CN105624333A - 一种检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂主要耐药突变位点的引物及其应用 - Google Patents

一种检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂主要耐药突变位点的引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂主要耐药突变位点的引物，包括检测HIV-1病毒pol基因的突变位点M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、T215Y和T215F的ASPCR引物，每个突变位点均包括一对野生型PCR扩增引物及一对突变型PCR扩增引物，每个突变位点引物对的特异上游引物分别为SEQ？ID？NO.1～SEQ？ID？NO.20，通用下游引物为SEQ？ID？NO.21。所述的引物用于检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂的耐药突变位点，具有特异性强、灵敏度高、简便快速、成本低等优点。

Description

一种检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂主要耐药突变位点的引物及其应用
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，涉及艾滋病病毒耐药突变位点的检测，尤其涉及一种检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂主要耐药突变位点的引物及其应用。
背景技术
艾滋病自1981年发现以来，迅速在全世界蔓延，已成为危害人类健康的重大公共卫生问题。据UNAIDS报道，截至2014年，全球存活的艾滋病病毒感染者和病人约3670万，其中2014年新发感染200万例。
高效抗逆转录病毒治疗已广泛应用于艾滋病患者的临床治疗，目前约有1560万艾滋病病毒感染者接受抗逆转录病毒治疗，极大地提高了患者的生存率。然而，抗病毒治疗的人数及地区的快速扩大也导致艾滋病耐药毒株的传播和流行。我国不同地区抗病毒治疗人群耐药发生率从3％到56％不等。
对于艾滋病初治患者，抗病毒治疗方案为2种核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)+1种非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)或2种NRTIs+1种蛋白酶抑制剂(PIs)，分别以HIV病毒pol基因上的逆转录酶和蛋白酶为靶标。艾滋病的耐药发生在艾滋病病毒pol基因上，主要分为NRTIs耐药突变、NNRTIs耐药突变和PIs耐药突变。其中NRTIs药物有齐多夫定、拉米夫定、扎西他滨等，可诱导产生K65R、M184、T215Y等耐药突变。
病毒耐药是导致治疗失败的主要原因之一，采用经济高效的耐药检测方法，及时了解HIV治疗患者的耐药性，对于提高艾滋病治疗效果和控制艾滋病疫情有重要意义。
目前临床上广泛使用的耐药检测方法是基于测序的基因型检测，包括直接测序法、克隆测序分析、连续特异性扩增分析、深度焦磷酸测序等。这些方法虽然操作较为简单，但缺点明显，如检测时间长、费用高等。
等位基因特异性PCR(ASPCR)是一种快速、准确、低成本的检测单碱基突变的技术。它通过设计三条引物，其中一条为通用引物，另外两条为特异性平行引物，引物的3’末端分别与突变位点配对或错配。进行PCR时，模板正确匹配的引物正常扩增，而与模板错误配对的引物没有扩增产物，从而确定序列的基因型。
发明内容
本发明的目的是使用ASPCR技术，针对主要的NRTIs耐药突变设计特异性引物，提供一种快速、灵敏、低成本的检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂主要耐药突变位点的引物及其应用。
本发明采取的技术方案如下：
一种检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂主要耐药突变位点的引物，包括检测HIV-1病毒pol基因的突变位点M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、T215Y和T215F的ASPCR引物，每个突变位点均包括一对野生型PCR扩增引物及一对突变型PCR扩增引物，每对野生型PCR扩增引物或突变型PCR扩增引物均包括一条特异性上游引物和一条通用下游引物；
对于M41L位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.2和SEQIDNO.21；
对于D67N位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.3和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.4和SEQIDNO.21；
对于K65R位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.5和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.6和SEQIDNO.21；
对于K70R位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.7和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.8和SEQIDNO.21；
对于K70E位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.9和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.10和SEQIDNO.21；
对于M184V位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.11和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.12和SEQIDNO.21；
对于M184I位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.13和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.14和SEQIDNO.21；
对于L210W位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.15和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.16和SEQIDNO.21；
对于T215Y位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.17和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.18和SEQIDNO.21；
对于T215F位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.19和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.20和SEQIDNO.21。
所述的HIV-1病毒pol基因为SEQIDNO.22所示的核苷酸序列。
本发明还请求保护所述的引物在检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变位点中的应用，所述的耐药突变位点为M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、T215Y和T215F。
所述的引物用于检测HIV-1病毒NRTI耐药突变位点M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、T215Y和T215F的ASPCR检测方法，具体步骤为：将耐药突变位点相应的引物以待检测样品的cDNA为模板进行PCR扩增，实时real-timePCR检测的反应体系共20uL，其中2XSYBRGreenPCRMasterMix10uL，上游引物和下游引物各0.4uL，待检样品cDNA模板2uL，ddH2O7.2uL；反应程序为：①预变性95℃1min，②然后95℃10sec，退火62℃30sec，延伸72℃1min，重复40个循环，③以每5秒升高0.5℃的速度，从60℃升至95℃，获得产物的特异性溶解峰；根据荧光信号到达设定阈值所经历的循环数CT值判定结果，当CT值小于等于33时，待测样品中含有扩增引物对应的基因型，当CT值大于35时，待测样品中不含扩增引物对应的基因型。
本发明具有特异性强、灵敏度高、简便快速、成本低等优点。设计的ASPCR引物只针对特定位点碱基突变序列，能特异性扩增突变模板，检测基因突变灵敏度可以达到10％(即目的基因的突变基因RNA模板数占野生型RNA模板数的10％)，能有效检测艾滋病低丰度耐药，克服了基因型检测方法实验周期长、检测丰度高的缺点。本发明只涉及real-timePCR检测这一常见方法，易于掌握，操作快速，根据PCR的扩增曲线和CT值即可判断基因类型。
附图说明
图1是实施例2所述的检测结果示意图。
图2是实施例3所述的检测结果示意图。
图3是实施例4所述的检测结果示意图。
图4是实施例5所述的检测结果示意图。
图5是实施例6所述的检测结果示意图。
图6是实施例7所述的检测结果示意图。
图7是实施例8所述的检测结果示意图。
图8是实施例9所述的检测结果示意图。
图9是实施例10所述的检测结果示意图。
图10是实施例11所述的检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的技术方案和获得的有益效果。实施例2-11所采用的实时real-timePCR检测的反应体系为：2XSYBRGreenPCRMasterMix10uL，上游引物和下游引物各0.4uL，待检样品cDNA模板2uL，ddH2O7.2uL。反应程序为：①预变性95℃1min，②然后95℃10sec，退火62℃30sec，延伸72℃1min，重复40个循环，③以每5秒升高0.5℃的速度，从60℃升至95℃，获得产物的特异性溶解峰。
实施例1：HIV-1野生型质粒和突变型质粒的构建
(1)将经测序鉴定不含耐药突变的逆转录酶基因序列(长度1.1kb，相对HXB2位置：2243-3304)与pUCm-19载体进行连接，然后转化、提取质粒DNA，测序验证质粒连接正确，获得HIV-1野生型克隆质粒，稀释至0.01ng/uL。
(2)通过人工定点突变的方法，分别对HIV-1野生型克隆质粒中对应逆转录基因第41、65、70、184、210、215位氨基酸的碱基进行突变，获得M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、T215Y、T215F位点的突变型质粒，稀释至0.01ng/uL。
实施例2：ASPCR方法检测M41L位点的特异度和灵敏度
(1)分别以HIV-1野生型克隆质粒、M41L位点突变型质粒为模板，利用M41L位点野生型扩增引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图1-(1)所示，野生型模板的扩增曲线呈S型增长，其荧光信号到达设定阈值所经历的循环数CT值为24.8，突变型模板没有扩增曲线，其荧光信号未到达设定阈值，无CT值，二者区别明显，扩增特异性较高。
(2)分别以HIV-1野生型克隆质粒、M41L位点突变型质粒为模板，利用M41L位点突变型扩增引物SEQIDNO.2和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图1-(2)所示，野生型模板没有扩增曲线，其荧光信号未到达设定阈值，无CT值，突变型模板的扩增曲线呈S型增长，其荧光信号到达设定阈值所经历的循环数CT值为24.1，二者区别明显，扩增特异性较高。
(3)取HIV-1野生型克隆质粒和M41L位点突变型质粒以不同比例混合，制备不同比例M41L突变样本，得到1％突变样本、5％突变样本、10％突变样本。分别以上述1％突变样本、5％突变样本、10％突变样本为模板，利用M41L位点突变型扩增引物SEQIDNO.2和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图1-(3)所示，10％突变样本的扩增曲线呈典型S型增长曲线，CT值为30.4，本发明的检测灵敏度可达10％突变样本。
实施例3：ASPCR方法检测D67N位点的特异度和灵敏度
(1)分别以HIV-1野生型克隆质粒、D67N位点突变型质粒为模板，利用D67N位点野生型扩增引物SEQIDNO.3和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图2-(1)所示，该引物对特异性扩增HIV-1野生型序列。
(2)分别以HIV-1野生型克隆质粒、D67N位点突变型质粒为模板，利用D67N位点突变型扩增引物SEQIDNO.4和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图2-(2)所示，该引物对特异性扩增D67N位点突变型序列。
(3)以D67N位点1％-10％突变样本为模板，利用D67N位点突变型扩增引物SEQIDNO.4和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图2-(3)所示，检测灵敏度可达10％突变样本。
实施例4：ASPCR方法检测K65R位点的特异度和灵敏度
(1)分别以HIV-1野生型克隆质粒、K65R位点突变型质粒为模板，利用K65R位点野生型扩增引物SEQIDNO.5和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图3-(1)所示，该引物对特异性扩增HIV-1野生型序列。
(2)分别以HIV-1野生型克隆质粒、K65R位点突变型质粒为模板，利用K65R位点突变型扩增引物SEQIDNO.6和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图3-(2)所示，该引物对特异性扩增K65R位点突变型序列。
(3)以K65R位点1％-10％突变样本为模板，利用K65R位点突变型扩增引物SEQIDNO.6和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图3-(3)所示，检测灵敏度可达10％突变样本。
实施例5：ASPCR方法检测K70R位点的特异度和灵敏度
(1)分别以HIV-1野生型克隆质粒、K70R位点突变型质粒为模板，利用K70R位点野生型扩增引物SEQIDNO.7和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图4-(1)所示，该引物对特异性扩增HIV-1野生型序列。
(2)分别以HIV-1野生型克隆质粒、K70R位点突变型质粒为模板，利用K70R位点突变型扩增引物SEQIDNO.8和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图4-(2)所示，该引物对特异性扩增K70R位点突变型序列。
(3)以K70R位点1％-10％突变样本为模板，利用K70R位点突变型扩增引物SEQIDNO.8和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图4-(3)所示，检测灵敏度可达10％突变样本。
实施例6：ASPCR方法检测K70E位点的特异度和灵敏度
(1)分别以HIV-1野生型克隆质粒、K70E位点突变型质粒为模板，利用K70E位点野生型扩增引物SEQIDNO.9和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图5-(1)所示，该引物对特异性扩增HIV-1野生型序列。
(2)分别以HIV-1野生型克隆质粒、K70E位点突变型质粒为模板，利用K70E位点突变型扩增引物SEQIDNO.10和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图5-(2)所示，该引物对特异性扩增K70E位点突变型序列。
(3)以K70E位点1％-10％突变样本为模板，利用K70E位点突变型扩增引物SEQIDNO.10和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图5-(3)所示，检测灵敏度可达10％突变样本。
实施例7：ASPCR方法检测M184V位点的特异度和灵敏度
(1)分别以HIV-1野生型克隆质粒、M184V位点突变型质粒为模板，利用M184V位点野生型扩增引物SEQIDNO.11和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图6-(1)所示，该引物对特异性扩增HIV-1野生型序列。
(2)分别以HIV-1野生型克隆质粒、M184V位点突变型质粒为模板，利用M184V位点突变型扩增引物SEQIDNO.12和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图6-(2)所示，该引物对特异性扩增M184V位点突变型序列。
(3)以M184V位点1％-10％突变样本为模板，利用M184V位点突变型扩增引物SEQIDNO.12和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图6-(3)所示，检测灵敏度可达10％突变样本。
实施例8：ASPCR方法检测M184I位点的特异度和灵敏度
(1)分别以HIV-1野生型克隆质粒、M184I位点突变型质粒为模板，利用M184I位点野生型扩增引物SEQIDNO.13和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图7-(1)所示，该引物对特异性扩增HIV-1野生型序列。
(2)分别以HIV-1野生型克隆质粒、M184I位点突变型质粒为模板，利用M184I位点突变型扩增引物SEQIDNO.14和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图7-(2)所示，该引物对特异性扩增M184I位点突变型序列。
(3)以M184I位点1％-10％突变样本为模板，利用M184I位点突变型扩增引物SEQIDNO.14和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图7-(3)所示，检测灵敏度可达10％突变样本。
实施例9：ASPCR方法检测L210W位点的特异度和灵敏度
(1)分别以HIV-1野生型克隆质粒、L210W位点突变型质粒为模板，利用L210W位点野生型扩增引物SEQIDNO.15和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图8-(1)所示，该引物对特异性扩增HIV-1野生型序列。
(2)分别以HIV-1野生型克隆质粒、L210W位点突变型质粒为模板，利用L210W位点突变型扩增引物SEQIDNO.16和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图8-(2)所示，该引物对特异性扩增L210W位点突变型序列。
(3)以L210W位点1％-10％突变样本为模板，利用L210W位点突变型扩增引物SEQIDNO.16和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图8-(3)所示，检测灵敏度可达10％突变样本。
实施例10：ASPCR方法检测T215Y位点的特异度和灵敏度
(1)分别以HIV-1野生型克隆质粒、T215Y位点突变型质粒为模板，利用T215Y位点野生型扩增引物SEQIDNO.17和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图9-(1)所示，该引物对特异性扩增HIV-1野生型序列。
(2)分别以HIV-1野生型克隆质粒、T215Y位点突变型质粒为模板，利用T215Y位点突变型扩增引物SEQIDNO.18和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图9-(2)所示，该引物对特异性扩增T215Y位点突变型序列。
(3)以T215Y位点1％-10％突变样本为模板，利用T215Y位点突变型扩增引物SEQIDNO.18和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图9-(3)所示，检测灵敏度可达10％突变样本。
实施例11：ASPCR方法检测T215F位点的特异度和灵敏度
(1)分别以HIV-1野生型克隆质粒、T215F位点突变型质粒为模板，利用T215F位点野生型扩增引物SEQIDNO.19和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图10-(1)所示，该引物对特异性扩增HIV-1野生型序列。
(2)分别以HIV-1野生型克隆质粒、T215F位点突变型质粒为模板，利用T215F位点突变型扩增引物SEQIDNO.20和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图10-(2)所示，该引物对特异性扩增T215F位点突变型序列。
(3)以T215F位点1％-10％突变样本为模板，利用T215F位点突变型扩增引物SEQIDNO.20和SEQIDNO.21进行real-timePCR检测。结果如图10-(3)所示，检测灵敏度可达10％突变样本。

Claims (3)

1.一种检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂主要耐药突变位点的引物，其特征在于，包括检测HIV-1病毒pol基因的突变位点M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、T215Y和T215F的ASPCR引物，每个突变位点均包括一对野生型PCR扩增引物及一对突变型PCR扩增引物，每对野生型PCR扩增引物或突变型PCR扩增引物均包括一条特异性上游引物和一条通用下游引物；
对于M41L位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.2和SEQIDNO.21；
对于D67N位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.3和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.4和SEQIDNO.21；
对于K65R位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.5和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.6和SEQIDNO.21；
对于K70R位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.7和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.8和SEQIDNO.21；
对于K70E位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.9和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.10和SEQIDNO.21；
对于M184V位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.11和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.12和SEQIDNO.21；
对于M184I位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.13和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.14和SEQIDNO.21；
对于L210W位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.15和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.16和SEQIDNO.21；
对于T215Y位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.17和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.18和SEQIDNO.21；
对于T215F位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.19和SEQIDNO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDNO.20和SEQIDNO.21。
2.权利要求1所述的引物在检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变位点中的应用，其特征在于，所述的耐药突变位点为M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、T215Y和T215F。
3.权利要求1所述的引物用于检测HIV-1病毒NRTI耐药突变位点M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、T215Y和T215F的ASPCR检测方法，其特征在于，具体步骤为：将耐药突变位点相应的引物以待检测样品的cDNA为模板进行PCR扩增，实时real-timePCR检测的反应体系共20uL，其中2XSYBRGreenPCRMasterMix10uL，上游引物和下游引物各0.4uL，待检样品cDNA模板2uL，ddH2O7.2uL；反应程序为：①预变性95℃1min，②然后95℃10sec，退火62℃30sec，延伸72℃1min，重复40个循环，③以每5秒升高0.5℃的速度，从60℃升至95℃，获得产物的特异性溶解峰；根据荧光信号到达设定阈值所经历的循环数CT值判定结果，当CT值小于等于33时，待测样品中含有扩增引物对应的基因型，当CT值大于35时，待测样品中不含扩增引物对应的基因型。
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