CN109182458A - 检测hiv逆转录酶区主要耐药突变的dna芯片及其制备和应用 - Google Patents
检测hiv逆转录酶区主要耐药突变的dna芯片及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测HIV逆转录酶区主要耐药突变的DNA芯片，包括16种HIV逆转录酶区主要耐药突变的40条寡核苷酸探针，寡核苷酸探针分布在载体上形成点阵。同时，发明人还建立了相应的DNA芯片的制备方法。利用本发明制备的DNA芯片能同时检测16种常见的HIV逆转录酶区主要耐药突变。实验证明，本发明通过对待测HIV病毒逆转录酶区的耐药位点进行检测，结果直观、准确，避免了DNA直接测序法繁琐的分析过程，对于艾滋病抗病毒治疗方案的确定有指导作用，据此，还可制备相应检测试剂盒，用于艾滋病耐药监测。总之，该DNA芯片具有快速、灵敏、高效、低成本等特点，为HIV耐药流行病学调查提供一种新的检测手段。
Description
技术领域
本发明属于基因芯片检测技术领域，尤其涉及一种检测HIV逆转录酶区主要耐药突变的DNA芯片及其制备和应用。
背景技术
我国于2003年开始对艾滋病病人进行高效抗逆转录病毒治疗(HARRT)，该方法能有效抑制艾滋病患者体内艾滋病病毒(HIV)的复制，降低病死率，延长患者生命。但是，随着抗病毒治疗范围的扩大也促进了HIV耐药突变和耐药株的发生。HIV耐药突变分为蛋白酶区耐药突变和逆转录酶区耐药突变，逆转录酶区已有近40种主要耐药突变。开展耐药株的检测，不仅可以掌握耐药株的流行趋势和传播现状，还可以指导制定针对性的抗病毒治疗策略，在提高抗病毒治疗效果、控制艾滋病的传播方面具有极其重要的意义。
DNA芯片技术通过在固相支持物上固定核酸探针，并通过杂交来检测待测核酸，具有高通量、低成本、高灵敏度、高特异性、操作方便、分析速度快、可自动化检测等优势，目前已广泛应用于各个领域。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高通量、灵敏、快速的检测HIV逆转录酶区主要耐药突变的DNA芯片及其制备和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
检测HIV逆转录酶区主要耐药突变的DNA芯片，包括16种HIV逆转录酶区主要耐药突变的40条寡核苷酸探针，寡核苷酸探针分布在载体上形成点阵；16种HIV逆转录酶区主要耐药突变分别为K70E、K103N、K65R、K70R、V108I、Y188C、Y181C、M184V、M184I、L210W、M230I、G190R、G190A、V179D、T215Y和T215F位点；寡核苷酸探针分别具有序列表SEQ.ID.No.42至SEQ.ID.No.121的碱基序列。
载体为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。
上述DNA芯片的制备方法，包括以下步骤：
<1>设计HIV逆转录酶区耐药突变特异性引物
选择HIV逆转录酶区耐药突变位点作为检测基因，根据等位基因特异性检测原理设计，引物包括一条通用下游引物和多条特异性上游引物，其中耐药位点野生型特异性上游引物3’末端碱基与被检测位点的野生型位点序列完全互补，突变型特异性上游引物3’末端碱基与被检测位点的突变型位点序列完全互补；
<2>探针的设计
根据每种突变位点的引物序列，设计一组寡核苷酸探针，每条探针包括正义链和与之互补的反义链；探针正义链的3’端与特异性上游引物的5’端相连，形成探针-引物链；
<3>引物与探针配对、合成
合成5’端cy3、cy5或生物素修饰的通用下游引物，合成无特殊修饰的探针-引物链，合成5’端氨基修饰的探针反义链；
<4>制备寡核苷酸芯片
探针反义链用水溶解并稀释至10μM，每条探针取30μl加入到384孔板中，将384孔板加入点样仪，将探针反义链点制到空白的醛基化修饰玻璃片上，其中芯片阴性探针为20T序列，每条探针重复点样三个孔，室温放置12h，4℃保存。
上述DNA芯片在制备检测HIV逆转录酶区主要耐药突变的试剂盒中的应用。
上述试剂盒，还包括检测16种HIV逆转录酶区主要耐药突变的1条通用引物和40条特异性引物，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.41的碱基序列。
上述试剂盒，还包括PCR体系、杂交液、洗涤液和阴性质控品。
针对目前HIV耐药突变日益流行传播的现状，发明人利用生物芯片进行杂交检测的原理，并遵循等位基因特异性PCR原理，设计并制备了一种检测HIV逆转录酶区主要耐药突变的DNA芯片，包括16种HIV逆转录酶区主要耐药突变的40条寡核苷酸探针，寡核苷酸探针分布在载体上形成点阵。探针为随机寡核苷酸序列，探针正义链加在扩增引物的特异性上游引物5’，反义链固定在芯片上，二者互补。该DNA芯片专门针对逆转录酶区耐药位点，检测位点更全面，包括了目前艾滋病一线治疗方案中两大类药物NNRTIs和NRTIs发生频率较高的耐药位点。同时，发明人还建立了相应的DNA芯片的制备方法。利用本发明制备的DNA芯片能同时检测16种常见的HIV逆转录酶区主要耐药突变(包括K70E、K103N、K65R、K70R、V108I、Y188C、Y181C、M184V、M184I、L210W、M230I、G190R、G190A、V179D、T215Y和T215F位点)。实验证明，本发明通过对待测HIV病毒逆转录酶区的耐药位点进行检测，结果直观、准确，避免了DNA直接测序法繁琐的分析过程，对于艾滋病抗病毒治疗方案的确定有指导作用，据此，还可制备相应检测试剂盒，用于艾滋病耐药监测。总之，该DNA芯片具有快速、灵敏、高效、低成本等特点，为HIV耐药流行病学调查提供一种新的检测手段。
附图说明
图1是HIV耐药突变检测芯片原理图。
图2是探针在芯片上的阵列及对应检测位点图，图中：A阵列，B检测位点。
图3是芯片检测结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明引物设计遵循等位基因特异性PCR原理，包括一条通用下游引物和多条特异性上游引物，其中耐药位点野生型特异性上游引物3’末端碱基与被检测位点的野生型位点序列完全互补，突变型特异性上游引物3’末端碱基与被检测位点的突变型位点序列完全互补。如图1所示，先用常规PCR扩增方法扩增含有被检测位点的靶序列，如果引物的3’末端碱基与被检测位点的靶序列完全互补时，PCR扩增就会顺利进行，PCR产物就能与芯片上探针的互补序列杂交产生荧光信号。
实施例1、生物芯片的设计和制备
(1)引物及探针设计
以HIV逆转录酶区16个耐药突变位点作为检测基因，16个常见耐药位点分别为：K70E、K103N、K65R、K70R、V108I、Y188C、Y181C、M184V、M184I、L210W、M230I、G190R、G190A、V179D、T215Y、T215F；其位点分别位于HIV逆转录酶基因序列的第208、309、194、209、322、563、542位。根据等位基因特异性检测原理设计，引物包括一条通用下游引物和多条特异性上游引物(长度18-27bp)，其中耐药位点野生型特异性上游引物3’末端碱基与被检测位点的野生型位点序列完全互补，突变型特异性上游引物3’末端碱基与被检测位点的突变型位点序列完全互补，因此在进行PCR检测时，特异性上游引物只扩增与之互补的序列。针对这16个位点设计的一条通用下游引物和40条特异性上游引物，如表1所示：
表1引物序列与对应的耐药突变
根据每种突变位点的引物序列，设计一组15-20bp的寡核苷酸探针(表2)，探针正义链的3’端与特异性上游引物的5’端相连，称为探针-引物链(表3)
表2寡核苷酸探针
表3引物与探针相连形成的探针-引物链
(2)引物与探针的配对、合成
合成5’端cy3修饰的通用下游引物，合成无特殊修饰探针-引物链，合成5’端氨基修饰的探针反义链。
(3)制备寡核苷酸芯片
探针反义链用水溶解并稀释至10μM，每条探针取30μl加入到384孔板中，将384孔板加入点样仪，将探针反义链点制到空白的醛基化修饰玻璃片上，其中芯片阴性探针为20T序列，每条探针重复点样三个孔(图2)，室温放置12h，4℃保存。
实施例2、生物芯片在HIV逆转录酶区耐药突变检测中的应用
(1)PCR扩增待测样本
将待检测样品的DNA或cDNA与cy3修饰的探针-引物链、通用下游引物在同一管中进行PCR反应。
常规PCR扩增方法的扩增模板是从HIV病人血浆中提取的RNA经逆转录获得的cDNA或从人工构建质粒中提取的DNA。本实施例人工构建质粒为本实验室前期用pUCm-19载体构建的含HIV逆转录酶区基因的重组质粒，包括不含耐药突变的野生型质粒和含上述耐药突变的突变型质粒：Plasmid-HIV-WT、Plasmid-K70E、Plasmid-K103N、Plasmid-K65R、Plasmid-K70R、Plasmid-V108I、Plasmid-Y188C、Plasmid-Y181C、Plasmid-M184V、Plasmid-M184I、Plasmid-L210W、Plasmid-M230I、Plasmid-G190R、Plasmid-G190A、Plasmid-V179D、Plasmid-T215Y、Plasmid-T215F。
分别以重组质粒DNA为模板，分别采用表1中的引物进行PCR扩增，得到PCR产物，PCR反应体系为：01.ng/μl质粒DNA 2μl，2X SYBR Green PCR Master Mix 10μl，104nmol/L上下游引物各0.4μl，dd H2O7.2μl。PCR反应条件为：预变性95℃1min；然后95℃变性10sec，62℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环；最后72℃延伸10min。
(2)纯化
采用上海碧云天公司生产的PCR产物纯化试剂盒纯化上述PCR产物。
(3)杂交
将纯化后的16种PCR产物与分别芯片进行杂交，具体如下：
配制5X杂交液：NaCl 1.7530g，二水柠檬酸钠1.0051g，10％SDS，加dd H2O定容至20ml。
配制5X清洗液：NaCl 0.4383g，二水柠檬酸钠0.2513g，10％SDS，加dd H2O定容至20ml。稀释至1X待用。
取20μl 5X杂交液和80μl dd H2O加入到200μlPCR小管中，再加入10μl纯化后PCR产物，混匀；
放入PCR仪进行样品预处理，反应程序为95℃，5min，4℃，5min；
将预处理后的PCR产物加入到芯片的小孔中，封膜，放入58℃烘箱中，杂交1h30min。
(4)生物芯片的清洗
杂交结束后吸去芯片小孔里的液体，加入200μl清洗液，轻轻震荡10s，吸走液体，重复清洗4次。室温放置1min干燥。
(5)生物芯片信号的检测
用LuxScan 10K/A激光扫描仪(博奥公司)进行芯片扫描，采用LuxScan3.0图像分析软件(博奥公司)获取荧光扫描图像。
芯片杂交结果如图3所示，40个质粒样本均能特异性地与对应的探针结合呈现出绿色荧光，其他探针及阴性对照无荧光信号，杂交具有特异性，且准确性达100％。
序列表
<110> 广西医科大学
<120> 检测HIV逆转录酶区主要耐药突变的DNA芯片及其制备和应用
<160> 121
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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atacgctaca aactac 16
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catgacaatt ttttcg 16
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ataacggtat acagc 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctacagtttt gtactatt 18
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tcaataccat tagagc 16
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtcctaggt taagg 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
actttagaaa ttatctgt 18
<210> 121
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
acagataatt tctaaagt 18
Claims (6)
1.一种检测HIV逆转录酶区主要耐药突变的DNA芯片，其特征在于包括16种HIV逆转录酶区主要耐药突变的40条寡核苷酸探针，寡核苷酸探针分布在载体上形成点阵；所述16种HIV逆转录酶区主要耐药突变分别为K70E、K103N、K65R、K70R、V108I、Y188C、Y181C、M184V、M184I、L210W、M230I、G190R、G190A、V179D、T215Y和T215F位点；所述寡核苷酸探针分别具有序列表SEQ.ID.No.42至SEQ.ID.No.121的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的DNA芯片，其特征在于：所述载体为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。
3.权利要求1所述DNA芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
<1>设计HIV逆转录酶区耐药突变特异性引物
选择HIV逆转录酶区耐药突变位点作为检测基因，根据等位基因特异性检测原理设计，引物包括一条通用下游引物和多条特异性上游引物，其中耐药位点野生型特异性上游引物3’末端碱基与被检测位点的野生型位点序列完全互补，突变型特异性上游引物3’末端碱基与被检测位点的突变型位点序列完全互补；
<2>探针的设计
根据每种突变位点的引物序列，设计一组寡核苷酸探针，每条探针包括正义链和与之互补的反义链；探针正义链的3’端与特异性上游引物的5’端相连，形成探针-引物链；
<3>引物与探针配对、合成
合成5’端cy3、cy5或生物素修饰的通用下游引物，合成无特殊修饰的探针-引物链，合成5’端氨基修饰的探针反义链；
<4>制备寡核苷酸芯片
探针反义链用水溶解并稀释至10μM，每条探针取30μl加入到384孔板中，将384孔板加入点样仪，将探针反义链点制到空白的醛基化修饰玻璃片上，其中芯片阴性探针为20T序列，每条探针重复点样三个孔，室温放置12h，4℃保存。
4.权利要求1所述的DNA芯片在制备检测HIV逆转录酶区主要耐药突变的试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于还包括检测16种HIV逆转录酶区主要耐药突变的1条通用引物和40条特异性引物，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.41的碱基序列。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于还包括PCR体系、杂交液、洗涤液和阴性质控品。
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