할 수 있다.
상기 형광염료는 FAM, JOE, TexasRed, Cy5 중에서 선택하여 결합시킬 수 있으나, 상기 서열번호 3의 프로브, 상기 서열번호 6의 프로브, 상기 서열번호 9의 프로브 또는 상기 서열번호 12의 프로브는 서로 동일한 형광염료를 선택할 수는 없다. 왜냐하면 각각의 형광염료는 파장이 달라서, 여러 가지 병원체를 동시에 진단하기 위해서는 각기 다른 파장의 형광염료를 선택해서 사용해야한다. 한 튜브 내에서 여러 가지 병원체의 진단이 이루어지기 때문에 다른 형광염료를 사용하지 않으면 병원체를 구분할 수 없기 때문이다. 만약 동일한 형광염료를 선택하는 경우 4종의 꿀벌 바이러스 질병을 검출하는데 있어서 서로 다른 바이러스가 검출되더라도 동일한 파장에서 검출되어서 각각 4종의 꿀벌 바이러스 질병을 구별할 수 없어 진단에 어려움이 있기 때문이다.
상기 Ct 값을 확인하는 단계는 Ct값이 35이하일 경우 꿀벌의 바이러스 질병 양성반응으로 진단할 수 있다.
상기 꿀벌의 주요 바이러스성 질병 진단 방법은 한 번의 실험으로 하나의 질병만을 진단할 수 있는 Single target RT-PCR법 보다 진일보한 다중 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex RT-PCR)법이 바람직한데, 상기 방법은 한 번에 여러 종의 질병을 동시에 진단할 수 있는 PCR법이다.
상기 역전사 중합효소연쇄반응(PCR)은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서, 상기 꿀벌의 주요 바이러스성 질병을 진단하는 방법에서, 상기 역전사 중합효소연쇄반응은 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 DNA 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함할 수 있다.
또한 상기 꿀벌의 주요 바이러스성 질병을 진단하는 방법에서, 증폭 반응액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있으며, 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들은 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다.
상기 꿀벌의 주요 바이러스성 질병을 진단하는 방법에서, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 하는 것이 바람직하며, 이는 상업용으로 제공되는 조건에 부합하도록 수행하였다. 본 발명에서는 상업용으로 제공되는 onestep RT PCR 키트 (Taqman probe용)을 사용하였다.
따라서, 본 발명의 상기 꿀벌의 주요 바이러스성 질병을 진단하는 방법에서, 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
상기 TM(melting temperature)은 real-time PCR 증폭과정 후에 생산된 product의 확인을 위하여 수행하는 과정으로, conventional PCR의 경우 PCR후 전기영동을 통해 생산된 산물의 크기 등을 확인할 수 있지만, real-time PCR은 별도의 전기영동을 수행하지 않기 때문에 (TM 분석으로 산물을 100% 확인할 수 있는 것은 아님) 추가적 확인과정의 하나라고 할 수 있다.
PCR 증폭 후 온도를 보통 50℃~90℃ 정도로 서서히 상승시키면 생산된 double strand 가 single strand로 급격하게 풀어지는 온도가 있는데 이 온도를 TM이라고 한다.
TM analysis의 원리는 생산된 산물은 각각의 특이 염기서열을 가지고 있기 때문에 동일한 산물이라면 동일한 TM을 갖는 것으로 볼 수 있기 때문이다.
만약 비특이 반응이나 다이머 생산등으로 다른 산물이 생산됐다면 TM값에 차이가 있고, 이 값을 보고 증폭이 일어났다고 하더라도 이 증폭산물이 원하는 산물인지 아닌지를 구분할 수 있다.
본 발명의 또 다른 형태에 따라 꿀벌 바이러스 질병 진단용 키트를 제공한다.
상기 꿀벌 바이러스 질병 진단용 키트는 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트, 서열번호 4의 정방향 프라이머와 서열번호 5의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 제2 프라이머 세트, 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 프로브로 이루어진 제3 프라이머 세트 또는 서열번호 10의 정방향 프라이머와 서열번호 11의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 프로브로 이루어진 제4 프라이머 세트로 이루어진 군에서 하나 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
상기 꿀벌 바이러스 질병은 낭충봉아부패병(SBV, sacbrood virus), 여왕벌흑색병바이러스(BQCV, black queen cell virus), 날개 불구병 바이러스(DWV, deformed wing virus), 또는 이스라엘급성마비병(IAPV, Israelii Acute Paralysis Virus)을 포함한다.
상기 꿀벌의 바이러스 질병 진단용 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 꿀벌의 주요 바이러스성 병원체 4종에 대한 민감도 테스트
4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 각 병원체 프라이머 세트가 증폭할 수 있는 최소 병원체 DNA 농도를 확인하기 위하여, single target PCR을 이용하여 각 병원체 프라이머의 민감도(sensitivity) 테스트를 수행하였다.
각각의 병원체 DNA를 10배로 단계 희석(10-2㎍/㎕ ~ 10-5㎍/㎕d)한 후, 통상의 방법에 의한 PCR(conventional PCR), 양적 실시간 중합효소연쇄반응(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)을 수행하여 민감도 테스트를 한 결과를 도 1a 내지 도 1d에 나타내었다.
이때, PCR과 qRT-PCR은 제조사에서 제공되는 일반적인 사이클을 준용하였고 상세하게는 역전사 50℃, 15분; 전변성 94℃, 5분; 45 싸이클의 변성 95℃, 10초; 신장; 확장 60℃, 30초로 수행하였다.
도 1a 내지 도 1d에서 보는 바와 같이, 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)의 경우 4종의 병원체 모두 높은 희석배수에서도 민감도가 우수함을 알 수 있다.
실시예 2. 꿀벌의 주요 바이러스성 병원체 4종에 대한 특이도 테스트
4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 RNA 타겟 병원체에 대한 4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 각 병원체 프라이머 세트의 특이도(specificity)를 검증하기 위하여, 각각의 병원체 단독감염이 확인된 검체에 한하여 4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 각 병원체 프라이머 세트를 이용한 다중 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex real-time PCR)을 수행하였다. 이렇게 수행한 특이도 테스트 결과를 도 2a 내지 도 2d에 나타내었다.
도 2a 내지 도 2d에서 보는 바와 같이, 4종의 병원체에 대한 특이도를 가지고 있음을 알 수 있다.
* RNA 타겟 병원체의 특이도를 검증하기 위해 각각의 병원체 단독 감염이 확인된 검체에 한하여 특이도 실험에 사용하였음.
실시예 3. 꿀벌의 주요 바이러스성 병원체 4종에 대한 정밀도(반복성) 테스트
4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 RNA 타겟 병원체에 대한 4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 각 병원체 프라이머 세트의 정밀도(반복성)을 확인하기 위하여, 각 병원체 DNA의 복제수를 10배 단위로 단계적으로 감소시킨 후(105 copies/Rx ~ 102 copies/Rx) 4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 각 병원체 프라이머 세트를 이용한 다중 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex real-time PCR)을 수행하였다. 이렇게 수행한 정밀도(반복성)을 테스트 결과를 도 3a 내지 도 3d에 나타내었다.
도 3a 내지 도 3d에서 보는 바와 같이, 3종의 병원체 모두 102 copies/Rx의 낮은 복제수에서도 Ct 값이 35 이하로서 양성을 나타내는 바, 정밀도(반복성)가 우수함을 알 수 있다.
상기 Ct(threshold of cycle)는 값은 원하는 유전자가 일정양 (초기 10배) 증폭되는 cycle 수를 의미하며 타켓 유전자가 많을수록 초기에 증폭된다. 즉 Ct 가 낮을수록 높은 감염이라고 생각할 수 있다. 따라서 타겟(병원체) 유전자가 얼마나(정량) 있는지 확인하기 위한 값이라고 판단 할 수 있다.
실시예 4. 꿀벌의 낭충봉아부패병에 대한 정밀도(재현성) 테스트
낭충봉아부패병(SBV)의 RNA 타겟 병원체에 대한 4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 각 병원체 프라이머 세트의 정밀도(재현성)을 확인하기 위하여, SBV 병원체 RNA의 복제수를 10배 단위로 단계적으로 감소시킨 후(105 copies/Rx ~ 102 copies/Rx) 4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 각 병원체 프라이머 세트를 이용한 다중 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex real-time PCR)을 수행하였다. 이렇게 3회 수행한 정밀도(재현성) 테스트 결과를 도 4a 내지 도 4c에 나타내었다.
도 4a 내지 도 4c에서 보는 바와 같이, 낭충봉아부패병의 경우 102 copies/Rx의 낮은 복제수에서도 Ct 값이 35 이하로서 양성을 나타내는 바, 정밀도(재현성)가 우수함을 알 수 있다.
실시예 5. 꿀벌의 여왕벌흑색병바이러스에 대한 정밀도(재현성) 테스트
여왕벌흑색병바이러스(BQCV)의 RNA 타겟 병원체에 대한 4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 각 병원체 프라이머 세트의 정밀도(재현성)을 확인하기 위하여, BQCV 병원체 RNA의 복제수를 10배 단위로 단계적으로 감소시킨 후(105 copies/Rx ~ 102 copies/Rx) 4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 각 병원체 프라이머 세트를 이용한 다중 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex real-time PCR)을 수행하였다. 이렇게 3회 수행한 정밀도(재현성) 테스트 결과를 도 5a 내지 도 5c에 나타내었다.
도 5a 내지 도 5c에서 보는 바와 같이, 여왕벌흑색병바이러스의 경우 102 copies/Rx의 낮은 복제수에서도 Ct 값이 35 이하로서 양성을 나타내는 바, 정밀도(재현성)가 우수함을 알 수 있다.
실시예 6. 꿀벌의 날개 불구병 바이러스에 대한 정밀도(재현성) 테스트
날개 불구병 바이러스(DWV)의 RNA 타겟 병원체에 대한 4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 각 병원체 프라이머 세트의 정밀도(재현성)을 확인하기 위하여, DWV 병원체 RNA의 복제수를 10배 단위로 단계적으로 감소시킨 후(105 copies/Rx ~ 102 copies/Rx) 4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 각 병원체 프라이머 세트를 이용한 다중 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex real-time PCR)을 수행하였다. 이렇게 3회 수행한 정밀도(재현성) 테스트 결과를 도 6a 내지 도 6c에 나타내었다.
도 6a 내지 도 6c에서 보는 바와 같이, 날개 불구병 바이러스의 경우 102 copies/Rx의 낮은 복제수에서도 Ct 값이 35 이하로서 양성을 나타내는 바, 정밀도(재현성)가 우수함을 알 수 있다.
실시예 7. 꿀벌의 이스라엘급성마비병에 대한 정밀도(재현성) 테스트
이스라엘급성마비병(IAPV, Israelii Acute Paralysis Virus)의 RNA 타겟 병원체에 대한 4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 각 병원체 프라이머 세트의 정밀도(재현성)을 확인하기 위하여, IAPV 병원체 RNA의 복제수를 10배 단위로 단계적으로 감소시킨 후(105 copies/Rx ~ 102 copies/Rx) 4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 각 병원체 프라이머 세트를 이용한 다중 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex real-time PCR)을 수행하였다. 이렇게 3회 수행한 정밀도(재현성) 테스트 결과를 도 7a 내지 도 7c에 나타내었다.
도 7a 내지 도 7c에서 보는 바와 같이, IAPV의 경우 103 copies/Rx의 낮은 복제수에서도 Ct 값이 35 이하로서 양성을 나타내는 바, 정밀도(재현성)가 우수함을 알 수 있다.
실시예 8. 임상적 민감도 테스트
상기 실시예 4 내지 실시예 7 방법으로 하되 꿀벌 임상시료 94건을 대상으로 하였으며, 다중 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex RT-PCR) 및 통상의 PCR(conventional PCR)을 수행하여, 4종(낭충봉아부패병, 여왕벌흑색병바이러스, 날개 불구병 바이러스, IAPV)의 병원체에 대한 민감도를 테스트한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
검체 수 RT-PCR 결과
(＜ Ct.35 )		 C_PCR 결과
SBV 94 개 40 개 27 개
BQCV 94 개 50 개 43 개
DWV 94 개 20 개 14 개
IAPV 94 개 5 개 5 개
상기 표 2에서 보는 바와 같이, 실시간 PCR(RT-PCR)의 경우 통상의 PCR에 비하여, 민감도가 현저하게 우수함을 알 수 있다.
이는 본 발명에서 게시한 서열번호 1 내지 12의 4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 각 병원체 프라이머 세트를 이용한 실시예 1 내지 8의 실시간 PCR(RT-PCR)의 실험결과들을 참조하면, 본원발명의 4종(SBV, BQCV, DWV, IAPV)의 각 병원체 프라이머 세트는 정방향 및 역방항 프라이머 쌍과 프로브까지 3가지의 염기서열이 일치하여야 검출됨으로써 통상의 PCR에 비하여 민감도 뿐만 아니라, 특이도, 반복성, 재현성 등의 실험결과에서 모두 현저하게 우수함을 알 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 통상의 기술자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 기존에 uniplex PCR로 진행되던 국내 병성감정방법을 민감하고 실시간 정량이가능한 multiplex 진단방법으로 개발한 것으로, 국내 꿀벌질병의 모니터링 및 초기 진단을 가능하게하여 꿀벌질병의 진단 및 예방 등 활용 연구에 유용하게 사용하고자 한다.
<110> Animal and Plant Quarantine Agency <120> A primer set for virus disease diagnosis of bees including sacbrood virus, a method for diagnosing virus diseases of bees using the same, and a diagnostic kit <130> P19-E080 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 1 tcaccattac agacggga 18 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 2 aagtacctat aacatccatt tg 22 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 3 gtcagtggaa ctttgtacga catacccg 28 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 4 taatctcgat atagccactt cacc 24 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 5 aactgggccg tttgagat 18 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 6 tacagggcgg cgtaccgata aagatg 26 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 7 ggtagaagga acgacgaa 18 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 8 ggatggggtc ctgaatattt taattat 27 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 9 attgggtcgt cgtacagcaa cc 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 10 tgaccctaat aacgaacttg gt 22 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 11 aattgcgtca gtcgtcttc 19 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 12 gctggattgc cgcaaacata cc 22

Claims (13)

  1. 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트, 서열번호 4의 정방향 프라이머와 서열번호 5의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 제2 프라이머 세트, 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 프로브로 이루어진 제3 프라이머 세트 및 서열번호 10의 정방향 프라이머와 서열번호 11의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 프로브로 이루어진 제4 프라이머 세트를 포함하는 꿀벌의 바이러스 질병 검출 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트는 낭충봉아부패병 바이러스(SBV, sacbrood virus)를 검출하는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 바이러스 질병 검출 프라이머 세트.

  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 4의 정방향 프라이머와 서열번호 5의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 제2 프라이머 세트는 여왕벌흑색병바이러스(BQCV, black queen cell virus)를 검출하는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 바이러스 질병 검출 프라이머 세트.
  4. 제1항에 있어서,
    서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 프로브로 이루어진 제3 프라이머 세트는 날개 불구병 바이러스(DWV, deformed wing virus)를 검출하는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 바이러스 질병 검출 프라이머 세트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 10의 정방향 프라이머와 서열번호 11의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 프로브로 이루어진 제4 프라이머 세트는 이스라엘 급성 마비병 바이러스(IAPV, Israelii Acute Paralysis Virus)를 검출하는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 바이러스 질병 검출 프라이머 세트.
  6. 꿀벌의 바이러스 질병을 검출하는 방법으로서,
    (a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 (a)단계에서 추출한 DNA를 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트, 서열번호 4의 정방향 프라이머와 서열번호 5의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 제2 프라이머 세트, 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 프로브로 이루어진 제3 프라이머 세트 및 서열번호 10의 정방향 프라이머와 서열번호 11의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 프로브로 이루어진 제4 프라이머 세트를 포함하는 꿀벌의 바이러스 질병 검출 프라이머 세트를 이용하여 다중 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex RT-PCR)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행 후 Ct 값을 확인하는 단계를 포함하는 꿀벌의 바이러스 질병 검출방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트는 낭충봉아부패병 바이러스(SBV, sacbrood virus)를 검출하는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 바이러스 질병 검출방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 서열번호 4의 정방향 프라이머와 서열번호 5의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 제2 프라이머 세트는 여왕벌흑색병바이러스(BQCV, black queen cell virus)를 검출하는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 바이러스 질병 검출방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 프로브로 이루어진 제3 프라이머 세트는 날개 불구병 바이러스(DWV, deformed wing virus)를 검출하는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 바이러스 질병 검출방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 서열번호 10의 정방향 프라이머와 서열번호 11의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 프로브로 이루어진 제4 프라이머 세트는 이스라엘 급성 마비병 바이러스(IAPV, Israelii Acute Paralysis Virus)를 검출하는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 바이러스 질병 검출방법.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 Ct 값을 확인하는 단계는 Ct값이 35이하일 경우 꿀벌의 바이러스 질병 양성반응으로 검출하는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 바이러스 질병 검출방법.
  12. 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트, 서열번호 4의 정방향 프라이머와 서열번호 5의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 제2 프라이머 세트, 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 프로브로 이루어진 제3 프라이머 세트 및 서열번호 10의 정방향 프라이머와 서열번호 11의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 프로브로 이루어진 제4 프라이머 세트를 포함하는 꿀벌 바이러스 질병 검출용 키트.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 꿀벌 바이러스 질병은 낭충봉아부패병(SBV, sacbrood virus), 여왕벌흑색병바이러스(BQCV, black queen cell virus), 날개 불구병 바이러스(DWV, deformed wing virus), 또는 이스라엘급성마비병(IAPV, Israelii Acute Paralysis Virus)을 포함하는 꿀벌 바이러스 질병 검출용 키트.
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