KR101967404B1 - 말 파이로플라즈마증 진단용 세트, 이를 이용한 말 파이로플라즈마증의 진단방법 및 키트 - Google Patents

말 파이로플라즈마증 진단용 세트, 이를 이용한 말 파이로플라즈마증의 진단방법 및 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR101967404B1
KR101967404B1 KR1020170148653A KR20170148653A KR101967404B1 KR 101967404 B1 KR101967404 B1 KR 101967404B1 KR 1020170148653 A KR1020170148653 A KR 1020170148653A KR 20170148653 A KR20170148653 A KR 20170148653A KR 101967404 B1 KR101967404 B1 KR 101967404B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
diagnosing
kit
probe
primer
Prior art date
Application number
KR1020170148653A
Other languages
English (en)
Inventor
조윤상
서현지
유미선
현방훈
천두성
노진형
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020170148653A priority Critical patent/KR101967404B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101967404B1 publication Critical patent/KR101967404B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2545/00—Reactions characterised by their quantitative nature
    • C12Q2545/10—Reactions characterised by their quantitative nature the purpose being quantitative analysis
    • C12Q2545/101—Reactions characterised by their quantitative nature the purpose being quantitative analysis with an internal standard/control

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 고민감도 및 고특이도를 갖는 말 파이로플라즈마증 진단용 세트, 이를 이용한 말 파이로플라즈마증의 진단방법 및 키트에 관한 것으로서, 본 발명에 의하면, 말 파이로플라즈마증을 특이적으로 검출하는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 그에 소모되는 시간과 비용 절감이 가능함으로, 다양한 시료의 병성감정에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

말 파이로플라즈마증 진단용 세트, 이를 이용한 말 파이로플라즈마증의 진단방법 및 키트{Set for diagnosing equine piroplasmosis, method for diagnosing equine piroplasmosis by using the same and kit using the same}
본 발명은 말 파이로플라즈마증 진단용 세트, 이를 이용한 말 파이로플라즈마증의 실시간 유전자 진단방법 및 키트에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 고민감도 및 고특이도를 갖는 말 파이로플라즈마증 진단용 프라이머 및 프로브 세트, 이를 이용한 말 파이로플라즈마증의 진단방법 및 키트에 관한 것이다.
말 파이로플라즈마증(equine piroplasmosis)는 진드기 매개 원충성 질병으로서, 원인체는 대형 파이로에 속하는 바베시아 까발리(Babesia caballi)와 소형 파이로에 속하는 타이레리아 이콰이(Theileria equi)가 있다.
상기 말 파이로플라즈마증에는 말, 노새, 당나귀, 얼룩말 등 마과 동물이 감수성 동물이며, 그 임상 증상으로는 급성 발열, 식욕결핍, 쇠약, 빈혈, 황달, 갑작스런 폐사 또는 체중감소 등 다양하게 나타나며, 급성인 경우 발열 후 1~4주 안에 폐사하게 된다.
상기 말 파이로플라즈마증은 남부 유럽, 아시아, 아프리카, 중남미, 미국 등 전 세계적으로 문제가 되고 있는데, 세계동물보건기구(OIE)에 리스트되어 있는 질병으로 말의 수출입을 통한 질병 유입 발생 및 전파를 규제하고 있다.
국내에서는 상기 말 파이로플라즈마증에 대한 발생 조사 및 보고가 미미한 실정으로서, 2011년부터 말산업육성법 시행으로 중앙 정부와 지자체에서 말산업 육성 종합계획을 추진하고 있어 말사육 두수 및 수입증가가 예상되며, 이에 따른 말 전염병 예방관리의 중요성이 더욱 증가되고 있다.
말 파이로플라즈마증의 진단에 관한 종래기술로는 세계동물보건기구(OIE)에서는 항원검사법으로 직접 검경하거나 PCR을 권고하고 있고, 항체검사법으로는 IFAT, cELISA, CFT를 권고하고 있다 (OIE Terrestrial Manual 2014. CHAPTER 2.5.8. EQUINE PIROPLASMOSIS).
또한, 이태리 당나귀에서 IFAT 항체검사 결과 B. caballi 47.8%, T. equi 40.6%의 양성을 보였으며, PCR 항원검사 결과 B. caballi 3.6%, T. equi 17.4%의 양성이 확인된 바 있다 (BMC Vet Res. 2015. 28;11:100).
한편, 브라질 말에서 IFAT 항체검사 결과 B. caballi 83.0%, T. equi 91.0%의 양성을 보였으며, PCR 항원검사 결과 B. caballi 12.5%, T. equi 59.7%의 양성이 확인되었다 (Parasitol Res. 2007. 02(1):63-8).
또한, 중국에서 ELISA 항체검사 결과 B. caballi 51.16%, T. equi 11.51%의 양성이 확인된 바 있다 (J Vet Med Sci. 2014.76(4):549-52).
그러나, 현재까지 말 파이로플라즈마증에 대한 백신이 개발되지 않아, 예방접종에 의한 방역이 어려우므로 신속한 진단이 필수적이므로, 이에 대한 진단방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 고민감도 및 고특이도로 말 파이로플라즈마증을 신속하고 효과적으로 진단할 수 있는 말 파이로플라즈마증 진단용 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 진단용 세트를 이용하여 고민감도 및 고특이도로 말 파이로플라즈마증을 신속하고 효과적으로 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 진단용 세트를 포함함으로써, 고민감도 및 고특이도로 말 파이로플라즈마증을 신속하고 효과적으로 진단할 수 있는 말 파이로플라즈마증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 진단용 세트; 및 서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 진단용 세트를 포함하는 말 파이로플라즈마증 진단용 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 진단용 세트를 이용하여 말 파이로플라즈마증을 진단하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 진단용 세트를 포함하는 말 파이로플라즈마증 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 말 파이로플라즈마증을 일으키는 병원체 특이 진단용 프라이머 및 프로브 세트, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 말 파이로플라즈마증의 동시 진단방법 및 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 키트는, 말 파이로플라즈마증을 특이적으로 검출하는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 그에 소모되는 시간과 비용 절감이 가능함으로, 다양한 시료의 병성감정에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 실시예 2에서 병원체 감별을 위한 이중 실시간 중합효소연쇄반응(Duplex qPCR)에 따른 반응성을 확인한 것으로서, (A)는 바베시아 까발리/타이레리아 이콰이, (B)는 바베시아 까발리, (C)는 타이레리아 이콰이를 나타낸 것이다.
도 2는 민감도 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 특이도 평가 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 진단용 세트; 및 서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 진단용 세트를 포함하는 말 파이로플라즈마증 진단용 세트에 관한 것이다.
본 발명의 상기 말 파이로플라즈마증 진단용 세트에 포함되는 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 진단용 세트는 바베시아 까발리(Babesia caballi) 진단용일 수 있다.
본 발명의 상기 말 파이로플라즈마증 진단용 세트에 포함되는 상기 서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 진단용 세트는 타이레리아 이콰이(Theileria equi) 진단용일 수 있다.
본 발명의 상기 말 파이로플라즈마증 진단용 세트는 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 9의 프로브로 이루어진 내부 양성 대조군(internal positive control; IPC) 세트를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 말 파이로플라즈마증 진단용 세트를 이용하여 말 파이로플라즈마증을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 말 파이로플라즈마증을 진단하는 방법은 한 번의 실험으로 하나의 병원체만을 진단할 수 있는 Single target RT-PCR법 보다 진일보한 이중 실시간 중합효소연쇄반응(Duplex qPCR)법이 바람직한데, 상기 방법은 한 번에 두 종의 병원체를 동시에 진단할 수 있는 PCR법이다.
그러나, 상기 이중 실시간 중합효소연쇄반응법은 하나의 튜브 내에서 여러 종의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하기 때문에, 프라이머들 사이에 간섭 현상이 생길 수 있으며, 그 종류가 많아질수록 그 가능성은 높아지므로, PCR법을 수행하는데 여러 가지 조건을 수정하여 최적의 조건을 확립하는 것이 중요하다.
본 발명의 상기 말 파이로플라즈마증을 진단하는 방법은 (a) 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계, (b) 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 단계에서 추출한 주형 DNA를 이중 실시간 중합효소연쇄반응(Duplex qPCR)시켜 증폭하는 단계, 및 (c) 상기 단계에 의해 생성된 증폭산물의 Ct(threshold cycle) 값을 분석하여 말 파이로플라즈마증을 진단하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 말 파이로플라즈마증을 진단하는 방법에서, 상기 이중 실시간 중합효소연쇄반응은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서, 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700)에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
본 발명의 상기 말 파이로플라즈마증을 진단하는 방법에서, 상기 이중 실시간 중합효소연쇄반응은 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 예컨대 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다.
본 발명의 상기 말 파이로플라즈마증을 진단하는 방법에서, 바람직하게는, 상기 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다.
본 발명의 상기 말 파이로플라즈마증을 진단하는 방법에서, 증폭 반응액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 상기 말 파이로플라즈마증을 진단하는 방법에서, 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다.
본 발명의 상기 말 파이로플라즈마증을 진단하는 방법에서, Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 상기 말 파이로플라즈마증을 진단하는 방법에서, 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에서, "Ct 값"은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다.
또한, 본 발명은 상기의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 말 파이로플라즈마증 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 상기 말 파이로플라즈마증 진단용 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 말 파이로플라즈마증 진단용 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
< 실시예 1> 말 파이로플라즈마증 병원체에 대한 프라이머 및 프로브 설계
말 파이로플라즈마증을 일으키는 주요 병원체인 바베시아 까발리(Babesia caballi)와 타이레리아 이콰이(Theileria equi) 각각의 병원체의 특이 유전자 부위를 선정하여 상기 2종의 병원체를 진단하는 프라이머 세트 및 프로브를 확립하였다.
여기에서, 상기 프라이머 세트는 관련 논문을 참고하여 증폭되는 PCR 산물의 크기와 어닐링 온도 등을 고려하여 동시 진단이 가능한 프라이머 세트를 선택하거나, 자체 제작하여 말 파이로플라즈마증을 동시 진단할 수 있는 이중 실시간 중합효소연쇄반응(Duplex qPCR)의 프라이머 세트를 확립하였다.
각 원충에 대한 양성 시료를 확보한 후, 원충 프라이머를 이용하여 단일 타겟 실시간 중합효소연쇄반응(Single target RT-PCR)을 수행하고, 증폭산물을 전기 영동하여 DNA의 크기를 확인하였다.
그리고, 증폭된 DNA의 염기서열을 분석한 결과, 각 병원체의 유전정보와 일치함을 확인하였고, 이를 클로닝하여 각 말에 대한 양성 DNA로 이용하였다.
본 실험에 사용한 프라이머 및 프로브의 염기서열을 하기 표 1에 나타내었다.
구분 염기서열 서열번호 비고
B. caballi 세트 B_cabali_S GTTCGGCTGGGGCATCAA 1
B_cabali_AS CGACTGACGCTGTGTTCTGT 2
B_cabali_P CCGATGTCAAGGGGCAGGTTAGAGC 3 TexasRed
T. equi
세트		 T_equi_S GCTTTTGCGGTGTTTC 4
T_equi_AS TCCAAAGCTGATAGGTCAG 5
T_equi_P ATAAATTAGGGAATTGCATGGC 6 FAM
IPC
세트		 IPC-S CGGTCTGAACTCAGATCACGTA 7
IPC-AS CTAGGGATAACAGCGCAATC 8
IPC-P TGATCCAACATCGAGGTCGTAAACC 9 JOE
< 실시예 2> 말 파이로플라즈마증 주요 병원체 2종에 대한 스크리닝 및 Duplex qPCR 조건 확립
상기 실시예 1에서 설계한 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 말 파이로플라즈마증 병원체 진단을 위한 이중 실시간 중합효소연쇄반응(Duplex qPCR) 조건을 확립하기 위하여, 프라이머 농도, 프로브 농도, 어닐링 온도 등을 농도 및 온도를 단계별로 조정하여 최적의 조건을 수립하였다.
각 프라이머 농도를 10 pmole로 하고, 프로브의 농도를 5 pmole로 하며, DNA 5㎕의 조건에서의 스크리닝 및 Duplex qPCR 최적 조건은 하기 표 2와 같다.
이때, 바베시아 까발리(Babesia caballi)와 타이레리아 이콰이(Theileria equi) 각 병원체의 진단 부위를 클로닝하여 Duplex qPCR의 DNA로 이용하였다.
Figure 112017111230055-pat00001
또한, 상기에서 확립한 Duplex qPCR 최적 조건에 따른 반응성을 확인한 결과를 도 1에 나타내었는데, (A)는 바베시아 까발리/타이레리아 이콰이, (B)는 바베시아 까발리, (C)는 타이레리아 이콰이를 나타낸 것이다.
< 실시예 3> 말 파이로플라즈마증의 주요 병원체 2종에 대한 민감도 평가
바베시아 까발리(Babesia caballi)와 타이레리아 이콰이(Theileria equi) 2종의 DNA 타겟 병원체의 민감도(sensitivity)를 확인하기 위하여, 각 병원체 DNA의 복제수를 10배 단위로 단계적으로 감소시킨 후(104 copies/Rx ~ 101 copies/Rx), 민감도를 평가한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이, Duplex qPCR 진단용의 민감도는 모두 10 copies/Rx로서, 매우 우수함을 알 수 있다.
< 실시예 4> 말 파이로플라즈마증의 주요 병원체 2종에 대한 특이도 평가
바베시아 까발리(Babesia caballi)와 타이레리아 이콰이(Theileria equi) 2종의 병원체 및 큐열(coxiella burnetti), 리케치아(Rickettsia conorii), 바토넬라(Bartonella quintana , Bartonella henselae), 보렐리아(Borrelia burgdorferi , Borrelia garnii , Borrelia afzelii), 아나플라즈마(Anaplasma phagocytophlium) 등과 같은 진드기 매개 세균과 원충성 질병에 대한 특이도(specificity)를 확인하기 위하여, 각 병원체 DNA의 복제수를 10배 단위로 단계적으로 감소시킨 후(104 copies/Rx ~ 101 copies/Rx), 특이도를 평가한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보는 바와 같이, 진드기 매개 세균 및 원충성 질병에 대해 특이도 평가를 수행한 결과, 모두 음성으로 확인되었다.
< 실시예 5> 국내 시료의 Duplex qPCR을 이용한 병성감정
본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 확립한 Duplex qPCR법을 적용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 국내에서 채집한 말 혈액 및 혈청 시료 및 말 파이로플라즈마증 매개체 진드기를 이용하여 병성감정을 수행하였다.
실험에 이용된 야외 가검물은 말 혈액 및 혈청 시료 724두, 진드기 6,924마리이다. 상기 국내 시료의 Duplex qPCR 적용에 대한 결과는 하기 표 3에서 보는 바와 같이, 1 두에서 Theileria equi 양성을 확인하였다.
이때, 항원 검사로는 Duplex qPCR 진단법을 이용하고, 항체 검사는 Verterinary Medical Research & Development(VMRD) ELISA kit를 이용하였다.
Figure 112017111230055-pat00002
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 말 파이로플라즈마증을 일으키는 병원체 동시 진단용 프라이머 세트 및 프로브, 이를 이용한 말 파이로플라즈마증의 동시 진단방법 및 이를 포함하는 키트는, 말 파이로플라즈마증을 특이적으로 검출하는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 그에 소모되는 시간과 비용 절감이 가능함으로, 다양한 시료의 병성감정에 이용될 수 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.
<110> Republic of Korea(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Set for diagnosing equine piroplasmosis, method for diagnosing equine piroplasmosis by using the same and kit using the same <130> 10773 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of B. cabali_S <400> 1 gttcggctgg ggcatcaa 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of B. cabali_AS <400> 2 cgactgacgc tgtgttctgt 20 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe of B. cabali_P <400> 3 ccgatgtcaa ggggcaggtt agagc 25 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of T. equi_S <400> 4 gcttttgcgg tgtttc 16 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of T. equi_AS <400> 5 tccaaagctg ataggtcag 19 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe of T. equi_P <400> 6 ataaattagg gaattgcatg gc 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of IPC <400> 7 cggtctgaac tcagatcacg ta 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of IPC <400> 8 ctagggataa cagcgcaatc 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe of IPC <400> 9 tgatccaaca tcgaggtcgt aaacc 25

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 바베시아 까발리(Babesia caballi) 진단용 세트; 및
    서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 타이레리아 이콰이(Theileria equi) 진단용 세트를 포함하는 말 파이로플라즈마증 진단용 세트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 9의 프로브로 이루어진 내부 양성 대조군(internal positive control) 세트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 말 파이로플라즈마증 진단용 세트.
  5. 제1항 또는 제4항의 진단용 세트를 이용하여 말 파이로플라즈마증을 진단하는 방법으로서,
    (a) 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 진단용 세트를 이용하여 상기 단계에서 추출한 주형 DNA를 이중 실시간 중합효소연쇄반응(Duplex qPCR)시켜 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 단계에 의해 생성된 증폭산물의 Ct 값을 분석하여 말 파이로플라즈마증을 진단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 말 파이로플라즈마증을 진단하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항 또는 제4항의 진단용 세트를 포함하는 말 파이로플라즈마증 진단용 키트.
KR1020170148653A 2017-11-09 2017-11-09 말 파이로플라즈마증 진단용 세트, 이를 이용한 말 파이로플라즈마증의 진단방법 및 키트 KR101967404B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170148653A KR101967404B1 (ko) 2017-11-09 2017-11-09 말 파이로플라즈마증 진단용 세트, 이를 이용한 말 파이로플라즈마증의 진단방법 및 키트

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170148653A KR101967404B1 (ko) 2017-11-09 2017-11-09 말 파이로플라즈마증 진단용 세트, 이를 이용한 말 파이로플라즈마증의 진단방법 및 키트

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101967404B1 true KR101967404B1 (ko) 2019-04-11

Family

ID=66167171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170148653A KR101967404B1 (ko) 2017-11-09 2017-11-09 말 파이로플라즈마증 진단용 세트, 이를 이용한 말 파이로플라즈마증의 진단방법 및 키트

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101967404B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110016514A (zh) * 2019-04-12 2019-07-16 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种可用于马梨形虫检测的引物组及试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140003823A (ko) * 2012-06-29 2014-01-10 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) 주혈원충, 바베스열원충, 범안열원충을 진단할 수 있는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 중합효소 연쇄반응 키트, 상기 키트를 이용한 주혈원충, 바베스열원충, 범안열원충 진단 방법
KR20140026592A (ko) * 2014-01-27 2014-03-05 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) 바베스열원충을 진단할 수 있는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 중합효소 연쇄반응 키트 및 상기 키트를 이용한 바베스열원충의 진단 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140003823A (ko) * 2012-06-29 2014-01-10 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) 주혈원충, 바베스열원충, 범안열원충을 진단할 수 있는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 중합효소 연쇄반응 키트, 상기 키트를 이용한 주혈원충, 바베스열원충, 범안열원충 진단 방법
KR20140026592A (ko) * 2014-01-27 2014-03-05 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) 바베스열원충을 진단할 수 있는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 중합효소 연쇄반응 키트 및 상기 키트를 이용한 바베스열원충의 진단 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Veterinary Research Forum, (2014), Vol. 5, No.2, pp129-133. 1부.* *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110016514A (zh) * 2019-04-12 2019-07-16 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种可用于马梨形虫检测的引物组及试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
White et al. A consensus on fungal polymerase chain reaction diagnosis?: a United Kingdom-Ireland evaluation of polymerase chain reaction methods for detection of systemic fungal infections
Jordan et al. TaqMan-based detection of Trichomonas vaginalis DNA from female genital specimens
JPWO2017212904A1 (ja) 複数のプライマーセットを組み合わせたｌａｍｐ法を用いたアフリカ豚コレラウイルスの迅速検出法
CN105603123B (zh) 快速检测猪细小病毒的实时荧光rpa试剂盒、试纸条rpa试剂盒及其用途
Subbotin Molecular identification of nematodes using polymerase chain reaction (PCR).
CN102816847A (zh) 用于检测布鲁氏菌的lamp引物及含有该引物的试剂盒
CN112739833A (zh) 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
Lamaningao et al. Development of a PCR assay for diagnosing trematode (Opisthorchis and Haplorchis) infections in human stools
Sriisan et al. A sensitive and specific SYBR Green-based qPCR assay for detecting scale drop disease virus (SDDV) in Asian sea bass
KR101967404B1 (ko) 말 파이로플라즈마증 진단용 세트, 이를 이용한 말 파이로플라즈마증의 진단방법 및 키트
Hou et al. Rapid detection of bovine viral diarrhea virus using recombinase polymerase amplification combined with lateral flow dipstick assays in bulk milk/Brzo otkrivanje uzrocnika virusnog proljeva goveda u mlijeku iz spremnika pomocu kombinacije metoda umnozene rekombinazne polimeraze i test-traka za" lateral flow" analizu
JP2016019495A (ja) 核酸増幅法
KR20090100950A (ko) 실시간 ｐｃｒ을 이용한 브루셀라 속 균주의 검출 방법
CN101381767A (zh) 旋毛虫通用型实时荧光pcr检测方法
JP2010046038A (ja) イチゴ重要病害の病原菌検出方法および検出用プライマー
CN102154487A (zh) 检测土拉弗朗西斯菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测土拉弗朗西斯菌的方法
JP6880692B2 (ja) 改良された腸内細菌のスクリーニング方法
KR102219895B1 (ko) 쯔쯔가무시병 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트
Sung et al. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid and sensitive detection of nervous necrosis virus in groupers
JP6226460B2 (ja) 核酸の定量方法、それに使用されるプライマーセット、ｄｎａチップおよびアッセイキット、並びにそれを利用する常在菌の判定方法
Heidarnejhad et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid, simple and sensitive detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis.
CN111712583B (zh) 使用多拷贝基因诊断恙虫病的方法
CN107267635B (zh) 用于检测待测猪对猪蓝耳病病毒抗性的试剂盒
JP6886143B2 (ja) ウレアプラズマ属細菌検出用プライマーセット及びその使用
KR20200048076A (ko) 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant