KR20240102035A - 대추나무황화모틀연관바이러스 신속 진단을 위한 재조합효소-중합효소 증폭 반응용 프라이머 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) 신속 진단을 위한 재조합효소-중합효소 증폭 반응용 프라이머 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명은 JYMaV의 RNA를 대추 나무에서 분리하여, JYMaV의 염기서열을 분석하였으며, JYMaV RNA 서열을 바탕으로 재조합효소-중합효소 증폭법으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 제작하였다. 또한, 제작된 프라이머 쌍의 최적 조건을 확인하고, JYMaV의 RNA를 신속 검출 및 진단할 수 있는 것을 확인하였다.
Description
대추나무황화모틀연관바이러스 신속 진단을 위한 재조합효소-중합효소 증폭 반응용 프라이머 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)는 Fimoviridae 과, Emaravirus 속에 속하는 바이러스 종으로, Emaravirus ziziphi으로 불리기도 하며 중국에서 최초로 보고된 이후로 다른 국가로의 확산이 보고된 바 없으며, 대추나무에 감염되어 잎에서의 기형과 황백화 등을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. 국내에서는 공식적으로는 JYMaV에 대한 발생이 보고된 바 없으나, 그 감염이 확인된 바 있다. 기존에 진단 방법으로는 유전물질을 추출한 다음 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction, PCR)으로 진단에 필요한 유전자 일부분을 증폭해 확인하는 방법이 일반적으로 알려진 진단법이나, PCR을 이용한 진단은, 진단 시 핵산의 추출에서부터 증폭 산물의 확인까지 최소 190분 이상의 시간이 소요되며, 유전물질의 추출과 PCR 진행 시 각 과정마다 특수한 장비가 요구되기 때문에, 신속한 검출과 진단에 어려움이 있다.
한편, 재조합효소-중합효소 증폭법(Recombinase Polymerase Amplification; RPA)은 등온에서 특이 DNA를 빠르게 증폭시킬 수 있는 방법으로서, 특이 병원체가 보유한 특이 염기서열의 증폭을 이용하여, 다양한 병원체들을 검출하는데 응용되고 있다.
본 발명의 목적은 대추 나무에서 분리된 신규한 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍을 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 조성물을 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 대추 나무 검체로부터 RNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 RNA를 상기의 키트를 이용하여 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 산물을 확인하는 단계;를 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)의 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대추 나무에서 분리된 신규한 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍을 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 대추 나무 검체로부터 RNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 RNA를 상기의 키트를 이용하여 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 산물을 확인하는 단계;를 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)의 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)의 RNA를 대추나무에서 분리하여, JYMaV의 염기서열을 분석하였으며, JYMaV RNA 서열을 바탕으로 재조합효소-중합효소 증폭법으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 제작하였다. 또한, 제작된 프라이머 쌍의 최적 조건을 확인하고, 신속한 JYMaV의 RNA를 신속 검출 및 진단할 수 있는 것을 확인하여, 관련 산업에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 대추나무 시료에서 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)의 RNA를 PCR로 확인한 도이다.
도 2는 본 발명의 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)을 위하여 제작된 프라이머 쌍의 정보를 확인한 도이다.
도 3는 본 발명의 5쌍의 프라이머 쌍으로 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) RNA 검출을 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 프라이머 쌍 2의 최적 증폭 온도를 확인한 도이다(35℃~45℃).
도 5는 본 발명의 프라이머 쌍 2의 증폭반응에서, 겔 전기영동을 통해 육안을 확인 가능한 시간을 확인한 도이다.
도 6는 본 발명의 프라이머 쌍 2의 증폭반응에서, 최적의 프라이머 농도를 확인한 도이다.
도 7는 본 발명의 프라이머 쌍 2의 증폭반응에서, 최적의 MgOAc의 농도를 확인한 도이다.
도 2는 본 발명의 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)을 위하여 제작된 프라이머 쌍의 정보를 확인한 도이다.
도 3는 본 발명의 5쌍의 프라이머 쌍으로 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) RNA 검출을 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 프라이머 쌍 2의 최적 증폭 온도를 확인한 도이다(35℃~45℃).
도 5는 본 발명의 프라이머 쌍 2의 증폭반응에서, 겔 전기영동을 통해 육안을 확인 가능한 시간을 확인한 도이다.
도 6는 본 발명의 프라이머 쌍 2의 증폭반응에서, 최적의 프라이머 농도를 확인한 도이다.
도 7는 본 발명의 프라이머 쌍 2의 증폭반응에서, 최적의 MgOAc의 농도를 확인한 도이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.
따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 대추 나무에서 분리된 신규한 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)를 제공한다.
본 발명의 “대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)”는 대추(Ziziphus jujuba Mill.) 나무에 영향을 미치는 신규한 에마라바이러스(Emaravirus) 속의 바이러스로 2015년 발견되었으며, 이후 small RNA 라이브러리의 고처리량 시퀀싱을 수행하여, 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)로 확인되었고, 대추나무의 잎에 발생하는 대추 황색 얼룩병(jujube yellow mottle disease)의 원인 바이러스이다. JYMaV는 6개의 유전체 RNA 분절이 시퀀싱 되었으며, 각각은 바이러스 상보성 가닥에 단일 개방형 판독 프레임과 상보적인 5` 및 3` 말단이 있는 2개의 번역되지 않는 영역을 포함하고 있어, 다른 음성 가닥 RNA 바이러스의 전형적인 특징을 가지고 있다. RNA1 (7.1 kb), RNA2 (2.2 kb) 및 RNA3 (1.2 kb)는 보존된 모티프를 기반으로 RNA 의존성 RNA 중합효소, 당 단백질 및 뉴클레오 캡시드 단백질로 확인되는 단백질을 암호화하고, 이는 라즈베리 잎 얼룩 바이러스(raspberry leaf blotch virus, RLBV)에 의해 암호화된 단백질과 중요한 서열 상동성(52-.1-70.4%)을 공유하는 것이 보고되었다. RNA4 (1.5 kb) 및 RNA5 (1.2 kb)는 RLBV 단백질과 관련된 2개의 putative 30 K 운동 단백질을 암호화하고, RNA6에 의해 암호화된 단백질의 기능적인 역할은 아직 알려져 있지 않다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 바이러스는, 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 RNA1 분절 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 바이러스는, 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 RNA2 분절 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 바이러스는, 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 RNA3 분절 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 바이러스는, 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 RNA4 분절 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 바이러스는, 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 RNA5 분절 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 바이러스는, 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 RNA6 분절 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍을 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명의 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 프라이머 쌍은 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)에 이용하는 것일 수 있다.
본 발명의 “재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)”은 PCR 기술 기반의 DNA 및 RNA 증폭을 확인할 수 있는 기술이다. 기존 PCR 방법과는 다르게 RPA 방법은 DNA 결합 단백질(binding protein)과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 시퀀스(target sequence)를 증폭시킬 수 있고, 등온의 중합효소(mesophilic polymerase)를 이용하여 등온조건에서도 증폭이 가능하므로 특별한 장비 없이 등온장치만 있으면 빠른 시간 안에 바이러스를 검출 및 진단할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, RPA 방법에는 비특이적 반응이 종종 발생하므로 이를 방지하기 위하여 적합한 프라이머의 제작이 중요하다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바이러스를 검출용 조성물은 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있으며, 상기 조성물은 반응 증폭 혼합물을 더 포함할 수 있다. 반응 증폭 혼합물은 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 중합 효소, 데옥시뉴클레오티드, 뉴클레아제가 없는 멸균수 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액 등을 지칭하며, 바람직하게는 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드, DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 상기 프로브의 말단에는 형광 물질 등의 리포터를 표지(labeling)할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍을 0.5 내지 6.5 μl 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 1.0 내지 5.0 μl 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은, MgOAc를 0.5 내지 6.5 μl 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 1.0 내지 5.5 μl, 더욱 바람직하게는 1.5 내지 5.0 μl일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 재조합-중합효소 증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 대추 나무 검체로부터 RNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 RNA를 상기의 키트를 이용하여 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 산물을 확인하는 단계;를 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) 검출 방법은 대추 나무 검체 내 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 JYMaV감염 여부를 진단하는 방법을 말한다. 더욱 구체적으로 본 발명의 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)를 진단하기 위한 프라이머를 이용한 증폭 반응을 수행하여 JYMaV의 RNA를 특이적으로 검출할 수 있는 방법일 수 있다.
상기 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미하며, 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA), 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로, 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭 (transcription-mediatedamplification; TMA) (WO88/10315), 자가유지염기서열복제(self sustained sequence replication) (WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭 (loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 등의 증폭 방법일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 증폭은 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)으로 증폭하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 재조합-중합효소 증폭법은 20 내지 50℃의 온도 조건으로 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 20 내지 45℃일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 재조합-중합효소 증폭법은 10 내지 50 분간 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 15 내지 40분 일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 증폭 산물의 확인은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방산선 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 확인하는 것일 수 있고, 바람직하게는 겔 전기영동 방법이나, 이에 제한되지는 않는다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 대추나무 시료에서의 viral RNA 추출 및 확인
<1-1 viral RNA 추출>
대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)감염 시료를 얻기 위해 게놈의 일부분을 타겟으로 한 프라이머를 이용하여 PCR로 진단을 실시하였다. 시료는 경산과 보은의 재배지와 수원의 시험포에서 재배 중인 것을 이용하였으며, 채집한 시료는 비즈를 이용해 곱게 갈아주었다. 그 후 Viral Gene-spinTM Viral DNA / RNA Extraction kit(Intronbio)를 사용해 Viral DNA/RNA를 추출 후 SuPrimeScript RT-PCR Premix(2X)(GENETBIO)를 사용해 PCR을 수행하였으며, PCR 산물을 전기영동을 이용하여 확인하였다. PCR 분석에 이용된 프라이머 쌍은 하기 표 1에 나타내었다.
| primer | sequence (5`-3`) | product size (bp) |
| F | CTTCACCAAATCCACAAGCAAG | 530 |
| R | CACATCACAGAAAAATGAGACC |
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 목적하는 크기의 전기영동 산물이 확인되었다.
<1-2 viral DNA 분석>
상기 실시예 1-1에서 수득된 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다. 구체적으로, 수득된 PCR 산물의 염기서열을 분석한 후 CLC Sequencing Viewer 8을 사용하여 NCBI에 등록된 기존 JYMaV의 서열(MK305894-9)과 비교하여, 서열이 일치하는지 확인하였다. 이후 확인된 시료로부터 차세대염기서열분석법을 이용하여 전체 게놈 RNA에 대한 염기서열을 확인하였다. 이후 확인된 시료로부터 차세대염기서열분석법을 이용하여 RNA1, RNA2, RNA3, RNA4, RNA5, RNA6에 대한 염기서열을 확인하였으며, 각 RNA의 염기서열 명칭 및 서열번호는 하기 표 2에 나타내었다.
| name | 서열번호 |
| JYMaV_RNA1 Nucleic acids Sequence | 11 |
| JYMaV_RNA2 Nucleic acids Sequence | 12 |
| JYMaV_RNA3 Nucleic acids Sequence | 13 |
| JYMaV_RNA4 Nucleic acids Sequence | 14 |
| JYMaV_RNA5 Nucleic acids Sequence | 15 |
| JYMaV_RNA6 Nucleic acids Sequence | 16 |
<실시예 2> JYMaV 검출을 위한 재조합효소-중합효소 증폭법 최적화
<2-1> JYMaV 검출을 위한 프라이머 설계
본 발명의 재조합효소-중합효소 증폭법(Recombinase Polymerase Amplification; RPA)을 이용하여 JYMaV를 검출하기 위한 프라이머를 제작하였다. 구체적으로 상기 실시예 1에서 분석된 JYMaV 염기서열을 바탕으로 Primer BLAST를 시행하여, 5쌍의 프라이머 쌍을 제작하였다. 그 후 제작된 프라이머쌍에서 JYMaV의 RPA 진단에 적합한 프라이머 쌍을 확인하고, RPA 분석을 시행하여 적합한 프라이머 쌍을 선별하였다. 제작된 5쌍의 프라이머 정보는 하기 표 3에 나타내었다.
| Primer | 서열번호 | Sequence | Size |
| JYMaV-RPA_1F | 1 | CTTCAGGATACTCATATATTTTGATAGTAG | 226 bp |
| JYMaV-RPA_1R | 2 | AGGATTAGTAGGAATGAATTGAATTATAGG | |
| JYMaV-RPA_2F | 3 | CCATATTTTGTTATTGGTTCTTAGTTTGTC | 251 bp |
| JYMaV-RPA_2R | 4 | TTAGTACCAAAAGGATATTGAAGATAGATG | |
| JYMaV-RPA_3F | 5 | CATCTATCTTCAATATCCTTTTGGTACT | 232 bp |
| JYMaV-RPA_3R | 6 | CAAGAAATAGATAAAGATTATGACCTGAGGAT | |
| JYMaV-RPA_4F | 7 | TATCCTCAGGTCATAATCTTTATCTATTTC | 160 bp |
| JYMaV-RPA_4R | 8 | GCTTTCACCTTTGAAAACTACTATCAAAAT | |
| JYMaV-RPA_5F | 9 | AAGAAATCTGGTAATCTTGATTTTATTGCC | 207 bp |
| JYMaV-RPA_5R | 10 | TAGTACCAAAAGGATATTGAAGATAGATG |
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기의 프라이머 쌍 중 프라이머 쌍 2(primer pair 2)가 RPA 분석에 적합한 프라이머 쌍인 것을 확인하였으며, 실제로 RPA 분석 결과 프라이머 쌍 2에서 증폭 산물의 밴드(band)가 가장 뚜렷한 것을 확인하여, 프라이머 쌍 2를 이용하여, 최적 조건을 확립하였다.
<2-2> RPA 조건 최적화(온도 조건 확인)
RPA 분석에서 중요한 등온 유지조건의 최적화를 위하여, 최적의 RPA 분석 온도를 확인하였다. 구체적으로, 35℃~45℃의 다양한 온도 조건에서 상기 실시예 2-1의 프라이머를 이용하여 JYMaV를 검출하였다.
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 35 내지 35.6℃의 온도조건에서 반응성이 뛰어난 것을 볼 수 있었다.
<2-3> RPA 조건 최적화(시간 조건 확인)
RPA 분석에서 중요한 등온 유지조건의 최적화를 위하여, 최적의 등온 유지 시간을 확인하였다. 구체적으로, 35.3℃에서 0분 내지 50분간 RPA를 이용하여 JYMaV를 검출하였다.
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 37℃에서는 반응 10분부터 증폭 산물이 확인되었으며, 35분 이후에서 선명하게 관찰되었다.
<2-4> RPA 조건 최적화(최적 프라이머 첨가량 확인)
RPA 분석의 최적화를 위하여, 프라이머의 첨가량에 따른 JYMaV 검출 효과를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2-1의 프라이머를 0배에서부터 2배까지 농도차로 첨가하여, RPA로 JYMaV를 검출하였다. (프라이머 농도 1배 2.1 μl)
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이 프라이머의 첨가량이 늘어날수록 밴드가 선명한 모습을 보였으며, 프라이머의 농도가 2.0배 (4.2 μl)가 되었을 때 밴드가 가장 두껍게 나타나는 모습을 보였다.
<2-5> RPA 조건 최적화(최적 MgOAc 첨가량 확인)
RPA 분석에서 가장 중요한 반응물로 MgOAc가 있으며, MgOAc의 첨가량에 따른 JYMaV 분석 효율을 확인하였다. 구체적으로, 0배에서부터 2배까지 농도차로 MgOAc를 첨가하여 JYMaV 검출을 위한 RPA를 수행하였다. (MgOAc 농도 1배 2.5 μl)
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 1.0배 내지 1.5배로 MgOAc를 첨가하였을 때 최적의 증폭 산물을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 JYMaV의 DNA를 대추나무에서 분리하여, JYMaV의 염기서열을 분석하였으며, JYMaV RNA 서열을 바탕으로 재조합효소-중합효소 증폭법으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 제작하였다. 또한, 제작된 프라이머 쌍의 최적 조건을 확인하고, 신속한 JYMaV의 RNA를 신속 검출 및 진단할 수 있는 것을 확인하였다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (20)
- 대추 나무에서 분리된 신규한 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)
- 제 1항에 있어서,
상기 바이러스는, 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 RNA1 분절 서열을 포함하는 것인, 바이러스. - 제 1항에 있어서,
상기 바이러스는, 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 RNA2 분절 서열을 포함하는 것인, 바이러스. - 제 1항에 있어서,
상기 바이러스는, 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 RNA3 분절 서열을 포함하는 것인, 바이러스. - 제 1항에 있어서,
상기 바이러스는, 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 RNA4 분절 서열을 포함하는 것인, 바이러스. - 제 1항에 있어서,
상기 바이러스는, 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 RNA5 분절 서열을 포함하는 것인, 바이러스. - 제 1항에 있어서,
상기 바이러스는, 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 RNA6 분절 서열을 포함하는 것인, 바이러스. - 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍을 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) 검출용 프라이머 세트.
- 제 8항에 있어서,
상기 프라이머 쌍은 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)에 이용하는 것인, 프라이머 세트. - 제 8항에 있어서,
상기 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 것인, 프라이머 세트. - 제 8항의 프라이머 세트를 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) 검출용 조성물.
- 제 11항에 있어서,
상기 조성물은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머 쌍을 0.5 내지 6.5 μl 포함하는 것인, 조성물. - 제 11항에 있어서,
상기 조성물은, MgOAc를 0.5 내지 6.5 μl 포함하는 것인, 조성물. - 제 11항에 있어서,
상기 조성물은 재조합-중합효소 증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함하는 것인, 조성물. - 제 11항의 조성물을 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV) 검출용 키트.
- 대추 나무 검체로부터 RNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 RNA를 제 15항의 키트를 이용하여 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 산물을 확인하는 단계;를 포함하는 대추나무황화모틀연관바이러스(Jujube yellow mottle-associated virus, JYMaV)의 검출 방법. - 제 16항에 있어서,
상기 증폭은 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)으로 증폭하는 것인, 방법. - 제 17항에 있어서,
상기 재조합-중합효소 증폭법은 20 내지 50℃의 온도 조건으로 수행되는 것인, 방법. - 제 17항에 있어서,
상기 재조합-중합효소 증폭법은 10 내지 50 분간 수행되는 것인, 방법. - 제 16항에 있어서,
상기 증폭 산물의 확인은 DNA 칩, 겔 전기영동으로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 확인하는 것인, 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220183019A KR20240102035A (ko) | 2022-12-23 | 2022-12-23 | 대추나무황화모틀연관바이러스 신속 진단을 위한 재조합효소-중합효소 증폭 반응용 프라이머 조성물 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220183019A KR20240102035A (ko) | 2022-12-23 | 2022-12-23 | 대추나무황화모틀연관바이러스 신속 진단을 위한 재조합효소-중합효소 증폭 반응용 프라이머 조성물 및 이의 용도 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| KR20240102035A true KR20240102035A (ko) | 2024-07-03 |
Family
ID=91900529
Family Applications (1)
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-
2022
- 2022-12-23 KR KR1020220183019A patent/KR20240102035A/ko unknown
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