发明内容
本发明的目的是提供一种检测HIV-1对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂抗性的基因芯片及试剂盒。
本发明提供的一组寡核苷酸探针,该组寡核苷酸探针的序列如SEQ ID No.1-SEQID No.126所示;
所述SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶_10_L野生型位点;
所述SEQ ID No.5所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶_46_M野生型位点;
所述SEQ ID No.6所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶M46I突变型位点;
所述SEQ ID No.7所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶M46L突变型位点;
所述SEQ ID No.8所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶L10R突变型位点;
所述SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶_63_L野生型位点;
所述SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.16所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶L63P突变型位点;
所述SEQ ID No.13所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶_82_V野生型位点;
所述SEQ ID No.14所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶V82I突变型位点;
所述SEQ ID No.15所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶V82T突变型位点;
所述SEQ ID No.17和SEQ ID No.21所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶_84_I野生型位点;
所述SEQ ID No.18和SEQ ID No.22所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶I84V突变型位点;
所述SEQ ID No.19和SEQ ID No.23所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶_90_L野生型位点;
所述SEQ ID No.20和SEQ ID No.24所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶L90M突变型位点;
所述HIV-1蛋白酶的野生型位点为不耐HIV-1蛋白酶抑制剂的位点;
所述HIV-1蛋白酶的突变型位点为耐HIV-1蛋白酶抑制剂的位点;
所述SEQ ID No.25和SEQ ID No.29所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_41_M野生型位点;
所述SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶M41L突变型位点;
所述SEQ ID No.28和SEQ ID No.36所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_65_K野生型位点;
所述SEQ ID No.32和SEQ ID No.40所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K65R突变型位点;
所述SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_62_A野生型位点;
所述SEQ ID No.35所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶A62V突变型位点;
所述SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.41和SEQ ID No.42所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_67_D野生型位点;
所述SEQ ID No.39和SEQ ID No.43所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶D67N突变型位点;
所述SEQ ID No.44所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_75_V野生型位点;
所述SEQ ID No.45和SEQ ID No.46所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_74_L野生型位点;
所述SEQ ID No.47所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶L74V突变型位点;
所述SEQ ID No.48所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶V75I突变型位点;
所述SEQ ID No.49、SEQ ID No.52和SEQ ID No.53所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_103_K野生型位点;
所述SEQ ID No.50和SEQ ID No.54所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K103N突变型位点;
所述SEQ ID No.51和SEQ ID No.55所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K103S突变型位点;
所述SEQ ID No.56、SEQ ID No.60所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_70_K野生型位点;
所述SEQ ID No.57和SEQ ID No.61所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K70R突变型位点;
所述SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.63和SEQ ID No.65所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K101E突变型位点;
所述SEQ ID No.62和SEQ ID No.64所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_101_K野生型位点;
所述SEQ ID No.66和SEQ ID No.70所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_106_V野生型位点;
所述SEQ ID No.67和SEQ ID No.71所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶V106I突变型位点;
所述SEQ ID No.68和SEQ ID No.72所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶V106A突变型位点;
所述SEQ ID No.69所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_151_Q野生型位点;
所述SEQ ID No.73所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶Q151M突变型位点;
所述SEQ ID No.74、SEQ ID No.75和SEQ ID No.76所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_108_V野生型位点;
所述SEQ ID No.77所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶V108I突变型位点;
所述SEQ ID No.78和SEQ ID No.82所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_116_F野生型位点;
所述SEQ ID No.79和SEQ ID No.83所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶F116Y突变型位点;
所述SEQ ID No.80和SEQ ID No.84所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_181_Y野生型位点;
所述SEQ ID No.81和SEQ ID No.85所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶Y181C突变型位点;
所述SEQ ID No.86和SEQ ID No.90所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_184_M野生型位点;
所述SEQ ID No.87和SEQ ID No.91所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶M184V突变型位点;
所述SEQ ID No.88和SEQ ID No.92所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶M184I突变型位点;
所述SEQ ID No.89和SEQ ID No.93所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_190_G野生型位点;
所述SEQ ID No.94和SEQ ID No.98所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_188_Y野生型位点;
所述SEQ ID No.95、SEQ ID No.96、SEQ ID No.99和SEQ ID No.100所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶Y188L突变型位点;
所述SEQ ID No.97所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶G190A突变型位点;
所述SEQ ID No.101所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶G190S突变型位点;
所述SEQ ID No.102、SEQ ID No.103、SEQ ID No.104、SEQ ID No.106SEQ ID No.107和SEQ ID No.108所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_210_L野生型位点;
所述SEQ ID No.105和SEQ ID No.109所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶L210W突变型位点;
所述SEQ ID No.110和SEQ ID No.111所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_215_T野生型位点;
所述SEQ ID No.112所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶T215Y突变型位点;
所述SEQ ID No.113所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶T215F突变型位点;
所述SEQ ID No.114和SEQ ID No.115所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_179_V野生型位点;
所述SEQ ID No.116所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶V179D突变型位点;
所述SEQ ID No.117所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_219_K野生型位点;
所述SEQ ID No.118所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K219Q突变型位点;
所述SEQ ID No.119所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K219E突变型位点;
所述SEQ ID No.120所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_221_H野生型位点;
所述SEQ ID No.121和SEQ ID No.122所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_227_F野生型位点;
所述SEQ ID No.123所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶F227L突变型位点;
所述SEQ ID No.124和SEQ ID No.126所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶H221Y突变型位点;
所述SEQ ID No.125所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_221_H野生型位点;
所述HIV-1逆转录酶的野生型位点为不耐HIV-1逆转录酶抑制剂的位点;
所述HIV-1逆转录酶的突变型位点为耐HIV-1逆转录酶抑制剂的位点;
所述野生型位点中,数字代表氨基酸的位置,数字后面的字母表示此位置的氨基酸残基种类;
所述突变型位点中,中间的数字代表突变氨基酸的位置,数字前面的字母表示此位置氨基酸突变前的氨基酸残基种类,数字后面的字母表示此位置氨基酸突变后的氨基酸残基种类,以HIV-1蛋白酶L10R突变型位点和HIV-1逆转录酶M41L突变型位点为例,L10R的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突变为R,M41L的意思是HIV-1病毒的逆转录酶的第41位氨基酸由M突变成L。
所述寡核苷酸探针大小均为15-50个核苷酸,优选15-30个核苷酸。
上述寡核苷酸探针中,所述寡核苷酸探针的5’端用NH2-(T)n修饰,其中(T)n表示n个寡聚dT,其中n为10-35,优选15-25,具体为20。
一种用于检测HIV-1中与逆转录酶抑制剂耐药性和/或蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点的基因芯片也属于本发明的保护范围,该基因芯片包含固相载体和设于固相载体上的探针;
所述固相载体为硅片、用功能基团修饰的玻片或用功能基团衍生的膜;
所述功能基团具体为醛基基团;
所述设于固相载体上的探针包含上述任一所述的寡核苷酸探针组;
所述耐药性的相关突变位点如下:L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V、L90M、M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L;
所述L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V和L90M为HIV-1蛋白酶中与HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点;
所述M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L为HIV-1逆转录酶中与HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关的突变位点;
所述突变位点中,中间的数字代表突变氨基酸的位置,数字前面的字母表示此位置氨基酸突变前的氨基酸残基种类,数字后面的字母表示此位置氨基酸突变后的氨基酸残基种类,以HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点L10R和HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关的突变位点M41L为例,L10R的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突变为R,M41L的意思是HIV-1病毒的逆转录酶的第41位氨基酸由M突变成L;
所述逆转录酶抑制剂为HIV-1核苷类逆转录酶抑制剂和/或HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂。
上述基因芯片中,所述设于固相载体上的探针还包含表面化学质控探针和杂交质控探针,所述表面化学质控探针如SEQ ID No.130所示,所述杂交质控探针如SEQ IDNo.131所示。
所述表面化学质控探针的5’端用荧光基团-(T)m修饰,3’端被NH2修饰,(T)m表示m个寡聚dT,m为10-35,优选15-25,具体为20,荧光基团具体为HEX;
所述杂交质控探针的5’端被NH2-(T)k修饰,(T)k表示k个寡聚dT,k为10-35,k具体为20。
一种用于检测HIV-1中与逆转录酶抑制剂耐药性和/或蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点的试剂盒也属于本发明的保护范围,该试剂盒包含上述任一所述的探针或上述任一所述的基因芯片和引物组;
所述引物组由三条引物组成,其序列分别如SEQ ID No.127、SEQ ID No.128和SEQ ID No.129所示;
所述SEQ ID No.127为正向引物,SEQ ID No.128和SEQ ID No.129为反向引物;
所述正向引物在PCR体系中的浓度是上述任一所述反向引物在PCR体系中浓度的2-10倍,具体为8倍;
所述引物的大小均为15-50个核苷酸,优选15-40个核苷酸;
所述正向引物的5’端用荧光基团标记,荧光基团具体为TAMRA。
所述耐药性的相关突变位点如下:L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V、L90M、M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L;
所述L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V和L90M为HIV-1蛋白酶中与HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点;
所述M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L为HIV-1逆转录酶中与HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关的突变位点;
所述突变位点中,中间的数字代表突变氨基酸的位置,数字前面的字母表示此位置氨基酸突变前的氨基酸残基种类,数字后面的字母表示此位置氨基酸突变后的氨基酸残基种类,以HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点L10R和HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关的突变位点M41L为例,L10R的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突变为R,M41L的意思是HIV-1病毒的逆转录酶的第41位氨基酸由M突变成L;
所述逆转录酶抑制剂为HIV-1核苷类逆转录酶抑制剂和/或HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂。
上述试剂盒中,所述试剂盒还包含PCR扩增试剂、杂交缓冲液、芯片洗涤液Ⅰ以及芯片洗涤液Ⅱ和产品说明书;
所述PCR扩增试剂由ddH2O、PCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶组成;
所述杂交缓冲液由SSC、Denhardt's液、硫酸葡聚糖、十二烷基硫酸钠、SEQ IDNo.132所示的DNA分子和ddH2O组成;
所述SSC在杂交缓冲液中的浓度为3.33×,Denhardt's在杂交缓冲液中的浓度为8.33×,硫酸葡聚糖在杂交缓冲液中的浓度为4.17%,十二烷基硫酸钠在杂交缓冲液中的浓度为0.67%,SEQ ID No.132所示的DNA分子在杂交缓冲液中的浓度为0.83nM,%代表质量体积百分数g/100ml;
所述SEQ ID No.132为SEQ ID No.131所示的杂交质控探针的靶标序列,该序列的5’端被荧光基团标记,荧光基团具体为TAMRA;
所述芯片洗涤液Ⅰ由SSC、十二烷基硫酸钠和水组成,SSC在芯片洗涤液Ⅰ的浓度为2×,十二烷基硫酸钠在芯片洗涤液Ⅰ中的浓度为0.2%,%代表质量体积百分数g/100ml;
所述芯片洗涤液II由SSC和水组成,SSC在芯片洗涤液II中的浓度为0.2×;
产品说明书记载如下内容:所述PCR为不对称PCR,该PCR反应可分为四个步骤,第一个步骤是95℃变性600s,第二个步骤是由35-45个(优选45个)循环组成,每个循环由95℃变性30s、55℃退火30s和72℃延伸80s组成,第三个步骤由10-25个(优选20个)循环组成,每个循环由95℃变性30s和60-80℃(优选72℃)延伸80s组成,第四个步骤是60-80℃(优选72℃)延伸420s。
上述任一所述的探针、上述任一所述的基因芯片、上述任一所述试剂盒在制备检测HIV-1的耐药性相关的突变位点的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的探针、上述任一所述的基因芯片、上述任一所述试剂盒在制备检测HIV-1对HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性和/或HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的应用中,所述耐药性相关的突变位点如下:L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V、L90M、M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L;
所述L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V和L90M为HIV-1蛋白酶中与HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点;
所述M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L为HIV-1逆转录酶中HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关的突变位点;
所述突变位点中,中间的数字代表突变氨基酸的位置,数字前面的字母表示此位置氨基酸突变前的氨基酸残基种类,数字后面的字母表示此位置氨基酸突变后的氨基酸残基种类,以HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点L10R和HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关的突变位点M41L为例,L10R的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突变为R,M41L的意思是HIV-1病毒的逆转录酶的第41位氨基酸由M突变成L。
上述任一所述的应用中,所述逆转录酶抑制剂为HIV-1核苷类逆转录酶抑制剂和/或HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂。
本发明的基因芯片将HIV-1逆转录酶和蛋白酶基因同时作为检测突变位点的区域,通过PCR扩增的样品目的片段与探针杂交的信号强弱来判定病毒基因组中是否存在某种耐药相关位点突变,并且通过在寡核苷酸探针上引入连续简并碱基,增强了探针对非检测位点碱基多态性的耐受性。本发明的基因芯片和试剂盒可同时检测中国境内的HIV-1对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂是否耐药及耐药程度,该基因芯片和试剂盒操作简便、准确性高、通量大、耗时短,为协助临床及时掌握HIV的治疗效果并制定治疗方案提供参考。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
一、寡核苷酸探针的合成
(一)针对HIV-1逆转录酶23个耐药性相关的氨基酸残基的29种突变类型和蛋白酶6个耐药性相关的氨基酸残基的8种突变类型,设计了包括全部野生型位点的核苷酸序列以及突变型位点的核苷酸序列共126条寡核苷酸探针,如表1所示。
表1寡核苷酸探针
表1中对应检测位点的表示形式为:
酶的种类_氨基酸位点_氨基酸残基类型野生型
或,
酶的种类突变前的氨基酸残基类型氨基酸位点突变后的氨基酸残基类型突变型
序列中Y=C/T;R=A/G;N=A/C/G/T;S=C/G;W=A/T;K=G/T;D=A/G/T。
SEQ ID No.1-SEQ ID No.24为包含HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关位点的寡核苷酸探针;
SEQ ID No.25-SEQ ID No.126为包含HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关位点的寡核苷酸探针;
SEQ ID No.1-SEQ ID No.126中部分寡核苷酸探针含有单个或多个简并碱基的核苷酸位点,表示该位点存在多种等位基因。
(二)合成表1中的SEQ ID No.1-SEQ ID No.126的寡核苷酸探针,将各个寡核苷酸探针的5’端用NH2-(T)n修饰,其中(T)n表示n个寡聚dT,其中n为20。
二、引物的合成
(一)合成用于扩增目的片段的引物,如表2所示。
表2引物序列
序列号 |
引物名称 |
Sequence(5'-3') |
SEQ ID No.127 |
PROF4-F |
TCACTTGCTTCCGTTGAGGCCCAAATCACTCTTTGGC |
SEQ ID No.128 |
RTR8 |
GGAGTTCATAACCCATCC |
SEQ ID No.129 |
RTR9 |
GGAGTTCATATCCCATCC |
(二)合成表2中SEQ ID No.127-SEQ ID No.129所示的引物,其中PROF4-F为正向引物,RTR8和RTR9为反向引物,将正向引物PROF4-F的5’端用荧光基团TAMRA标记。
三、质控探针和靶标序列的合成
(一)合成质控探针和靶标序列,如表3所示。
表3质控探针及靶标序列
序列号 |
序列名称 |
Sequence(5'-3') |
SEQ ID No.130 |
QC-00002 |
gcaagacaagtggaagtgtg |
SEQ ID No.131 |
EC-00012 |
gcaaccaccaccggagg |
SEQ ID No.132 |
QC-00011 |
cctccggtggtggttgc |
(二)合成表3中的质控探针和靶标序列。QC-00002为表面化学质控探针,EC-00012为杂交质控探针,QC-00011为杂交质控探针的靶标序列。
表面化学质控探针QC-00002的5’端用荧光基团-(T)m修饰,3’端被NH2修饰,(T)m表示m个寡聚dT,m为10-35,优选15-25,下述实施例中m为20个。荧光基团为HEX。表面化学质控探针的作用是质控探针与基底共价连接的效果。
杂交质控探针EC-00012的5’端被NH2-(T)k修饰,(T)k表示k个寡聚dT,k为10-35,实施例中为20;杂交质控探针的作用是质控杂交的效果。
杂交质控探针的靶标序列QC-00011的5’端被TAMRA标记。
上述核苷酸序列的合成与修饰由上海英骏生物科技有限公司完成。
芯片洗涤液I:含有终浓度为2×SSC,体积百分含量0.2%SDS的水溶液。
芯片洗涤液II:含有终浓度0.2×SSC的水溶液。
实施例1、HIV-1耐药性相关基因的扩增
一、中国医科大学附属第一医院提取来源于中国境内的HIV感染者共81个血液样品(患者知情同意)的HIV-1病毒的RNA,反转录成cDNA。
二、分别取各样本的2μl cDNA加入到PCR扩增体系中,体系如表4所示。
表4PCR扩增体系
反应物名称 |
原始浓度 |
加样量(μl) |
ddH2O |
/ |
19 |
10×PCR Buffer |
10× |
3 |
dNTPs |
2.5mM |
2.4 |
rTaq酶 |
5U/μl |
0.6 |
PROF4-F |
10μM |
2.4 |
RTR8 |
10μM |
0.3 |
RTR9 |
10μM |
0.3 |
总量 |
/ |
28 |
其中用于扩增HIV-1逆转录酶和蛋白酶基因的PCR引物为PROF4-F、RTR8和RTR9,其中正向引物PROF4-F的浓度为每条反向引物RTR8和RTR9浓度的8倍。
三、按照表5所示的PCR程序进行扩增。
表5PCR程序
表5所示的PCR为不对称PCR,该PCR反应可分为两个阶段的温度循环:第一阶段的温度循环由变性、退火和延伸三个步骤组成,包括35-45个循环,优选45个循环,本实施例中为45个循环;第二阶段的温度循环由变性和延伸两个步骤组成,包括10-25个温度循环,优选20个循环,本实施例中为20个循环;第二阶段的延伸温度可为60-80℃,优选72℃,本实施例中为72℃。最终获得待检测样本HIV-1病毒的逆转录酶和蛋白酶基因的PCR扩增产物。
实施例2、芯片检测
一、芯片的制备
将表1的126种寡核苷酸探针和表3中的表面化学质控探针QC-00002,杂交质控探针EC-00012按图1所示的排布喷点在固相载体(醛基化的玻璃基片)上,制备成检测用芯片。
二、配制杂交缓冲液
按照表6配制杂交缓冲液。
表6杂交缓冲液组成成分
杂交缓冲液成分 |
原始浓度 |
终浓度 |
配制体积(mL) |
SSC |
20× |
3.33× |
1.5 |
Denhardt's |
50× |
8.33× |
1.5 |
硫酸葡聚糖 |
10% |
4.17% |
3.75 |
SDS |
10% |
0.67% |
0.6 |
QC-00011 |
10nM |
0.83nM |
0.75 |
纯化水 |
/ |
|
0.9 |
总量 |
/ |
|
9 |
三、单链的制备
将实施例1得到的PCR产物98℃变性5分钟,然后将其立即浸入冰水混合物中,冰浴3分钟。
四、杂交
(一)在基因微阵列芯片杂交盒的底部加入200μl蒸馏水(或纯化水),将芯片正面向上,小心放入杂交盒内,盖片的四个凸台向下盖在芯片上。
(二)将18μl杂交缓冲液和12μl实施例1得到的待检测样本的HIV-1病毒的PCR产物混合进行杂交反应,得到该样本病毒相应的杂交反应混合物。
(三)每个点阵经盖片的加样孔加入13.5μl杂交反应混合物,每种待检测样本的HIV-1病毒相应的杂交反应混合物加入1、2或3、4两个微阵列,每个微阵列限加一个样本的HIV-1病毒相应的杂交反应混合物,迅速盖上杂交盒并密封,记录芯片编号、微阵列位置及对应的病毒样品编号。
(四)立即将密封好的杂交盒水平放入50℃预热的恒温水浴锅中放置1h。
(五)杂交反应结束后,将杂交盒水平取出拆开,将芯片取出,进行芯片洗涤。具体步骤如下:将取出的芯片立即放在盛有平衡至室温(10-30℃)的芯片洗涤液Ⅰ的容器(如烧杯)中的玻片架上,在恒温摇床上以80-100rpm的转速,室温洗涤3分钟,将玻片架连同芯片一起取出放入另一个容器(如烧杯)中的平衡至室温(10-30℃)的芯片洗涤液Ⅱ在恒温摇床上,以80-100rpm的转速,室温洗涤3分钟。然后将芯片连同玻片架在离心机中800rpm离心5分钟,甩干后扫描。
五、杂交信号的扫描与结果分析
使用LuxScan10K-B微阵列芯片扫描仪和Luxscan3.0软件进行信号的读取。
通过软件扫描,获得每一个探针(SEQ ID No.1-SEQ ID No.126和SEQ ID No.130-SEQ ID No.131)杂交信号,当杂交信号大于100荧光强度值时判断为阳性。其中SEQID No.130-SEQ ID No.131用于质控其所在点阵的结果。
对81例临床HIV-1病毒样品进行检测,以每一个样品针对同一氨基酸位点的所有探针中荧光信号最高的探针所代表的氨基酸类型为待测样品在该位点的氨基酸类型,按照此方法得出待测样本每个待测位点的氨基酸类型。
经测序表明,本发明的方法可将每种突变均检出,没有遗漏,81个样本中一共存在HIV-1病毒蛋白酶6个耐药性相关的氨基酸残基的8种突变类型和逆转录酶23个耐药性相关的氨基酸残基的29种突变类型,共可检出37种耐药相关的突变类型,如图2所示。
部分样品的个别待检位点附近存在较严重的基因多态性,导致该位点所有探针信号均为阴性,导致该位点检测失败,经计算每个耐药性位点的检测成功率如图2所示,所有位点的检查成功率均达到90%以上,表明该方法对HIV-1的高基因多态性具有较好的耐受力,能够达到很好的检测效果。
图2中,PRO代表HIV-1蛋白酶,RT代表HIV-1逆转录酶。图2中各个位点符号中,中间的数字代表突变氨基酸的位置,数字前面的字母表示此位置氨基酸突变前的氨基酸残基种类,数字后面的字母表示此位置氨基酸突变后的氨基酸残基种类,/表示或。以PRO-L10R和RT-M41L为例,L10R的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突变成R,RT-M41L的意思是HIV-1病毒的逆转录酶的第41位氨基酸由M突变成L。
其中一个临床样品的检测结果如图3所示。图3表明,PRO-V82I代表检测样本的HIV-1病毒的蛋白酶的第82位氨基酸残基存在V到I的突变,RT-K101E代表该样本的HIV-1病毒的逆转录酶的第101位氨基酸残基存在K到E的突变,RT-M184V代表该样本的HIV-1病毒的逆转录酶的第184位氨基酸残基存在M到V的突变,RT-G190S代表该样本的HIV-1病毒的逆转录酶的第190位氨基酸残基存在G到S的突变。
六、耐药性结果
斯坦福耐药数据库可以根据耐药突变的位置和种类对HIV的药物耐药程度进行评分,最后指示对某一具体药物耐药程度(高度,中度,低度,潜在低度,敏感)。以此实现本发明检测中国境内HIV-1病毒对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的耐药性检测。
根据病毒耐药性位点的核苷酸序列得到耐药位点的氨基酸序列,将每一个HIV-1病毒样品的蛋白酶和逆转录酶的氨基酸序列检测结果提交到如下网址http://sierra2.stanford.edu/sierra/servlet/JSierra?action=sequenceInput与美国斯坦福大学HIV耐药数据或数据库进行比较,即可得到该病毒毒株对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的耐药性情况。