CN118086583A

CN118086583A - 基于ngs的hiv耐药基因检测的组合物、试剂盒，及其用途

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Publication number: CN118086583A
Application number: CN202310479174.XA
Authority: CN
Inventors: 丁峰; 刘让蛟; 陆馨岚; 李赛; 欧阳凯; 许汶
Original assignee: Hunan Shengweier Medical Inspection Co ltd
Current assignee: Hunan Shengweier Medical Inspection Co ltd
Priority date: 2023-04-28
Filing date: 2023-04-28
Publication date: 2024-05-28

Abstract

本发明属于生物检测领域，具体地，涉及HIV耐药性基因检测，更具体地，涉及基于NGS的HIV耐药性基因检测。本发明提供了一种结合NGS检测HIV耐药性的组合物，包括第一检测组合物和第二检测组合物。使用本发明的检测组合物，通过检测DNA，能够同时检测出HIV的蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、整合酶抑制剂三类药物的耐药性，操作更为简便，成本更低，并且灵敏度高，能揭示潜在地可能形成病毒的耐药情况。

Description

基于NGS的HIV耐药基因检测的组合物、试剂盒，及其用途

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体地，涉及HIV耐药基因检测，更具体地，涉及基于NGS的HIV耐药性基因检测。

背景技术

获得性免疫缺陷综合症是由两种逆转录病毒HIV-1或HIV-2感染引起。HIV-1在全球造成了大规模感染，而HIV-2的侵染则局限在西非地区，全球其他区域有零星分布。HIV病毒是一种传染性逆转录病毒，可感染人体免疫细胞，导致免疫下降。它主要攻击免疫系统中最重要的CD4+T淋巴细胞，使人体易于感染多种疾病，并可引发恶性肿瘤，病死率较高。艾滋病临床表现没有特异性，感染初期，很多患者无明显症状，感染2～4周，有些患者会出现发烧、皮疹、咽喉痛、淋巴结肿大、疲倦及各种更少见的症状。HIV通过与含有病毒的体液(如血液、精液或阴道液)或被病毒感染的细胞密切接触传播。

在全球范围内普遍流行的HIV-1型可分为M(Main)、N(Non-M-Non-O)、O(Outlier)和P 4个组，其中最主要的M组可以分为A、B、C、D、F、G、H、J和K亚型，N、O和P组毒株主要局限在中非，且流行率较低。该分类系统并不是静态的，近年来还报道了许多广泛流行的重组亚型(CRFs)。HIV-2主要局限于非洲地区，至少有A-G 7种亚型。

国家十部委联合下发的《遏制艾滋病传播实施方案(2019—2022年)》将三个90％作为艾滋病防治的具体指标，在艾滋病治疗过程中的耐药性检测精确性对治疗有着重要的指示作用。中国的人口基数大，患者量大，在耐药检测需求不断提高，有更多的临床需求提出。

HIV-1DNA库的大小可预测临床结果和疾病进展，启动ART治疗与HIV DNA含量有关，其含量可能是ART减少或中断的标准，同时不同型别的毒株与HIV DNA含量有一定关系。那么在治疗前进行DNA耐药的检测对初次用药的安全性有极大的帮助；在治疗中低病毒血症(HIV患者在接受治疗后，血液中HIV病毒载量得到一定控制，但未完全控制的情况，一般表现为载量处于50～200copies/mL，这种情况经常被临床医生提及，是一种治疗过程中的疑难情况)情况下，进行DNA耐药检测，对病毒的RNA及DNA情况有更好的判断，可大大避免临床医生治疗用药的盲目性；在病毒控制情况良好时，进行DNA耐药检测，对潜在的病毒DNA库进行检测，可预测病毒发展趋势，规避用药；在治疗过程中，需根据病毒载量情况定期进行HIV RNA耐药检测，如有异常可补充DNA耐药检测。总之，RNA耐药检测更能反映已确切存在的病毒耐药情况，而DNA耐药情况更能揭示潜在地可能形成病毒的耐药情况。

因此，本领域需求一种HIV DNA耐药性检测产品，其能够广谱的检测多种类型的耐药，例如，蛋白酶、逆转录酶、整合酶等靶点的耐药性，并且灵敏度高，能揭示潜在地可能形成病毒的耐药情况。

发明内容

有鉴于此，第一方面，本发明提供一种结合NGS检测HIV耐药性的组合物，包括第一组合物，其中，

所述第一组合物包括第一检测组合物和第二检测组合物，其中，

第一检测组合物：

如SEQ ID NO.1～2所示的扩增Pro区的引物组；

如SEQ ID NO.3～4所示的扩增RT区的引物组；和

如SEQ ID NO.5～6所示的扩增Int区的引物组；

第二检测组合物：

如SEQ ID NO.7～8所示的扩增Pro区的引物组；

如SEQ ID NO.9～10所示的扩增RT区的引物组；和

如SEQ ID NO.11～12所示的扩增Int区的引物组。

使用本发明的检测组合物，能够同时检测出HIV的蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、整合酶抑制剂三类药物的耐药性，操作更为简便，成本更低，并且灵敏度高，能揭示潜在地可能形成病毒的耐药情况。

进一步地，本发明所述组合物先使用第一检测组合物进行第一轮PCR扩增，再使用第二检测组合物进行第二轮PCR的扩增。

进一步地，本发明所述组合物还包括第二组合物，所述第二组合物为通过HIV RNA进行耐药检测。

通过在HIV携带者的不同时期因其体内病毒存在形式不同，检测其不同的靶标(即DNA和RNA)，能够形成完整的耐药分析，为HIV携带者的用药提供了更为精确的指导意义。

进一步地，所述第二组合物包括第三检测组合物和第四检测组合物，其中，

第三检测组合物：

如SEQ ID NO.13～14所示的扩增Pro区的引物组；

如SEQ ID NO.15～16所示的扩增RT区的引物组；和

如SEQ ID NO.17～18所示的扩增Int区的引物组；

第四检测组合物：

如SEQ ID NO.19～20所示的扩增Pro区的引物组；

如SEQ ID NO.21～22所示的扩增RT区的引物组；和

如SEQ ID NO.23～24所示的扩增Int区的引物组。

第二方面，本发明提供一种上述组合物用于制备检测HIV耐药的试剂盒中的用途。

进一步地，制备用于检测针对HIV的劣势耐药毒株的试剂盒。

进一步地，制备用于检测HIV耐药基因变异的试剂盒。

第三方面，本发明提供一种结合NGS检测HIV耐药性的试剂盒，包括上述组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括如下中至少一种：DNA聚合酶、dNTP、缓冲液，和Mg²⁺。

更进一步地，所述引物组：DNA聚合酶的比例为5:20。

进一步地，所述试剂盒还包括如下中至少一种：DNA片段化试剂、末端修复试剂、连接酶、磁珠混液。

第四方面，本发明提供一种以非诊断目的结合NGS检测HIV耐药性的方法，包括：

1)提取或释放待测样本的核酸；

2)使用如上所述的第一检测组合物进行第一轮扩增，获得第一轮扩增产物；

3)处理所述第一轮扩增产物，使用如上所述的第二检测组合物对第一轮扩增产物进行第二轮扩增，获得第二轮扩增产物；

4)处理所述第二轮扩增产物并建库；以及

5)测序并分析结果。

进一步地，所述核酸为DNA。

进一步地，所述第一轮扩增的条件为：

酶激活，温度为50℃～60℃，时间为3～30分钟，1次循环，温度为95℃，时间为1～3分钟，1次循环；变性，温度为94℃，时间为5～40秒，退火，温度为55～60℃，时间为10～60秒，延伸，温度为72℃，时间为30～60秒，30～40次循环。

进一步地，所述第二轮扩增的条件为：

cDNA预变性，温度为95℃，时间为5～60秒，1次循环；变性，温度为94℃，时间为5～40秒，退火，温度为55～60℃，时间为10～60秒，延伸，温度为72℃，时间为30～60秒，30～40次循环。

进一步地，处理所述第二轮扩增产物并建库包括打断和文库扩增。打断即为DNA片段化。

进一步地，本发明所述方法还可以包括：

6)提取或释放待测样本的RNA；

7)使用第三检测组合物进行第一轮扩增，获得第一轮扩增产物；

8)处理所述第一轮扩增产物，使用第四检测组合物对第一轮扩增产物进行第二轮扩增，获得第二轮扩增产物；

9)处理所述第二轮扩增产物并建库；以及

10)测序并分析结果。

在本文中，术语“以非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染上述病原体并具备耐药性等的信息。例如，该方法可以检测培养物(例如细胞)中的HIV毒株是否具有耐药性。

附图说明

图1为样本D17 DNA检测深度图；

图2为样本1的检测输出报告图；

图3为样本D34 DNA检测深度图；

图4为样本2的检测输出报告图；

图5为样本D4 DNA检测深度图；

图6为样本D4 RNA检测深度图；

图7为样本D5 DNA检测深度图；

图8为样本D5 RNA检测深度图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、本发明所使用的引物

本发明所使用的引物组如表1所示。

表1

其中，S、R、B、W、M、Y等均为简并碱基。

实施例2、HIV DNA耐药样本提取

试剂制备

提取试剂：核酸纯化或提取试剂(货号：S4005)，2-8℃保存；

取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温且溶液均澄清透透明后，混匀备用；根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按比例(预裂解液45μL/人份+蛋白酶K 20μL/人份)取相应量的裂解液，混匀成裂解液mix，备用。

根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按比例配制PCR混合液，见下表3配方制备，离心10s后备用。

按照“S4005-洗涤液2”标签指示，使用前加入相应用量的无水乙醇。

提取过程

1、取1.5ml离心管，加入提取溶液1(700μL)+混合液65μL(预裂解液45μL/人份+蛋白酶K 20μL/人份)+样本(200μL)，震荡混匀，瞬时离心，60℃静置12min；

2、加入提取溶液2(200μL)，震荡1min，瞬时离心，室温静置5min；

3、将离心管置于磁性分离器上，2min后缓慢吸弃废液(注意不要碰到吸附于管壁内的磁珠)；

4、加入洗涤液1(800μL)，震荡30s，将离心管置于磁性分离器上，2min后缓慢吸弃废液(注意不要碰到吸附于管壁内的磁珠)；

5、加入洗涤液2(800μL)，震荡30s，将离心管置于磁性分离器上，2min后缓慢吸弃废液(注意不要碰到吸附于管壁内的磁珠)；

6、加入洗涤液2(800μL)，震荡30s，将离心管置于磁性分离器上，2min后缓慢吸弃废液(注意不要碰到吸附于管壁内的磁珠)；

7、瞬时离心，将离心管置于磁性分离器上，小心吸弃管底废液，室温静置5min(注：乙醇残留会对后续实验造成不良影响，需保证乙醇充分挥发；同时不要干燥太长时间，以免磁珠挂壁难以洗脱)；

8、加入80～100μL洗脱液S，震荡混匀30s，将离心管壁上的磁珠洗脱到管底，室温静置10min(也可以选择56℃静置10min，可提高部分复杂样本的核酸洗脱效率)；将离心管再次置于磁性分离器上磁吸3min，然后将洗脱下来的核酸转移到新管中。

9、将洗脱下来的核酸吸取20μL加入到各30μL的PCR混合液进行PCR扩增。

实施例3、结合NGS检测耐药的方法

使用实施例1所述的第一检测组合物对核酸产物进行扩增。第一组引物针对Pro区、Int区和RT区三个耐药相关区域进行扩增，反应液配方见下表2，反应程序见下表3。

表2

一扩扩增体系	单人份体积(μL)
		5*HCV Buffer	25
dNTPs	1
		MgCl₂	0.3
Taq酶	2
		上游引物	0.5
下游引物	0.5
		模板	20
添加纯化水至	50

表3

对一轮扩增产物进行稀释或纯化后再使用第二检测组合物对应地进行第二轮巢式扩增。第二组引物较第一组引物短，对一轮产物进行稀释或磁珠纯化后进行第二轮扩增，以提高特异性和产物浓度。反应液配方见下表4，反应程序见下表5。

表4

二扩扩增体系	单人份体积(μL)
		5*HCV Buffer	25
dNTPs	1
		MgCl₂	0.3
Taq酶	2
		纯化水	10.7
上游引物	0.5
		下游引物	0.5
模板	10
		总	50

表5

对第二轮扩增产物进行纯化，建库。建库现使用翌圣一步法建库试剂盒，建库流程按说明书流程操作。

1)通过Qubit测定浓度后，确定样本投入量，制表，用纯水稀释样本，以控制投入浓度；

2)使用酶打断，反应条件及试剂用量见下表表6；

3)加接头，保证每一个样本的接头不重复，操作过程无交叉污染，反应条件及试剂用量见下表表5；

4)0.7*纯化后，进行文库扩增，反应条件及试剂用量见下表表6；

5)0.9*纯化后出库，通过Qubit测定出库浓度，调整投入量填表后进行pooling，测定浓度是否与理论浓度相符。

Pooling：将不同标签、不同浓度的样本，取一定体积进行混合，以保证取出的各样本浓度几乎相等，以控制测序片段中各样本深度均一。

表6

测序，二代测序仪使用illumina Nextseq500或illumina CN500，对测序结果按接头进行拆分数据。

生信分析，对数据进行对比分析，输出耐药结果报告。

实施例4、本发明组合物测试样本1的检测结果

使用如实施例1所述的组合物按照实施例2所述的方法，对HIV样本1(D17样本，样本取自长沙市第一医院，载量<25copies/mL)进行检测，检测结果如图1所示，对HIV病毒载量偏低的样本仍可达到深度全覆盖，保证其检出深度的数据量。其次如表7和8所示，在检测数据结果输出中更全面的显示各区的突变情况，对有突变的均进行输出，同时输出深度和突变频率。

在此之外输出耐药结果，如表9和图2所述，更直接地显示各样本的耐药情况，便于通过计算机整合报告，大大减少报告输出过程的耗时。

表7

Sample	Raw reads	Clean reads	Mapping reads	pol coverage	pol mean depth
						样本名	原始reads数	净reads数	匹配reads数	pol覆盖均度	pol均深度
D17	863216	848295	545694	0.75494	15210.087

表8

表9

实施例5、本发明组合物测试样本2的检测结果

使用如实施例1所述的组合物按照实施例2所述的方法，对HIV样本2(D34样本，样本取自永州市第三人民医院，载量<25copies/mL)进行检测，检测结果如图3所示，对HIV样本检出深度全覆盖，其次如表10～12所示，检测数据结果输出各区的突变情况，对有突变的均进行输出，同时输出深度和突变频率，并输出结果，如图4所示。

表10

样本名	原始reads数	净reads数	匹配reads数	pol覆盖均度	pol均深度
						D34	134533	131550	106256	0.66344	2993.288

表11

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表12

对比例1、与使用NGS方法检测的RNA测序结果对比

D4样本，样本取自长沙市第一医院，载量2180copies/mL。HIV DNA耐药检测通过此技术方案进行，HIV RNA耐药样本类型使用血浆进行HIV RNA耐药检测。

本样本耐药检测结果对比可见表13～16和图5～6，在载量E3水平时，可能会出现RNA耐药未检出，但DNA水平出现低水平的耐药突变，对DNA耐药的检测对临床治疗中病毒发展趋势有指示作用。

表13

样本名	原始reads数	净reads数	匹配reads数	pol覆盖均度	pol均深度
						D4-DNA	180913	180219	146332	0.75453	6405.029
D4-RNA	177757	174582	131941	0.74809	5110.141

表14、D4样本DNA耐药测序深度数据表(部分)

表15、D4样本RNA耐药测序深度数据表(部分)

表16、D4样本RNA-DNA耐药情况对比表

D5样本，样本取自长沙市第一医院，载量未检测。

该样本检测结果显示如表17～20和图7和8所示，在DNA耐药高频存在情况下，RNA耐药也可能同时存在，在进行DNA检测时能发现更多潜在突变。

表17

样本名	原始reads数	净reads数	匹配reads数	pol覆盖均度	pol均深度
						D5-DNA	322102	320735	210889	0.74446	5910.765
D5-RNA	277979	276812	229106	0.66304	6583.749

表18、D5样本DNA耐药测序深度数据表(部分)

表19、D5样本RNA耐药测序深度数据表(部分)

表20、D5样本RNA-DNA耐药情况对比表

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Claims

1.一种结合NGS检测HIV耐药性的组合物，包括第一检测组合物和第二检测组合物，其中，

第一检测组合物：

如SEQ ID NO.1～2所示的扩增Pro区的引物组；

如SEQ ID NO.3～4所示的扩增RT区的引物组；和

如SEQ ID NO.5～6所示的扩增Int区的引物组；

第二检测组合物：

如SEQ ID NO.7～8所示的扩增Pro区的引物组；

如SEQ ID NO.9～10所示的扩增RT区的引物组；和

如SEQ ID NO.11～12所示的扩增Int区的引物组。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，先使用所述第一检测组合物进行第一轮PCR扩增，再使用所述第二检测组合物进行第二轮PCR的扩增。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括第二组合物，所述第二组合物为通过HIV RNA进行耐药检测。

4.如权利要求1～3中任一项所述的组合物用于制备检测HIV耐药的试剂盒中的用途。

5.一种结合NGS检测HIV耐药性的试剂盒，包括如权利要求1～3中任一项所述的组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下中至少一种：DNA聚合酶、dNTP、缓冲液，和Mg²⁺。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下中至少一种：DNA片段化试剂、末端修复试剂、连接酶、磁珠混液。

8.一种以非诊断目的结合NGS检测HIV耐药性的方法，包括：

1)提取或释放待测样本的DNA；

2)使用如权利要求1～3中任一项所述的组合物的第一检测组合物进行第一轮扩增，获得第一轮扩增产物；

3)处理所述第一轮扩增产物，使用如权利要求1或2所述的组合物的第二检测组合物对第一轮扩增产物进行第二轮扩增，获得第二轮扩增产物；

4)处理所述第二轮扩增产物并建库；以及

5)测序并分析结果。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

6)提取或释放待测样本的RNA；

9)处理所述第二轮扩增产物并建库；以及

10)测序并分析结果。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤4)包括打断和文库扩增。