CN101463387A - 甄别活性单增李斯特菌的实时荧光pcr试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种甄别活性单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的实时荧光PCR试剂盒，主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物：5′－CGGAGGTTCCGCAAAAGATG－3′下游引物：5′－CCTCCAGAGTGATCGATGTT－3′荧光探针：5′－FAM－AAATCATCGACGGCAACCTC－TAMRA－3′其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。本发明的有益效果主要体现在：能够有效的甄别细菌死活状态，而且细菌的检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对活性单增李斯特菌进行快速、准确、特异检测。

Description

甄别活性单增李斯特菌的实时荧光PCR试剂盒及检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种甄别活性单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，简称单增李斯特菌)的实时荧光PCR试剂盒及检测方法。

(二)背景技术

李斯特菌在微生物分类中归革兰氏阳性无芽孢杆菌中的位置不定属，该属内共有7种菌(单增李斯特菌L.monocytogenes，绵羊李斯特菌L.iuanuii、英诺克李斯特菌L.innocua，威尔斯李斯特菌L.welshimeri，西尔李斯特菌L.seeligeri，格氏李斯特菌L.grayi，默氏李斯特菌L.murray)，其中仅单核细胞增生李斯特菌对人有致病性。单核细胞增生李斯特菌广泛存在于土壤、水、植物、人和动物的粪便中，中毒症状严重，除了常见的呕吐、腹泻等胃肠道表现外，还可以侵蚀人体中枢神经系统(主要表现脑膜炎、败血症、流产等疾病)，对机体造成极大地伤害，并且死亡率极高，容易引起李斯特菌病的大暴发。畜禽产品、蛋、乳制品、蔬菜及各种肉类食品是单增李斯特菌主要的污染源。该致病菌还被列为90年代威胁食品安全的四大致病菌(单增李斯特菌，致病性大肠杆菌，肉毒梭菌，亲水气单胞菌)之一。由于单增李斯特菌在4℃的环境中仍能正常生长繁殖，经常污染冷冻食品，因此也是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。

目前常规鉴定单增李斯特菌的方法仍然以常规培养方法为主，根据生化特性、致病力及协同溶血试验等进行鉴定，鉴定周期需要5～10天。一些分子生物学技术已经被广泛应用到了致病菌的检测领域。实时荧光定量PCR技术具有快速、准确、可定量等优点。目前对于食品安全中致病菌诊断所采用的方法均是针对致病菌的基因组DNA，缺点是无法对食品中致病菌的死活状态进行准确甄别，这样会导致在解决食品安全问题过程中，数据不完整，引发一系列不必要预防和治疗措施。

(三)发明内容

本发明目的是根据单增李斯特菌溶血素A基因设计引物和TaqMan探针，提供一种甄别活性单增李斯特菌的实时荧光PCR试剂盒及检测方法，可实现对单增李斯特菌快速、准确、特异检测，并能够有效甄别菌体的死活状态。

本发明采用的技术方案是：

一种甄别活性单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的实时荧光PCR试剂盒，主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3′

下游引物：5′-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3′

荧光探针：5′-FAM-AAATCATCGACGGCAACCTC-TAMRA-3′

其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

本发明关键在于特异性引物和荧光探针序列的设计及检测方法，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作单增李斯特菌的定性检测，也可加入标准菌株标准品进行定量检测。

为达到定量检测的效果，所述试剂盒还包括单核细胞增生李斯特菌标准菌株RNA标准品。以梯度浓度的单增李斯特菌标准菌株(CMCC54001)RNA溶液在与样品RNA相同条件下进行反转录和PCR扩增反应，以单增李斯特菌标准菌株(CMCC 54001)浓度的对数值为横坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品测得的Ct值，对照标准曲线，则可获得样品单增李斯特菌的浓度。

本发明还涉及一种甄别活性单核细胞增生李斯特菌的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括：

(1)按照常规方法提取待测样品RNA；提取可采用市购RNA提取试剂盒，如采用promage公司的试剂盒SV Total RNA IsolationZ3100等，操作按照试剂盒标示进行即可。

(2)按照本领域常规方法对样品RNA进行反转录，得到样品cDNA；反转录是以RNA为模板合成DNA的过程，也称逆转录。反转录反应可以利用Oligo(dT)₁₅或随机引物引导。如果需要由3’Poly(A)区域引导，选用Oligo(dT)₁₅引物；如果需要引导全长RNA，选用随机引物。

本发明中，样品RNA反转录方法如下：取2.5μg总RNA与1.0μL的10mM脱氧三磷酸核苷混合物和1.0μL的随机引物(0.5μg/μL)(宝生物大连有限公司，D3801)混匀后将反应体积用DEPC(焦碳酸二乙酯)水补充至10μL，65℃孵浴5分钟后立即置冰浴3分钟，加入10×反转录缓冲液2μL，25mM MgCl₂ 4.0μL，0.1M二硫苏糖醇2.0μL，RNA酶抑制剂(宝生物大连有限公司，D2310A)1.0μL，混匀后42℃孵浴2分钟。加入1.0μL Reverse Transcriptase XL(AMV)(宝生物大连有限公司，D2620)(5U/μL)，混匀后42℃孵浴50分钟，70℃孵浴15分钟终止反应后冰浴，得到cDNA分装，-20℃保存，待用。10×反转录缓冲液表示其组分终浓度为1×反转录缓冲液的10倍(1×反转录缓冲液组成为：10mM Tris-HCl[pH 9.0，25℃]，50mM KCl，01％

X-100)。

(3)以样品cDNA为模板，与特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶混合配制PCR反应体系，进行PCR反应，反应产物置于定量PCR仪进行荧光检测；

所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3′

下游引物：5′-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3′

荧光探针：5′-FAM-AAATCATCGACGGCAACCTC-TAMRA-3′

其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；

(4)择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性，即样本中存在活的单核细胞增生李斯特菌。

所述阴性对照品可按本领域常规方法选择，通常选择不含靶基因的非靶细菌，如副溶血性弧菌、志贺菌、沙门菌等。

定量检测时，同时以梯度浓度的单增李斯特菌标准菌株RNA溶液在与样品RNA相同条件下进行反转录和PCR扩增反应，反应产物置于定量PCR仪进行荧光检测，以单核细胞增生李斯特菌标准菌株浓度的对数值为横坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据待测样品测得的Ct值，对照标准曲线，获得待测样品单核细胞增生李斯特菌的浓度。

所述步骤(3)PCR反应体系可按照本领域常规方法配制，本发明中PCR反应体系终浓度组成如下：

PCR缓冲液                           终浓度为1×

脱氧三磷酸核苷混合物                各0.2mmol/L

MgCl₂                               5mmol/L

上游引物                        0.5μmol/L

下游引物                        0.5μmol/L

探针                            0.5μmol/L

DNA聚合酶                       0.5U/反应

模板cDNA                        10～10²ng/μL

溶剂为ddH₂O。

所述PCR反应条件可按参照本领域常规荧光定量PCR方法，具体的，步骤(3)PCR反应条件如下：93℃预变性5min；93℃20s，55℃30s，共40个循环。

本发明建立了利用TaqMan荧光定量PCR技术甄别活性单增李斯特菌的方法，并经检测模拟双盲食品污染样本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了反转录和PCR扩增技术，检测的菌体RNA，因此能够准确的甄别菌体的死活状态，同时使得细菌的检测敏感性大大提高，而且由于荧光探针的应用，使得其特异性亦大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率，使得我们可以在极少的标本中获得足够的信息。

本发明采用了反转录和特异性荧光探针杂交定量PCR检测技术，在保持高敏感性的前提下尽量减少假阳性干扰，同时本发明能够有效的甄别菌体的死活状态。在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的定量不论是直接PCR还是竞争性PCR，基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法实际上都属于半定量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给结果分析带来影响，从而影响定量这一目的。随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。而且，目前很多的荧光定量PCR技术均是检测细菌的DNA，因为DNA不容易降解，因此无法对菌体的死活状态进行区分，使得检测的结果不全面。

本发明的有益效果主要体现在：能够有效的甄别细菌死活状态，而且细菌的检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对活性单增李斯特菌进行快速、准确、特异检测。

(四)附图说明

图1为反转录结合实时荧光定量PCR标准菌株检测：单核增生李斯特菌实时荧光定量PCR标准菌株(CMCC 54001)检测结果，从左至右分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹CFU/mL标准品。

图2为实时荧光定量PCR标准曲线。标准曲线为Y＝-3.047×X+41.456，Y：对应的CT值；X：细菌的CFU的对数值。

图3为20例模拟双盲食品污染样本反转录结合荧光定量PCR检测结果。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：特异性引物、荧光探针

1、材料：

细菌RNA提取试剂购自promega公司(SV Total RNA IsolationZ3100)；Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司，377型测序仪及7000型定量PCR仪均为美国ABI公司产品。

2、引物及探针设计与合成：

以单核增生李斯特菌溶血素A基因序列(注册号为EU372055)为模板，使用Primer Express^TM(V2.0，美国ABI公司)软件分析TaqMan引物和探针位点，从中选择最佳组合。

上游引物：5′-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3′

下游引物：5′-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3′

荧光探针：5′-FAM-AAATCATCGACGGCAACCTC-TAMRA-3′

其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

均由大连宝生物工程有限公司合成。

实施例2：荧光定量PCR法检测模拟食品污染单核增生李斯特菌

1、样本检测：

用标准菌株(CMCC 54001)制备20例双盲食品样本，经生理盐水洗涤后离心，采用细菌RNA提取试剂提取RNA，分别取2.5μg做模板进行反转录反应，然后用检测用上下游引物及探针在ABI公司7000型定量PCR仪上进行PCR扩增。

(1)反转录反应

反转录反应如下：①取2.5μg总RNA与1.0μL的10mM脱氧三磷酸核苷混合物和1.0μL的随机引物(0.5μg/μL)(宝生物大连有限公司，D3801)混匀后将反应体积用DEPC(焦碳酸二乙酯)水补充至10μL。65℃孵浴5分钟后立即置冰浴3分钟。②加入10×反转录缓冲液2μL，25mMMgCl₂ 4.0μL，0.1M二硫苏糖醇2.0μL，RNA酶抑制剂(宝生物大连有限公司，D2310A)1.0μL，混匀后42℃孵浴2分钟。加入1.0μL ReverseTranscriptase XL(AMV)(宝生物大连有限公司，D2620)(5U/μL)，混匀后42℃孵浴50分钟。70℃孵浴15分钟终止反应后冰浴，获得cDNA。(2)实时荧光定量PCR反应

PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度)：包括1×PCR缓冲液，0.2mmol/L脱氧三磷酸核苷混合物，5mmol/L MgCl₂，上游引物0.5μlmol/L，下游引物0.5μmol/L，探针0.5μmol/L，DNA聚合酶0.5U，模板cDNA(10²ng/μL)2μL，用ddH₂O补足至20μL。

PCR反应条件：93℃预变性5min；93℃ 20s，55℃ 30s，共40个循环。

以非靶细菌(副溶血性弧菌、志贺菌、沙门菌)为阴性对照于相同条件下进行反转录和PCR检测，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。

同时在相同条件下以不同浓度标准菌株标准品进行检测，并绘制标准曲线。

待测样本的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测样本中的单核增生李斯特菌的数量。

2、样品检测结果

标准菌株制备标准品的检测结果参见图1，标准曲线参见图2。

结果显示双盲样本中10份检测出存在活性单核增生李斯特菌，另外10份检测结果为阴性。上述结果与制备双盲样本的结果完全一致，其中检测阴性的样本中包括5份失活的单增李氏菌、1份绵羊李斯特菌、1份希尔李斯特菌、1份格雷氏李斯特菌、1份志贺氏菌、1份沙门氏菌。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江省疾病预防控制中心

<120>甄别活性单增李斯特菌的实时荧光PCR试剂盒及检测方法

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

Claims (6)

1.一种甄别活性单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的实时荧光PCR试剂盒，主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3′

下游引物：5′-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3′

荧光探针：5′-FAM-AAATCATCGACGGCAACCTC-TAMRA-3′

其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括单核细胞增生李斯特菌标准菌株的RNA标准品。

3.一种甄别活性单核细胞增生李斯特菌的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括：

(1)提取待测样品RNA；

(2)对样品RNA进行反转录，得到样品cDNA；

(3)以样品cDNA为模板，与特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶混合配制PCR反应体系，进行PCR反应，反应产物置于定量PCR仪进行荧光检测；

所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3′

下游引物：5′-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3′

荧光探针：5′-FAM-AAATCATCGACGGCAACCTC-TAMRA-3′

其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；

(4)择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性，即样本中存在活的单核细胞增生李斯特菌。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同时以梯度浓度的单核增生李斯特菌标准菌株RNA溶液在与样品RNA相同条件下进行反转录和PCR扩增反应，反应产物置于定量PCR仪进行荧光检测，以单核细胞增生李斯特菌标准菌株浓度的对数值为横坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据待测样品测得的Ct值，对照标准曲线，获得待测样品单核细胞增生李斯特菌的浓度。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中PCR反应体系终浓度组成如下：

PCR缓冲液                                终浓度为1×

脱氧三磷酸核苷混合物                     各0.2mmol/L

MgCl₂                                    5mmol/L

上游引物                                 0.5μmol/L

下游引物                                 0.5μmol/L

探针                                     0.5μmol/L

DNA聚合酶                                0.5U/反应

模板cDNA                                 10～10²ng/μL

溶剂为ddH₂O。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中PCR反应条件如下：93℃预变性5min；93℃ 20s，55℃ 30s，共40个循环。

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