JP2001352993A - 核酸増幅法のためのオリゴヌクレオチド配列の発見方法 - Google Patents
核酸増幅法のためのオリゴヌクレオチド配列の発見方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 核酸増幅法のための異種オリゴヌクレオチド
配列を見いだす方法の提供。 【解決手段】 この方法は、 ａ）増幅すべき標的核酸の保存的領域をフラグメント化
することにより互いに重複するオリゴヌクレオチド配列
を発生させ、 ｂ）これらの配列フラグメントを、遺伝子バンクまたは
他のＤＮＡデータベースに類似のＤＮＡセグメントを見
いだすために使用し、それにより他の種の生物体に由来
する適当な異種オリゴヌクレオチド配列を同定し、つい
で ｃ）見いだされた異種オリゴヌクレオチド配列を、核酸
増幅法を用いて標的核酸を単離するためのプライマーお
よび／またはプローブとして使用することからなる。
配列を見いだす方法の提供。 【解決手段】 この方法は、 ａ）増幅すべき標的核酸の保存的領域をフラグメント化
することにより互いに重複するオリゴヌクレオチド配列
を発生させ、 ｂ）これらの配列フラグメントを、遺伝子バンクまたは
他のＤＮＡデータベースに類似のＤＮＡセグメントを見
いだすために使用し、それにより他の種の生物体に由来
する適当な異種オリゴヌクレオチド配列を同定し、つい
で ｃ）見いだされた異種オリゴヌクレオチド配列を、核酸
増幅法を用いて標的核酸を単離するためのプライマーお
よび／またはプローブとして使用することからなる。
Description
【０００１】
【技術分野】本発明は、特定の、予め定められた正確に
知られている標的核酸を、この標的核酸の未知の変異体
および突然変異体を含めて検出するために適当な異種オ
リゴヌクレオチド配列を見いだすための方法に関する。
知られている標的核酸を、この標的核酸の未知の変異体
および突然変異体を含めて検出するために適当な異種オ
リゴヌクレオチド配列を見いだすための方法に関する。
【０００２】
【背景技術】核酸増幅法（ＮＡＴ）たとえばＰＣＲ（ポ
リメラーゼ連鎖反応）、ＮＡＳＢＡ（＝核酸配列ベース
増幅）、ＴＭＡ（転写仲介増幅）およびＬＣＲ（ライガ
ーゼ連鎖反応）はインビトロにおいて大量の特異的ＤＮ
Ａ配列を蓄積し、それによりその分析を可能にするため
にとくに効率的な方法である。任意のＤＮＡセグメント
が増幅可能なので、これらの方法とくにＰＣＲは多くの
様々な方法で応用され、とくに血液または血漿中に存在
する可能性があるウイルス汚染の検出にも使用されてい
る。血漿製品についてウイルス性核酸の存在を調べるＮ
ＡＴの使用はこれらの製品のウイルスの安全性を高める
ために確立された実務となっている。この方法は、ウイ
ルスタンパク質またはそれらに対する抗体が血中に検出
できる前に、患者の血液中にウイルスのゲノムを直接検
出してウイルス診断に用いることが可能である。
リメラーゼ連鎖反応）、ＮＡＳＢＡ（＝核酸配列ベース
増幅）、ＴＭＡ（転写仲介増幅）およびＬＣＲ（ライガ
ーゼ連鎖反応）はインビトロにおいて大量の特異的ＤＮ
Ａ配列を蓄積し、それによりその分析を可能にするため
にとくに効率的な方法である。任意のＤＮＡセグメント
が増幅可能なので、これらの方法とくにＰＣＲは多くの
様々な方法で応用され、とくに血液または血漿中に存在
する可能性があるウイルス汚染の検出にも使用されてい
る。血漿製品についてウイルス性核酸の存在を調べるＮ
ＡＴの使用はこれらの製品のウイルスの安全性を高める
ために確立された実務となっている。この方法は、ウイ
ルスタンパク質またはそれらに対する抗体が血中に検出
できる前に、患者の血液中にウイルスのゲノムを直接検
出してウイルス診断に用いることが可能である。
【０００３】ＰＣＲは何回も反復される３段階の反応工
程に基づいている。すなわち、鋳型として、求める配列
を有する二本鎖ＤＮＡを含有する反応混合物を熱により
変性させ、２つの一本鎖を解離させる。冷却すると、過
剰に添加したプライマーは、鋳型ＤＮＡ上の相補性塩基
配列とハイブリダイズする。この場合に使用されるプラ
イマーは、１５〜３０塩基を含有し、求めるＤＮＡセグ
メントの最初および末端に相補性の配列を有する合成オ
リゴヌクレオチドである。求めるＤＮＡセグメントは、
したがって、その２つのプライマーによって隣接され
る。第三の反応工程では、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
に至適な温度に加熱される。プライマーから始まり、ポ
リメラーゼは、開始時のＤＮＡあたり１個のコピーを合
成して、二本鎖化されるＤＮＡの長さはプライマー間の
距離により決定される。これらの過程工程を何回も反復
することによって、標的ＤＮＡが増幅され、分析のため
に利用される。
程に基づいている。すなわち、鋳型として、求める配列
を有する二本鎖ＤＮＡを含有する反応混合物を熱により
変性させ、２つの一本鎖を解離させる。冷却すると、過
剰に添加したプライマーは、鋳型ＤＮＡ上の相補性塩基
配列とハイブリダイズする。この場合に使用されるプラ
イマーは、１５〜３０塩基を含有し、求めるＤＮＡセグ
メントの最初および末端に相補性の配列を有する合成オ
リゴヌクレオチドである。求めるＤＮＡセグメントは、
したがって、その２つのプライマーによって隣接され
る。第三の反応工程では、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
に至適な温度に加熱される。プライマーから始まり、ポ
リメラーゼは、開始時のＤＮＡあたり１個のコピーを合
成して、二本鎖化されるＤＮＡの長さはプライマー間の
距離により決定される。これらの過程工程を何回も反復
することによって、標的ＤＮＡが増幅され、分析のため
に利用される。
【０００４】それぞれの場合、ＤＮＡ鎖の１つと、増幅
されべきＤＮＡセグメントの２つの末端でハイブリダイ
ズするプライマー配列は、標的指向性の様式でＰＣＲを
実施するための前提条件である。この理由から、二本鎖
化されるＤＮＡセグメントの始点および末端におけるヌ
クレオチド配列の正確な知識をもつことが必要である。
適当なプライマーを調製するためには、従って、現在ま
では、選択的ハイブリダイゼーションに適当であり、検
討下にある材料との適当なハイブリダイゼーションが種
特異的、すなわち自己ヌクレオチド配列を有するプライ
マーによって保証されるようにプライマーを調製するこ
とが必要であると考えられてきた。
されべきＤＮＡセグメントの２つの末端でハイブリダイ
ズするプライマー配列は、標的指向性の様式でＰＣＲを
実施するための前提条件である。この理由から、二本鎖
化されるＤＮＡセグメントの始点および末端におけるヌ
クレオチド配列の正確な知識をもつことが必要である。
適当なプライマーを調製するためには、従って、現在ま
では、選択的ハイブリダイゼーションに適当であり、検
討下にある材料との適当なハイブリダイゼーションが種
特異的、すなわち自己ヌクレオチド配列を有するプライ
マーによって保証されるようにプライマーを調製するこ
とが必要であると考えられてきた。
【０００５】この関係で、選択的ハイブリダイゼーショ
ンとは、検出すべきＤＮＡセグメントすなわち標的核酸
にのみ選択的かつ排他的にハイブリダイズするプライマ
ーを意味する。
ンとは、検出すべきＤＮＡセグメントすなわち標的核酸
にのみ選択的かつ排他的にハイブリダイズするプライマ
ーを意味する。
【０００６】しかしながら、慣用のＰＣＲ法は、種特異
的な自己由来プライマーと、同様にこの方法で用いられ
る自己由来のオリゴヌクレオチドプローブに束縛されて
その適用範囲が制限され、時に検出すべきＤＮＡ配列の
未知の変異体の同定には適当でないことが分かってき
た。
的な自己由来プライマーと、同様にこの方法で用いられ
る自己由来のオリゴヌクレオチドプローブに束縛されて
その適用範囲が制限され、時に検出すべきＤＮＡ配列の
未知の変異体の同定には適当でないことが分かってき
た。
【０００７】したがって、核酸増幅法、とくにＰＣＲ法
の適用範囲を、標的核酸を検出するためにこの標的核酸
に非選択的にハイブリダイズするプライマーの選択を利
用できるように改良する目的が生じた。この目的は、標
的核酸に非選択的にハイブリダイズし、標的核酸に関し
て異種である生物体からの異種プライマーであり、それ
にもかかわらずこれらのプライマーは標的核酸の増幅に
適当な異種プライマーを得る方法によって達成される。
の適用範囲を、標的核酸を検出するためにこの標的核酸
に非選択的にハイブリダイズするプライマーの選択を利
用できるように改良する目的が生じた。この目的は、標
的核酸に非選択的にハイブリダイズし、標的核酸に関し
て異種である生物体からの異種プライマーであり、それ
にもかかわらずこれらのプライマーは標的核酸の増幅に
適当な異種プライマーを得る方法によって達成される。
【０００８】
【発明の開示】したがって、本発明は、核酸増幅法のた
めの異種オリゴヌクレオチド配列を見いだす方法におい
て、 ａ) 増幅すべき核酸の保存的領域をフラグメント化する
ことにより互いに重複する配列フラグメント、好ましく
は３０〜５０塩基（たとえば１〜５０、２５〜７５、５
０〜１００等）を発生させ、 ｂ) これらの配列フラグメントを用いて、遺伝子バンク
または他のＤＮＡデータベースたとえばＥＭＢＬに類似
の、すなわち他の種の生物体に由来するオリゴヌクレオ
チド配列にハイブリダイズするＤＮＡセグメントを見い
だし、それを同定し、 ｃ) 見いだされた異種の、ハイブリダイズするオリゴヌ
クレオチド配列を、核酸増幅法を用いて標的核酸を単離
するためのプライマーおよび／またはプローブとして使
用することからなる方法に関する。
めの異種オリゴヌクレオチド配列を見いだす方法におい
て、 ａ) 増幅すべき核酸の保存的領域をフラグメント化する
ことにより互いに重複する配列フラグメント、好ましく
は３０〜５０塩基（たとえば１〜５０、２５〜７５、５
０〜１００等）を発生させ、 ｂ) これらの配列フラグメントを用いて、遺伝子バンク
または他のＤＮＡデータベースたとえばＥＭＢＬに類似
の、すなわち他の種の生物体に由来するオリゴヌクレオ
チド配列にハイブリダイズするＤＮＡセグメントを見い
だし、それを同定し、 ｃ) 見いだされた異種の、ハイブリダイズするオリゴヌ
クレオチド配列を、核酸増幅法を用いて標的核酸を単離
するためのプライマーおよび／またはプローブとして使
用することからなる方法に関する。
【０００９】この方法は、ウイルスのゲノムにおける好
ましくは保存的領域のフラグメント化によって互いに重
複する配列フラグンメントを発生させ、これらのフラグ
ンメントにハイブリダイズし、他の種の生物体に由来す
るオリゴヌクレオチド配列を遺伝子ライブラリー中に同
定することによりウイルス配列セグメントを検出するた
めにとくに有利に使用することができる。配列フラグン
メントは、好ましくは３０〜５０塩基を有するものでな
ければならない。
ましくは保存的領域のフラグメント化によって互いに重
複する配列フラグンメントを発生させ、これらのフラグ
ンメントにハイブリダイズし、他の種の生物体に由来す
るオリゴヌクレオチド配列を遺伝子ライブラリー中に同
定することによりウイルス配列セグメントを検出するた
めにとくに有利に使用することができる。配列フラグン
メントは、好ましくは３０〜５０塩基を有するものでな
ければならない。
【００１０】完全な遺伝子もしくは比較的大きいＤＮＡ
配列に関して配列類似性または配列相同性を見いだすた
めには、多くの相同性探索プログラム（たとえば、Fast
Ｎ、Blast または Wordsearch，the Genetics Computer
Group Inc. Wisconsin Package の作成部門による）が
設計されているが、核酸技術に適当なプライマーおよび
プローブを検索する場合の課題はきわめて高度の類似性
を有する短い配列を正確に見いだすことからなるとの観
察に基づいて、切断が行われる。できる限り多くの異種
配列の同定に成功する見込みを増大させるためには、最
初から、標的ウイルス配列を相同性の検索から除外する
ことが薦められる。
配列に関して配列類似性または配列相同性を見いだすた
めには、多くの相同性探索プログラム（たとえば、Fast
Ｎ、Blast または Wordsearch，the Genetics Computer
Group Inc. Wisconsin Package の作成部門による）が
設計されているが、核酸技術に適当なプライマーおよび
プローブを検索する場合の課題はきわめて高度の類似性
を有する短い配列を正確に見いだすことからなるとの観
察に基づいて、切断が行われる。できる限り多くの異種
配列の同定に成功する見込みを増大させるためには、最
初から、標的ウイルス配列を相同性の検索から除外する
ことが薦められる。
【００１１】上述の相同性の検討に関連して、遺伝子ラ
イブラリー中に見いだされる配列は様々な相同性の程
度、および用いられるフラグメント化されたオリゴヌク
レオチド配列とは異なる配列の長さを示す。したがっ
て、これらの異種オリゴヌクレオチド配列はついで、プ
ライマーおよびプローブとして使用するためのそれらの
適性について、もう一度注意深くチェックしなければな
らない。ＤＮＡへのプライマーまたはプローブの結合の
強さの指標として、相同配列の全体的長さ、保存的ヌク
レオチドの数、存在するミスマッチの数、そのＧ／Ｃ含
量および計算された変性温度は、自己由来のプライマー
およびプローブを置換する異種配列の安定性の決定のた
めに重要な基準である。
イブラリー中に見いだされる配列は様々な相同性の程
度、および用いられるフラグメント化されたオリゴヌク
レオチド配列とは異なる配列の長さを示す。したがっ
て、これらの異種オリゴヌクレオチド配列はついで、プ
ライマーおよびプローブとして使用するためのそれらの
適性について、もう一度注意深くチェックしなければな
らない。ＤＮＡへのプライマーまたはプローブの結合の
強さの指標として、相同配列の全体的長さ、保存的ヌク
レオチドの数、存在するミスマッチの数、そのＧ／Ｃ含
量および計算された変性温度は、自己由来のプライマー
およびプローブを置換する異種配列の安定性の決定のた
めに重要な基準である。
【００１２】この方法で得られた異種プライマーがなお
ミスマッチを含有する場合には、これらの点に位置する
塩基を「ユニバーサルな塩基」たとえばイノシンで置換
し、標的核酸と異種プライマーのヌクレオチド配列の完
全なハイブリダイゼーションを達成することも可能であ
る。
ミスマッチを含有する場合には、これらの点に位置する
塩基を「ユニバーサルな塩基」たとえばイノシンで置換
し、標的核酸と異種プライマーのヌクレオチド配列の完
全なハイブリダイゼーションを達成することも可能であ
る。
【００１３】したがって、この方法は他の種の生物体か
ら異種プライマーを得るために使用することが可能であ
って、これらのプライマーは、自己由来すなわち標的核
酸を含有する生物体中に存在するＤＮＡ配列に由来する
プライマーと同じ方法で標的核酸とハイブリダイゼーシ
ョンさせるのに適している。この方法で得られる異種オ
リゴヌクレオチドは、またＰＣＲに使用できるプローブ
を調製するためにも使用することができる。このような
プローブは多くの場合、蛍光標識されていて、たとえ
ば、５′−ヌクレアーゼアッセイ（Livakら, 1995, Oli
gonucleotides withfluorescent dyes at opposite end
s provide a quenched probe system usefulfor detect
ing a PCR product and nucleic acid hybridization.
PCR Meth.Applic. 4: 357-362）または特定二次構造（T
yagiら, Molecular beacons: Probesthat Fluoresce up
on Hybridization. Nature Biotechnology, March 199
6, Vol. 14: 303-308）に基づいている。
ら異種プライマーを得るために使用することが可能であ
って、これらのプライマーは、自己由来すなわち標的核
酸を含有する生物体中に存在するＤＮＡ配列に由来する
プライマーと同じ方法で標的核酸とハイブリダイゼーシ
ョンさせるのに適している。この方法で得られる異種オ
リゴヌクレオチドは、またＰＣＲに使用できるプローブ
を調製するためにも使用することができる。このような
プローブは多くの場合、蛍光標識されていて、たとえ
ば、５′−ヌクレアーゼアッセイ（Livakら, 1995, Oli
gonucleotides withfluorescent dyes at opposite end
s provide a quenched probe system usefulfor detect
ing a PCR product and nucleic acid hybridization.
PCR Meth.Applic. 4: 357-362）または特定二次構造（T
yagiら, Molecular beacons: Probesthat Fluoresce up
on Hybridization. Nature Biotechnology, March 199
6, Vol. 14: 303-308）に基づいている。
【００１４】しかしながら、本発明による方法では２つ
の蛍光染料（レポーターおよびクエンチャー）で標識さ
れたプライマーを用いることも可能である。このプライ
マーは３′末端で増幅すべきＤＮＡ配列に完全にはハイ
ブリダイズしない。この方法はドイツ特許出願 197 55
642.6 に記載されている。１種または２種以上の熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼを使用することが可能な増幅で
は、少なくともその１種は校正機構特性をもたねばなら
ず、標識プライマーのアンペア塩基はそれに結合したク
エンチャー染料とともに遊離し、レポーター染料の波長
での蛍光の増大を生じる。
の蛍光染料（レポーターおよびクエンチャー）で標識さ
れたプライマーを用いることも可能である。このプライ
マーは３′末端で増幅すべきＤＮＡ配列に完全にはハイ
ブリダイズしない。この方法はドイツ特許出願 197 55
642.6 に記載されている。１種または２種以上の熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼを使用することが可能な増幅で
は、少なくともその１種は校正機構特性をもたねばなら
ず、標識プライマーのアンペア塩基はそれに結合したク
エンチャー染料とともに遊離し、レポーター染料の波長
での蛍光の増大を生じる。
【００１５】本発明の方法で得られ、ＰＣＲのために使
用できる異種オリゴヌクレオチドは、したがってプライ
マーまたはプローブとして用いた場合、標的核酸のＤＮ
Ａ配列のみではなく、他の種の生物体中に存在する核酸
にもハイブリダイズするという事実により傑出してい
る。これにもかかわらず、それらは同じ生物体に由来す
るオリゴヌクレオチドである自己由来のオリゴヌクレオ
チドと全く同様に、標的核酸の検出または単離に適して
いる。
用できる異種オリゴヌクレオチドは、したがってプライ
マーまたはプローブとして用いた場合、標的核酸のＤＮ
Ａ配列のみではなく、他の種の生物体中に存在する核酸
にもハイブリダイズするという事実により傑出してい
る。これにもかかわらず、それらは同じ生物体に由来す
るオリゴヌクレオチドである自己由来のオリゴヌクレオ
チドと全く同様に、標的核酸の検出または単離に適して
いる。
【００１６】上述のアプローチを採用して、Ｃ型肝炎ウ
イルス（ＨＣＶ）の保存的５′-非翻訳領域が異種配列
を見いだすために使用された。以下の配列は、検索結果
の選択を提供し、ＰＣＲによるＨＣＶの検出に用いられ
た。
イルス（ＨＣＶ）の保存的５′-非翻訳領域が異種配列
を見いだすために使用された。以下の配列は、検索結果
の選択を提供し、ＰＣＲによるＨＣＶの検出に用いられ
た。
【００１７】配列番号はまず誘導されたプライマー配列
（配列番号１，２，３，４，６，７，８）またはプロー
ブ配列（５，９）、および、その下に異種配列と代表的
ＨＣＶ領域の相同性を示す。使用された配列では、非相
同塩基はイノシン（Ｉ）で置換された。
（配列番号１，２，３，４，６，７，８）またはプロー
ブ配列（５，９）、および、その下に異種配列と代表的
ＨＣＶ領域の相同性を示す。使用された配列では、非相
同塩基はイノシン（Ｉ）で置換された。
【００１８】配列番号：１ 5′GGT ICA IGG TCT AIG AGA CII CCC GGG 3′ ＡＢ007366 Red Sea Bream イリドウイルス遺伝子ＤＮ
Ａポリメラーゼ
Ａポリメラーゼ
【００１９】式中、「5′GGT ICA IGG TCT AIG AGA CII
CCC GGG 3′」はプライマーの配列を示す。ＡＢ007366
は Red Sea Bream イリドウイルスＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子の配列が寄託された遺伝子バンクの受入番号であ
る。配列の比較では、ＨＣＶ（上段）とＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子（下段）の間に存在する相同性を示してい
る。｜は同一の塩基を指示する。
CCC GGG 3′」はプライマーの配列を示す。ＡＢ007366
は Red Sea Bream イリドウイルスＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子の配列が寄託された遺伝子バンクの受入番号であ
る。配列の比較では、ＨＣＶ（上段）とＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子（下段）の間に存在する相同性を示してい
る。｜は同一の塩基を指示する。
【００２０】配列番号：２ 5′ACT CCA CCA TAG ATC ACT 3′ ＡＢ020864 ヒトゲノムＤＮＡ 8ｐ21.3-ｐ22
【００２１】配列番号：３ 5′CTA ICC ATG GCI TTA GTA TGA G 3′ ＡＣ004616 ヒトＸｐ22
【００２２】配列番号：４ 5′AGC ACC CTI TCA GGC AGT ACC 3′ Ｚ97055 染色体 22 上のＰＡＣ 388Ｍ5 からのヒトＤＮ
Ａ配列
Ａ配列
【００２３】配列番号：５ 5′FAM-TGG GTC ICG AAA GIC CTT GT-TAMRA 3′ ＡＪ009757 Helianthus tuberosus sst-1 遺伝子
【００２４】配列番号：６ 5′GCT CAT GIT GCA CGI ICT ICG AGA C 3′ ＡＪ010298 Drosophila melanogaster レトロトランス
ポゾン様エレメント
ポゾン様エレメント
【００２５】配列番号：７ 5′CAT AGI TCA CTC CCC TGT GA 3′ ＡＦ111207 Cyprinella galactura ＮＡＤＨデヒドロゲ
ナーゼサブユニット２（ＮＤ2）遺伝子
ナーゼサブユニット２（ＮＤ2）遺伝子
【００２６】配列番号：８ 5′AAA GIG ICT AGC CAT GIC ITT AGT A 3′ ＢＶＤＣＧ ウシウイルス性下痢ウイルス完全ゲノム
【００２７】配列番号：９ 5′FAM-GTA CCT GGG TCI CGA AAG ICC TTG TGG TAC T-T
AMRA 3′ ＡＪ009757 Helianthus tuberosus sst-1 遺伝子
AMRA 3′ ＡＪ009757 Helianthus tuberosus sst-1 遺伝子
【００２８】上述のプライマーおよびプローブをＰＣＲ
に使用すると、ＰＣＲの前提条件は少なくとも１つのプ
ライマーペアが増幅すべき核酸とハイブリダイズするこ
とであるから、核酸増幅はＣ型肝炎ウイルス核酸の存在
下にのみ起こる。しかしながら、この場合、他の核酸に
対する前提条件のプライマーペアが存在しないので、そ
れはＣ型肝炎ウイルスの存在下にのみ可能である。入れ
子ＰＣＲが特異性を、なおさらに増大させる。
に使用すると、ＰＣＲの前提条件は少なくとも１つのプ
ライマーペアが増幅すべき核酸とハイブリダイズするこ
とであるから、核酸増幅はＣ型肝炎ウイルス核酸の存在
下にのみ起こる。しかしながら、この場合、他の核酸に
対する前提条件のプライマーペアが存在しないので、そ
れはＣ型肝炎ウイルスの存在下にのみ可能である。入れ
子ＰＣＲが特異性を、なおさらに増大させる。
【００２９】ＨＣＶの検出に関して上述のプライマーお
よびプローブの特異性および感度を証明するために以下
の反応混合物を使用した。
よびプローブの特異性および感度を証明するために以下
の反応混合物を使用した。
【００３０】
【実施例】実施例１：ＨＣＶ入れ子ＰＣＲ，ＴaqＭan
検出 ＲＮＡ抽出 Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡを検出するために、このＲＮＡ
をまず標準方法（たとえば Ishizawa M, Kobayashi Y,
Miyamura T, Matsuma S: Simple procedure ofDNA isol
ation from human serum. Nucl.Acids Res., 1991, 19:
5792）を用いて抽出する。増幅は以下のようにセット
アップする。
検出 ＲＮＡ抽出 Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡを検出するために、このＲＮＡ
をまず標準方法（たとえば Ishizawa M, Kobayashi Y,
Miyamura T, Matsuma S: Simple procedure ofDNA isol
ation from human serum. Nucl.Acids Res., 1991, 19:
5792）を用いて抽出する。増幅は以下のようにセット
アップする。
【００３１】ｃＤＮＡ合成 抽出したＲＮＡ １０μｌを４μｌの５×第一鎖緩衝液
（Life Technologies）、２μｌ プライマー１（５０pm
ol／μｌ；配列表配列番号１参照）、１μｌのｄＮＴＰ
（１０mM）、２μｌのジチオスレイトール（１００m
M）、０.７５μｌの水および０.２５μｌの Superscrip
t（５０単位，Life Technologies）と混合し、この混合
物を４２℃で１時間インキュベートする。ついで酵素を
９５℃で５分間不活性化する。
（Life Technologies）、２μｌ プライマー１（５０pm
ol／μｌ；配列表配列番号１参照）、１μｌのｄＮＴＰ
（１０mM）、２μｌのジチオスレイトール（１００m
M）、０.７５μｌの水および０.２５μｌの Superscrip
t（５０単位，Life Technologies）と混合し、この混合
物を４２℃で１時間インキュベートする。ついで酵素を
９５℃で５分間不活性化する。
【００３２】第一のＰＣＲ ８０μｌの第一ＰＣＲ混合物［水６１.７μｌ、１０×
ＰＣＲ緩衝液（PerkinElmer）８μｌ、２μｌのプライ
マー２（５０pmol／μｌ；配列表の配列番号２参照）、
塩化マグネシウム（２５mM）４.８μｌ、３μｌのｄＮ
ＴＰ（２.５mM）、Taq ＤＮＡポリメラーゼ（２.５単
位，Perkin Elmer）０.５μｌをｃＤＮＡ混合物中にピ
ペットで加え、全体を混合して、以下の熱サイクルに付
す。 １．最初の変性１分間９０℃ ２．各場合、９４℃に２８秒（変性）、５０℃に２８秒
（アニーリング）および６０℃に３８秒（伸長）の３５
サイクル
ＰＣＲ緩衝液（PerkinElmer）８μｌ、２μｌのプライ
マー２（５０pmol／μｌ；配列表の配列番号２参照）、
塩化マグネシウム（２５mM）４.８μｌ、３μｌのｄＮ
ＴＰ（２.５mM）、Taq ＤＮＡポリメラーゼ（２.５単
位，Perkin Elmer）０.５μｌをｃＤＮＡ混合物中にピ
ペットで加え、全体を混合して、以下の熱サイクルに付
す。 １．最初の変性１分間９０℃ ２．各場合、９４℃に２８秒（変性）、５０℃に２８秒
（アニーリング）および６０℃に３８秒（伸長）の３５
サイクル
【００３３】第二のＰＣＲ ５μｌの第一ＰＣＲ混合物を４５μｌの第二のＰＣＲ反
応混合物［水１６.５５μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液（Per
kin Elmer）５μｌ、３μｌの塩化マグネシウム（２５m
M）、４μｌのｄＮＴＰ（２.５mM）、８μｌのプライマ
ー３（１０pmol／μｌ；配列表配列番号３参照）、８μ
ｌのプライマー４（１０pmol／μｌ；配列表配列番号４
参照）、ＴaqＭan プローブ５（１０pmol／μｌ；配列
表の配列番号５参照）０.２５μｌ、０.２μｌのＴaq
ＤＮＡポリメラーゼ（２.５単位，Perkin Elmer）］と
混合し、混合物を以下の熱サイクルに付す。 １．最初の変性１分間９０℃ ２．各場合、９４℃に２８秒（変性）、５６℃に１分
（アニーリングおよび伸長）の３５サイクル ３．評価まで４℃に冷却
応混合物［水１６.５５μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液（Per
kin Elmer）５μｌ、３μｌの塩化マグネシウム（２５m
M）、４μｌのｄＮＴＰ（２.５mM）、８μｌのプライマ
ー３（１０pmol／μｌ；配列表配列番号３参照）、８μ
ｌのプライマー４（１０pmol／μｌ；配列表配列番号４
参照）、ＴaqＭan プローブ５（１０pmol／μｌ；配列
表の配列番号５参照）０.２５μｌ、０.２μｌのＴaq
ＤＮＡポリメラーゼ（２.５単位，Perkin Elmer）］と
混合し、混合物を以下の熱サイクルに付す。 １．最初の変性１分間９０℃ ２．各場合、９４℃に２８秒（変性）、５６℃に１分
（アニーリングおよび伸長）の３５サイクル ３．評価まで４℃に冷却
【００３４】評価 ＰＣＲ反応は蛍光スペクトロメーターで評価する。これ
には蛍光をレポーターの波長（ＦＡＭについては５１８
nm）で測定する。閾値は、標的配列を含まない陰性対照
の蛍光に基づいて計算し、未知試料はこの値に対して評
価する。
には蛍光をレポーターの波長（ＦＡＭについては５１８
nm）で測定する。閾値は、標的配列を含まない陰性対照
の蛍光に基づいて計算し、未知試料はこの値に対して評
価する。
【００３５】実施例２：ＨＣＶ入れ子ＰＣＲ，分子ビー
コンによって検出 ＲＮＡ抽出 Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡを検出するために、このＲＮＡ
をまず標準方法（たとえば Ishizawa M, Kobayashi Y,
Miyamura T, Matsuma S: Simple procedure ofDNA isol
ation from human serum. Nucl.Acids Res., 1991, 19:
5792）を用いて抽出する。増幅は以下のようにセット
アップする。
コンによって検出 ＲＮＡ抽出 Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡを検出するために、このＲＮＡ
をまず標準方法（たとえば Ishizawa M, Kobayashi Y,
Miyamura T, Matsuma S: Simple procedure ofDNA isol
ation from human serum. Nucl.Acids Res., 1991, 19:
5792）を用いて抽出する。増幅は以下のようにセット
アップする。
【００３６】ｃＤＮＡ合成／第一のＰＣＲ 抽出したＲＮＡ １０μｌを２５μｌの２×反応ミック
ス（Life Technologies）、２μｌのプライマー６（５
０pmol／μｌ；配列表の配列番号６参照）、２μｌのプ
ライマー７（５０pmol／μｌ；配列表の配列番号７参
照）、１０μｌの水および１μｌの Superscript II／
Ｔaq ポリメラーゼミックス（Life Technologies）と混
合し、この混合物を以下の熱サイクルに付す。 １．ｃＤＮＡを合成するために、５０℃で１時間インキ
ュベート ２．最初の変性９４℃に２分間 ３．各場合、９４℃に２８秒（変性），５０℃に２８秒
（アニーリング）および６０℃に38秒（伸長）の３５サ
イクル
ス（Life Technologies）、２μｌのプライマー６（５
０pmol／μｌ；配列表の配列番号６参照）、２μｌのプ
ライマー７（５０pmol／μｌ；配列表の配列番号７参
照）、１０μｌの水および１μｌの Superscript II／
Ｔaq ポリメラーゼミックス（Life Technologies）と混
合し、この混合物を以下の熱サイクルに付す。 １．ｃＤＮＡを合成するために、５０℃で１時間インキ
ュベート ２．最初の変性９４℃に２分間 ３．各場合、９４℃に２８秒（変性），５０℃に２８秒
（アニーリング）および６０℃に38秒（伸長）の３５サ
イクル
【００３７】第二のＰＣＲ ５μｌの第一ＰＣＲ混合物を４５μｌの第二のＰＣＲ反
応混合物［水１６.５５μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液（Per
kin Elmer）５μｌ、３μｌの塩化マグネシウム（２５m
M）、４μｌのｄＮＴＰ（２.５mM）、８μｌのプライマ
ー８（１０pmol／μｌ；配列表配列番号８参照）、８μ
ｌのプライマー４（１０pmol／μｌ；配列表配列番号４
参照）、０.２５μｌの分子ビーコンプローブ９（５pmo
l／μｌ；配列表の配列番号９参照）、０.２５μｌのＴ
aq ＤＮＡポリメラーゼ（２.５単位，Perkin Elmer）］
と混合し、混合物を以下の熱サイクルに付す。 １．最初の変性１分間９０℃ ２．各場合、９４℃に２８秒（変性）、５６℃に２８秒
（アニーリング）および７２℃に３８秒（伸長）の３５
サイクル ３．１０分以内に２０℃に冷却
応混合物［水１６.５５μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液（Per
kin Elmer）５μｌ、３μｌの塩化マグネシウム（２５m
M）、４μｌのｄＮＴＰ（２.５mM）、８μｌのプライマ
ー８（１０pmol／μｌ；配列表配列番号８参照）、８μ
ｌのプライマー４（１０pmol／μｌ；配列表配列番号４
参照）、０.２５μｌの分子ビーコンプローブ９（５pmo
l／μｌ；配列表の配列番号９参照）、０.２５μｌのＴ
aq ＤＮＡポリメラーゼ（２.５単位，Perkin Elmer）］
と混合し、混合物を以下の熱サイクルに付す。 １．最初の変性１分間９０℃ ２．各場合、９４℃に２８秒（変性）、５６℃に２８秒
（アニーリング）および７２℃に３８秒（伸長）の３５
サイクル ３．１０分以内に２０℃に冷却
【００３８】評価 ＰＣＲ反応は蛍光スペクトロメーターで評価する。これ
には蛍光をレポーターの波長（ＦＡＭについては５１８
nm）で測定する。閾値は、標的配列を含まない陰性対照
の蛍光に基づいて計算し、未知試料はこの値に対して評
価する。
には蛍光をレポーターの波長（ＦＡＭについては５１８
nm）で測定する。閾値は、標的配列を含まない陰性対照
の蛍光に基づいて計算し、未知試料はこの値に対して評
価する。
【００３９】結果 上述の条件下に実施した実験で達成された結果は、ＨＣ
Ｖゲノタイプ（ゲノタイプ１〜５の単離体が処理され
た）の検出性および分析の感度の両者に関して、自己由
来のプライマーおよびプローブを使用した入れ子ＰＣＲ
によって得られた結果と同等であった。
Ｖゲノタイプ（ゲノタイプ１〜５の単離体が処理され
た）の検出性および分析の感度の両者に関して、自己由
来のプライマーおよびプローブを使用した入れ子ＰＣＲ
によって得られた結果と同等であった。
【００４０】本発明の核酸増幅法は、使用されるプライ
マーペア中の両プライマーが異種であることを要求しな
い。標的核酸の検出および／または単離に適当な増幅は
また自己由来プライマーおよび異種プライマーの組み合
わせを用いても実施できる。
マーペア中の両プライマーが異種であることを要求しな
い。標的核酸の検出および／または単離に適当な増幅は
また自己由来プライマーおよび異種プライマーの組み合
わせを用いても実施できる。
【００４１】本発明はまた、プライマーの１種または両
者が異種のセットである、ＰＣＲを実施するための試薬
セットに関する。本発明はさらに、上述のプライマーに
加えて、他の種の生物体のゲノムに由来し、したがって
異種であり、好ましくは分子ビーコンプローブとして存
在するオリゴヌクレオチドプローブをも含有する試薬セ
ットに関する。
者が異種のセットである、ＰＣＲを実施するための試薬
セットに関する。本発明はさらに、上述のプライマーに
加えて、他の種の生物体のゲノムに由来し、したがって
異種であり、好ましくは分子ビーコンプローブとして存
在するオリゴヌクレオチドプローブをも含有する試薬セ
ットに関する。
【００４２】本発明によるオリゴヌクレオチドの場合に
は、標的核酸のヌクレオチド配列との完全なハイブリダ
イゼーションを妨げるミスマッチを補償するためにユニ
バーサルな塩基のイノシンを使用することができる。標
的核酸との不完全なハイブリダイゼーションはまた、ま
だ不明の標的核酸の変異体の存在により起こることもあ
る。これらの変異体でも、本発明の異種プライマーおよ
びプローブによって、特異的に検出することができる。
ユニバーサルな塩基のイノシンが、プライマーまたはプ
ローブのミスマッチ部位に挿入されるからである。した
がって、本発明の方法は、もっぱら自己由来のプライマ
ーおよびプローブで操作される方法に比べて、拡大され
た検出範囲を有するものである。
は、標的核酸のヌクレオチド配列との完全なハイブリダ
イゼーションを妨げるミスマッチを補償するためにユニ
バーサルな塩基のイノシンを使用することができる。標
的核酸との不完全なハイブリダイゼーションはまた、ま
だ不明の標的核酸の変異体の存在により起こることもあ
る。これらの変異体でも、本発明の異種プライマーおよ
びプローブによって、特異的に検出することができる。
ユニバーサルな塩基のイノシンが、プライマーまたはプ
ローブのミスマッチ部位に挿入されるからである。した
がって、本発明の方法は、もっぱら自己由来のプライマ
ーおよびプローブで操作される方法に比べて、拡大され
た検出範囲を有するものである。
【００４３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Aventis Behring GmbH <120> Process for finding oligonucleotide sequences for nucleic acid amplification methods <130> SP-1083 <150> DE 100 18 901.6 <151> 2000-04-14 <150> DE 100 24 830.6 <151> 2000-05-19 <160> 9 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Red sea bream iridovirus gene <400> 1 ggticaiggt ctaigagaci icccggg 27 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 actccaccat agatcact 18 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctaiccatgg cittagtatg ag 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Human DNA sequence from PAC 388M5 <400> 4 agcaccctit caggcagtac c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Helianthus tuberosus sst-1 gene <400> 5 FAM-tgggtcicga aagiccttgt-TAMRA 20 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Drosophila melanogaster <400> 6 gctcatgitg cacgiictic gagac 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> cyprinella galactura <400> 7 catagitcac tcccctgtga 20 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Bovine viral diarrhea virus <400> 8 aaagigicta gccatgicit tagta 25 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Helianthus tuberosus sst-1 gene <400> 9 FAM-gtacctgggt cicgaaagic cttgtggtact-TAMRA 31
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA14 BA80 CA04 CA09 CA11 HA12 4B063 QA01 QA17 QQ03 QQ10 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02
Claims (9)
- 【請求項１】 核酸増幅法のための異種オリゴヌクレオ
チド配列を見いだす方法であって、 ａ) 増幅すべき標的核酸の保存的領域をフラグメント化
することにより互いに重複するオリゴヌクレオチド配列
を発生させ、 ｂ) これらの配列フラグメントを、遺伝子バンクまたは
他のＤＮＡデータベースに類似のＤＮＡセグメントを見
いだすために使用し、それにより他の種の生物体に由来
する適当な異種オリゴヌクレオチド配列を同定し、つい
で ｃ) 見いだされた異種オリゴヌクレオチド配列を、核酸
増幅法を用いて標的核酸を単離するためのプライマーお
よび／またはプローブとして使用することからなる方
法。 - 【請求項２】 ３０〜５０塩基からなる互いに重複する
オリゴヌクレオチド配列をウイルスのゲノムにおける保
存的領域のフラグメント化によって発生させ、ウイルス
を検出するために適当な異種オリゴヌクレオチド配列を
遺伝子ライブラリー中に同定することからなる請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】 見いだされたハイブリダイズする異種オ
リゴヌクレオチド配列中に存在するミスマッチをユニバ
ーサルな塩基（たとえば、イノシン）により置換し、そ
れによって標的核酸のヌクレオチド配列との完全なハイ
ブリダイゼーションを達成することからなる請求項１ま
たは２記載の方法。 - 【請求項４】 核酸を増幅する方法において、請求項１
〜３のいずれかに記載のようにして得られた異種オリゴ
ヌクレオチド配列を、予め定められた標的核酸の選択的
な単離のためのプライマーおよび／またはプローブとし
て使用することからなる方法。 - 【請求項５】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＮＡ
ＳＢＡ（＝核酸配列ベース増幅）、ＴＭＡ（転写仲介増
幅）またはＬＣＲ（ライガーゼ連鎖反応）のような核酸
増幅法を標的核酸の増幅のために用いる請求項４記載の
方法。 - 【請求項６】 求めるＤＮＡ配列を有し、他の種の生物
体のゲノムに由来するオリゴヌクレオチドプライマーの
ペアからなる、ポリメラーゼ連鎖反応を実行するための
試薬セット。 - 【請求項７】 他の種の生物体のゲノムに由来し、プラ
イマーに隣接する標的核酸ＤＮＡ配列にハイブリダイズ
する異種ＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドプロー
ブをさらに含む請求項６記載の試薬セット。 - 【請求項８】 プローブは、その５′および３′位置に
互いの蛍光に影響する２つの蛍光染料（レポーターおよ
びクエンチャー）を有する請求項７記載の試薬セット。 - 【請求項９】 ２つの蛍光染料（レポーターおよびクエ
ンチャー）で標識され、増幅すべきＤＮＡ配列と３′末
端において完全にはハイブリダイズしないプライマーを
使用する請求項６記載の試薬セット。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10018901 | 2000-04-14 | ||
| DE10018901:6 | 2000-05-19 | ||
| DE10024830:6 | 2000-05-19 | ||
| DE10024830A DE10024830A1 (de) | 2000-05-19 | 2000-05-19 | Verfahren zum Auffinden von Oligonukleotid-Sequenzen für Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001352993A true JP2001352993A (ja) | 2001-12-25 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| KR (1) | KR20010098540A (ja) |
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| JP2010528619A (ja) * | 2007-05-31 | 2010-08-26 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | インフルエンザａおよびインフルエンザｂウイルスを検出するための配列および方法 |
| WO2021261924A1 (en) * | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Seegene, Inc. | Computer-implemented method for providing coverage of oligonucleotide set for plurality of nucleic acid sequences |
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| US5837832A (en) * | 1993-06-25 | 1998-11-17 | Affymetrix, Inc. | Arrays of nucleic acid probes on biological chips |
| US5585477A (en) * | 1993-07-13 | 1996-12-17 | Us Health | Poliovirus specific primers |
-
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