JP6886143B2 - ウレアプラズマ属細菌検出用プライマーセット及びその使用 - Google Patents
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Description
[1]ウレアプラズマ属細菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号1に記載の塩基配列、又は配列番号1に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号2に記載の塩基配列、又は配列番号2に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号3に記載の塩基配列、又は配列番号3に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号4に記載の塩基配列、又は配列番号4に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を含み、ウレアプラズマ属細菌のウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅する、プライマーセット。
[2]配列番号1に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号2に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号3に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号4に記載の塩基配列からなるプライマー、を含む、[1]に記載のプライマーセット。
[3]配列番号5に記載の塩基配列、又は配列番号5に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、又は配列番号6に記載の塩基配列、又は配列番号6に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を更に含む、[1]又は[2]に記載のプライマーセット。
[4]配列番号5に記載の塩基配列からなるプライマー、又は配列番号6に記載の塩基配列からなるプライマー、を更に含む、[1]又は[2]に記載のプライマーセット。
[5]配列番号7に記載の塩基配列、又は配列番号7に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号8に記載の塩基配列、又は配列番号8に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号9に記載の塩基配列、又は配列番号9に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号10に記載の塩基配列、又は配列番号10に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を更に含む、[1]〜[4]のいずれかに記載のプライマーセット。
[6]配列番号7に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号8に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号9に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号10に記載の塩基配列からなるプライマー、を更に含む、[1]〜[4]のいずれかに記載のプライマーセット。
[7]配列番号11に記載の塩基配列、又は配列番号11に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、又は配列番号12に記載の塩基配列、又は配列番号12に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を更に含む、[5]又は[6]に記載のプライマーセット。
[8]配列番号11に記載の塩基配列からなるプライマー、又は配列番号12に記載の塩基配列からなるプライマー、を更に含む、[5]又は[6]に記載のプライマーセット。
[9][1]〜[8]のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、ウレアプラズマ属細菌をLAMP法で検出するためのキット。
[10]ウレアプラズマ属細菌の検出方法であって、生体試料に[1]〜[8]のいずれかに記載のプライマーセットを混合してLAMP法による等温増幅反応を行う工程を含み、前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にウレアプラズマ属細菌が存在していたことを示す、検出方法。
1実施形態において、本発明は、ウレアプラズマ属細菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号1に記載の塩基配列、又は配列番号1に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号2に記載の塩基配列、又は配列番号2に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号3に記載の塩基配列、又は配列番号3に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号4に記載の塩基配列、又は配列番号4に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を含み、ウレアプラズマ属細菌のウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅する、プライマーセットを提供する。
上述したように、ウレアプラズマ・パルバムは、感染者数がより多いため、検出対象としてより重要である。本実施形態のプライマーセットにおいて、配列番号1〜4に記載の塩基配列からなるプライマーは、ウレアプラズマ・パルバムのウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅することができる。ウレアプラズマ・パルバムのウレアーゼβサブユニット遺伝子の塩基配列を配列番号13に示す。
上述したように、ウレアプラズマ・パルバムは、感染者数がより多いため、検出対象としてより重要である。しかしながら、別のウレアプラズマ属細菌であるウレアプラズマ・ウレアリチカムに感染する患者も存在する。
1実施形態において、本発明は、上述したプライマーセットを含む、ウレアプラズマ属細菌をLAMP法で検出するためのキットを提供する。本実施形態のキットを用いてLAMP法を行うことにより、試料中に存在するウレアプラズマ属細菌を簡便に検出することができる。
1実施形態において、本発明は、ウレアプラズマ属細菌の検出方法であって、生体試料に上述したプライマーセットを混合してLAMP法による等温増幅反応を行う工程を含み、前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にウレアプラズマ属細菌が存在していたことを示す、検出方法を提供する。
(ウレアプラズマ・パルバム検出用プライマーの検討)
まず、ウレアプラズマ・パルバム(SV3F4株)から、市販のキット(型式「Maxwell RSC Blood DNA キット」、プロメガ社)を用いてDNAを抽出した。
(ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーの検討)
まず、ウレアプラズマ・ウレアリチカム(F24株)から、市販のキット(型式「Maxwell RSC Blood DNA キット」、プロメガ社)を用いてDNAを抽出した。
(ウレアプラズマ属細菌検出用プライマーの交差反応の検討)
実験例1及び2で見出したウレアプラズマ属細菌検出用プライマーの交差反応について検討した。具体的には、実験例1で見出したプライマーセット「UP7」及び実験例2で見出したプライマーセット「UU4」を用いたLAMP法により、ウレアプラズマ属細菌の類縁菌種のDNAが増幅されるか否かを検討した。
(検出可能なウレアプラズマ・パルバム株の検討)
ウレアプラズマ・パルバムには、SV3F4株、B7株、S55株、OMC−P162株等が存在する。そこで、実験例1で見出したプライマーセット「UP7」を用いたLAMP法により、これらの株を検出することができるか否かを検討した。
(検出可能なウレアプラズマ・ウレアリチカム株の検討)
ウレアプラズマ・ウレアリチカムには、F24株、F7株、S18株、S59株、S100株等が存在する。そこで、実験例2で見出したプライマーセット「UU4」を用いたLAMP法により、これらの株を検出することができるか否かを検討した。
(臨床検体を用いたウレアプラズマ属細菌の検出)
46名の妊婦の膣から綿棒で採取した標本を使用して、従来法である培養法、従来法であるPCR法及びプライマーセット「UP7」及び「UU4」を用いたLAMP法により、ウレアプラズマ属細菌を検出し、結果を比較した。
培養法によるウレアプラズマ属細菌の検出は次のようにして行った。まず、選択培地であるウレアプラズマ寒天培地(アップル科学有限会社)に検体を接種し、35±1℃、CO2濃度5±1%の条件下で4日間培養した。培地に含まれる基質をウレアプラズマ属細菌が利用すると、pHの上昇により指示薬であるフェノールレッドが変色する。この指示薬の変色及びコロニー形態の観察によりウレアプラズマ属細菌の存在の有無を判定した。
もう1本の検体輸送用チューブ内の液体培地1mLを、1.5mLチューブに移し、20,000×gで20分間遠心した。続いて、上清950μLを捨て、残りの50μLから、Loopamp(登録商標)SR DNA抽出キット(栄研化学株式会社)を用いてDNAを抽出した。
検体から抽出したDNAを、プライマーセット「UP7」及び「UU4」を用いたLAMP法によりそれぞれ増幅し、増幅の有無を確認した。プライマーセット「UP7」によりウレアプラズマ・パルバムの存在を検出し、プライマーセット「UU4」によりウレアプラズマ・ウレアリチカムの存在を検出した。
Claims (8)
- ウレアプラズマ・パルバムをLoop−Mediated Isothermal Amplification(LAMP)法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号1に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号2に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号3に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号4に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含み、ウレアプラズマ・パルバムのウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅する、プライマーセット。 - 配列番号5に記載の塩基配列からなるプライマー、又は
配列番号6に記載の塩基配列からなるプライマー、
を更に含む、請求項1に記載のプライマーセット。 - ウレアプラズマ・ウレアリチカムをLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号7に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号8に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号9に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号10に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含み、ウレアプラズマ・ウレアリチカムのウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅する、プライマーセット。 - 配列番号11に記載の塩基配列からなるプライマー、又は
配列番号12に記載の塩基配列からなるプライマー、
を更に含む、請求項3に記載のプライマーセット。 - 請求項1又は2に記載のプライマーセットを含む、ウレアプラズマ・パルバムをLAMP法で検出するためのキット。
- 請求項3又は4に記載のプライマーセットを含む、ウレアプラズマ・ウレアリチカムをLAMP法で検出するためのキット。
- ウレアプラズマ・パルバムの検出方法であって、
生体試料に請求項1又は2に記載のプライマーセットを混合してLAMP法による等温増幅反応を行う工程を含み、
前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にウレアプラズマ・パルバムが存在していたことを示す、検出方法。 - ウレアプラズマ・ウレアリチカムの検出方法であって、
生体試料に請求項3又は4に記載のプライマーセットを混合してLAMP法による等温増幅反応を行う工程を含み、
前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にウレアプラズマ・ウレアリチカムが存在していたことを示す、検出方法。
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