CN107177688A - 检测耳聋易感基因突变的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测耳聋易感基因突变的试剂盒及其应用。该试剂盒内的PCR反应液包括17条引物单链(SEQ ID NO：1～17所示)和11条探针(SEQ ID NO：19～29所示)，可以在单管PCR体系中同时检测4个耳聋易感基因的9个突变位点的基因型及1个内参基因，PCR扩增结束后经荧光PCR熔解曲线分析获知样本基因型，整个操作可在2～3小时完成，操作步骤少、耗时短、单管检测位点多、通量高、突变覆盖率高；此外本发明的试剂盒采用均相检测、闭管操作，减少了PCR产物的污染，且检测特异性高，结果易于判读。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测耳聋易感基因突变的试剂盒及其应用。
背景技术
耳聋是一种严重影响人类生活质量的常见疾病，在世界范围内，平均每1000名新生儿中就有1名先天性耳聋患儿。2006年底第二次全国残疾人抽样调查结果显示，中国听力残疾者共2670万人，占残疾人总数的19.3％；1-7岁听力障碍儿童为80万，每年新生聋儿超过3万。耳聋可由环境因素(如医疗因素、环境暴露、创伤、药物等)引起，也可以由相关基因的突变或基因和环境两者共同作用而致，其中遗传因素占60％。在新生儿听力筛查的基础上进行耳聋易感基因筛查，可以对携带有耳聋基因的潜在听力损失儿童做到早发现、早诊断、早干预，减少漏诊；针对育龄期妇女及普通人群进行耳聋易感基因筛查，可以为其提供生育和遗传指导。最常见的耳聋易感基因包括GJB2、SLC26A4、线粒体12SrRNA和GJB3。
目前用于耳聋易感基因突变检测的方法主要有芯片法、ARMS-PCR法、荧光PCR法。芯片法通量较高，但操作繁琐(一般包括扩增、杂交、洗片和扫描等步骤)、耗时长，所需设备较多(PCR仪、杂交仪和扫描仪等多种配套仪器)、芯片成本较高，且易造成污染。ARMS-PCR法通量低，耗时较长，且存在非特异扩增问题。基于Taqman探针的荧光PCR法通量较低，成本较高(针对同一突变位点需要合成两条探针)。因此，现有技术很难满足耳聋易感基因突变检测的临床需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种基于多重不对称PCR及熔解曲线分析技术的耳聋易感基因检测试剂盒及其应用，旨在解决现有耳聋易感基因检测耗时长、准确率低以及成本高的技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供一种检测耳聋易感基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括：用于扩增12SrRNA基因中m.1555A>G位点和m.1494C>T位点的第一上游引物和第一下游引物，用于扩增内参基因RPP30的第二上游引物和第二下游引物，用于扩增SLC26A4基因中c.2168A＞G位点的第三上游引物和第三下游引物，用于扩增GJB3基因中c.538C＞T位点的第四上游引物和第四下游引物，用于扩增SLC26A4基因中IVS7-2A>G位点的第五上游引物和第五下游引物，用于扩增GJB2基因中c.176_191del16位点、c.235delC位点的第六上游引物和第六下游引物，用于扩增GJB2基因中c.299_300delAT位点的第七上游引物和第七下游引物，用于扩增GJB2基因中c.35delG位点的第八上游引物和第八下游引物，用于不对称PCR扩增的通用引物即第九引物，以及
检测所述m.1555A>G位点的第一探针，检测所述m.1494C>T位点的第二探针，检测所述内参基因RPP30的第三探针，检测所述c.2168A＞G位点的第四探针，检测所述c.538C＞T位点的第五探针，检测所述IVS7-2A>G位点的第六探针，检测所述c.176_191del16位点的第七和第八探针，检测所述c.235delC位点的第九探针，检测所述c.299_300delAT位点的第十探针，检测所述c.35delG位点的第十一探针，
其中，所述第一上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述第一下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，所述第二上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，所述第二下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，所述第三上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，所述第三下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示，所述第四上游引物的序列如SEQ ID NO:7所示，所述第四下游引物的序列如SEQ ID NO:8所示，所述第五上游引物的序列如SEQ ID NO:9所示，所述第五下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示，所述第六上游引物的序列如SEQ ID NO:11所示，所述第六下游引物的序列如SEQ ID NO:12所示，所述第七上游引物的序列如SEQ ID NO:13所示，所述第七下游引物的序列如SEQ ID NO:14所示，所述第八上游引物的序列如SEQ IDNO:15所示，所述第八下游引物的序列如SEQ ID NO:16所示，所述第九引物的序列如SEQ IDNO:17所示，所述第一探针的序列如SEQ ID NO:19所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO:20所示，所述第三探针的序列如SEQ ID NO:21所示，所述第四探针的序列如SEQ ID NO:22所示，所述第五探针的序列如SEQ ID NO:23所示，所述第六探针的序列如SEQ ID NO:24所示，所述第七探针的序列如SEQ ID NO:25所示，所述第八探针的序列如SEQ ID NO:26所示，所述第九探针的序列如SEQ ID NO:27所示，所述第十探针的序列如SEQ ID NO:28所示，所述第十一探针的序列如SEQ ID NO:29所示，且十一条所述探针的5’端具有荧光报告基团，3’端具有荧光淬灭基团。
本发明另一方面提供一种上述的试剂盒的应用，所述试剂盒用于检测耳聋易感基因时，对应的荧光PCR熔解曲线检测程序如下：
50℃3min，95℃3min；
95℃15s，72℃～62℃30s，10个循环，其中72℃～62℃30s每个循环下降1℃；
95℃15s，62℃30s，50个循环，在62℃退火阶段采集荧光信号；
95℃1min，70℃3min，35℃3min，35℃～90℃，其中35℃～90℃以0.03℃/s的速率升温，且在此阶段采集荧光信号。
本发明提供的检测耳聋易感基因突变的试剂盒，利用荧光PCR熔解曲线分析检测耳聋易感基因的突变，其根据常见的4个耳聋易感基因中的9个高频突变位点，并选择一种内参基因RPP30(重组人核糖核酸酶P蛋白30KD亚基-P30)，设计了17条引物单链和11条探针，在一管PCR体系中同时检测4个耳聋易感基因的9个突变位点的基因型及1个内参基因。
本发明的基本原理是利用多重不对称PCR及熔解曲线分析技术进行基因检测。本发明具体内容是针对耳聋易感基因的突变位点所在序列设计扩增引物和荧光探针，在每对扩增引物序列设计中，除包含突变位点所在常规序列特异性片段外，特别在其中一条扩增引物5’端含有一段通用引物序列(为20bp左右的一段和人类基因序列相似性低、经检测不能针对人类基因组产生扩增片段的序列)；另一条扩增引物含有一段平衡序列(使正反向引物长度趋于一致),如表1所示。针对每个扩增片段的扩增均有3条引物参与，即正反向扩增引物和通用引物。目的是提高多重不对称PCR扩增效率，并平衡多重特异扩增引物对之间的竞争关系，使不对称扩增所得各目的片段(即可以和探针互补结合的单链)大量均衡积累。
按照所选择的条件将所有引物、探针、酶和DNA模板加入同一PCR扩增反应管，进行多重不对称PCR扩增，随后进行低温到高温的熔解曲线分析，由于荧光探针与匹配程度不同靶形成的异源双链的稳定性不同，即Tm值不同，荧光探针与完全互补的靶形成的异源双链的熔点最高，与有一个或两个碱基错配的靶形成的异源双链的熔点较低，其熔点与错配碱基的类型、位置均有关系，故一种特定的基因型对应一个特异的Tm值，通过不同Tm值即可获知不同基因型。
本发明具有如下有益效果：(1)单管检测位点多：本发明充分挖掘了多重不对称PCR和探针熔解曲线技术的潜力，采用优化的八重PCR扩增体系和探针杂交体系、在荧光PCR仪每个检测通道同时进行2至3个位点的检测，从而实现了在单管同时检测10个位点(9个耳聋易感基因突变位点和一个内参基因特异片段)，在单管检测位点数目上实现了突破，避免了临床上针对同一样本进行多管检测的不便，也可为其它基因检测产品的开发提供技术方法上的借鉴。(2)突变覆盖率高：本发明针对中国人群最常见4个耳聋易感基因9个位点及1个内参基因进行检测，对中国人群的突变覆盖率高。(3)通量高、成本低：本发明在一管PCR体系中完成4个基因9个位点的突变检测，大幅节约反应物料，而且PCR扩增可以在普通PCR仪上运行，一台荧光PCR仪可配合多台普通PCR仪完成熔解曲线分析，可以提高荧光PCR仪的利用率，大大提高检测通量，降低成本。(4)简便快速、耗时短：本发明基于荧光PCR熔解曲线分析技术，PCR扩增结束后经一次荧光PCR熔解曲线分析即可获知样本基因型，整个操作可在2～3小时完成。(5)减少污染：本发明为均相检测体系，PCR及熔解曲线分析都在同一封闭的反应管中完成，无需PCR后处理，减少了PCR产物的污染。(6)检测特异性高、结果容易判读：本发明是通过熔解峰对应的熔点来判定基因型，结果易于判读，准确可靠，故检测特异性高。
附图说明
图1为本发明实施例3中试剂盒的检测体系在FAM荧光通道的各位点的检测结果图；
图2为本发明实施例3中试剂盒的检测体系在HEX荧光通道的各位点的检测结果图；
图3为本发明实施例3中试剂盒的检测体系在ROX荧光通道的各位点的检测结果图；
图4为本发明实施例3中试剂盒的检测体系在CY5荧光通道的各位点的检测结果图；
图5为本发明对比例中两种反应体系针对相同样本检测在FAM荧光通道产生的熔解曲线图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一方面，本发明实施例提供了一种检测耳聋易感基因突变的试剂盒，其包括PCR反应液，所述PCR反应液包括：
用于扩增12SrRNA基因中m.1555A>G位点和m.1494C>T位点的第一上游引物和第一下游引物，用于扩增内参基因RPP30的第二上游引物和第二下游引物，用于扩增SLC26A4基因中c.2168A＞G位点的第三上游引物和第三下游引物，用于扩增GJB3基因中c.538C＞T位点的第四上游引物和第四下游引物，用于扩增SLC26A4基因中IVS7-2A>G位点的第五上游引物和第五下游引物，用于扩增GJB2基因中c.176_191del16位点、c.235delC位点的第六上游引物和第六下游引物，用于扩增GJB2基因中c.299_300delAT位点的第七上游引物和第七下游引物，用于扩增GJB2基因中c.35delG位点的第八上游引物和第八下游引物，用于不对称PCR扩增的通用引物即第九引物，以及
检测所述m.1555A>G位点的第一探针，检测所述m.1494C>T位点的第二探针，检测所述内参基因RPP30的第三探针，检测所述c.2168A＞G位点的第四探针，检测所述c.538C＞T位点的第五探针，检测所述IVS7-2A>G位点的第六探针，检测所述c.176_191del16位点的第七和第八探针，检测所述c.235delC位点的第九探针，检测所述c.299_300delAT位点的第十探针，检测所述c.35delG位点的第十一探针，
其中，如表1和表2所示，所述第一上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述第一下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，所述第二上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，所述第二下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，所述第三上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，所述第三下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示，所述第四上游引物的序列如SEQ ID NO:7所示，所述第四下游引物的序列如SEQ ID NO:8所示，所述第五上游引物的序列如SEQ ID NO:9所示，所述第五下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示，所述第六上游引物的序列如SEQ IDNO:11所示，所述第六下游引物的序列如SEQ ID NO:12所示，所述第七上游引物的序列如SEQ ID NO:13所示，所述第七下游引物的序列如SEQ ID NO:14所示，所述第八上游引物的序列如SEQ ID NO:15所示，所述第八下游引物的序列如SEQ ID NO:16所示，所述第九引物的序列如SEQ ID NO:17所示，所述第一探针的序列如SEQ ID NO:19所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO:20所示，所述第三探针的序列如SEQ ID NO:21所示，所述第四探针的序列如SEQ ID NO:22所示，所述第五探针的序列如SEQ ID NO:23所示，所述第六探针的序列如SEQ ID NO:24所示，所述第七探针的序列如SEQ ID NO:25所示，所述第八探针的序列如SEQ ID NO:26所示，所述第九探针的序列如SEQ ID NO:27所示，所述第十探针的序列如SEQID NO:28所示，所述第十一探针的序列如SEQ ID NO:29所示，且十一条所述探针的5’端具有荧光报告基团，3’端具有荧光淬灭基团。
表1
表2
本发明实施例提供的检测耳聋易感基因突变的试剂盒，利用荧光PCR熔解曲线分析检测耳聋易感基因的突变，其根据常见的4耳聋易感基因中的9个高频突变位点，并选择一种内参基因RPP30，设计了17条引物单链和11条探针，可以在一管PCR体系中同时检测4个耳聋易感基因的9个突变位点的基因型及1个内参基因。因此具有简便快速、耗时短、通量高、成本低等特点。内参的选择，更进一步提高本发明的检测准确性。
优选地，上述荧光报告基团为ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold 540、JOE、HEX、CAL Flour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXASRED、CAL Flour Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5和Quasar 705中的任意一种，荧光淬灭基团为DABCYL、BHQ、ECLIPSE和TAMRA中的任意一种。具体地，在本发明一实施例中，第一探针的5’端连有FAM，3’端连有BHQ1；第二探针的5’端连有FAM，3’端连有BHQ1；第三探针的5’端连有FAM，3’端连有BHQ1；第四探针的5’端连有HEX，3’端连有BHQ1；第五探针的5’端连有HEX，3’端连有BHQ1；第六探针的5’端连有ROX，3’端连有BHQ2；第七探针的5’端连有ROX，3’端连有BHQ2；第八探针的5’端连有ROX，3’端连有BHQ2；第九探针的5’端连有ROX，3’端连有BHQ2；第十探针的5’端连有CY5，3’端连有BHQ2；第十一探针的5’端连有CY5，3’端连有BHQ2。
优选地，上述PCR反应液还包括：PCR buffer、dNTPs、MgCl2和PCR反应酶；且所述PCR buffer包括：Tris-HCl、KCl和50％甘油；所述PCR反应酶包括UNG酶和DNA聚合酶，且所述UNG酶和所述DNA聚合酶的浓度比为1:10；所述PCR反应液中dNTPs中dGTP:dCTP:dATP:dTTP:dUTP＝4:4:4:3:1。上述试剂盒中的PCR反应酶在本说明书中定义为EL酶，本发明实施例提供的PCR反应酶使扩增效果达到最佳。在本发明实施例提供的反应液条件下，为样本检测提供一个良好的PCR扩增体系。
优选地，上述试剂盒还包括第一阳性对照、第二阳性对照、第三阳性对照、阴性对照，
优选地，上述试剂盒中的第一阳性对照(本说明书中定义为EL阳性对照1)包括上述八对引物扩增的未突变核苷酸序列，即为9个位点野生型序列及内参基因的等量混合物，检测位点的基因型均为野生型；上述试剂盒中的第二阳性对照(本说明书中定义为EL阳性对照2)包含第六上游引物和第六下游引物扩增的c.235delC位点突变型序列及其它七对引物扩增的未突变核苷酸序列，即为c.235delC位点突变型序列、另外七个位点野生型序列及内参基因的等量混合物，检测的基因型除c.235delC为突变型外，其它位点均为野生型；上述试剂盒中的第三阳性对照(本说明书中定义为EL阳性对照3)包括所述第一上游引物和第一下游引物扩增的m.1555A＞G位点突变型序列及其它七对引物扩增的未突变核苷酸序列，即为m.1555A＞G位点突变型序列、七个位点野生型序列及内参基因的等量混合物，检测的基因型除m.1555A＞G为突变型外，其它位点均为野生型。阳性对照序列可以人工合成；而阴性对照(本说明书中定义为EL阴性对照)包括Tris-EDTA缓冲液。
另一方面，本发明实施例还提供了上述试剂盒的应用，该试剂盒用于检测耳聋易感基因时，对应的荧光PCR熔解曲线检测程序如下：
50℃3min，95℃3min；
95℃15s，72℃～62℃30s，10个循环，其中72℃～62℃30s每个循环下降1℃；
95℃15s，62℃30s，50个循环，在62℃退火阶段采集荧光信号；
95℃1min，70℃3min，35℃3min，35℃～90℃，其中35℃～90℃以0.03℃/s的速率升温，且在此阶段采集荧光信号。
本发明实施例提供的上述荧光PCR熔解曲线检测程序所采集到的荧光信号达到最佳。
优选地，该试剂盒用于检测耳聋易感基因前，其中的PCR反应液预分装于荧光PCR八连管中。如此，只需加入模板DNA这一步操作即可上机检测，省略PCR反应液配制等过程，显著提高了检测速度，具有检测流程短的特点。
本发明先后进行过多次试验，现列举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
实施例1
一种检测耳聋易感基因突变的试剂盒，本试剂盒中的引物和探针根据Genebank中的人GJB2、SLC26A4、线粒体12SrRNA、GJB3和RPP30基因序列设计。
其中，扩增引物的设计方法是，从Genebank下载得到对应序列后，利用Primerpremier 5软件设计各个位点的扩增引物，设置引物长度为18-30bp，Tm值在55-65℃范围。在反向引物5’端加入通用引物序列(选取一段20bp左右、和人类基因序列相似性低、经检测不能针对人类基因组产生扩增片段的序列)，在正向引物序列5’端加入平衡序列(长度和同用引物接近，和人类基因序列相似性低、经检测不能针对人类基因组产生扩增片段的序列)。遵循杂交探针设计的一般原则，选择覆盖突变位点的适宜长度的序列作为探针(一般为18-30bp)，相同检测通道不同位点的探针之间的Tm值差异一般要求达到10以上。
具体序列如表1和表2所示。探针在设计完成后需要加上荧光基团和淬灭基团，其中第一探针的5’端连有FAM，3’端连有BHQ1；第二探针的5’端连有FAM，3’端连有BHQ1；第三探针的5’端连有FAM，3’端连有BHQ1；第四探针的5’端连有HEX，3’端连有BHQ1；第五探针的5’端连有HEX，3’端连有BHQ1；第六探针的5’端连有ROX，3’端连有BHQ2；第七探针的5’端连有ROX，3’端连有BHQ2；第八探针的5’端连有ROX，3’端连有BHQ2；第九探针的5’端连有ROX，3’端连有BHQ2；第十探针的5’端连有CY5，3’端连有BHQ2；第十一探针的5’端连有CY5，3’端连有BHQ2。
实施例2
一种检测耳聋易感基因突变的试剂盒，本试剂盒包含PCR反应液(用荧光PCR八连管预分装，每管含PCR反应液35μL，包含实施例1中的引物和探针)、EL阳性对照1(为9个位点野生型序列及内参基因的等量混合物)、EL阳性对照2(为235delC位点突变型序列、7个位点野生型序列及内参基因的等量混合物)、EL阳性对照3(为1555A＞G位点突变型序列、7个位点野生型序列及内参基因的等量混合物)、EL阴性对照(Tris-EDTA缓冲液)。其中，PCR反应液包括：1×PCR buffer(包括Tris-HCl、KCl和体积比为50％甘油)、dNTP0.25mM、MgCl21.5mM、EL酶0.2U/μL，上述前八对引物浓度均为0.1μM、第九引物的浓度为2μM，11条探针浓度均为0.25μM。
本试剂盒对应的荧光PCR熔解曲线检测程序如下：
50℃3min，95℃3min；
95℃15s，72℃～62℃30s，10个循环，其中72℃～62℃30s每个循环下降1℃；
95℃15s，62℃30s，50个循环，在62℃退火阶段采集FAM、HEX、ROX、CY5通道的荧光信号；
95℃1min，70℃3min，35℃3min，35℃～90℃，其中35℃～90℃以0.03℃/s的速率升温，且在此阶段采集FAM、HEX、ROX、CY5通道的荧光信号。
实施例3
用实施例2的试剂盒进行检测分析，使用的仪器为SLAN 96S实时荧光PCR仪(上海宏时医疗科技有限公司)，具体步骤如下：
(1)利用核酸提取试剂盒(深圳联合医学科技有限公司，备案号：粤深械备20160073号)提取4个人的全血样本(EDTA抗凝血)的基因组DNA；通过微量紫外分光光度计(德国Implen NanoPhotometerTMP-Clas微量分光光度计)测定DNA的OD260、OD280和浓度得：OD260/OD280值在1.5～2.0之间，DNA浓度范围为10ng/μL～100ng/μL；以此获得的DNA样本可用于突变检测。
(2)从试剂盒中取一条预分装PCR反应液的八连管，前四管中依次加入5μL步骤(1)中提取的DNA，另四个管中分别加入试剂盒中配备的EL阳性对照1、EL阳性对照2、EL阳性对照3和EL阴性对照各5μL，并按实施例2中的荧光PCR熔解曲线检测程序进行检测。
(3)结果判读：本发明的试剂盒对9种突变类型及内参基因都可检测出特异的熔解曲线信号，各位点相应基因型所对应熔解峰如图1至图4所示。计算各位点熔解峰与EL阳性对照1对应熔解峰的Tm值差异，即ΔTm＝Tm(阳性对照1)-Tm(待测样本)，各检测通道的突变位点、野生型Tm参考值、野生型及突变型对应ΔTm值归纳如下表3所示。
表3
实验结果显示EL阴性对照无熔解峰、EL阳性对照1在各通道熔解峰Tm均符合野生型范围，EL阳性对照2和3分别为c.235delC突变型和m.1555A>G突变型，所以判定此次检测有效。依据所得ΔTm值判别4个样本对应位点的基因型，同时针对各样本的9个位点所在序列进行测序，将本试剂盒检测结果和测序所得结果进行比较，结果如下表4所示。从表4中的结果可知，采用本实施例的试剂盒针对4个样本的检测结果和测序结果完全一致。
表4
对比例
本发明的试剂盒所用引物和普通引物的对比实验：合成一组不带有通用序列与平衡序列的引物(即为普通引物，其核苷酸序列为：从相应的SEQ IDNO:1-16所示的八对引物中，每一对引物剔除通用序列和平衡序列所剩余的序列)。本发明的引物组(定义为实验组1)采用实施例3的方法配制反应体系；普通引物组(定义为实验组2)则用8对普通引物充当扩增引物，且各上游引物的浓度为0.03μM，各下游引物的浓度为0.15μM，不加通用引物，其它物料和实验组1相同。选取4个合格的DNA样本，利用实验组1和实验组2分别进行检测。
比较两组实验的结果，部分熔解曲线图见图5，结果显示，两种反应体系针对同一位点检测所得Tm值基本一致，实验组1的峰高明显高于实验组2，且实验组1不同位点的峰高更加均衡，更易于判断结果。说明采用包含通用序列的引物组合在优化的反应条件下能够获得更多的目的序列单链，从而产生更高的熔解曲线峰；通用引物有效平衡了不同引物扩增效率的差异，减弱了多重体系中各引物之间的竞争和相互作用，使得不同序列的扩增速度更加均衡，从而不同位点的峰高趋于平衡，特异性更高，结果更准确且方便读取。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳联合医学科技有限公司
<120> 检测耳聋易感基因突变的试剂盒及其应用
<160> 29
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 42
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
acgatcctgg ggggtgtgaa caa 23
Claims (8)
1.一种检测耳聋易感基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括：
用于扩增12SrRNA基因中m.1555A>G位点和m.1494C>T位点的第一上游引物和第一下游引物，用于扩增内参基因RPP30的第二上游引物和第二下游引物，用于扩增SLC26A4基因中c.2168A＞G位点的第三上游引物和第三下游引物，用于扩增GJB3基因中c.538C＞T位点的第四上游引物和第四下游引物，用于扩增SLC26A4基因中IVS7-2A>G位点的第五上游引物和第五下游引物，用于扩增GJB2基因中c.176_191del16位点、c.235delC位点的第六上游引物和第六下游引物，用于扩增GJB2基因中c.299_300delAT位点的第七上游引物和第七下游引物，用于扩增GJB2基因中c.35delG位点的第八上游引物和第八下游引物，用于不对称PCR扩增的通用引物即第九引物，以及
检测所述m.1555A>G位点的第一探针，检测所述m.1494C>T位点的第二探针，检测所述内参基因RPP30的第三探针，检测所述c.2168A＞G位点的第四探针，检测所述c.538C＞T位点的第五探针，检测所述IVS7-2A>G位点的第六探针，检测所述c.176_191del16位点的第七和第八探针，检测所述c.235delC位点的第九探针，检测所述c.299_300delAT位点的第十探针，检测所述c.35delG位点的第十一探针，
其中，所述第一上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述第一下游引物的序列如SEQID NO:2所示，所述第二上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，所述第二下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，所述第三上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，所述第三下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示，所述第四上游引物的序列如SEQ ID NO:7所示，所述第四下游引物的序列如SEQ ID NO:8所示，所述第五上游引物的序列如SEQ ID NO:9所示，所述第五下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示，所述第六上游引物的序列如SEQ ID NO:11所示，所述第六下游引物的序列如SEQ ID NO:12所示，所述第七上游引物的序列如SEQ ID NO:13所示，所述第七下游引物的序列如SEQ ID NO:14所示，所述第八上游引物的序列如SEQ ID NO:15所示，所述第八下游引物的序列如SEQ ID NO:16所示，所述第九引物的序列如SEQ ID NO:17所示，所述第一探针的序列如SEQ ID NO:19所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO:20所示，所述第三探针的序列如SEQ ID NO:21所示，所述第四探针的序列如SEQ ID NO:22所示，所述第五探针的序列如SEQ ID NO:23所示，所述第六探针的序列如SEQ ID NO:24所示，所述第七探针的序列如SEQ ID NO:25所示，所述第八探针的序列如SEQ ID NO:26所示，所述第九探针的序列如SEQ ID NO:27所示，所述第十探针的序列如SEQ ID NO:28所示，所述第十一探针的序列如SEQ ID NO:29所示，且十一条所述探针的5’端具有荧光报告基团，3’端具有荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团为ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold 540、JOE、HEX、CAL Flour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Flour Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5和Quasar 705中的至少一种，所述荧光淬灭基团为DABCYL、BHQ、ECLIPSE和TAMRA中的至少一种。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括：PCR buffer、dNTPs、MgCl2和PCR反应酶；且所述PCR buffer包括：Tris-HCl、KCl和50％甘油；所述PCR反应酶包括UNG酶和DNA聚合酶，且所述UNG酶和所述DNA聚合酶的浓度比为1:10；所述PCR反应液中dNTPs中dGTP:dCTP:dATP:dTTP:dUTP＝4:4:4:3:1。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第一阳性对照、第二阳性对照、第三阳性对照、阴性对照。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第一阳性对照包括八对所述上游引物和下游引物扩增的未突变核苷酸序列；
所述第二阳性对照包括所述第六上游引物和第六下游引物扩增的c.235delC位点突变型序列及其它七对引物扩增的未突变核苷酸序列；
所述第三阳性对照包括所述第一上游引物和第一下游引物扩增的m.1555A＞G位点突变型序列及其它七对引物扩增的未突变核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照包括Tris-EDTA缓冲液。
7.一种如权利要求1-6任一所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测耳聋易感基因时，对应的荧光PCR熔解曲线检测程序如下：
50℃3min，95℃3min；
95℃15s，72℃～62℃30s，10个循环，其中72℃～62℃30s每个循环下降1℃；
95℃15s，62℃30s，50个循环，在62℃退火阶段采集荧光信号；
95℃1min，70℃3min，35℃3min，35℃～90℃，其中35℃～90℃以0.03℃/s的速率升温，且在此阶段采集荧光信号。
8.如权利要求7所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测耳聋易感基因前，所述PCR反应液预分装于荧光PCR八连管中。
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