CN116426688A - 检测hiv-1 rna蛋白酶和逆转录酶区域耐药突变的引物组及方法 - Google Patents

检测hiv-1 rna蛋白酶和逆转录酶区域耐药突变的引物组及方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了检测HIV‑1RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药位点突变的引物组及方法，该检测方法通过优化耐药反应体系、扩增程序及引物序列，可应用于HIV‑1RNA包括低浓度HIV‑1RNA时的蛋白酶和逆转录酶耐药检测，检测方法可以血清、血浆、精液、尿液、脑脊液等人体体液做为样本，采用特定引物组，通过巢式PCR方法扩增HIV‑1蛋白酶和逆转录酶区域序列，并通过Sanger测序方法测定扩增序列，分析耐药相关基因突变，使HIV‑1RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药检测效率得到了大幅的提高，利用基因型耐药解释系统判断是否对特定药物产生耐药以及耐药的程度，从而为患者制定一线抗病毒治疗、二线治疗方案、暴露前/后预防用药方案和制定减少耐药发生的措施等提供参考依据。

Description

检测HIV-1 RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药突变的引物组及 方法
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，尤其涉及用于HIV-1 RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药位点突变的引物组、利用该引物组检测HIV-1 RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药位点突变的方法及包含该引物组的HIV-1 RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药位点突变检测试剂盒。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus，HIV)感染是人类患艾滋病(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)的元凶。据估计，2020年全球感染HIV约有3770万人，死亡人数为68万人，且每年约有150万新发感染者。由于其传播速度快，暂无治愈的药物及其造成严重的后果而得到世界的广泛关注。
高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antiroviral Therapy，HAART)也称为联合抗逆转录病毒治疗(cART)是目前FDA批准的唯一抗逆转录病毒疗法，也是联合应用三种或三种以上抗逆病毒药物来治疗获得性免疫缺陷综合征的方法，这种方法可有效抑制HIV复制使病毒载量下降，使被破坏的机体免疫功能获得恢复或部分恢复。国内治疗HIV感染的高效抗逆转录病毒疗法主要是由核苷类逆转录酶制剂(nucleoside reversetranscriptase inhibitors，NRTIs)、非核苷类逆转录酶抑制剂(non-nucleoside reversetranscriptase inhibitors，NNRTIs)和蛋白酶抑制剂(protease inhibitors，PIs)这三类药物联合使用治疗，其中NRTIs在细胞内磷酸化后生成活性代谢产物，可通过竞争性抑制天然核苷与HIV逆转录酶结合，阻碍HIV cDNA生成，从而抑制HIV复制；NNRTIs可通过非竞争性与HIV逆转录酶结合，阻碍病毒复制，从而产生抗病毒作用；PIs可竞争性阻断HIV蛋白酶与其天然底物的结合，抑制HIV后期复制。
而自HAART应用以来，其虽然改善了艾滋病感染者的生存状况，但是仍有20～30％患者会发生低病毒血症(low-level viermia,LLV)。低病毒血症患者与已实现病毒学抑制的患者相比，其发生病毒学失败、免疫重建不良、耐药等风险增加。常规的耐药检测中当病毒载量＞1000copies/mL时，其成功率约为90％左右，因此临床医生认为只有当患者体内病毒载量超过1000copies/mL时，才进行HIV-1 RNA耐药检测，但由于高效抗逆转病毒药物的使用，这部分患者在临床上占比较低。而50～1000copies/mL的低病毒载量患者在临床占30％左右，已有研究表明LLV的发生与HIV-1耐药有关。
因此，为满足市场需求，亟需开发一种用于检测RNA低浓度蛋白酶和逆转录酶区域耐药突变检测方法。
发明内容
针对现有技术的问题，本申请提供了一种检测HIV-1 RNA蛋白酶及逆转录酶区域耐药检测的方法，所述检测方法可应用于HIV-1 RNA所有浓度包括低浓度蛋白酶及逆转录酶耐药检测，所述检测方法以血清、血浆、精液、尿液、脑脊液等人体体液做为样本，采用PCR及Sanger测序方法测定HIV-1 RNA蛋白酶及逆转录酶区域的基因片段序列，将获得的相关基因片段序列，通过与野生型的基因序列和耐药毒株的序列信息进行比较，分析耐药相关基因突变，利用基因型耐药解释系统判断是否耐药以及耐药的程度，可为患者制定一线抗病毒治疗、二线治疗方案、暴露前/后预防用药方案和制定减少耐药发生的措施等提供参考依据。
第一方面，本申请提供了一种用于扩增HIV-1 RNA蛋白酶和逆转录酶区域的引物组，所述引物组包括：
第一引物组，所述第一引物组包括第一组上游引物和第一组下游引物，所述第一组上游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：1～27的引物中的至少一种；所述第一组下游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：28～55的引物中的至少一种；以及第二引物组，所述第二引物组包括第二组上游引物和第二组下游引物，所述第二组上游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：56～80的引物中的至少一种；所述第二组下游引物包括核苷酸序列为SEQ IDNO：81～110的引物中的至少一种。
进一步地，所述引物组的引物序列中，A代表腺嘌呤、G代表鸟嘌呤、C代表胞嘧啶、T代表胸腺嘧啶；字母H/R/Y代表简并(混合)碱基；其中，H代表A+T+C，R代表A+G，Y代表C+T。
进一步地，所述第一组上游引物中包括H、R两种简并碱基；所述第一组下游引物中包括R、Y两种简并碱基；所述第二组上游引物包括R、Y两种简并碱基；所述第二组下游引物包括Y、R两种简并碱基。
第二方面，本申请提供了一种测序引物组，所述测序引物组用于对HIV-1蛋白酶和逆转录酶区域基因扩增产物进行测序，所述扩增产物为第一方面所述引物组PCR扩增获得；所述测序引物组包括核苷酸序列为SEQ ID NO：111～134的引物中的至少四种，所述测序引物组包括正向测序引物和反向测序引物。
进一步地，所述测序引物序列中，A代表腺嘌呤、G代表鸟嘌呤、C代表胞嘧啶、T代表胸腺嘧啶；字母R/Y代表简并碱基；其中，R代表A+G；Y代表C+T。
第三方面，本申请提供了一种试剂盒，用于检测HIV-1 RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药位点突变，所述试剂盒包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、第一方面所述引物组和/或第二方面所述测序引物组。
第四方面，本申请提供了一种HIV-1 RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药位点突变的检测方法，所述检测方法包括：
提取待检样品总RNA，并将RNA逆转录成cDNA；
以cDNA为模板，利用第一方面所述引物组进行巢式PCR扩增，获得巢式PCR扩增产物；
对所述巢式PCR扩增产物进行电泳(如琼脂糖凝胶电泳)分析；
对所述巢式PCR扩增产物纯化后进行测序实验；以及
将测序结果进行分析，获得HIV-1 RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药突变结果。
进一步地，所述巢式PCR扩增包括：
第一轮PCR扩增，所述第一轮PCR扩增用的引物为前述第一引物组；
第二轮PCR扩增，所述第二轮PCR扩增用的引物为前述第二引物组。
进一步地，对扩增产物进行测序所采用的引物为第二方面所述测序引物组。
进一步地，所述PCR扩增的体系包括：
第一轮PCR扩增体系，反应体积以50μL计算，具体为：
Mg2+5～15μL(储液浓度：25mM)，5×buffer 5～15μL，上、下游引物各0.5～1.5μL(储液浓度：20μM)，dNTP 0.5～1μL(储液浓度：100mM)，RNA核酸样本5～25μL，逆转录酶0.1～0.3μL(储液浓度：160U/uL)，Taq酶0.5～1μL(储液浓度：5U/uL)，Rnase抑制剂0.3～0.7μL(储液浓度：40U/uL)，使用ddH2O将反应体系的体积补充至50μL；
所述第二轮PCR扩增的体系，反应体积以50μL计算，具体为：
Mg2+5～15μL(储液浓度：25mM)，5×buffer 5～15μL，上、下游引物各0.5～1.5μL(储液浓度：20μM)，dNTP 0.5～1μL(储液浓度：100mM)，第一轮PCR扩增的核酸产物5～15μL，Taq酶0.5～1μL(储液浓度：5U/uL)，使用ddH2O将反应体系的体积补充至50μL。
进一步地，所述PCR扩增的程序包括第一轮PCR扩增程序和第二轮PCR扩增程序；其中，
所述第一轮PCR扩增的程序包括：
50℃逆转录40～50min；93～96℃预变性1～3min；93～96℃变性20～35s、45～55℃退火25～35s、70～75℃延伸1～3min，共25～40个循环；70～75℃再延伸5～10min，4℃保存；
所述第二轮PCR扩增的程序包括：
93～96℃预变性3～5min；93～96℃变性10～20s、50～60℃退火15～30s、70～75℃延伸1～3min，共30～45个循环；70～75℃再延伸5～10min，4℃保存。
进一步地，对巢式PCR扩增产物进行测序过程中，采用引物为第二方面所述测序引物组。
进一步地，将测序结果进行分析的步骤包括：
打开Sequencher 5.4.6序列拼接软件，导入原始序列文件；对原始序列进行修剪；获得待分析序列；
导入参考序列模板，设置参考序列；
选中待分析序列和参考序列，进行比对分析；
显示峰图和次级峰图，比对分析，确定简并碱基；
耐药位点比对分析，采用Sequencher 5.4.6序列拼接软件获得拼接序列，所述拼接序列根据测序结果拼接而成，可反应原始碱基序列；导出拼接序列并保存；
打开HIV DRUG RESISTANCE DATABASE耐药分析网站(https://hivdb.stanford.edu/hivdb/by-patterns/)，导入拼接序列进行耐药性分析。
第五方面，本申请提供了第一方面所述引物组、第二方面所述测序引物组、第三方面所述试剂盒和/或第四方面所述检测方法在检测HIV-1RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药位点突变中的应用。
与现有技术相比，本申请采用上述技术方案，至少具有如下技术效果：
1.目前，当VL≥1000copies/mL时，HIV-1 RNA蛋白酶及逆转录酶区的耐药检测成功率较高；而VL低于1000copies/mL时，HIV-1病毒基因的扩增失败率较高，导致部分患者HIV耐药浓度过低时检测不到或直接忽视，从而导致临床医生无法及时对这部分患者病情进行有效抑制和以及其治疗方案的及时更改。这也是现在患者迫切想了解的问题。
2.本申请通过优化耐药反应体系、扩增程序及引物序列等，使HIV-1RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药检测效率得到了大幅的提高，不仅让VL≥500copies/mL的患者HIV-1RNA蛋白酶及逆转录区域耐药检测达到稳定状态，当检测VL<500copies/mL的低病载HIV-1RNA蛋白酶及逆转录酶区域耐药时，检测的成功率随病毒载量的升高而增大。。
附图说明
图1为本申请实施例提供的HIV-1蛋白酶及逆转录酶酶区耐药检测成功的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果；其中待测核酸为RNA。
图2为本申请实施例提供的耐药位点的信息图，即HIV-1 RNA的耐药位点突变位点及扩增产物所在区域示意图，由图可知该条序列在各自酶区的突变情况；例如：K20R代表蛋白酶区的第20号氨基酸处发生突变，氨基酸由K变为R，以此类推可从图中获取该区域全部碱基的突变情况。
图3为本申请实施例提供的进化树分析图，其中图中加粗部分为不同亚型的标准序列，检测样本以数字命名，通过使用进化树模型进行对未知样本的亚型分析。
具体实施方式
具体实施方式：下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。应理解，举出
以下实施例是为了向本申请所属技术领域的一般专业人员就如何利用本申请之方法和组合物提供一个完整的公开和说明，并非用于限制本申请的范围。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
第一方面，本申请提供了一种用于扩增HIV-1蛋白酶和逆转录酶区域的引物组。在本申请实施例中，所述引物组包括：第一引物组，所述第一引组包括第一组上游引物和第一组下游引物，所述第一组上游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：1～27的引物中的至少一种；所述第一组下游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：28～55的引物中的至少一种；以及第二引物组，所述第二引物组包括第二组上游引物和第二组下游引物，所述第二组上游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：56～80的引物中的至少一种；所述第二组下游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：81～110的引物中的至少一种。在本申请实施例中，第一组上游引物、第一组下游引物、第二组上游引物、第二组下游引物中均至少选择其中一条即可达到扩增HIV-1蛋白酶和逆转录酶区域的目的，进一步用于检测HIV-1蛋白酶和逆转录酶区域耐药的目的。
在本申请实施例中，所述引物组的引物序列中，A代表腺嘌呤、G代表鸟嘌呤、C代表胞嘧啶、T代表胸腺嘧啶；字母H/R/Y代表简并碱基；“简并碱基”是指该位置是有两种或三种或四种碱基混合存在，其可对于某指定位置发生突变的序列捕捉到并进行扩增；其中，H代表A+C+T，R代表A+G，Y代表C+T。
在本申请实施例中，所述引物组中的某些引物存在上述简并碱基的至少一个简并碱基，其中所述第一组上游引物中包括H、R两种简并碱基，如SEQ ID NO：1存在H，SEQ IDNO：7存在R，SEQ ID NO：12中存在R等；所述第一组下游引物中包括R、Y两种简并碱基，如SEQID NO：33存在R，SEQ ID NO：44存在Y；所述第二组上游引物包括R、Y两种简并碱基，如SEQID NO：56、75均存在R，SEQ ID NO：65、69均存在Y；所述第二组下游引物包括Y、R两种简并碱基，如SEQ ID NO：81、82、102均存在R，SEQ ID NO：84、86、95存在Y。
在某些实施例中，所述用于扩增HIV-1蛋白酶和逆转录酶区域的引物组中的第一组上游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：1～27的引物中的至少N种，其中，N为2～27中的任一自然数；所述引物组第一组下游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：27～55的引物中的至少W种，其中，W为2～29中的任一自然数；所述引物组第二组上游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：56～80的引物中的至少T种，其中，T为2～25的任一自然数；所述引物组第二组下游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：81～110的引物中的至少Q种，其中，Q为2～30中的任一自然数。
优选的实施例中，所述用于扩增HIV-1蛋白酶和逆转录酶区域的引物组中的第一组上游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：1～27的全部引物；所述引物组第一组下游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：28～55的全部引物；所述引物组第二组上游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：56～80的全部引物；所述引物组第二组下游引物包括核苷酸序列为SEQID NO：81～110的全部引物。
第二方面，本申请提供了一种测序引物组。
本申请实施例中，所述测序引物组用于对HIV-1蛋白酶和逆转录酶区域基因扩增产物进行测序，所述扩增产物为前述引物组PCR扩增获得；所述测序引物组包括核苷酸序列为SEQ ID NO：111～134的引物中的至少四种，所述测序引物组包括正向测序引物和反向测序引物。
在本申请实施例中，所述测序引物序列中，A代表腺嘌呤、G代表鸟嘌呤、C代表胞嘧啶、T代表胸腺嘧啶；字母R/Y代表简并碱基；其中，R代表A+G；Y代表C+T。
在本申请实施例中，所述测序引物中，某些序列中存在R，如SEQ IDNO：112中存在R；某些序列中存在Y，如SEQ ID NO：120存在Y。
在某些实施例中，所述测序引物组包括核苷酸序列为SEQ ID NO：111～134的引物中的至少S种，其中S为5～24中的任一自然数。
优选的实施例中，所述测序引物组包括核苷酸序列为SEQ ID NO：111～134的引物中的全部24种引物。
第三方面，本申请提供了一种用于检测HIV-1 RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药位点突变的试剂盒，所述试剂盒包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、第一方面所述引物组和/或第二方面所述测序引物组。
进一步，所述试剂盒是用于检测HIV-1 RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药位点突变的核酸样品为RNA。
第四方面，本申请提供了一种HIV-1 RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药突变的检测方法。
本申请实施例中，所述检测方法包括：提取待检样品核酸；利用前述引物组对前获得核酸进行巢式PCR扩增；对巢式PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；对巢式PCR扩增产物进行测序；以及将测序结果进行分析，获得HIV-1 RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药突变结果。
本申请实施例中，若待检样品核酸为DNA,则直接以提取的DNA为模板进行PCR扩增；若待检样品核酸为RNA时，则前述方法中还包括将RNA逆转录为cDNA的步骤，并以cDNA为模板进行扩增。
本申请实施例中，所述巢式PCR扩增包括：第一轮PCR扩增，所述第一轮PCR扩增用的引物为前述第一引物组；以及第二轮PCR扩增，所述第二轮PCR扩增用的引物为前述第二引物组。
本申请实施例中，所述PCR扩增的体系包括：第一轮PCR扩增体系，反应体积以50μL计算，具体为：Mg2+5～15μL(储液浓度：25mM)，5×buffer5～15μL，上、下游引物各0.5～1.5μL(储液浓度：20μM)，dNTP 0.5～1μL(储液浓度：100mM)，RNA核酸样本5～25μL，逆转录酶0.1～0.3μL(储液浓度：160U/uL)，Taq酶0.5～1μL(储液浓度：5U/uL)，Rnase抑制剂0.3～0.7μL(储液浓度：40U/uL)，使用ddH2O将反应体系的体积补充至50μL；所述第二轮PCR扩增的体系，反应体积以50μL计算，具体为：Mg2+5～15μL(储液浓度：25mM)，5×buffer 5～15μL，上、下游引物各0.5～1.5μL(储液浓度：20μM)，dNTP 0.5～1μL(储液浓度：100mM)，第一轮PCR扩增的核酸产物5～15μL，Taq酶0.5～1μL(储液浓度：5U/uL)，使用ddH2O将反应体系的体积补充至50μL。
本申请实施例中，所述PCR扩增的程序包括第一轮PCR扩增程序和第二轮PCR扩增程序；其中，所述第一轮PCR扩增程序包括：RNA扩增程序，具体为：50℃逆转录40～50min；93～96℃预变性1～3min；93～96℃变性20～35s、45～55℃退火25～35s、70～75℃延伸1～3min，共25～40个循环；70～75℃再延伸5～10min，4℃保存；所述第二轮PCR扩增的程序包括：93～96℃预变性3～5min；93～96℃变性10～20s、50～60℃退火15～30s、70～75℃延伸1～3min，共30～45个循环；70～75℃再延伸5～10min，4℃保存。
本申请实施例中，对巢式PCR扩增产物进行测序过程中，采用前述测序引物组。
在某些优选的实施例中，所选用的用于扩增HIV-1蛋白酶和逆转录酶区域的引物组中的第一组上游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：1～27的全部引物；所述引物组第一组下游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：28～55的全部引物；所述引物组第二组上游引物包括核苷酸序列为SEQ IDNO：56～80的全部引物；所述引物组第二组下游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：81～110的全部引物；所选用的测序引物组包括核苷酸序列为SEQ IDNO：111～134的引物中的全部24种引物；所选用的检测方法应用于HIV-1 RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药突变检测的具体过程如下：
1、核酸提取：
本方法需先在血清、血浆、精液、尿液或脑脊液中抽提出RNA，并检测抽提出的HIV-1 RNA核酸浓度。
(1)RNA核酸提取(13例样本)
取300μL血清/血浆样品中加入800μL的裂解液，振荡混匀30s，常温孵育10min；加入异丙醇300μL，上下颠倒混匀30s，室温放置2min；瞬时离心，按710μL转移至离心吸附柱中，10000rpm离心1min；丢弃2mL收集管，将离心吸附柱转移至新的2mL收集管，重复2次，直至所有样本都转移至离心吸附柱中；丢弃2mL收集管，将离心吸附柱转移至新的2mL收集管，加入500μL洗涤液1，10000rpm离心1min；丢弃2mL收集管，将离心吸附柱转移至新的2mL收集管，加入500μL洗涤液2，14000rpm离心3min；丢弃2mL收集管，将离心吸附柱转移至新的2mL收集管，14000rpm离心1min；丢弃2mL收集管，将离心吸附柱转移至新的1.5mL EP管，开盖放置2min，加入60μL的洗脱液(TE)，放置2min，10000rpm离心1min，收集1.5mL EP管即为所提取的核酸样本，提取的核酸样本放置-80℃保存，避免反复冷冻。
使用HIV-1 RNA实时荧光定量PCR法进行浓度定量检测，结果如表1所示：
表1
Figure BDA0004086388670000121
从表中可以看出，选择的样本既有HIV-1 RNA较高的，也有低于1000copies/mL的，现有的国家指南中指出＞1000copies/mL的样本的耐药成功率在85％左右。
2、第一轮核酸PCR扩增：
(1)反应体系配制：Mg2+10μL(储液浓度：25mM)，5×buffer 10μL，上、下游引物各1.25μL(储液浓度：20μM)，所述引物有55个，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～55所示，dNTP 1μL(储液浓度：100mM)，逆转录酶0.125μL(储液浓度：160U/uL)，Taq酶0.8μL(储液浓度：5U/uL)，Rnase抑制剂0.5μL(储液浓度：40U/uL)，使用ddH2O将反应体系的体积补充至30μL(如样本的核酸类型为DNA时则不需加入Rnase抑制剂及逆转录酶，体积用ddH2O补足)；
(2)根据单人份反应液体系计算出本次实验所需用量(损耗值需计算在内)，并按每孔30μL分装到PCR八联排中；
(3)加入提取纯化后的核酸样本20μL，做好命名标记，涡旋震荡30s，快速离心；
(4)PCR扩增：将八联排放入仪器后，选择以下PCR扩增程序：
50℃逆转录45min；94℃预变性2min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环；72℃再延伸10min，4℃保存；
实验运行时间约为3h。
3、第二轮核酸PCR扩增：
(1)反应体系配制：Mg2+10μL(储液浓度：25mM)，5×buffer 10μL，上、下游引物各1.25μL(储液浓度：20μM)，所述引物有55个，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：56～110所示，dNTP 1μL(储液浓度：100mM)，Taq酶0.8μL(储液浓度：5U/uL)，使用ddH2O将反应体系的体积补充至40μL；
(2)根据单人份反应液体系计算出本次实验所需用量(损耗值需计算在内)，并按每孔40μL分装到PCR八联排中；
(3)加入提取纯化后的核酸样本10μL，做好命名标记，涡旋震荡30s，快速离心；
(4)PCR扩增：将八联排放入仪器后，选择如下PCR扩增程序：
94℃预变性4min，94℃变性15s、55℃退火20s、72℃延伸2min，37个循环；72℃再延伸10min，4℃保存；
实验运行时间约为3h。
4、琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物：
TAE稀释：10mL(50×TAE)+490mL纯水，得到1×TAE；配制2％琼脂糖，具体情况根据配制的胶大小计算；微波炉溶解；琼脂糖溶液室温冷却至65℃左右，加入核酸染料，摇匀后倒入电泳槽内冷却成胶；待胶凝固后；将胶转移到电泳槽中上样：样本量为10μL，中间加2kb的marker；进行琼脂糖凝胶电泳、电泳结束后进行上机拍摄保存图片；将有目的条带的样本在表上标记好。
琼脂糖凝胶电泳分析结果：如图1所示，目的条带在1000～2000bp之间，出现条带代表着扩增成功，即可做后续的耐药检测。检测结果如表2所示，HIV-1 RNA样本浓度大于500copies/mL时，检出率皆为100％，以及其在各个浓度范围内的成功率皆远高于现有技术。
表2
Figure BDA0004086388670000141
5、PCR扩增产物进行测序及分析：
(1)PCR扩增产物进行测序：将上述PCR扩增的目的条带切下，进行纯化；
使用ND8000测值仪器进行测定回收产物的浓度值，通过换算决定后续测序反应的上样量；根据浓度计算加入水、甜菜碱、引物、模板、BDT的体积后，转速：1200rpm，离心30s，进行BDT反应；
BDT反应实验结束后，需要用磁珠把样品吸附，把其余多余的未参与反应的成分使用85％的酒精洗脱掉，最后加无菌水，上测序仪，进行测序反应；测序引物核苷酸序列如SEQID NO：111～134所示。
(2)测序后数据分析：
打开Sequencher 5.4.6序列拼接软件，点击File→import→Folder ofsequences选择要导入测序产生的所有原始文件，进行序列的比对；使其显示峰图，按照耐药位点进行比对，看其是否发生基因突变；完成后保存项目并将拼接好的序列导出到指定文件夹中；打开HIV DRUG RESISTANCE DATABASE耐药分析网站，分析序列的突变情况，由此计算出耐药位点的信息以及药物的耐药程度，如图2所示。
本方法在测序后的数据处理上与现有技术有所不同，在处理过程中首先会去掉测序背景杂峰较多，碱基识读不清等质量比较差的序列头和尾部，其次对某位点出现简并碱基的定义为：次级峰的高度是主峰高度的30％以上才会认定为该位点存在简并情况。
亚型分析：
将拼接后的序列以进化树的方式进行亚型判断，如图3所示，本方法目前可完成B、C、D、CRF01_AE、A1、G、CPZ、CRF02_AG、CRF37_CPX、CRF03_AB、CRF36_06A1、CRF07_BC、CRF08_BC、CRF71_BF1、CRF12_BF、F1、CRF21_A2D、CRF50_A1D、CRF55_01B、CRF05_DF、CRF44_BF、CRF49_CPX、CRF78_CPX、CRF96_CPX、CRF06_CPX、CRF09_CPX、CRF11_CPX、CRF13_CPX、CRF14_BG、CRF15_01B、CRF16_A2D、CRF18_CPX、CRF19_CPX、CRF20_BG、CRF04_CPX、CRF22_01A1、CRF23_BG、CRF24_BG、CRF25_CPX、CRF26_A5U、CRF27_CPX、CRF29_BF1、CRF31_BC、CRF33_01B、CRF34_01B、CRF35_A1D、CRF36_CPX、CRF37_CPX、CRF38_BF1、CRF39_BF1、CRF40_BF1、CRF43_02G、CRF47_BF1、CRF48_01B、CRF51_01B、CRF53_01B、CRF54_01B、CRF56_CPX、CRF57_BC、CRF58_01B、CRF59_01B、CRF61_BC、CRF62_BC、CRF64_BC、CRF65_CPX、CRF69_01B、CRF70_BF1、CRF72_BF1、CRF73_BG、CRF74_01B、CRF77_CPX、CRF79_0107、CRF82_CPX、CRF83_CPX、CRF85_BC、CRF86_BC、CRF90_BF1、O亚型等多种HIV-1亚型的耐药检测。
6、检测结果与分析
图2为本申请实施例提供的耐药位点的信息图，即为HIV-1 RNA的耐药位点突变位点及扩增产物所在区域示意图，由图可知该条序列在各自酶区的突变情况。例如：K20R代表蛋白酶区的第20号氨基酸处发生突变，氨基酸由K变为R，以此类推可从图中获取该区域全部碱基的突变情况。
图3为本申请实施例提供的进化树分析图，即为以HIV-1 RNA为样本类型进行的进化树分析图。图中加粗部分为不同亚型的标准序列，检测样本以数字命名，通过使用进化树模型进行对未知样本的亚型分析。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种用于扩增HIV-1RNA蛋白酶和逆转录酶区域的引物组，其特征在于，所述引物组包括：
第一引物组，所述第一引物组包括第一组上游引物和第一组下游引物，所述第一组上游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：1～27的引物中的至少一种；所述第一组下游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：28～55的引物中的至少一种；以及
第二引物组，所述第二引物组包括第二组上游引物和第二组下游引物，所述第二组上游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：56～80的引物中的至少一种；所述第二组下游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：81～110的引物中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述第一组上游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：1～27的引物中的至少N种，其中，N为2～27中的任一自然数；所述引物组第一组下游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：28～55的引物中的至少W种，其中，W为2～28中的任一自然数；所述引物组第二组上游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：56～80的引物中的至少T种，其中，T为2～25中的任一自然数；所述引物组第二组下游引物包括核苷酸序列为SEQID NO：81～110的引物中的至少Q种，其中，Q为2～30中的任一自然数。
3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述第一组上游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：1～27的全部引物；所述第一组下游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：28～55的全部引物；所述第二组上游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：56～80的全部引物；所述第二组下游引物包括核苷酸序列为SEQ ID NO：81～110的全部引物。
4.一种测序引物组，其特征在于，所述测序引物组用于对HIV-1蛋白酶和逆转录酶区域基因扩增产物进行测序，所述扩增产物为通过权利要求1所述引物组PCR扩增获得；所述测序引物组包括核苷酸序列为SEQ ID NO：111～134的引物中的至少四种，所述测序引物组包括正向测序引物和反向测序引物。
5.一种检测HIV-1RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药位点突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、权利要求1～3任一项所述所述引物组和/或权利要求4所述测序引物组。
6.一种HIV-1RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药位点突变的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
提取待检样品RNA，并将RNA逆转录成cDNA；
以cDNA为模板，利用权利要求1～3任一项所述引物组进行巢式PCR扩增，获得巢式PCR扩增产物；
对所述巢式PCR扩增产物进行电泳分析，确认目的条带；
对所述巢式PCR扩增产物纯化后进行测序实验，所采用的测序引物为权利要求4所述测序引物组；以及
将测序结果进行分析，获得HIV-1RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药突变结果。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述巢式PCR扩增包括：
第一轮PCR扩增，所述第一轮PCR扩增用的引物为权利要求1中所述引物组中的第一引物组；
第二轮PCR扩增，所述第二轮PCR扩增用的引物为权利要求1中所述引物组中的第二引物组。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增的体系，反应体积以50μL计算，具体为：
Mg2+5～15μL，5×buffer5～15μL，上、下游引物各0.5～1.5μL，dNTP0.5～1μL，RNA核酸样本5～25μL，逆转录酶0.1～0.3μL，Taq酶0.5～1μL，Rnase抑制剂0.3～0.7μL，使用ddH2O将反应体系的体积补充至50μL；
所述第二轮PCR扩增的体系，反应体积以50μL计算，具体为：
Mg2+5～15μL，5×buffer5～15μL，上、下游引物各0.5～1.5μL，dNTP0.5～1μL，第一轮PCR扩增的核酸产物5～15μL，Taq酶0.5～1μL，使用ddH2O将反应体系的体积补充至50μL。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增的程序包括：
50℃逆转录40～50min；93～96℃预变性1～3min；93～96℃变性20～35s、45～55℃退火25～35s、70～75℃延伸1～3min，共25～40个循环；70～75℃再延伸5～10min，4℃保存；
所述第二轮PCR扩增的程序包括：
93～96℃预变性3～5min；93～96℃变性10～20s、50～60℃退火15～30s、70～75℃延伸1～3min，共30～45个循环；70～75℃再延伸5～10min，4℃保存。
10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，对巢式PCR扩增产物进行测序过程中，采用的测序引物为权利要求4所述测序引物组。
11.权利要求1～3任一项所述引物组、权利要求4所述测序引物组、权利要求5所述试剂盒和/或权利要求6～10任一项所述检测方法在检测HIV-1RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药位点突变中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，在检测HIV-1RNA蛋白酶和逆转录酶区域耐药位点突变中所选用的样本类型为血清、血浆、精液、尿液、脑脊液等人体体液中的任一种，其提取的核酸种类为RNA。
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