CN118086582A - 基于ngs的hiv耐药基因检测的组合物、方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测领域，具体地，涉及HIV耐药性基因检测，更具体地，涉及基于NGS的HIV耐药性基因检测。本发明提供了一种结合NGS检测HIV耐药性的组合物，包括第一检测组合物和第二检测组合物。使用本发明的检测组合物，能够同时检测出HIV的蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、整合酶抑制剂三类药物的耐药性，操作更为简便，成本更低。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体地，涉及HIV耐药基因检测，更具体地，涉及基于NGS的HIV耐药性基因检测。
背景技术
获得性免疫缺陷综合症是由两种逆转录病毒HIV-1或HIV-2感染引起。HIV-1在全球造成了大规模感染，而HIV-2的侵染则局限在西非地区，全球其他区域有零星分布。HIV病毒是一种传染性逆转录病毒，可感染人体免疫细胞，导致免疫下降。它主要攻击免疫系统中最重要的CD4+T淋巴细胞，使人体易于感染多种疾病，并可引发恶性肿瘤，病死率较高。艾滋病临床表现没有特异性，感染初期，很多患者无明显症状，感染2～4周，有些患者会出现发烧、皮疹、咽喉痛、淋巴结肿大、疲倦及各种更少见的症状。HIV通过与含有病毒的体液(如血液、精液或阴道液)或被病毒感染的细胞密切接触传播。
在全球范围内普遍流行的HIV-1型可分为M(Main)、N(Non-M-Non-O)、O(Outlier)和P 4个组，其中最主要的M组可以分为A、B、C、D、F、G、H、J和K亚型，N、O和P组毒株主要局限在中非，且流行率较低。该分类系统并不是静态的，近年来还报道了许多广泛流行的重组亚型(CRFs)。HIV-2主要局限于非洲地区，至少有A-G 7种亚型。
《中国遏制与防治艾滋病行动计划》要求我国艾滋病防治要实现“三个90％”的防治目标；国家十部委联合下发的《遏制艾滋病传播实施方案(2019—2022年)》也将三个90％作为艾滋病防治的具体指标，在艾滋病治疗过程中的耐药性检测精确性对治疗有着重要的指示作用。中国的人口基数大，患者量大，在耐药检测需求不断提高，有更多的临床需求提出。
现在主流的是RT-PCR结合Sanger测序法，但少量样本进行Sanger测序的结果无法反映其临床表现，主要是其测序的次数少，劣势毒株无法测得，在临床上对疑似耐药的患者情况无法预知。因此，目前，开发出了RT-PCR结合NGS测序法，例如，中国发明专利CN111500782B和CN111560474B，分别检测了HIV-1的逆转录酶和蛋白酶的耐药性，但是，其检测耐药的广谱性仍然存在缺陷。
因此，本领域需求一种HIV耐药性检测产品，其能够广谱的检测多种类型的耐药，例如，蛋白酶、逆转录酶、整合酶等靶点的耐药性。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供一种结合NGS检测HIV耐药性的组合物，包括第一检测组合物和第二检测组合物，其中，
第一检测组合物：
如SEQ ID NO.1～2所示的扩增Pro区的引物组；
如SEQ ID NO.3～4所示的扩增RT区的引物组；和
如SEQ ID NO.5～6所示的扩增Int区的引物组；
第二检测组合物：
如SEQ ID NO.7～8所示的扩增Pro区的引物组；
如SEQ ID NO.9～10所示的扩增RT区的引物组；和
如SEQ ID NO.11～12所示的扩增Int区的引物组。
使用本发明的检测组合物，能够同时检测出HIV的蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、整合酶抑制剂三类药物的耐药性，操作更为简便，成本更低。
进一步地，本发明所述组合物先使用第一检测组合物进行第一轮PCR扩增，再使用第二检测组合物进行第二轮PCR的扩增。
第二方面，本发明提供一种上述组合物用于制备检测HIV耐药的试剂盒中的用途。
进一步地，制备用于检测针对HIV的劣势耐药毒株的试剂盒。
进一步地，制备用于检测HIV耐药基因变异的试剂盒。
第三方面，本发明提供一种结合NGS检测HIV耐药性的试剂盒，包括上述组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括如下中至少一种：逆转录酶、DNA聚合酶、dNTP、缓冲液，和Mg2+。
更进一步地，所述引物组：逆转录酶：DNA聚合酶的比例为10:3:20。
进一步地，所述试剂盒还包括如下中至少一种：DNA片段化试剂、末端修复试剂、连接酶、磁珠混液。
第四方面，本发明提供一种以非诊断目的结合NGS检测HIV耐药性的方法，包括：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上所述的第一检测组合物进行第一轮扩增，获得第一轮扩增产物；
3)处理所述第一轮扩增产物，使用如上所述的第二检测组合物对第一轮扩增产物进行第二轮扩增，获得第二轮扩增产物；
4)处理所述第二轮扩增产物并建库；以及
5)测序并分析结果。
进一步地，所述核酸为RNA。
进一步地，所述第一轮扩增的条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；变性，温度为94℃，时间为5～40秒，退火，温度为55～60℃，时间为10～60秒，延伸，温度为72℃，时间为30～60秒，30～40次循环。
进一步地，所述第二轮扩增的条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间为3～10分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；变性，温度为94℃，时间为5～40秒，退火，温度为55～60℃，时间为10～60秒，延伸，温度为72℃，时间为30～60秒，30～40次循环。
进一步地，处理所述第二轮扩增产物并建库包括打断和文库扩增。打断即为DNA片段化。
在本文中，术语“以非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染上述病原体并具备耐药性等的信息。例如，该方法可以检测培养物(例如细胞)中的HIV是否具有耐药性。
附图说明
图1为低载样本检测深度覆盖图；
图2为样本1耐药性检测报告图；
图3为样本709检测深度覆盖图；
图4为样本709耐药性检测报告；
图5为对比方法检测深度覆盖图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物
本发明所使用的引物组如表1所示。
表1
其中，S、R、B、W、M、Y等均为简并碱基。
实施例2、结合NGS检测耐药的方法
使用实施例1所述的第一检测组合物对核酸产物进行扩增。第一组引物针对Pro区、Int区和RT区三个耐药相关区域进行扩增，反应液配方见下表2，反应程序见下表3。
表2
| 一扩扩增体系 | 单人份体积(μL) |
| 5*HCV Buffer | 25 |
| dNTPs | 1 |
| MgCl2 | 0.3 |
| NRT酶 | 0.3 |
| Taq酶 | 2 |
| 上游引物 | 0.5 |
| 下游引物 | 0.5 |
| 模板 | 20 |
| 总 | 50 |
表3
3对一轮扩增产物进行稀释或纯化后再使用第二检测组合物对应地进行第二轮巢式扩增。第二组引物较第一组引物短，对一轮产物进行稀释或磁珠纯化后进行第二轮扩增，以提高特异性和产物浓度。反应液配方见下表4，反应程序见下表5。
表4
| 二扩扩增体系 | 单人份体积(μL) |
| 5*HCV Buffer | 25 |
| dNTPs | 1 |
| MgCl2 | 0.3 |
| Taq酶 | 2 |
| 纯化水 | 10.7 |
| 上游引物 | 0.5 |
| 下游引物 | 0.5 |
| 模板 | 10 |
| 总 | 50 |
表5
对第二轮扩增产物进行纯化，建库。建库现使用翌圣一步法建库试剂盒，建库流程按说明书流程操作。
1)通过Qubit测定浓度后，确定样本投入量，制表，用纯水稀释样本，以控制投入浓度
2)使用酶打断，反应条件及试剂用量见下表表6；
3)加接头，保证每一个样本的接头不重复，操作过程无交叉污染，反应条件及试剂用量见下表表5；
4)0.7*纯化后，进行文库扩增，反应条件及试剂用量见下表表6；
5)0.9*纯化后出库，通过Qubit测定出库浓度，调整投入量填表后进行pooling，测定浓度是否与理论浓度相符。
Pooling：将不同标签、不同浓度的样本，取一定体积进行混合，以保证取出的各样本浓度几乎相等，以控制测序片段中各样本深度均一。
表6
测序。二代测序仪使用illumina Nextseq500或illumina CN500，对测序结果按接头进行拆分数据。
生信分析，对数据进行对比分析，输出耐药结果报告。
实施例3、本发明组合物测试样本1的检测结果
使用如实施例1所述的组合物按照实施例2所述的方法，对HIV样本进行检测，检测结果如图1所示，对HIV病毒载量偏低的样本仍可达到深度全覆盖，保证其检出深度的数据量。其次如表7和8所示，在检测数据结果输出中更全面的显示各区的突变情况，对有突变的均进行输出，同时输出深度和突变频率。
在此之外输出耐药结果，如图2所述，更直接地显示各样本的耐药情况，便于通过计算机整合报告，大大减少报告输出过程的耗时。
表7
表8
| 样本名 | 抑制剂种类 | 氨基酸变异位点 | 耐药药物 | 耐药水平 | 置信度 |
| 4 | NNRTI | M230I | DOR | PL微度耐药 | Hign Confidence |
| 4 | NNRTI | M230I | EFV | PL微度耐药 | Hign Confidence |
| 4 | NNRTI | M230I | ETR | PL微度耐药 | Hign Confidence |
| 4 | NNRTI | M230I | NVP | I中度耐药 | Hign Confidence |
| 4 | NNRTI | M230I | RPV | I中度耐药 | Hign Confidence |
实施例4、本发明组合物测试样本2的检测结果
使用如实施例1所述的组合物按照实施例2所述的方法，对HIV样本进行检测，检测结果如图3所示，对HIV样本检出深度全覆盖，其次如表9和10和图4所示，检测数据结果输出各区的突变情况，对有突变的均进行输出，同时输出深度和突变频率。
表9
表10
| 样本名 | 抑制剂种类 | 氨基酸变异位点 | 耐药药物 | 耐药水平 |
| 709 | INSTI | E157Q | EVG | PL微度耐药 |
| 709 | INSTI | E157Q | RAL | PL微度耐药 |
对比例1、对比例方法检测HIV耐药
使用现有技术的方法对同样的样本进行检测，检测结果如图5所示，深度覆盖存在大量区域缺失，在不同样本间有大量漏检。对低频突变的菌株无法输出结果，在信息分析中需要进行大量细节上的调整；原始输出结果如下表11，原有输出结果可用度低，对信息的分析无法应用于直接判读。
表11
| 耐药原始信息输出 | |||||
| 样本名 | 位点 | 位置 | 参考核苷酸 | 突变核苷酸 | 突变:协方差:Reads1:Reads2:频率:P值 |
| 28-7 | Pol-RT | 774 | G | A | A:174:25:141:81.03％:3.4582E-68 |
| 28-7 | Pol-RT | 776 | A | T | T:7:0:7:100％:2.9138E-4 |
| 耐药结果输出 | |||||
| 28-7 | 耐药基因 | snp | 氨基酸注释 | 深度 | 突变频率 |
| 28-7 | Pol-RT | A776T | K259M | 7 | 100％ |
Claims (10)
1.一种结合NGS检测HIV耐药性的组合物，包括第一检测组合物和第二检测组合物，其中，
第一检测组合物：
如SEQ ID NO.1～2所示的扩增Pro区的引物组；
如SEQ ID NO.3～4所示的扩增RT区的引物组；和
如SEQ ID NO.5～6所示的扩增Int区的引物组；
第二检测组合物：
如SEQ ID NO.7～8所示的扩增Pro区的引物组；
如SEQ ID NO.9～10所示的扩增RT区的引物组；和
如SEQ ID NO.11～12所示的扩增Int区的引物组。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，先使用所述第一检测组合物进行第一轮PCR扩增，再使用所述第二检测组合物进行第二轮PCR的扩增。
3.如权利要求1或2所述的组合物用于制备检测HIV耐药的试剂盒中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂盒是用于检测针对HIV的劣势耐药毒株或者HIV耐药基因变异的试剂盒。
5.一种结合NGS检测HIV耐药性的试剂盒，包括如权利要求1或2所述的组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下中至少一种：逆转录酶、DNA聚合酶、dNTP、缓冲液，和Mg2+。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组：逆转录酶：DNA聚合酶的比例为10:3:20。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下中至少一种：DNA片段化试剂、末端修复试剂、连接酶、磁珠混液。
9.一种以非诊断目的结合NGS检测HIV耐药性的方法，包括：
1)提取或释放待测样本的RNA；
2)使用如权利要求1或2所述的组合物的第一检测组合物进行第一轮扩增，获得第一轮扩增产物；
3)处理所述第一轮扩增产物，使用如权利要求1或2所述的组合物的第二检测组合物对第一轮扩增产物进行第二轮扩增，获得第二轮扩增产物；
4)处理所述第二轮扩增产物并建库；以及
5)测序并分析结果。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤4)包括打断和文库扩增。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310400821.3A CN118086582A (zh) | 2023-04-14 | 2023-04-14 | 基于ngs的hiv耐药基因检测的组合物、方法及其用途 |
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|---|---|---|---|
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| CN118086582A true CN118086582A (zh) | 2024-05-28 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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2023
- 2023-04-14 CN CN202310400821.3A patent/CN118086582A/zh active Pending
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