CN103215378B - 检测hiv-1病毒核苷类抑制剂耐药突变方法及试剂盒 - Google Patents
检测hiv-1病毒核苷类抑制剂耐药突变方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。具体而言,本发明公开了检测人类免疫缺陷病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针,包括检测逆转录酶基因M41L突变的探针、检测逆转录酶基因A62V突变的探针、检测逆转录酶基因K65R突变的探针、检测逆转录酶基因D67N突变的探针、检测逆转录酶基因69INS插入突变的探针、检测逆转录酶基因K70R突变的探针、检测逆转录酶基因L74V突变的探针、检测逆转录酶基因V75I突变的探针、检测逆转录酶基因F77L突变的探针、检测逆转录酶基因Y115F突变的探针、检测逆转录酶基因F116Y突变的探针等等。
Description
技术领域
本发明涉及检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。
背景技术
一、核苷和核苷类似物类药物作用机制:
人类免疫缺陷病毒(HIV)属于逆转录病毒,又分为HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地区的艾滋病患者是被HIV-1病毒所感染,现有药物主要是抑制HIV-1型病毒的复制。自从1995年开始应用新的抗病毒治疗方案,即联合使用逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的HAART以来,HIV感染的临床进程被大大改变。这些药物通过阻断病毒复制使得免疫系统重建其CD4 +T细胞库并恢复对病原体的免疫力,明显降低了HIV/AIDS相关疾病的发病率和病死率。截至目前,美国FDA已经批准了4大类共26种抗病毒药物用于艾滋病的临床治疗,其中包括核苷类逆转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcriptase inhibitor,nRTI)、非核苷类逆转录酶抑制剂(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor,NNRTI)、蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitor,PI)和融合抑制剂(fusion inhibitors)。我国已有5种国产抗病毒药物进入临床。
在HIV-1的复制循环中,逆转录酶在完成RNA指导的DNA合成、RNA水解反应和DNA指导的DNA合成过程中起着十分重要的作用。因此,HIV-1逆转录酶是抗HIV/AIDS药物设计的一个重要生物靶点。目前市场上出现的以HIV-1逆转录酶为靶点的药物按作用机制和化学结构可分为核苷类逆转录酶抑制剂和非核苷类逆转录酶抑制剂。
核苷类逆转录酶抑制剂是最先问世、开发品种较多的一类药物,临床证实对HIV复制具有很强的抑制作用,核苷类逆转录酶抑制剂(nRTIs),是HIV病毒逆转录酶作用底物脱氧核苷酸的类似物,在体内转化成活性的三磷酸核苷衍生物,与天然的三磷酸脱氧核苷竞争性与HIV逆转录酶(reverse transcriptase,RT)结合,抑制RT的作用,阻碍前病毒的合成。已上市的nRTIs药物有:齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨(DDC)、司坦夫定、拉米夫定、阿巴卡韦等。nRTIs的结构与核苷类似,为双脱氧核苷衍生物,可与细胞内核苷竞争性地结合逆转录酶,从而终止逆转录反应。通过阻断病毒RNA基因的逆转录,即阻断病毒的双股DNA的形成,使病毒失去复制的模板。此类药物首先进入被感染的细胞,然后磷酸化形成具有活性的双脱氧核苷三磷酸化合物,竞争性抑制艾滋病病毒逆转录酶,可导致未成熟的DNA链合成终结,从而病毒复制受到抑制。早期用于治疗AIDS及其相关综合征,对治疗HIV阳性/AIDS有一定的效果,可降低死亡率及机会性感染率,但不能治愈AIDS。研究表明,核苷类逆转录酶抑制剂联用,副作用大,易出现交叉耐药。
二、HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂的耐药类型及机制:
随着我国免费艾滋病抗病毒治疗的开展,HIV-1病毒耐药性的监测越来越受到重视。HIV-1病毒耐药性的产生取决于两方面:病毒复制过程中的高频突变和抗病毒药物产生的选择压力。HIV-1是RNA病毒,其基因组由单链RNA转变为RNA-DNA复合物,进而反向转录为前病毒DNA,再由前病毒转录为病毒基因组RNA,整个过程均由病毒自身的RT催化。因其RT缺乏核酸外切酶活性,对转录错误无校正功能,所以转录的忠实性差,转录中的碱基错配常导致基因突变,因此HIV-1病毒复制过程中表现出很高的突变频率,每个碱基对在每轮复制中发生突变的频率约为3.4×10-5。另一方面,HIV-1病毒复制迅速,感染初期每天可新形成109~1010病毒颗粒。HIV-1病毒的高速复制及复制过程中的高频突变,导致原发感染的几个月内就可形成非常大量的基因突变病毒。一旦突变发生在逆转录酶和蛋白酶的编码基因序列,就有可能引起逆转录酶和蛋白酶分子发生改变,导致HIV-1病毒对作用于这两种酶的抑制剂不再敏感,产生耐药性。开始抗病毒治疗后,野生型病毒被显著抑制,临床上可见到病毒载量明显下降,如果药物对病毒抑制不完全,与耐药有关的突变型仍可以持续复制。在药物产生的选择压力下,耐药突变型最终取代野生病毒株成为优势群体,临床上可表现为病毒载量的反弹。
核苷和核苷类似物通过抑制RT终止病毒DNA的合成。HIV对这些药物的耐药涉及2种不同机制,即破坏这些类似物与DNA结合以及将其从过早终止的DNA链末端移除。RT的多种变异或组合变异可通过选择性破坏RT而具有将类似物结合到DNA的能力,导致耐药产生。主要包括M184V变异、Q151M变异复合体以及K65R变异。M184V、非胸苷类似物突变如K65R和L74V、多核苷耐药突变Q151M复合体是通过减少nRTI整合至DNA的机制产生耐药;脱氧胸腺嘧啶核苷类似物突变(TAMs)、与多核苷耐药相关的T69插入以及许多辅助突变是通过促使nRTIs从DNA水解而产生耐药。
M184V变异即在RT第184位的甲硫氨酸被缬氨酸取代,该变异也是导致病毒对拉米夫定耐药的主要变异。Q151M复合体在HIV-1中相对较少(在所有对核苷类似物耐药的HIV-1中所占比例小于5%),但可导致对大部分而非全部(如拉米夫定和替诺福韦)类似物的耐药。RT的一组变异可导致核苷类似物从DNA链末端被移除,促使对所有核苷和核苷酸类似物的耐药,其中包括替诺福韦。此类变异是逐渐出现的,且出现的顺序也是多变的。TAMs突变可分为两条通路:一条与T215Y突变有关(包括M41L、L210W、T215Y和EA4D),称为TAMs-I;另一类与T215F突变有关(包括D67N、K70R、T215F和K219Q),称为TAMs-II。研究认为,在TAMs-I通路中,最初出现的突变是T215Y,随后是M41L和L210W,之后再在此基础上逐级积累l-3个其他突变密码子。至于TAMs-II通路,很多研究认为K70R突变通常是逆转录酶在AZT治疗过程中最先出现的基因突变。
三、HIV-1病毒的耐药检测方法:
在高效抗逆转录病毒联合疗法(highly active antiretroviral therapy,HAART)治疗中,病毒变异使得治疗的敏感性下降,常常导致治疗失败。一些研究显示,耐药与抗逆转录病毒治疗无效密切相关,对HIV-1耐药株进行监测以指导临床用药及预防耐药株的迅速上升和扩散日显其重要性。目前已有数项研究表明,对病人进行耐药性检测具有重要临床应用价值,因而国际艾滋病学会(International AIDS Society-USA)、欧洲AIDS临床学会(European AIDSClinical Society,EAcs)等几个专家组,在其AIDS治疗指南当中推荐使用HIV耐药检测。耐药成为AIDS治疗面临的严峻挑战,同时耐药性检测逐渐成为帮助临床医生选择联合用药方案的重要工具。
目前HIV-1病毒耐药性检测有两种方法,即表型检测及基因型检测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行,而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变。
基因型检测的方法有直接测序法、异源双链轨迹试验(HTA)、PCR连续酶测定试验、线性探针试验、限制性内切酶酶切试验、引物特异的PCR测定、RNA酶A(RNaseA)错配剪切试验等,其中部分技术已有商用系统。在进行基因测序后,将测序结果与标准病毒株比较后可坦福大学耐药数据库(http://hivdb.stanford.edu/)及Los Alamos HIV耐药数据库。通过输入所测得的序列,数据库可自动提供病毒基因变异及耐药结果。目前已有基于测序技术的商品化的试剂盒:TRUEGENE HIV-1Genotyping Kit(Visible Genetics,Inc.Toronto,Canada)和ViroSeq Kit(Applied Biosystems,Inc.Foster City,CA,USA)。两者都已获得美国FDA批准成为应用于临床常规检测的试剂盒。此外,基于线性探针技术(Line probe assay)的商品化的试剂盒LiPA(Innogenetics,Ghent,Belgium)也已用于实验室研究。基因型检测的优点是可提供交叉耐药资料,可在样品收集后1~2周得到结果,技术步骤较少,一般情况下费用较便宜。但也存在明显缺点,即不直接提供药物的耐受程度,无法定量,部分变异位点与临床耐受的相关性无法完全确认,分析基因型耐药检测时,需要掌握大量相关知识,如突变与抗病毒药物及其它药物的交叉耐药等,才能对结果进行正确的分析。
表型检测通过病毒培养,再通过与无耐药性个体减少HIV复制50%或90%(50%or90%inhibitory concentration,IC50or IC90)所需的药物水平比较来分级耐药程度。表型分析的标准方法是首先从病人体内分离病毒,与待检药物共同培养,然后测定不同药物浓度下外周血单核细胞(PBMC)所产生的p24抗原量,据此得到IC50。该法步骤复杂,对操作技术要求高,整个过程至少需6周时间,病毒分离培养过程还有可能发生变异。重组表型方法将病人体内HIV-1的蛋白酶和逆转录酶基因序列进行RT-PCR扩增,扩增产物继而插入pol基因缺失型HIV-1载体以形成重组病毒,因此重组病毒保持了病人体内病毒对药物的敏感性,然后在不同药物,同一药物不同浓度下对重组病毒进行培养,即可测定出对药物的敏感性。表型耐药检测的结果与基因型检测结果通常相同,但有时亦有差异。当耐药HIV株水平较低时,表型检测可发现基因型检测所没有提示的耐药性变异。表型耐药是耐药检测的金标准,直接提供药物的耐受情况,可定量,但缺点也很明显,即技术要求高、费时、费用高昂,因此目前国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。
基因型和表型检测的进一步应用限制,包括缺乏对现有检测方法的质量保证;检测费用较高;对微小病毒标本不敏感;如果存在耐药病毒,而病毒量又低于20%,现有检测方法很可能检测不到。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、快速、成本低的检测HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种检测人类免疫缺陷病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针,包括以下16类特异性探针中的至少一类:
检测逆转录酶基因M41L突变的特异性探针,为SEQ ID NO:1~9中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因A62V突变的特异性探针,为SEQ ID NO:10~17中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因K65R突变的特异性探针,为SEQ ID NO:18~23中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因D67N突变的特异性探针,为SEQ ID NO:24~29中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因69INS插入突变的特异性探针,为SEQ ID NO:30~39中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因K70R突变的特异性探针,为SEQ ID NO:40~45中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因L74V突变的特异性探针,为SEQ ID NO:46~51中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因V75I突变的特异性探针,为SEQ ID NO:52~57中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因F77L突变的特异性探针,为SEQ ID NO:58~63中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因Y115F突变的特异性探针,为SEQ ID NO:64~69中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因F116Y突变的特异性探针,为SEQ ID NO:70~75中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因Q151M突变的特异性探针,为SEQ ID NO:76~81中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因M184V和M184I突变的特异性探针,为SEQ ID NO:82~90中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因L210W突变的特异性探针,为SEQ ID NO:91~96中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因T215Y和T215F突变的特异性探针,为SEQ ID NO:97~105中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因K219Q和K219E突变的特异性探针,为SEQ ID NO:106~116中的任意一种或任意一种的互补序列。
作为本发明的检测人类免疫缺陷病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针的改进:
检测逆转录酶基因M41L突变的特异性探针中,SEQ ID NO:1~3中的任意一种为针对第41位氨基酸残基为M(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:4~9中的任意一种为针对第41位氨基酸残基为L(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因;
检测逆转录酶基因A62V突变的特异性探针中,SEQ ID NO:10~12中的任意一种为针对第62位氨基酸残基为A(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:13~17中的任意一种为针对第62位氨基酸残基为V(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因;
检测逆转录酶基因K65R突变的特异性探针中,SEQ ID NO:18~20中的任意一种为针对第65位氨基酸残基为K(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:21~23中的任意一种为针对第65位氨基酸残基为R(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因;
检测逆转录酶基因D67N突变的特异性探针中,SEQ ID NO:24~26中的任意一种为针对第67位氨基酸残基为D(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:27~29中的任意一种为针对第67位氨基酸残基为N(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因;
检测逆转录酶基因69INS插入突变的特异性探针中,SEQ ID NO:30~32中的任意一种为针对第69位氨基酸残基为T(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:33~39中的任意一种为针对在第69位氨基酸残基T后插入SSS、SSA或SSG(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因;
检测逆转录酶基因K70R突变的特异性探针中,SEQ ID NO:40~42中的任意一种为针对第70位氨基酸残基为K(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:43~45中的任意一种为针对第70位氨基酸残基为R(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因;
检测逆转录酶基因L74V突变的特异性探针中,SEQ ID NO:46~48中的任意一种为针对第74位氨基酸残基为L(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:49~51中的任意一种为针对第74位氨基酸残基为V(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因;
检测逆转录酶基因V75I突变的特异性探针中,SEQ ID NO:52~54中的任意一种为针对第75位氨基酸残基为V(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:55~57中的任意一种为针对第75位氨基酸残基为I(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因;
检测逆转录酶基因F77L突变的特异性探针中,SEQ ID NO:58~60中的任意一种为针对第77位氨基酸残基为F(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:61~63中的任意一种为针对第77位氨基酸残基为L(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因;
检测逆转录酶基因Y115F突变的特异性探针中,SEQ ID NO:64~66中的任意一种为针对第115位氨基酸残基为Y(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:67~69中的任意一种为针对第115位氨基酸残基为F(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因;
检测逆转录酶基因F116Y突变的特异性探针中,SEQ ID NO:70~72中的任意一种为针对第116位氨基酸残基为F(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:73~75中的任意一种为针对第116位氨基酸残基为Y(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因;
检测逆转录酶基因Q151M突变的特异性探针中,SEQ ID NO:76~78中的任意一种为序列76到序列78是针对第151位氨基酸残基为Q(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ IDNO:79~81中的任意一种为针对第151位氨基酸残基为M(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因;
检测逆转录酶基因M184V和M184I突变的特异性探针中,SEQ ID NO:82~84中的任意一种为针对第184位氨基酸残基为M(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:85~87中的任意一种为针对第184位氨基酸残基为V(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ IDNO:88~90中的任意一种为针对第184位氨基酸残基为I(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因;
检测逆转录酶基因L210W突变的特异性探针中,SEQ ID NO:91~93中的任意一种为针对第210位氨基酸残基为L(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:94~96中的任意一种为针对第210位氨基酸残基为W(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因;
检测逆转录酶基因T215Y和T215F突变的特异性探针中,SEQ ID NO:97~99中的任意一种为针对第215位氨基酸残基为T(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:100~102中的任意一种为针对第215位氨基酸残基为F(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ IDNO:103~105中的任意一种为针对第215位氨基酸残基为Y(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因;
检测逆转录酶基因K219Q和K219E突变的特异性探针中,SEQ ID NO:106~108中的任意一种为针对第219位氨基酸残基为K(野生型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:109~111中的任意一种为针对第219位氨基酸残基为Q(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因,SEQ IDNO:112~116中的任意一种为针对第219位氨基酸残基为E(耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因。
利用上述检测人类免疫缺陷病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针制备而得的检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变的试剂盒:
除了包括检测逆转录酶基因M41L突变的特异性探针、检测逆转录酶基因A62V突变的特异性探针、检测逆转录酶基因K65R突变的特异性探针、检测逆转录酶基因D67N突变的特异性探针、检测逆转录酶基因69INS插入突变的特异性探针、检测逆转录酶基因K70R突变的特异性探针、检测逆转录酶基因L74V突变的特异性探针、检测逆转录酶基因V75I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因F77L突变的特异性探针、检测逆转录酶基因Y115F突变的特异性探针、检测逆转录酶基因F116Y突变的特异性探针、检测逆转录酶基因Q151M突变的特异性探针、检测逆转录酶基因M184V和M184I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因L210W突变的特异性探针、检测逆转录酶基因T215Y和T215F突变的特异性探针、检测逆转录酶基因K219Q和K219E突变的特异性探针外,
还包括HIV-1逆转录酶基因内标探针、表面化学质控探针和杂交阳性质控探针。
作为本发明的检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变的试剂盒的改进:HIV-1逆转录酶基因内标探针、表面化学质控探针和杂交阳性质控探针的长度均为15~35个核苷酸;所述探针的5’端均连接上10~40个寡聚dT。
作为本发明的检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变的试剂盒的进一步改进:
HIV-1逆转录酶基因内标探针的序列为SEQ ID NO:117所示或其互补序列;
表面化学质控探针PBQC-003为HEX-poly(T)12-gcaagacaagtggaagtgtg-NH2;
杂交阳性质控探针PBQC-002为NH2-poly(T)25–GCAACCACCACCGGAGG。
作为本发明的检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变的试剂盒的进一步改进:
探针固定于载体上,所述载体为硅片、用各种功能基团衍生的膜、或用各种功能基团修饰的玻片。
作为本发明的检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变的试剂盒的进一步改进:
载体为表面带有醛基基团修饰的玻片。
本发明还同时公开了一种检测人类免疫缺陷病毒对核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法,包括以下步骤:
1)利用所述试剂盒扩增待测的人类免疫缺陷病毒基因组中的逆转录酶基因区段;
2)将步骤1)得到的扩增产物与所述试剂盒中的HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变特异性探针进行杂交,确定待测人类免疫缺陷病毒所含的对核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变类型。
作为本发明的检测人类免疫缺陷病毒对核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法的改进:PCR扩增为套式不对称RT-PCR,其中用外套引物进行的PCR为RT-PCR,取其部分扩增产物作为内套引物扩增的模板,用内套引物进行的PCR扩增为不对称PCR。
作为本发明的检测人类免疫缺陷病毒对核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法的进一步改进:所述扩增HIV-1病毒逆转录酶基因区段的内套引物对,其下游引物的5’端标记有荧光分子,且其5’端序列包含一段与HIV-1基因组及人类基因组序列无关的序列,使上下游引物的Tm值相差至少8-15°C。
本发明公开的检测人类免疫缺陷病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒,包括扩增HIV-1病毒逆转录酶基因的方法,以及与上述扩增的PCR产物进行杂交,检测HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针。
在本发明中:
待测人类免疫缺陷病毒耐药突变为nRTIs耐药突变(即核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变)。耐药突变位于人类免疫缺陷病毒逆转录酶基因区段内。
检测HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针、HIV-1逆转录酶基因内标探针的序列可以是如序列SEQ ID NO:1-117所示,也可以是如序列SEQ ID NO:1-117所示序列的互补序列。
当采用的HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变检测探针和内标探针序列为SEQ IDNO:1-117时,内套扩增引物的反向引物被荧光标记;当采用的HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变检测探针和内标探针序列为SEQ ID NO:1-117所示序列的互补序列时,内套扩增引物的正向引物被荧光标记。
试剂盒还包括杂交阳性探针的靶标;试剂盒还包括进行PCR扩增和分子杂交反应的反应液,和50%的二甲亚砜(DMSO)作为点样和杂交反应的空白对照。所述杂交反应液中含有所述的杂交阳性对照探针的靶标。
在本发明的检测方法中:
所述用内套引物进行的不对称PCR扩增包含两个阶段,每个阶段的每个温度循环由变性、退火和延伸三个步骤组成,包括10-30个温度循环,优选为20个温度循环。其中第一阶段的退火温度为45-50°C,优选为48°C;第二阶段的退火温度为55-65°C,优选为58°C。
所述的内套引物中的上游引物与下游引物的浓度比例可以是1:2至1:100之间的任意比例,优选为1:5。
杂交包括以下步骤:
1)将内套引物PCR扩增产物与杂交液,及杂交阳性对照探针的靶标混合,高温变性并速冷以使双链PCR产物解链为单链;
2)上述变性后的杂交混合物与固定于载体上的探针在合适的温度下杂交一定时间;
3)在洗液中清洗,去除未与载体上的探针杂交的PCR产物、盐离子等杂交液成分。
所述的杂交液包含杂交所需的盐溶液、表面活性剂,以及用于控制杂交严谨度的甲酰胺。所述的盐溶液可以是1-10×SSC,或1-10×SSPE,优选为3×SSC或3×SSPE。所述的用于控制杂交严谨度的甲酰胺浓度范围可以是5%-30%,优选为20%。
所述的合适的杂交温度范围可以介于30°C-42°C,优选为32°C。
所述的杂交时间可以介于15分钟至24小时之间,优选为2小时。
本发明的用外套引物进行的RT-PCR包含两个阶段:第一阶段为逆转录阶段,与常规逆转录方法相同。第二阶段为PCR扩增阶段,在灭活逆转录酶后,在外套引物存在的条件下进行PCR扩增。扩增温度循环由变性、退火和延伸三个步骤组成,包括10-40个温度循环,优选为30个循环。所述的第二阶段退火温度为45-55°C,优选为48°C。
所述的不对称PCR扩增是指通过调整内套引物中上游引物与下游引物的浓度比例,使上游引物的量低于下游引物,以及在扩增的第二阶段提高退火温度(如上文所述),使得上游引物在该退火温度下无法与模板复性,而下游引物由于Tm值高于上游引物,在该退火温度下仍可正常与模板复性并进一步延伸,最终实现PCR扩增产物中两条链的产量不同的不对称扩增效果,其中能够与HIV-1耐药突变特异性探针杂交的单链数量高于该链的互补链。
所述的上游引物的Tm值高于下游引物,其差值可以是8-15°C之间的任意值,优选为10°C。
在本发明中:
检测HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒包括对HIV-1病毒基因组中与耐药相关的逆转录酶基因区段进行套式不对称PCR扩增及荧光标记的扩增方法,以及与上述扩增的PCR产物进行杂交,检测HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针。
所述HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变是指HIV-1病毒逆转录酶基因内某个(或多个)核苷酸的突变,进一步改变了该位点所对应的氨基酸残基类型,导致含有该突变的HIV-1病毒对核苷类逆转录酶抑制剂产生耐药的突变。
所述的HIV-1病毒基因组中与核苷类逆转录酶抑制剂耐药相关的逆转录酶基因区段是指包含待检耐药突变的区段,具体的是指编码第1到第257个氨基酸的基因片段。
所述的待检的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变是指针对HIV-1逆转录酶16个氨基酸位点的19种突变类型,具体是指以下突变类型:
1)M41L(即逆转录酶基因的第41位氨基酸残基由M突变为L);
2)A62V(即逆转录酶基因的第62位氨基酸残基由A突变为V);
3)K65R(即逆转录酶基因的第65位氨基酸残基由K突变为R);
4)D67N(即逆转录酶基因的第67位氨基酸残基由D突变为N);
5)69INS(即逆转录酶基因的第69位氨基酸残基后有其他氨基酸残基插入);
6)K70R(即逆转录酶基因的第70位氨基酸残基由K突变为R);
7)L74V(即逆转录酶基因的第74位氨基酸残基由L突变为V);
8)V75I(即逆转录酶基因的第75位氨基酸残基由V突变为I);
9)F77L(即逆转录酶基因的第77位氨基酸残基由F突变为L);
10)Y115F(即逆转录酶基因的第115位氨基酸残基由Y突变F);
11)F116Y(即逆转录酶基因的第116位氨基酸残基由F突变为Y);
12)Q151M(即逆转录酶基因的第151位氨基酸残基由Q突变为M);
13)M184V(即逆转录酶基因的第184位氨基酸残基由M突变为V)、M184I(即逆转录酶基因的第184位氨基酸残基由M突变为I);
14)L210W(即逆转录酶基因的第210位氨基酸残基由L突变为W);
15)T215Y(即逆转录酶基因的第215位氨基酸残基由T突变为Y)、T215F(即逆转录酶基因的第215位氨基酸残基由T突变为F);
16)K219Q(即逆转录酶基因的第219位氨基酸残基由K突变为Q)、K219E(即逆转录酶基因的第219位氨基酸残基由K突变为E)。
所述扩增HIV-1病毒基因组中与耐药相关的编码逆转录酶基因区段的引物分为外套正向引物和外套反向引物,以及内套正向引物和内套反向引物,大小均为15-50个核苷酸,优选为15-45个核苷酸;所述的内套反向引物5’-末端连接上加尾序列后,再被荧光标记。
所述的外套引物可扩增HIV-1病毒基因组中长度为1300bps的片段,包含HIV-1蛋白酶基因上游的132bps片段、所述的蛋白酶基因编码第1到第99个氨基酸的基因片段和逆转录酶基因编码第1到第290个氨基酸的基因片段。
所述的内套引物可扩增858bp的片段,包含逆转录酶基因编码第1到第257个氨基酸的基因片段。
所述试剂盒还包括检测HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针、内标探针、表面化学质控探针、杂交阳性探针以及所述杂交阳性探针的靶标。所述探针的大小均为12-24个核苷酸,优选为15-20个核苷酸;所述探针的5’-末端连接上10-40个寡聚dT,优选连接上20-30个寡聚dT。
所述的检测HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针为单链DNA,包括序列表中序列1到序列117所示序列,以及序列表中序列1到序列117所示序列的互补序列,优选为序列表中序列1到序列117所示序列。当采用的HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变检测探针为序列表中序列1到序列117所示序列时,内套扩增引物的反向引物5’-末端连接上加尾序列后,再被荧光标记;当采用的HIV-1耐药突变检测探针为序列表中序列1到序列117所示序列的互补序列时,内套扩增引物的正向引物5’-末端连接上加尾序列后,再被荧光标记。
本发明的内标探针具有序列表中序列117的核苷酸序列,是针对逆转录酶基因扩增片段内的保守序列,无论是野生型HIV-1病毒,还是包含上述任何核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的HIV-1病毒均可与该探针杂交。
所述的表面化学质控探针(PBQC-003)主要用于芯片制备过程中监控芯片表面化学性质,检测探针固定效率,其序列可以是与待检测序列无同源性的任何序列,长度介于20-70个寡核苷酸,其5’端被荧光分子标记;
所述的杂交阳性质控探针(PBQC-002)主要用于监控芯片杂交过程,其序列可以是与待检测序列无同源性的任何序列,长度介于20-70个寡核苷酸;所述的杂交阳性对照探针的靶标(PBQC-001)是与所述的杂交阳性质控探针(PBQC-002)序列完全互补的寡核苷酸,其5’端被荧光分子标记。
本发明所述的检测HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒具有集成化程度高、灵敏度高、特异性好,检测结果稳定可靠,成本低的特点,可广泛用于HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的发生、发展的流行病学监测,为合理用药,有效降低和延缓耐药得发生提供有效工具。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为检测HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的探针点阵排布图;
图2为检测HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂单位点耐药突变的杂交反应结果图;
图3为检测HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂多位点耐药突变的杂交反应结果图;
图4为检测全血、血浆以及核酸样品中HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的杂交反应结果图。
具体实施方式
实施例1、利用本发明检测HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂单位点耐药突变
本实施例检测了本发明所涉及的所有HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变类型,以及不包含任何突变的野生型HIV-1病毒逆转录酶基因类型。
1.寡核苷酸引物和探针的制备
表1和表2显示了本发明检测HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变所用的引物和探针的序列,均委托上海英骏生物技术有限公司合成。
表1HIV-1病毒逆转录酶基因区段扩增引物
引物编号 | 引物序列(5’-3’) |
PMV-001 | gagagcttcaggtctgggg |
PMV-002 | CTGTTAGTGCTTTGGTTCCTCT |
PMV-012 | ARGCTATAGGKACAGTATTAGTAG |
PMV-008 | TAMRA-TCACTTGCTTCCGTTGAGG ATGTCATTGACAGTCCAGCT |
表2检测HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的探针
Seq ID | 探针编号 | 探针序列(5’-3’) |
1 | RT-M41-WT-1 | NH2-poly(T)25-TGT ACA GAA ATG GAA AAG |
2 | RT-M41-WT-2 | NH2-poly(T)25-T ACA GAA ATG GAA AAG |
3 | RT-M41-WT-3 | NH2-poly(T)25-ACA GAA ATG GAA AAG |
4 | RT-M41L-CTG-1 | NH2-poly(T)25-GT ACA GAA CTG GAA AAG |
5 | RT-M41L-CTG-2 | NH2-poly(T)25-T ACA GAA CTG GAA AAG |
6 | RT-M41L-CTG-3 | NH2-poly(T)25-ACA GAA CTG GAA AAG |
7 | RT-M41L-TTG-1 | NH2-poly(T)25-GT ACA GAA TTG GAA AAG |
8 | RT-M41L-TTG-2 | NH2-poly(T)25-T ACA GAA TTG GAA AAG |
9 | RT-M41L-TTG-3 | NH2-poly(T)25-ACA GAA TTG GAA AAG |
10 | RT-A62-WT-1 | NH2-poly(T)25-GTA TTT GCC ATA AAG |
11 | RT-A62-WT-2 | NH2-poly(T)25-A GTA TTT GCC ATA AAG |
12 | RT-A62-WT-3 | NH2-poly(T)25-CA GTA TTT GCC ATA AAG |
13 | RT-A62V-1 | NH2-poly(T)25-A GTA TTT GTC ATA AAG |
14 | RT-A62V-2 | NH2-poly(T)25-CA GTA TTT GTC ATA AAG |
15 | RT-A62V-3 | NH2-poly(T)25-CCA GTA TTT GTC ATA AAG |
16 | RT-A62V-4 | NH2-poly(T)25-CA GTA TTT GTC ATA AAG AA |
17 | RT-A62V-5 | NH2-poly(T)25-CCA GTA TTT GTC ATA AAG AAA |
18 | RT-K65-WT-1 | NH2-poly(T)25-CC ATA AAG AAA AAA GAC |
19 | RT-K65-WT-2 | NH2-poly(T)25-ATA AAG AAA AAA GAC AG |
Seq ID | 探针编号 | 探针序列(5’-3’) |
20 | RT-K65-WT-3 | NH2-poly(T)25-GCC ATA AAG AAA AAA G |
21 | RT-K65R-1 | NH2-poly(T)25-CC ATA AAG AGA AAA GAC |
22 | RT-K65R-2 | NH2-poly(T)25-C ATA AAG AGA AAA GAC |
23 | RT-K65R-3 | NH2-poly(T)25-A AAG AGA AAA GAC AG |
24 | RT-D67-WT-1 | NH2-poly(T)25-G AAA AAA GAC AGT ACT |
25 | RT-D67-WT-2 | NH2-poly(T)25-AG AAA AAA GAC AGT AC |
26 | RT-D67-WT-3 | NH2-poly(T)25-AAG AAA AAA GAC AGT AC |
27 | RT-D67N-1 | NH2-poly(T)25-G AAA AAA AAC AGT ACT |
28 | RT-D67N-2 | NH2-poly(T)25-AG AAA AAA AAC AGT AC |
29 | RT-D67N-3 | NH2-poly(T)25-AAG AAA AAA AAC AGT AC |
30 | RT-69-WT-1 | NH2-poly(T)25-GAC AGT ACT AAA TGG |
31 | RT-69-WT-2 | NH2-poly(T)25-A GAC AGT ACT AAA TGG |
32 | RT-69-WT-3 | NH2-poly(T)25-A GAC AGT ACT AAA TGG A |
33 | RT-69ins-SSS-1 | NH2-poly(T)25-GAC AGT AGT AGT AGT AAA TGG |
34 | RT-69ins-SSS-2 | NH2-poly(T)25-GAC AGT TCT AGC TCT AAA TGG |
35 | RT-69ins-SSS-3 | NH2-poly(T)25-GAC AGT TCT AGT TCT AAA TGG |
36 | RT-69ins-SSA-1 | NH2-poly(T)25-GAC AGT AGC AGC GCT AAA TGG |
37 | RT-69ins-SSA-2 | NH2-poly(T)25-GAC AGT TCT AGT GCT AAA TGG |
38 | RT-69ins-SSA-3 | NH2-poly(T)25-GAC AGT AGT AGC GCT AAA TGG |
39 | RT-69ins-SSG-1 | NH2-poly(T)25-GAC AGT AGT AGT GGT AAA TGG |
40 | RT-K70-WT-1 | NH2-poly(T)25-C AGT ACT AAA TGG AGA |
41 | RT-K70-WT-2 | NH2-poly(T)25-AGT ACT AAA TGG AGA A |
42 | RT-K70-WT-3 | NH2-poly(T)25-GT ACT AAA TGG AGA AA |
43 | RT-K70R-1 | NH2-poly(T)25-C AGT ACT AGA TGG AGA |
44 | RT-K70R-2 | NH2-poly(T)25-AGT ACT AGA TGG AGA A |
45 | RT-K70R-3 | NH2-poly(T)25-GT ACT AGA TGG AGA AA |
46 | RT-L74-WT-1 | NH2-poly(T)25-GG AGA AAA TTA GTA GAT |
47 | RT-L74-WT-2 | NH2-poly(T)25-GG AGA AAA TTA GTA GA |
48 | RT-L74-WT-3 | NH2-poly(T)25-TGG AGA AAA TTA GTA G |
49 | RT-L74V-1 | NH2-poly(T)25-G AGA AAA GTA GTA GAT |
50 | RT-L74V-2 | NH2-poly(T)25-GG AGA AAA GTA GTA GA |
51 | RT-L74V-3 | NH2-poly(T)25-TGG AGA AAA GTA GTA G |
52 | RT-V75-WT-1 | NH2-poly(T)25-GA AAA TTA GTA GAT TTC |
Seq ID | 探针编号 | 探针序列(5’-3’) |
53 | RT-V75-WT-2 | NH2-poly(T)25-AGA AAA TTA GTA GAT TT |
54 | RT-V75-WT-3 | NH2-poly(T)25-G AGA AAA TTA GTA GAT T |
55 | RT-V75I-1 | NH2-poly(T)25-GA AAA TTA ATA GAT TTC A |
56 | RT-V75I-2 | NH2-poly(T)25-AGA AAA TTA ATA GAT TTC |
57 | RT-V75I-3 | NH2-poly(T)25-G AGA AAA TTA ATA GAT TT |
58 | RT-F77-WT-1 | NH2-poly(T)25-TA GTA GAT TTC AGA GA |
59 | RT-F77-WT-2 | NH2-poly(T)25-GTA GAT TTC AGA GAA C |
60 | RT-F77-WT-3 | NH2-poly(T)25-TA GAT TTC AGA GAA CT |
61 | RT-F77L-1 | NH2-poly(T)25-A GTA GAT CTC AGA GA |
62 | RT-F77L-2 | NH2-poly(T)25-GTA GAT CTC AGA GAA |
63 | RT-F77L-3 | NH2-poly(T)25-TA GAT CTC AGA GAA C |
64 | RT-Y115-WT-1 | NH2-poly(T)25-GAT GCA TAT TTT TCA G |
65 | RT-Y115-WT-2 | NH2-poly(T)25-C GAT GCA TAT TTT TC |
66 | RT-Y115-WT-3 | NH2-poly(T)25-GC GAT GCA TAT TTT T |
67 | RT-Y115F-1 | NH2-poly(T)25-GAT GCA TTT TTT TCA G |
68 | RT-Y115F-2 | NH2-poly(T)25-C GAT GCA TTT TTT TC |
69 | RT-Y115F-3 | NH2-poly(T)25-GC GAT GCA TTT TTT T |
70 | RT-F116-WT-1 | NH2-poly(T)25-GCA TAT TTT TCA GTT C |
71 | RT-F116-WT-2 | NH2-poly(T)25-CA TAT TTT TCA GTT CC |
72 | RT-F116-WT-3 | NH2-poly(T)25-A TAT TTT TCA GTT CCC |
73 | RT-F116Y-1 | NH2-poly(T)25-GCA TAT TAT TCA GTT C |
74 | RT-F116Y-2 | NH2-poly(T)25-GCA TAT TAT TCA GTT CC |
75 | RT-F116Y-3 | NH2-poly(T)25-CA TAT TAT TCA GTT CCC |
76 | RT-Q151-WT-1 | NH2-poly(T)25-TG CTT CCA CAG GGA TG |
77 | RT-Q151-WT-2 | NH2-poly(T)25-G CTT CCA CAG GGA TGG |
78 | RT-Q151-WT-3 | NH2-poly(T)25-CTT CCA CAG GGA TGG A |
79 | RT-Q151M-1 | NH2-poly(T)25-TG CTT CCA ATG GGA TG |
80 | RT-Q151M-2 | NH2-poly(T)25-G CTT CCA ATG GGA TGG |
81 | RT-Q151M-3 | NH2-poly(T)25-CTT CCA ATG GGA TGG A |
82 | RT-M184-WT-1 | NH2-poly(T)25-T CAA TAC ATG GAT GAT |
83 | RT-M184-WT-2 | NH2-poly(T)25-CAA TAC ATG GAT GAT |
84 | RT-M184-WT-3 | NH2-poly(T)25-CAA TAC ATG GAT GAT T |
85 | RT-M184V-1 | NH2-poly(T)25-T CAA TAC GTG GAT GAT |
Seq ID | 探针编号 | 探针序列(5’-3’) |
86 | RT-M184V-2 | NH2-poly(T)25-CAA TAC GTG GAT GAT |
87 | RT-M184V-3 | NH2-poly(T)25-AA TAC GTG GAT GAT T |
88 | RT-M184I-1 | NH2-poly(T)25-T CAA TAC ATA GAT GAT T |
89 | RT-M184I-2 | NH2-poly(T)25-CAA TAC ATA GAT GAT TT |
90 | RT-M184I-3 | NH2-poly(T)25-CAA TAC ATA GAT GAT TTG |
91 | RT-L210-WT-1 | NH2-poly(T)25-A CAT CTG TTG AGG TG |
92 | RT-L210-WT-2 | NH2-poly(T)25-CAT CTG TTG AGG TGG |
93 | RT-L210-WT-3 | NH2-poly(T)25-AT CTG TTG AGG TGG G |
94 | RT-L210W-1 | NH2-poly(T)25-A CAT CTG TGG AGG TG |
95 | RT-L210W-2 | NH2-poly(T)25-CAT CTG TGG AGG TGG |
96 | RT-L210W-3 | NH2-poly(T)25-AT CTG TGG AGG TGG G |
97 | RT-T215-WT-1 | NH2-poly(T)25-GGA TTT ACC ACA CCA |
98 | RT-T215-WT-2 | NH2-poly(T)25-G GGA TTT ACC ACA CC |
99 | RT-T215-WT-3 | NH2-poly(T)25-GG GGA TTT ACC ACA C |
100 | RT-T215F-1 | NH2-poly(T)25-GGA TTT TTC ACA CCA |
101 | RT-T215F-2 | NH2-poly(T)25-G GGA TTT TTC ACA CC |
102 | RT-T215F-3 | NH2-poly(T)25-GG GGA TTT TTC ACA C |
103 | RT-T215Y-1 | NH2-poly(T)25-GGA TTT TAC ACA CCA |
104 | RT-T215Y-2 | NH2-poly(T)25-G GGA TTT TAC ACA CC |
105 | RT-T215Y-3 | NH2-poly(T)25-GG GGA TTT TAC ACA C |
106 | RT-K219-WT-1 | NH2-poly(T)25-CCA GAC AAA AAA CAT |
107 | RT-K219-WT-2 | NH2-poly(T)25-A CCA GAC AAAAAA CA |
108 | RT-K219-WT-3 | NH2-poly(T)25-CA CCA GAC AAA AAA C |
109 | RT-K219Q-1 | NH2-poly(T)25-CCA GAC CAA AAA CAT |
110 | RT-K219Q-2 | NH2-poly(T)25-A CCA GAC CAA AAA CA |
111 | RT-K219Q-3 | NH2-poly(T)25-CA CCA GAC CAA AAA C |
112 | RT-K219E-1 | NH2-poly(T)25-CCA GAC GAA AAA CAT |
113 | RT-K219E-2 | NH2-poly(T)25-A CCA GAC GAA AAA CA |
114 | RT-K219E-3 | NH2-poly(T)25-CA CCA GAC GAA AAA C |
115 | RT-K219E-4 | NH2-poly(T)25-CA GAC GAA AAA CAT C |
116 | RT-K219E-5 | NH2-poly(T)25-A GAC GAA AAA CAT CA |
117 | RT-IC-1 | NH2-poly(T)25-CAA TGG CCA TTG ACA G |
/ | PBQC-003 | HEX-poly(T)12-gcaagacaagtggaagtgtg-NH2 |
Seq ID | 探针编号 | 探针序列(5’-3’) |
/ | PBQC-002 | NH2-poly(T)25-GCAACCACCACCGGAGG |
2.HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变检测芯片的制备
采用GeneMachine点样仪,将上述寡核苷酸探针(如表2所示)分别各自溶解在50%(V/V)DMSO中,浓度为10μM。按图1所示的探针排布方式将溶解后的探针点制在醛基修饰的基片(光学级醛基基片,北京博奥生物芯片有限责任公司,产品号:420022)上,干燥并固定后,贴上12样品围栏(SmartGridTM,北京博奥生物芯片有限责任公司,产品号:430033)备用。
3.待检样品制备
在野生型HIV-1全基因组克隆质粒pNL4-3的基础上,采用人工定点突变的方法,分别获得本发明所涉及的所有19种核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变克隆,包括M41L-ctg、M41L-ttg、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、F77L、Y115F、F116Y、Q151M、M184I、M184V、L210W、T215Y、T215F、K219E和K219Q。所有的突变克隆进行Sanger测序,确定突变序列全部正确。
待检样品编号及对应的HIV-1基因类型见表3。
表3待检样品编号及对应的HIV-1基因类型
4.PCR扩增HIV-1病毒逆转录酶基因片段
本实施例以克隆质粒DNA为模板,采用套式不对称PCR扩增。
4.1第一轮PCR扩增
首先用外套引物PMV-001和PMV-002对20种HIV-1质粒(19种突变型+野生型)进行PCR扩增,单份样品的反应体系如下(采用天根公司产品2×Taq PCR MasterMix,产品号:KT201),根据样品数量进行体系放大:
备注说明:克隆质粒DNA是指表3中的突变型、野生型中的一种。
PCR反应在DNA Engine Tetrad2(BIO-RAD)热循环仪上进行,采用以下热循环程序:
4.2第二轮不对称PCR扩增
取少量第一轮PCR的扩增产物作为第二轮不对称PCR扩增的模板,用内套引物PMV-012和PMV-008进行不对称扩增,同时利用引物PMV-008上标记的荧光分子TAMRA对PCR产物进行荧光标记。
在PCR扩增过程中,利用上下游引物浓度的不同,以及上下游引物Tm值相差近10°C的特性,在第一阶段的20个循环中,采用较低的退火温度,使得上下游引物均可与模板复性,获得较多数量的双链扩增产物。第二阶段的20个循环,在较多数量的双链扩增产物基础上,采用较高的退化温度,使得上游引物无法与模板复性,而下游引物由于Tm值较高,可正常复性和延伸,实现双链的不对称扩增,由此获得大量的单链荧光标记扩增产物。
单份样品的第二轮不对称PCR扩增的反应体系如下(采用天根公司产品2×Taq PCRMasterMix,产品号:KT201),根据样品数量进行体系放大:
PCR反应在DNA Engine Tetrad2(BIO-RAD)热循环仪上进行,采用以下热循环程序:
5.芯片杂交及信号检测
取第二轮PCR产物,与适当浓度的盐溶液、表面活性剂、甲酰胺以及杂交阳性对照探针的靶标混合,配制成与芯片上固定的探针进行反应的杂交反应液。单份杂交反应液的配制如下(根据样品数量进行体系放大):
备注说明:4%SDS(W/V)是指每L的SDS溶液中含有40g的SDS(十二烷基硫酸钠)。
PBQC-001序列为:TAMRA-cctccggtggtggttgc。
在芯片杂交盒(HybriCassettesTM,北京博奥生物芯片有限责任公司,产品号:430010)内加入200μl双蒸水,以增加杂交盒内的湿度,防止杂交过程中样品蒸发。将制备好的HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变检测芯片和盖片(SmartCoverTM,北京博奥生物芯片有限责任公司,产品号:430044)放置于杂交盒内。
将杂交反应液加热至95°C,维持5分钟使PCR产物充分变性后,立即置于冰上速冷。取20μl杂交反应液,通过盖片上的加样孔加入到盖片与芯片之间的空隙中,盖好杂交盒,两端用卡条封闭好后,置于32°C杂交2小时。杂交结束后,取出芯片,置于2×SSC和0.2%SDS的洗液I中,室温摇洗5分钟;然后再置于0.2×SSC的洗液II中,室温摇洗5分钟;之后再将芯片用去离子水漂洗5分钟后,离心甩干。
芯片上的荧光信号采用GenePix4200AL激光共聚焦扫描仪及其配套软件GenePix Pro6.0(Axon Inc.)扫描采集。扫描参数如下:激发光波长:532nm;Laser Power:33%;PMT:400。
6.结果分析
用GenePix Pro6.0软件提取每个探针信号点的杂交信号,计算每一个探针信号点的信噪比(Signal Noise Ratio,SNR=(信号值-背景值)/背景值),从而确定样品中HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂的突变情况,提示耐药性。20种基因型的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变及野生型克隆质粒的芯片杂交反应结果如图2所示。
备注说明:当信噪比≥3时,能确认该探针为阳性,即样品中包含该探针所对应的耐药突变。以下同。
具体如下:
P1#样品芯片检测结果显示在逆转录酶基因区段内不包含任何待测的突变类型,HIV-1逆转录酶基因为野生型,与测序结果相符;
P33#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:4~6对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含M41L-ctg的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P34#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:7~9对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含M41L-ttg的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P35#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:13~17对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含A62V的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P36#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:21~23对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含基因型为K65R的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P37#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:27~29对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含基因型为D67N的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P38#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:43~45对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含基因型为K70R的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P39#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:49~51对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含L74V的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P40#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:55~57对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含V75I的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P41#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:61~63对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含F77L的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P42#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:67~69对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含Y115F的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P43#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:73~75对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含基因型为F116Y的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P44#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:79~81对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含基因型为Q151M的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P45#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:85~87对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含基因型为M184V的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P46#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:88~90对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含基因型为M184I的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P47#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:94~96对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含基因型为L210W的核苷类逆转录酶抑制剂剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P48#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:100~102对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含基因型为T215F的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P49#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:103~105对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含基因型为T215Y的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P50#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:109~111对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含基因型为K219Q的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符;
P51#样品芯片检测结果(SEQ ID NO:112~116对应的信噪比均≥3)显示在逆转录酶基因区段内包含基因型为K219E的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变,其他位点无突变,与测序结果相符。
本方法所得的结果与测序结果完全一致。这说明本发明提供的方法可以特异性的检测出上述各种核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变类型。
实施例2:利用本发明检测HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂多位点及低丰度耐药突变
本实施例说明本发明提供的方法和试剂盒可同时检测包含多个HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的样品。
本实施例同时说明本发明提供的方法可检测出样品中包含的丰度低至2%的耐药突变类型,是一种灵敏度极高的方法。
1.寡核苷酸引物和探针的制备
方法及步骤同实施例1。
2.HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变检测芯片的制备
方法及步骤同实施例1。
3.待检样品制备
本实施例中的待测样品(SN-1~4)包含至少2种以上的对核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变类型,其中耐药突变的丰度范围在2%-35%之间。本实施例用本发明提供的方法,对经过高通量测序,已确定耐药突变类型的临床样品进行检测,通过比较确定本发明所提供的方法对包含多个核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变类型的检测效果。待测样品为临床全血样品,各样品包含的耐药突变类型及丰度信息见表4。
表4待测样品包含的核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变类型及丰度
采用Roche公司High Pure Viral Nucleic Acid Kit(产品号:11858874001)提取全血样品中的病毒核酸。
4.PCR扩增HIV-1病毒逆转录酶基因片段
4.1第一轮RT-PCR扩增
首先用外套引物PMV-001和PMV-002对从待检测样品中提取的核酸进行RT-PCR扩增,单份样品的反应体系如下(采用TAKARA公司产品One Step RNA PCR Kit(AMV),产品号:DRR024A),根据样品数量进行体系放大:
RT-PCR反应在DNA Engine Tetrad2(BIO-RAD)热循环仪上进行,采用以下热循环程序:
4.2第二轮不对称PCR扩增
方法及步骤同实施例1。
5.芯片杂交及信号检测
方法及步骤同实施例1。
6.结果分析
用GenePix Pro6.0软件提取每个探针信号点的杂交信号值和背景值,计算每一个探针信号点的信噪比(Signal Noise Ratio,SNR=(信号值-背景值)/背景值),从而确定样品中HIV-1病毒逆转录酶基因的突变情况,提示对核苷类逆转录酶抑制剂的耐药性。待测样品的芯片杂交反应结果如图3和表5所示。
表5待测样品的芯片检测结果
比较芯片检测结果和高通量测序结果可以发现,本发明提供的方法可同时检测出待测样品中包含的多个核苷类逆转录酶抑制剂的耐药类型,两种方法的检测结果完全一致。说明本发明提供的方法和试剂盒可同时检测包含多个HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的样品,同时说明本发明提供的方法可检测出样品中包含的丰度低至2%的耐药突变类型,是一种灵敏度极高的方法。
实施例3:利用本发明检测血浆、全血及核酸样品中HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变
本实施例说明本发明提供的方法和试剂盒可用于血浆、全血及核酸样品中HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的检测。
1.寡核苷酸引物和探针的制备
方法及步骤同实施例1。
2.HIV-1病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变检测芯片的制备
方法及步骤同实施例1。
3.待检样品制备
本实施例对临床收集的全血(WB-6~8)、血浆(XJ-6~7)及核酸(R-5~6,D-3)样品进行检测。经高通量测序,全血样品WB-6包含核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变M41L、A62V、M184V和K219E;WB-7包含A62V和K219E耐药突变;WB-8包含M41L、A62V、M184V和K219E耐药突变;血浆样品XJ-6包含M41L、A62V、Y115F、F116Y、Q151M和M184V耐药突变;XJ-7包含M41L、A62V、Y115F、F116Y、Q151M、M184V、T215F和K219E耐药突变;RNA样品R-5包含A62V和K219E耐药突变;R-6包含M41L、A62V、M184V、L210W和K219E耐药突变;DNA样品D-3包含F116Y和T215F耐药突变。上述耐药突变的丰度均高于2%。
对临床收集的血浆及全血样品,采用Roche公司High Pure Viral Nucleic Acid Kit(产品号:11858874001)提取全血或血浆样品中的病毒核酸。对临床收集的核酸(包含HIV-1病毒RNA样品,及包含整合HIV-1病毒的DNA样品)样品,则直接进行核酸扩增。
4.PCR扩增HIV-1病毒逆转录酶基因片段
4.1第一轮RT-PCR扩增
对于DNA样品,方法及步骤同实施例1;对于全血、血浆及病毒RNA样品,方法及步骤同实施例2。
4.2第二轮不对称PCR扩增
方法及步骤同实施例1。
5.芯片杂交及信号检测
方法及步骤同实施例1。
6.结果分析
用GenePix Pro6.0软件提取每个探针信号点的杂交信号值和背景值,计算每一个探针信号点的信噪比(Signal Noise Ratio,SNR=(信号值-背景值)/背景值),从而确定样品中HIV-1病毒逆转录酶基因的突变情况,提示对核苷类逆转录酶抑制剂耐药性。血浆、全血及核酸待测样品的芯片杂交反应结果如图4和表5所示。
表5血浆、全血及核酸待测样品的芯片检测结果
比较芯片检测结果和高通量测序结果,可以发现两种方法的检测结果完全一致。说明本发明提供的方法适用于血浆、全血及核酸样品(HIV-1病毒RNA样品,及包含整合HIV-1病毒的DNA样品)的检测。
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.检测人类免疫缺陷病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针,其特征是:包括以下16类特异性探针:
检测逆转录酶基因M41L突变的特异性探针,为SEQ ID NO:1~9中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因A62V突变的特异性探针,为SEQ ID NO:10~17中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因K65R突变的特异性探针,为SEQ ID NO:18~23中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因D67N突变的特异性探针,为SEQ ID NO:24~29中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因69INS插入突变的特异性探针,为SEQ ID NO:30~39中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因K70R突变的特异性探针,为SEQ ID NO:40~45中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因L74V突变的特异性探针,为SEQ ID NO:46~51中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因V75I突变的特异性探针,为SEQ ID NO:52~57中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因F77L突变的特异性探针,为SEQ ID NO:58~63中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因Y115F突变的特异性探针,为SEQ ID NO:64~69中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因F116Y突变的特异性探针,为SEQ ID NO:70~75中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因Q151M突变的特异性探针,为SEQ ID NO:76~81中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因M184V和M184I突变的特异性探针,为SEQ ID NO:82~90中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因L210W突变的特异性探针,为SEQ ID NO:91~96中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因T215Y和T215F突变的特异性探针,为SEQ ID NO:97~105中的任意一种或任意一种的互补序列;
检测逆转录酶基因K219Q和K219E突变的特异性探针,为SEQ ID NO:106~116中的任意一种或任意一种的互补序列。
2.根据权利要求1所述的检测人类免疫缺陷病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针,其特征是:
所述检测逆转录酶基因M41L突变的特异性探针中,SEQ ID NO:1~3中的任意一种为针对第41位氨基酸残基为M的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:4~9中的任意一种为针对第41位氨基酸残基为L的HIV-1逆转录酶基因;
所述检测逆转录酶基因A62V突变的特异性探针中,SEQ ID NO:10~12中的任意一种为针对第62位氨基酸残基为A的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:13~17中的任意一种为针对第62位氨基酸残基为V的HIV-1逆转录酶基因;
所述检测逆转录酶基因K65R突变的特异性探针中,SEQ ID NO:18~20中的任意一种为针对第65位氨基酸残基为K的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:21~23中的任意一种为针对第65位氨基酸残基为R的HIV-1逆转录酶基因;
所述检测逆转录酶基因D67N突变的特异性探针中,SEQ ID NO:24~26中的任意一种为针对第67位氨基酸残基为D的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:27~29中的任意一种为针对第67位氨基酸残基为N的HIV-1逆转录酶基因;
所述检测逆转录酶基因69INS插入突变的特异性探针中,SEQ ID NO:30~32中的任意一种为针对第69位氨基酸残基为T的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:33~39中的任意一种为针对在第69位氨基酸残基T后插入SSS、SSA或SSG的HIV-1逆转录酶基因;
所述检测逆转录酶基因K70R突变的特异性探针中,SEQ ID NO:40~42中的任意一种为针对第70位氨基酸残基为K的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:43~45中的任意一种为针对第70位氨基酸残基为R的HIV-1逆转录酶基因;
所述检测逆转录酶基因L74V突变的特异性探针中,SEQ ID NO:46~48中的任意一种为针对第74位氨基酸残基为L的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:49~51中的任意一种为针对第74位氨基酸残基为V的HIV-1逆转录酶基因;
所述检测逆转录酶基因V75I突变的特异性探针中,SEQ ID NO:52~54中的任意一种为针对第75位氨基酸残基为V的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:55~57中的任意一种为针对第75位氨基酸残基为I的HIV-1逆转录酶基因;
所述检测逆转录酶基因F77L突变的特异性探针中,SEQ ID NO:58~60中的任意一种为针对第77位氨基酸残基为F的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:61~63中的任意一种为针对第77位氨基酸残基为L的HIV-1逆转录酶基因;
所述检测逆转录酶基因Y115F突变的特异性探针中,SEQ ID NO:64~66中的任意一种为针对第115位氨基酸残基为Y的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:67~69中的任意一种为针对第115位氨基酸残基为F的HIV-1逆转录酶基因;
所述检测逆转录酶基因F116Y突变的特异性探针中,SEQ ID NO:70~72中的任意一种为针对第116位氨基酸残基为F的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:73~75中的任意一种为针对第116位氨基酸残基为Y的HIV-1逆转录酶基因;
所述检测逆转录酶基因Q151M突变的特异性探针中,SEQ ID NO:76~78中的任意一种为序列76到序列78是针对第151位氨基酸残基为Q的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:79~81中的任意一种为针对第151位氨基酸残基为M的HIV-1逆转录酶基因;
所述检测逆转录酶基因M184V和M184I突变的特异性探针中,SEQ ID NO:82~84中的任意一种为针对第184位氨基酸残基为M的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:85~87中的任意一种为针对第184位氨基酸残基为V的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:88~90中的任意一种为针对第184位氨基酸残基为I的HIV-1逆转录酶基因;
所述检测逆转录酶基因L210W突变的特异性探针中,SEQ ID NO:91~93中的任意一种为针对第210位氨基酸残基为L的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:94~96中的任意一种为针对第210位氨基酸残基为W的HIV-1逆转录酶基因;
所述检测逆转录酶基因T215Y和T215F突变的特异性探针中,SEQ ID NO:97~99中的任意一种为针对第215位氨基酸残基为T的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:100~102中的任意一种为针对第215位氨基酸残基为F的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:103~105中的任意一种为针对第215位氨基酸残基为Y的HIV-1逆转录酶基因;
所述检测逆转录酶基因K219Q和K219E突变的特异性探针中,SEQ ID NO:106~108中的任意一种为针对第219位氨基酸残基为K的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:109~111中的任意一种为针对第219位氨基酸残基为Q的HIV-1逆转录酶基因,SEQ ID NO:112~116中的任意一种为针对第219位氨基酸残基为E的HIV-1逆转录酶基因。
3.利用如权利要求1或2所述的检测人类免疫缺陷病毒核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针制备而得的检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变的试剂盒,其特征是:
除了包括检测逆转录酶基因M41L突变的特异性探针、检测逆转录酶基因A62V突变的特异性探针、检测逆转录酶基因K65R突变的特异性探针、检测逆转录酶基因D67N突变的特异性探针、检测逆转录酶基因69INS插入突变的特异性探针、检测逆转录酶基因K70R突变的特异性探针、检测逆转录酶基因L74V突变的特异性探针、检测逆转录酶基因V75I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因F77L突变的特异性探针、检测逆转录酶基因Y115F突变的特异性探针、检测逆转录酶基因F116Y突变的特异性探针、检测逆转录酶基因Q151M突变的特异性探针、检测逆转录酶基因M184V和M184I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因L210W突变的特异性探针、检测逆转录酶基因T215Y和T215F突变的特异性探针、检测逆转录酶基因K219Q和K219E突变的特异性探针外,
还包括HIV-1逆转录酶基因内标探针、表面化学质控探针和杂交阳性质控探针。
4.根据权利要求3所述的检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变的试剂盒,其特征是:
HIV-1逆转录酶基因内标探针、表面化学质控探针和杂交阳性质控探针的长度均为15~35个核苷酸;所述探针的5’端均连接上10~40个寡聚dT。
5.根据权利要求4所述的检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变的试剂盒,其特征是:
所述HIV-1逆转录酶基因内标探针的序列为SEQ ID NO:117或其互补序列;
所述表面化学质控探针PBQC-003为HEX-poly(T)12-gcaagacaagtggaagtgtg-NH2;
所述杂交阳性质控探针PBQC-002为NH2-poly(T)25–GCAACCACCACCGGAGG。
6.根据权利要求3、4或5所述的检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变的试剂盒,其特征是:用于固定探针的载体为硅片、用各种功能基团衍生的膜、或用各种功能基团修饰的玻片。
7.根据权利要求6所述的检测HIV-1病毒核苷类抑制剂耐药突变的试剂盒,其特征是:所述载体为表面带有醛基基团修饰的玻片。
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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Targeting HIV:antiretroviral therapy and development of drug resistance;Luis Menendez-Arias;《TRENDS in Pharmacological Sciences》;20020831;第23卷(第8期);381-388 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN103215378A (zh) | 2013-07-24 |
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