CN105177161B - Y染色体azf区微缺失检测试剂盒 - Google Patents

Y染色体azf区微缺失检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测Y染色体AZF区微缺失的检测试剂，包括引物组合物，针对Y染色体AZF区域和其他作为内部参考的特异性区域选定的引物位点设计了引物序列，这些引物序列的特点为：（1）每组引物均是以基因组上一段序列为模板来设计三条连续的引物，这三条引物连接后形成PCR模板；（2）在正常人染色体目标区域，引物位点序列存在已知且不变的拷贝数，且在目标区域之外的其他染色体区域不存在该序列；（3）这些序列引物具有接近的退火温度，波动范围<5℃；（4）与通用扩增引物序列不存在互补性；（5）内参位点仅在目标区域唯一出现，在基因组其他区域不存在该位点。还提供了检测Y染色体AZF区微缺失的试剂盒以及检测Y染色体AZF区微缺失的方法。

Description

Y染色体AZF区微缺失检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用gDNA或外周血游离DNA检测Y染色体AZF区微缺失的试剂盒及使用该试剂盒体外检测Y染色体AZF区微缺失的方法。
背景技术
有研究报告指出，不育夫妇占已婚育龄夫妇的15％，其中男性因素约占一半，而男性不育症35％是由于遗传因素造成。Y染色体微缺失是除克式综合征外男性不育的最主要遗传因素。Y染色体大量的重复序列和回文结构在维持Y染色体进化稳定性的同时，也使Y染色体更容易发生结构重排，导致染色体部分缺失或重复。Y染色体微缺失主要发生在Y染色体上的AZF(azoospermia factor)区。AZF区包括AZFa、AZFb、AZFc三个亚区，这些位置包括许多与精子形成有关的基因，这些区域的完全缺失或部分缺失可引起男性精子发生障碍、少精、弱精甚至无精症状。
检测Y染色体AZF区微缺失现在已经成为男性不育专科的常规检查，可以为男性不育患者找出病因，为遗传咨询提供依据；也为临床医生的诊断与后续治疗提供指导。所以一种简单快速、准确度高且低成本的检测方法对临床具有重大意义。
目前检测Y染色体AZF区微缺失的方法有很多，例如多重PCR、实时荧光PCR、芯片杂交、MLPA等技术，最常用的是使用多重PCR扩增序列标签位点(Sequence Tagged Site,STS)。该方法选择AZFa、AZFb、AZFc区的STS序列进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，根据条带的有无判断AZF各区是否发生缺失。欧洲男科协会(European Academy of Andrology,EAA)和欧洲分子遗传质控网(European Molecular Genetics Quality Network,EMQN)联合发布的《Y染色体微缺失分子诊断实践指南》推荐了多重PCR检测Y染色体AZF区微缺失的6个STS(AZFa：sY84，sY86；AZFb：sY127，sY134；AZFc：sY254，sY255)。在此基础上，各个检测实验室可选择性地增加STS的数量进行更精确的检测。这种方法简单易行，目前使用最广泛。但是这种方法扩增的STS位点较少(6个或以上)，而且电泳只能定性检测目的产物是否存在，不能检测拷贝数的变化，这对于Y染色体AZF区部分缺失的情况可能检测不精确，所以这种方法在检测准确度和灵敏度上还有待提高。其中一个方法是增加检测的STS数量，但这需要进行多次多重PCR反应，从而大大增加实验工作量和检测成本。
检测Y染色体AZF区微缺失还可以使用多重实时荧光PCR，这种方法简便快速更准确，但是探针设计繁琐并且需要报告基团修饰，价格昂贵，不适合临床推广使用。
有文献报导采用芯片杂交技术检测Y染色体AZF区微缺失，相比于多重PCR技术，可以极大地提高检测的准确度和灵敏度。但缺点是该方法需要设计大量的探针，成本较高，另外检测信号分析也较为复杂，不适合临床医生判读。
MRC-Holland公司推出一款SALSA MLPA probe-mix kit P360-A1试剂盒，用于Y染色体AZF区微缺失的检测，通过杂交、连接手段获取探针相对拷贝数信号，并根据产物长度识别对应探针，最终通过探针信号给出检测结论。该技术手段与芯片杂交技术一样，面临着检测信号分析复杂的缺陷，另外由于需要根据产物长度识别探针，在探针设计和识别上有着一定的局限性。
综上所述，目前Y染色体AZF区微缺失的检测方法存在的缺陷主要有准确度和灵敏度低、成本高、检测结果判读复杂等。因此亟需开发一种Y染色体AZF区微缺失检测的新方法，来解决现有技术存在的上述不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用gDNA或外周血游离DNA检测Y染色体AZF区微缺失的引物系统、检测试剂、试剂盒和检测方法，以克服上述现有技术方法所存在的不足。
本发明的第一方面提供了一种检测Y染色体AZF区微缺失的引物组合物，其引物位点包括至少6个Y染色体AZF区位点，以及至少一个Y染色体其他特异性区域的内参位点。其中，根据每个引物位点的序列设计上、中、下游三条引物，每条引物长10～50bp，优选为20bp；每个引物位点的所述上、中、下游三条引物在参考基因组序列上自5’到3’方向是连续的。所述参考基因组序列为hg18或hg19版本。
优选地，所述引物的GC含量均为30％～70％，更优选50％。
优选地，每个引物位点的所述中游和下游引物的5’端分别进行磷酸化修饰。
优选地，每个引物位点的所述上游引物的5’端延伸15～30bp的保护序列，更优选为20bp。
优选地，每个引物位点的所述上游引物的5’端和下游引物的3’端分别延伸通用扩增引物序列。
本发明的引物系统的引物位点按照AZF区可划分到AZFa、AZFb及AZFc区的b1、b2、b3、b4、g1、g2、g3、r1、r2、r3、r4、y1、y2等不同的亚区(如图2所示)。其中b、g、r等亚区是本发明用来判定AZFc区详细缺失信息的重要参考区域。
在一个特定的实施方案中，针对Y染色体AZF区域和其他作为内部参考的特异性区域(包括SRY基因、ZFY基因和TBL1Y基因等)选定的148个引物位点，共设计了148组引物序列。这些引物序列的特点为：(1)每组引物均是以基因组上一段序列为模板来设计三条连续的引物，这三条引物连接后形成PCR模板；(2)在正常人染色体目标区域，引物位点序列存在已知且不变的拷贝数，且在目标区域之外的其他染色体区域不存在该序列；(3)这些序列引物具有接近的退火温度，波动范围<5℃；(4)与通用扩增引物序列不存在互补性；(5)内参位点仅在目标区域唯一出现，在基因组其他区域不存在该位点。
所述引物位点的上、中、下游三条引物的序列分别选自SEQ ID NO:n、SEQ ID NO:(n+148)、SEQ ID NO:(n+296)，其中n为1～148的自然数。
最优实施方式中，所述引物组合物包括序列分别为SEQ ID NO:1-444的全部引物。
本发明的第二方面提供了上述引物组合物组合物的用途。
上述引物组合物可用于制备用于检测Y染色体AZF区微缺失的诊断试剂或试剂盒。
上述引物组合物可用于体外检测Y染色体AZF区微缺失。所述检测可以是诊断目的(例如诊断男性不育等)，也可以是非诊断目的(例如实验室研究等)。
本发明的第三部分提供了一种检测Y染色体AZF区微缺失的检测试剂，其包括上述引物组合物。
本发明的第四部分提供了一种检测Y染色体AZF区微缺失的试剂盒，其包括上述引物组合物。优选地，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、通用PCR引物、DNA聚合酶、DNA连接酶、末端转移酶、dNTPs、反应缓冲液、用于纯化PCR反应产物的磁珠及缓冲液；更优选地，还包括阴性质控品和阳性质控品；最优选地，还包括用于高通量测序的试剂。所述的高通量测序方法选自Ion Torrent的PGM、Proton或Illumina的Hiseq、Miseq。
本发明的第五方面提供了一种体外检测Y染色体AZF区微缺失的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取gDNA或外周血游离DNA作为模板；
(2)将本发明的引物组合物与DNA模板进行杂交反应；
(3)杂交产物进行连接反应；
(4)将连接产物进行纯化；
(5)将纯化后的产物进行PCR扩增，构建文库；
(6)将PCR扩增产物进行高通量测序；
(7)测序数据分析。
优选地，包括以下步骤：
(1)分离、提取待检测样本的组织细胞gDNA或外周血的游离DNA片段；
(2)将样本DNA模板末端采用生物素标记，标记后的DNA模板和磁珠结合；
(3)将权利要求1-20任一项中定义的引物组合物与DNA模板进行杂交、连接反应，反应产物进行扩增，扩增产物构成文库；
(4)将扩增产物进行高通量测序；
(5)数据分析：将测序数据进行目标区域的定位，即与用来设计引物的参考基因组序列片段进行比对，根据比对结果计算每个目标区域的测序序列条数，根据目标区域的测序序列条数计算AZF区各小区域的拷贝数信息，通过与正常人理论值比较分析拷贝数的变化，从而判定AZF区微缺失检测信息。
检测结论的判断标准如下：
(1)若AZFa区所有或部分位点拷贝数为0，其余区域位点拷贝数不变，则检测结论为AZFa区缺失或部分缺失；
(2)若AZFb区的y3、y4、b5、b6和/或u1亚区位点拷贝数变为0或部分拷贝数发生变化，AZFa区及AZFc区位点拷贝数不变，则检测结论根据变化信息相应为AZFb区缺失或部分缺失；
(3)若g1、g2、g3区位点拷贝数减少1/3～2/3，r1、r2、r3、r4区位点拷贝数减少1/2以上，b1、b2、b3、b4区位点拷贝数减少1/4，y1、y2区位点拷贝数减少1/2，其余区域位点拷贝数不变，则检测结论为gr/gr缺失；
(4)若b1、b2、b3、b4区位点拷贝数减少1/2左右，g1、g2、g3、r1、r2、r3、r4、y1、y2、t1、t2区位点拷贝数为0，其余区域位点拷贝数不变，则检测结论为b2/b4缺失，亦称作AZFc区缺失；
(5)若同时存在(2)与(4)的拷贝数变化信息，则检测结论为AZFb+c区缺失，具体缺失的亚区区域可根据位点拷贝数变化来判定。
所述检测可以是诊断目的(例如诊断男性不育等)，也可以是非诊断目的(例如实验室研究等)。
附图说明
图1本发明的设计流程图。首先提取DNA模板，然后进行杂交、连接反应，并对产物进行纯化，之后进行PCR扩增并采用高通量测序技术对文库进行测序，最后分析测序数据。
图2目标检测区域的详细亚区划分。Y染色体AZF区可详细划分为AZFa、AZFbc区的y、b、g、r、t、grey等不同的亚区，有的亚区可能存在顺式重复或回文重复区域，例如g1、g2、g3三个重复区。
图3实施例1的拷贝数变化信息。
图4实施例2的拷贝数变化信息。
图5实施例3的拷贝数变化信息。
图6实施例4的拷贝数变化信息。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的方案进行清楚完整的描述，但本发明并不受其限制，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，基于本发明的实施例，本领域技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围；同样地，实施例的附图仅仅是本发明一部分实施例的附图，本领域技术人员根据这些附图所获得的其他附图，也都属于本发明的保护范围。
下列实施例中使用的杂交引物为表1所示的引物组合物(其中，上游引物序列分别为SEQ ID NO:1-148，中游引物序列分别为SEQ ID NO:149-296，下游引物序列分别为SEQID NO:297-444)，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
表1 杂交引物序列
实施例1 毛囊样本检测AZF区微缺失
一、材料：
1.标本：样本来源为合作医院接诊的一位男性少精症患者的毛囊样本，经医院采用多重PCR技术检测为Y染色体AZFc区缺失。
2.试剂：微量基因组DNA提取试剂盒、末端补平试剂盒、dsDNA HS分析试剂盒、生物素、标记酶、标记酶反应液、超纯水、杂交缓冲液、杂交引物、DNA溶解液(Low TE)、连接酶、连接酶反应液、PCR反应液、标签接头、洗涤液、XP磁珠、异丙醇、无水乙醇、MyOneTM Streptavidin C1 beads(Myone C1磁珠)、1M NaOH、Nuclease-freeWater(not DEPC-treated)、Ion PGMTM Template OT2 200 Kit。
3.器材：高速冷冻离心机、水浴锅、超声打断仪Covaris M220、磁力架、PCR仪、IonOneTouchTM 2 Instrument、Ion OneTouchTM ES、Ion torrentPGM测序仪、Ion 316TM Chipv2、四维旋转混合仪、迷你离心机、漩涡振荡器、Qubit2.0、移液器(1000/200/100/10/2.5μL)。
二、操作步骤：
1.提取毛囊样本中的基因组DNA。超声打断成150bp大小片段，按照下表配制体系，室温静置20分钟补平末端。
成分 体积
Fragmented gDNA 158μL
5×End Repair Buffer 40μL
End Repair Enzyme 2μL
总体系 200μL
将完成补平的体系加入360μL XP磁珠，混匀后室温放置5分钟，磁吸待液体澄清后弃上清，不取下离心管，加入75％乙醇500μL，来回倾斜磁力架冲洗磁珠表面5～10次，吸弃液体后再重复清洗一遍。取下离心管瞬时离心，重新放置在磁力架上至液体澄清后弃掉上清液，晾干磁珠，加入DNA溶解液，混匀后磁吸收集上清。
2.DNA标记
按照下表制备反应体系，混匀后37℃温浴1小时。
试剂 体积
DNA 38.75μL
生物素 0.25μL
标记酶 1μL
标记酶反应液 10μL
总体系 50μL
3.标记产物的纯化
加等体积异丙醇(预冷-20℃)，-70℃放置1小时以上或-20℃放置过夜，4℃13000rpm离心40min。用300μL新配制的75％乙醇洗涤沉淀，4℃13000rpm离心8min，弃上清。共洗两次。室温晾干沉淀后用13μL DNA溶解液溶解DNA。
4.杂交
准备Myone C1磁珠：(提前30min取出Myone C1磁珠室温孵育)漩涡振荡大于30s彻底混匀，取10μL磁珠移到一个新的PCR管中，磁吸3min，弃上清5μL，备用。按照下表混合反应体系，轻轻混匀(避免产生气泡)，PCR仪上95℃反应5min，反应结束后迅速冰置10min。
试剂 体积
标记纯化产物 12.5μL
杂交缓冲液 22.5μL
杂交引物 10μL
总体系 45μL
冰置结束后，瞬时离心，将反应液加入准备好的Myone C1磁珠中，漩涡振荡30s混匀，避免有气泡，室温22～25℃(室温不能低于20℃，最高不能超过27℃)轻轻旋转混合2h。
5.杂交产物的纯化
将PCR管置于磁力架上磁吸3min，待液体澄清后弃上清，取下PCR管(切勿使磁珠干燥)。加50μL洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管(切勿使磁珠干燥)。共洗涤3次。加入45μL DNA溶解液重悬磁珠。
6.连接
将下表的连接体系置于PCR仪上，37℃反应1小时。
试剂 体积
杂交纯化产物 45μL
连接酶 0.1μL
连接酶反应液 5μL
总体系 50.1μL
7.连接产物的纯化
将完成连接反应的PCR管置于磁力架上磁吸3min，液体澄清后弃上清，取下PCR管(切勿使磁珠干燥)。加50μL洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管。共洗涤2次。加入23μL DNA溶解液重悬磁珠，PCR仪上95℃变性3min，立即放到磁力架上磁吸，吸取上清液体至新的PCR管中。
8.PCR
按照下表加反应体系：
试剂 体积
连接纯化产物 23μL
PCR反应液 25μL
PCR引物 1μL
标签接头 1μL
总体系 50μL
按照下述程序进行反应：
9.PCR产物的纯化
将XP磁珠提前30min取出平衡至室温，漩涡振荡30s以上，各取20μL、97μL放入新的EP管中并做好标记。取45μL PCR产物加入20μL XP磁珠中，混匀后室温放置5min。磁吸3～5min，待液体彻底澄清后取上清62μL到97μLXP磁珠中，混匀后室温放置5min。磁吸待液体澄清后弃上清，不取下离心管，加入75％乙醇150μL，来回倾斜磁力架，使液体冲洗XP磁珠的表面5～10次，并在1min内吸弃液体。共洗两次。取下离心管瞬时离心，再重新放置在磁力架上，至液体澄清时弃掉上清。晾干磁珠，加入15μL DNA溶解液，混匀后室温放置3～5min，磁吸后将上清(即文库)转移至新的EP管中。
10.文库测序
取2μL文库用Qubit2.0进行浓度测定。将文库稀释至18pmol/μL经用Ion PGMTMTemplate OT2 200Kit制备成乳液PCR样本，Ion OneTouchTM ES上进行产物富集后在IonTorrent PGM(life technology)上测序。
11.数据分析
首先过滤低质量测序序列，去掉小于70bp的测序片段，将过滤后的序列比对到148个用来设计引物的参考基因组序列片段，计算这148个目标区域的总测序序列条数N和各自的测序序列条数Ni。
利用10个内部参考区域的引物序列条数的均值N0，将138个AZF区域的引物序列条数进行均一化，公式为：Ci＝Ni/N0。
根据每个引物的Ci值，计算AZF区划分的每个小区的均值，即得到待检测样本AZF区各小区的真实拷贝数信息，例如g区有10个引物位点，对应的Ci值分别为g1、g2、g3…g10，则g区拷贝数：
通过待检测样本AZF区各小区的真实拷贝数信息与理论值的变化比较，发现AZFc区内g、r区拷贝数变为0，b区拷贝数减少一半，而AZFa和AZFb区拷贝数不变(如图3所示)。检测结论为该样本Y染色体AZF区发生b2/b4缺失。
实施例2 外周血样本检测AZF区微缺失
一、材料：
1.标本：样本来源为合作医院接诊的一位男性少精症患者的外周血样本，经医院采用多重PCR技术检测为Y染色体AZFc区部分缺失。
2.试剂：血浆DNA提取试剂盒、dsDNA HS分析试剂盒、生物素、标记酶、标记酶反应液、超纯水、杂交缓冲液、杂交引物、DNA溶解液(Low TE)、连接酶、连接酶反应液、PCR反应液、标签接头、洗涤液、XP磁珠、异丙醇、无水乙醇、MyOneTM StreptavidinC1 beads(Myone C1磁珠)、1M NaOH、Nuclease-free Water(not DEPC-treated)、IonPGMTM Template OT2 200 Kit。
3.器材：高速冷冻离心机、水浴锅、磁力架、PCR仪、Ion OneTouchTM 2 Instrument、Ion OneTouchTM ES、Ion torrentPGM测序仪、Ion 316TM Chip v2、四维旋转混合仪、迷你离心机、漩涡振荡器、Qubit2.0、移液器(1000/200/100/10/2.5μL)。
二、操作步骤：
1.用血浆DNA提取试剂盒提取血浆DNA。
2.DNA标记
按照下表制备反应体系，混匀后37℃温浴1小时。
试剂 体积
DNA 38.75μL
生物素 0.25μL
标记酶 1μL
标记酶反应液 10μL
总体系 50μL
3.标记产物的纯化
加等体积异丙醇(预冷-20℃)，-70℃放置1小时以上或-20℃放置过夜，4℃13000rpm离心40min。用300μL新鲜配制的75％乙醇洗涤沉淀，4℃13000rpm离心8min，弃上清。共洗两次。室温晾干沉淀后用13μL DNA溶解液溶解DNA。
4.杂交
准备Myone C1磁珠：(提前30min取出Myone C1磁珠室温孵育)漩涡振荡大于30s彻底混匀，取10μL磁珠移到一个新的PCR管中，磁吸3min，弃上清5μL，备用。按照下表混合反应体系，轻轻混匀(避免产生气泡)，PCR仪上95℃反应5min，反应结束后迅速冰置10min。
试剂 体积
标记纯化产物 12.5μL
杂交缓冲液 22.5μL
杂交引物 10μL
总体系 45μL
冰置结束后，瞬时离心，将反应液加入准备好的Myone C1磁珠中，漩涡振荡30s混匀，避免有气泡，室温22～25℃(室温不能低于20℃，最高不能超过27℃)轻轻旋转混合2h。
5.杂交产物的纯化
将PCR管置于磁力架上磁吸3min，待液体澄清后弃上清，取下PCR管(切勿使磁珠干燥)。加50μL洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管(切勿使磁珠干燥)。共洗涤3次。加入45μL DNA溶解液重悬磁珠。
6.连接
将下表的连接体系置于PCR仪上，37℃反应1小时。
试剂 体积
杂交纯化产物 45μL
连接酶 0.1μL
连接酶反应液 5μL
总体系 50.1μL
7.连接产物的纯化
将完成连接反应的PCR管置于磁力架上磁吸3min，液体澄清后弃上清，取下PCR管(切勿使磁珠干燥)。加50μL洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管。共洗涤2次。加入23μL DNA溶解液重悬磁珠，PCR仪上95℃变性3min，立即放到磁力架上磁吸，吸取上清液移至新的PCR管中。
8.PCR
按照表格加反应体系。
试剂 体积
连接纯化产物 23μL
PCR反应液 25μL
PCR引物 1μL
标签接头 1μL
总体系 50μL
按照下述程序进行反应。
9.PCR产物的纯化
将XP磁珠提前30min取出平衡至室温，漩涡振荡30s以上，各取20μL、97μL放入新的EP管中并做好标记。取45μL PCR产物加入20μL XP磁珠中，混匀后室温放置5min。磁吸3～5min，待液体彻底澄清后取上清62μL到97μL XP磁珠中，混匀后室温放置5min。磁吸待液体澄清后弃上清，不取下离心管，加入75％乙醇150μL，来回倾斜磁力架，使液体冲洗XP磁珠的表面5～10次，并在1min内吸弃液体。共洗两次。取下离心管瞬时离心，再重新放置在磁力架上，至液体澄清时弃掉上清。晾干磁珠，加入15μL DNA溶解液，混匀后室温放置3～5min，磁吸后将上清(即文库)转移至新的EP管中。
10.文库测序
取2μL文库用Qubit2.0进行浓度测定。将文库稀释至18pmol/μL经用Ion PGMTMTemplate OT2 200 Kit制备成乳液PCR样本，Ion OneTouchTM ES上进行产物富集后在IonTorrent PGM(life technology)上测序。
11.数据分析
首先过滤低质量测序序列，去掉小于70bp的测序片段，将过滤后的序列比对到148个用来设计引物的参考基因组序列片段，计算这148个目标区域的总测序序列条数N和各自的测序序列条数Ni。
利用10个内部参考区域的引物序列条数的均值N0，将138个AZF区域的引物序列条数进行均一化，公式为：Ci＝Ni/N0。
根据每个引物的Ci值，计算AZF区划分的每个小区的均值，即得到待检测样本AZF区各小区的真实拷贝数信息，例如g区有10个引物位点，对应的Ci值分别为g1、g2、g3…g10，则g区拷贝数：
通过待检测样本AZF区各小区的真实拷贝数信息与理论值的变化比较，发现AZFc区内g区拷贝数变为0，而r区存在近1/4的拷贝数，判定b2/b3发生倒位；同时发现b区拷贝数减少一半，AZFa和AZFb区拷贝数不变(如图4所示)检测结论为该样本Y染色体AZF区发生b2/b3倒位后g1/b4区缺失。
实施例3 外周血样本检测AZF区微缺失
一、材料：
1.标本：样本来源为合作医院接诊的一位男性少精症患者的外周血样本，经医院采用多重PCR技术检测为Y染色体AZF区正常。
2.试剂：血浆DNA提取试剂盒、dsDNA HS分析试剂盒、生物素、标记酶、标记酶反应液、超纯水、杂交缓冲液、杂交引物、DNA溶解液(Low TE)、连接酶、连接酶反应液、PCR反应液、标签接头、洗涤液、XP磁珠、异丙醇、无水乙醇、MyOneTM StreptavidinC1 beads(Myone C1磁珠)、1M NaOH、Nuclease-free Water(not DEPC-treated)、IonPGMTM Template OT2 200 Kit。
3.器材：高速冷冻离心机、水浴锅、磁力架、PCR仪、Ion OneTouchTM 2 Instrument、Ion OneTouchTM ES、Ion torrentPGM测序仪、Ion 316TM Chip v2、四维旋转混合仪、迷你离心机、漩涡振荡器、Qubit2.0、移液器(1000/200/100/10/2.5μL)。
二、操作步骤：
1.用血浆DNA提取试剂盒提取血浆DNA。
2.DNA标记
按照下表制备反应体系，混匀后37℃温浴1小时。
试剂 体积
DNA 38.75μL
生物素 0.25μL
标记酶 1μL
标记酶反应液 10μL
总体系 50μL
3.标记产物的纯化
加等体积异丙醇(预冷-20℃)，-70℃放置1小时以上或-20℃放置过夜，4℃13000rpm离心40min。用300μL新鲜配制的75％乙醇洗涤沉淀，4℃13000rpm离心8min，弃上清。共洗两次。室温晾干沉淀后用13μL DNA溶解液溶解DNA。
4.杂交
准备Myone C1磁珠：(提前30min取出Myone C1磁珠室温孵育)漩涡振荡大于30s彻底混匀，取10μL磁珠移到一个新的PCR管中，磁吸3min，弃上清5μL，备用。按照下表混合反应体系，轻轻混匀(避免产生气泡)，PCR仪上95℃反应5min，反应结束后迅速冰置10min。
试剂 体积
标记纯化产物 12.5μL
杂交缓冲液 22.5μL
杂交引物 10μL
总体系 45μL
冰置结束后，瞬时离心，将反应液加入准备好的Myone C1磁珠中，漩涡振荡30s混匀，避免有气泡，室温22～25℃(室温不能低于20℃，最高不能超过27℃)轻轻旋转混合2h。
5.杂交产物的纯化
将PCR管置于磁力架上磁吸3min，待液体澄清后弃上清，取下PCR管(切勿使磁珠干燥)。加50μL洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管(切勿使磁珠干燥)。共洗涤3次。加入45μL DNA溶解液重悬磁珠。
6.连接
将下表的连接体系置于PCR仪上，37℃反应1小时。
试剂 体积
杂交纯化产物 45μL
连接酶 0.1μL
连接酶反应液 5μL
总体系 50.1μL
7.连接产物的纯化
将完成连接反应的PCR管置于磁力架上磁吸3min，液体澄清后弃上清，取下PCR管(切勿使磁珠干燥)。加50μL洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管。共洗涤2次。加入23μL DNA溶解液重悬磁珠，PCR仪上95℃变性3min，立即放到磁力架上磁吸，吸取上清液移至新的PCR管中。
8.PCR
按照表格加反应体系。
试剂 体积
连接纯化产物 23μL
PCR反应液 25μL
PCR引物 1μL
标签接头 1μL
总体系 50μL
按照下述程序进行反应。
9.PCR产物的纯化
将XP磁珠提前30min取出平衡至室温，漩涡振荡30s以上，各取20μL、97μL放入新的EP管中并做好标记。取45μL PCR产物加入20μL XP磁珠中，混匀后室温放置5min。磁吸3～5min，待液体彻底澄清后取上清62μL到97μL XP磁珠中，混匀后室温放置5min。磁吸待液体澄清后弃上清，不取下离心管，加入75％乙醇150μL，来回倾斜磁力架，使液体冲洗XP磁珠的表面5～10次，并在1min内吸弃液体。共洗两次。取下离心管瞬时离心，再重新放置在磁力架上，至液体澄清时弃掉上清。晾干磁珠，加入15μL DNA溶解液，混匀后室温放置3～5min，磁吸后将上清(即文库)转移至新的EP管中。
10.文库测序
取2μL文库用Qubit2.0进行浓度测定。将文库稀释至18pmol/μL经用Ion PGMTMTemplate OT2 200 Kit制备成乳液PCR样本，Ion OneTouchTM ES上进行产物富集后在IonTorrent PGM(life technology)上测序。
11.数据分析
首先过滤低质量测序序列，去掉小于70bp的测序片段，将过滤后的序列比对到148个用来设计引物的参考基因组序列片段，计算这148个目标区域的总测序序列条数N和各自的测序序列条数Ni。
利用10个内部参考区域的引物序列条数的均值N0，将138个AZF区域的引物序列条数进行均一化，公式为：Ci＝Ni/N0。
根据每个引物的Ci值，计算AZF区划分的每个小区的均值，即得到待检测样本AZF区各小区的真实拷贝数信息，例如g区有10个引物位点，对应的Ci值分别为g1、g2、g3…g10，则g区拷贝数：
通过待检测样本AZF区各小区的真实拷贝数信息与理论值的变化比较，发现AZFa、AZFb、AZFc区拷贝数不变(如图5所示)。检测结论为该样本Y染色体AZF区正常，造成患者少精症状的原因是AZF区之外的遗传因素或非遗传因素。
实施例4 外周血样本检测AZF区微缺失
一、材料：
1.标本：样本来源为合作医院接诊的一位男性少精症患者的外周血样本，经医院采用多重PCR技术检测为Y染色体AZFb+c区缺失。
2.试剂：血液基因组DNA提取试剂盒、末端补平试剂盒、dsDNA HS分析试剂盒、生物素、标记酶、标记酶反应液、超纯水、杂交缓冲液、杂交引物、DNA溶解液(Low TE)、连接酶、连接酶反应液、PCR反应液、标签接头、洗涤液、XP磁珠、异丙醇、无水乙醇、MyOneTM Streptavidin C1 beads(Myone C1磁珠)、1M NaOH、Nuclease-freeWater(not DEPC-treated)、Ion PGMTM Template OT2 200 Kit。
3.器材：高速冷冻离心机、水浴锅、超声打断仪Covaris M220、磁力架、PCR仪、IonOneTouchTM 2 Instrument、Ion OneTouchTM ES、Ion torrentPGM测序仪、Ion 316TM Chipv2、四维旋转混合仪、迷你离心机、漩涡振荡器、Qubit2.0、移液器(1000/200/100/10/2.5μL)。
二、操作步骤：
1.提取外周血样本中的基因组DNA。超声打断成150bp大小片段，按照下表配制体系，室温静置20分钟补平末端。
成分 体积
Fragmented gDNA 158μL
5×End Repair Buffer 40μL
End Repair Enzyme 2μL
总体系 200μL
将完成补平的体系加入360μL XP磁珠，混匀后室温放置5分钟，磁吸待液体澄清后弃上清，不取下离心管，加入75％乙醇500μL，来回倾斜磁力架冲洗磁珠表面5～10次，吸弃液体后再重复清洗一遍。取下离心管瞬时离心，重新放置在磁力架上至液体澄清后弃掉上清液，晾干磁珠，加入DNA溶解液，混匀后磁吸收集上清。
2.DNA标记
按照下表制备反应体系，混匀后37℃温浴1小时。
试剂 体积
DNA 38.75μL
生物素 0.25μL
标记酶 1μL
标记酶反应液 10μL
总体系 50μL
3.标记产物的纯化
加等体积异丙醇(预冷-20℃)，-70℃放置1小时以上或-20℃放置过夜，4℃13000rpm离心40min。用300μL新鲜配制的75％乙醇洗涤沉淀，4℃13000rpm离心8min，弃上清。共洗两次。室温晾干沉淀后用13μL DNA溶解液溶解DNA。
4.杂交
准备Myone C1磁珠：(提前30min取出Myone C1磁珠室温孵育)漩涡振荡大于30s彻底混匀，取10μL磁珠移到一个新的PCR管中，磁吸3min，弃上清5μL，备用。按照下表混合反应体系，轻轻混匀(避免产生气泡)，PCR仪上95℃反应5min，反应结束后迅速冰置10min。
试剂 体积
标记纯化产物 12.5μL
杂交缓冲液 22.5μL
杂交引物 10μL
总体系 45μL
冰置结束后，瞬时离心，将反应液加入准备好的Myone C1磁珠中，漩涡振荡30s混匀，避免有气泡，室温22～25℃(室温不能低于20℃，最高不能超过27℃)轻轻旋转混合2h。
5.杂交产物的纯化
将PCR管置于磁力架上磁吸3min，待液体澄清后弃上清，取下PCR管(切勿使磁珠干燥)。加50μL洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管(切勿使磁珠干燥)。共洗涤3次。加入45μL DNA溶解液重悬磁珠。
6.连接
将下表的连接体系置于PCR仪上，37℃反应1小时。
试剂 体积
杂交纯化产物 45μL
连接酶 0.1μL
连接酶反应液 5μL
总体系 50.1μL
7.连接产物的纯化
将完成连接反应的PCR管置于磁力架上磁吸3min，液体澄清后弃上清，取下PCR管(切勿使磁珠干燥)。加50μL洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管。共洗涤2次。加入23μL DNA溶解液重悬磁珠，PCR仪上95℃变性3min，立即放到磁力架上磁吸，吸取上清液移至新的PCR管中。
8.PCR
按照表格加反应体系。
试剂 体积
连接纯化产物 23μL
PCR反应液 25μL
PCR引物 1μL
标签接头 1μL
总体系 50μL
按照下述程序进行反应。
9.PCR产物的纯化
将XP磁珠提前30min取出平衡至室温，漩涡振荡30s以上，各取20μL、97μL放入新的EP管中并做好标记。取45μL PCR产物加入20μL XP磁珠中，混匀后室温放置5min。磁吸3～5min，待液体彻底澄清后取上清62μL到97μL XP磁珠中，混匀后室温放置5min。磁吸待液体澄清后弃上清，不取下离心管，加入75％乙醇150μL，来回倾斜磁力架，使液体冲洗XP磁珠的表面5～10次，并在1min内吸弃液体。共洗两次。取下离心管瞬时离心，再重新放置在磁力架上，至液体澄清时弃掉上清。晾干磁珠，加入15μL DNA溶解液，混匀后室温放置3～5min，磁吸后将上清(即文库)转移至新的EP管中。
10.文库测序
取2μL文库用Qubit2.0进行浓度测定。将文库稀释至18pmol/μL经用Ion PGMTMTemplate OT2 200 Kit制备成乳液PCR样本，Ion OneTouchTM ES上进行产物富集后在IonTorrent PGM(life technology)上测序。
11.数据分析
首先过滤低质量测序序列，去掉小于70bp的测序片段，将过滤后的序列比对到148个用来设计引物的参考基因组序列片段，计算这148个目标区域的总测序序列条数N和各自的测序序列条数Ni。
利用10个内部参考区域的引物序列条数的均值N0，将138个AZF区域的引物序列条数进行均一化，公式为：Ci＝Ni/N0。
根据每个引物的Ci值，计算AZF区划分的每个小区的均值，即得到待检测样本AZF区各小区的真实拷贝数信息，例如g区有10个引物位点，对应的Ci值分别为g1、g2、g3…g10，则g区拷贝数：
通过待检测样本AZF区各小区的真实拷贝数信息与理论值的变化比较，发现AZFb区内b5、b6、u1等区及AZFc区内b、g、r等区拷贝数均变为0，AZFa拷贝数不变(如图6所示)。检测结论为该样本Y染色体AZF区发生AZFb+c区缺失。

Claims (19)

1.一种检测Y染色体AZF区微缺失的检测试剂，包括引物组合物，其特征在于，引物位点包括至少6个Y染色体AZF区位点，以及至少一个Y染色体其他特异性区域的内参位点；所述的AZF区引物位点覆盖AZFa区，以及AZFbc区的y、b、g、r、t、grey亚区；其中，根据每个引物位点的序列设计上、中、下游三条引物，每个引物位点的所述上、中、下游三条引物在参考基因组序列上自5’到3’方向是连续的；所述引物组合物包括序列分别为SEQ ID NO: 1-444的全部引物。
2.权利要求1的检测试剂，所述引物组合物由序列分别为SEQ ID NO: 1-444的引物组成。
3.权利要求1的检测试剂，每个引物位点的所述上游引物的5’端延伸15~30bp的保护序列，每个引物位点的所述上游引物的5’端和所述下游引物的3’端分别延伸通用扩增引物序列。
4.权利要求2的检测试剂，每个引物位点的所述上游引物的5’端延伸15~30bp的保护序列，每个引物位点的所述上游引物的5’端和所述下游引物的3’端分别延伸通用扩增引物序列。
5.一种检测Y染色体AZF区微缺失的试剂盒，包括引物组合物，其特征在于，引物位点包括至少6个Y染色体AZF区位点，以及至少一个Y染色体其他特异性区域的内参位点；所述的AZF区引物位点覆盖AZFa区，以及AZFbc区的y、b、g、r、t、grey亚区；其中，根据每个引物位点的序列设计上、中、下游三条引物，每个引物位点的所述上、中、下游三条引物在参考基因组序列上自5’到3’方向是连续的；所述引物组合物包括序列分别为SEQ ID NO: 1-444的全部引物。
6.权利要求5的试剂盒，所述引物组合物由序列分别为SEQ ID NO: 1-444的引物组成。
7.权利要求5的试剂盒，每个引物位点的所述上游引物的5’端延伸15~30bp的保护序列，每个引物位点的所述上游引物的5’端和所述下游引物的3’端分别延伸通用扩增引物序列。
8.权利要求6的试剂盒，每个引物位点的所述上游引物的5’端延伸15~30bp的保护序列，每个引物位点的所述上游引物的5’端和所述下游引物的3’端分别延伸通用扩增引物序列。
9.权利要求1-4任一项的检测试剂或权利要求5-8任一项的试剂盒，其中，每个引物位点的所述中游和下游引物的5’端分别进行磷酸化修饰。
10.权利要求3或4的检测试剂或权利要求7或8的试剂盒，其中，所述保护序列为20bp。
11.权利要求1-4任一项的检测试剂或权利要求5-8任一项的试剂盒，其中，所述参考基因组序列为hg18或hg19版本。
12.权利要求1-4任一项的检测试剂或权利要求5-8任一项的试剂盒，其中，所述引物位点的序列与通用扩增引物序列不存在互补性。
13.权利要求1-4任一项的检测试剂或权利要求5-8任一项的试剂盒，其中，所述的AZF区引物位点在该区域存在已知拷贝数且在正常人AZF区域里拷贝数固定不变，AZF区域之外的基因组其他区域不存在该位点。
14.权利要求1-4任一项的检测试剂或权利要求5-8任一项的试剂盒，其中，所述的内参位点选自SRY基因、ZFY基因和TBL1Y基因区域。
15.权利要求1-4任一项的检测试剂或权利要求5-8任一项的试剂盒，其中，所述的内参位点仅在目标区域唯一出现，在基因组其他区域不存在该位点。
16.权利要求5-8任一项的试剂盒，其还包括DNA提取试剂、通用PCR引物、DNA聚合酶、DNA连接酶、末端转移酶、dNTPs、反应缓冲液、用于纯化PCR反应产物的磁珠及缓冲液。
17.权利要求16的试剂盒，其还包括阴性质控品和阳性质控品。
18.权利要求16的试剂盒，其还包括用于高通量测序的试剂。
19.权利要求18的试剂盒，其中，所述的用于高通量测序的试剂是用于如下高通量测序技术的：Ion Torrent的PGM、Proton或Illumina的Hiseq、Miseq。
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