CN102358908B

CN102358908B - 单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法及pna探针

Info

Publication number: CN102358908B
Application number: CN 201110333423
Authority: CN
Inventors: 张晓峰; 吴姗; 帅江冰; 李可; 董强
Original assignee: ZHEJIANG ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Current assignee: ZHEJIANG ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2031-10-28
Also published as: CN102358908A

Abstract

本发明涉及用于鉴定单核细胞增多性李斯特菌（Listeriamonocytogenes）的PNA探针的设计，及应用PNA-FISH法鉴定单核细胞增多性李斯特菌的方法。单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定用PNA探针，其特征在于：该PNA探针的DNA序列如SEQIDNO：1所示。本发明并将探针N端标记荧光素，与荧光原位杂交技术结合用于检测。同时建立了固相荧光原位杂交检测方法，并优化了杂交条件。PNA-FISH法具有快速特点，一般整个鉴定过程耗时不超过4个小时；PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性低，且PNA-FISH法可省去繁琐DNA提取的步骤。

Description

单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法及PNA探针

技术领域

本发明涉及用于鉴定单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）的PNA探针的设计，及应用PNA-FISH法鉴定单核细胞增多性李斯特菌的方法。

背景技术

李斯特菌属包括单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）、伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii）、无害李斯特菌（L. innocua），格氏李斯特菌（L. grayi）、塞氏李斯特菌（L. seeligeri）、威氏李斯特菌（L. welsshimeri）、以及2009年新近发现的L. marthii和L. rocourtiae。其中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌对动物具有致病性，且单增李斯特菌为人畜共患食源性致病菌。孕妇、小孩、老年人及免疫力低下人群易感，常表现为脑膜脑炎、脑炎、骨髓炎、心肌炎、脓血症、流产等，发病率虽然不高，但死亡率较高，成年人的致死率为20%～60%，对婴儿及免疫力低下的人群致死率高达54%～90%。该菌在自然界中广泛分布，环境适应性很强，pH4.4～9.2、3～45℃以及高达10%NaCl的环境中均可以生长，通过多种途径进入食品加工和生产过程污染食品，对消费者健康构成潜在威胁。

肽核酸是1991年由丹麦科学家Nielsen等人设计的一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA模拟物，其骨架结构单元为（2-氨乙基）甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接与主骨架的氨基N上，可以序列特异地与DNA、RNA结合。其骨架为电中性，与DNA-DNA或RNA-DNA互补链相比，PNA-DNA和PNA-RNA互补不存在静电排斥作用，因此具有很高的DNA或RNA亲和性，在无错配的情况下其结合具有高稳定性，且杂交速度快，具有良好的细胞穿透性，是核酸探针的良好选择。同时PNA探针结合原位荧光杂交技术（FISH），与传统生化鉴定比较，PNA-FISH法可节约大量时间，若不计增菌时间，一般耗时不超过4个小时。与PCR等方法比较，PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性较低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步骤。

发明内容

本发明的第一个目的是设计了单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定用PNA探针，该PNA探针具单核细胞增多性李斯特菌特异性；本发明的第二个目的是提供了一种单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法，该方法结合FISH检测技术，实现对单核细胞增多性李斯特菌的快速检测。

为了实现上述第一个目的，本发明采用以下技术方案：

单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定用PNA探针，其特征在于：该PNA探针的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

为了实现上述第二个目的，本发明采用以下技术方案：

单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法，该方法包括以下的步骤：

1）离心收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS调整菌液浓度至OD₆₀₀=0.5-2.0；

2）取10μl 菌液于98%酒精清洗过的玻片上涂匀，火焰固定，将玻片于80%的酒精中浸泡15分钟，风干；

3）25μl含500pmole/mlPNA探针的杂交缓冲液，PNA探针的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，滴加于玻片上，55℃作用1-1.5小时，杂交后玻片于55℃预热的洗涤缓冲液中洗涤2次，每次10分钟；

4）取2～5μl菌液涂片，风干后显微镜观察其荧光亮度及细菌的形态。

作为优选，上述的杂交缓冲液，pH7.5，该杂交缓冲液包括10%（w/v）硫酸葡聚糖，10 mM NaCl，30% (v/v)甲酰胺，0.1%（w/v）焦磷酸钠，0.2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮，0.2%（w/v）聚蔗糖，5 mM Na₂EDTA，0.2% (v/v) TritonX-100和50 mM Tris/HCl。

作为优选，上述的洗涤缓冲液，pH10，该洗涤缓冲液包括5 mM Tris，15mM NaCl和0.1% (v/v) TritonX-100。

本发明由于采用了上述技术方案， PNA具有与DNA和RNA特异性结合的高稳定性、杂交快速性、及其良好的细胞穿透性，使本发明的检测方法具有快速，准确、灵敏的特性。同时结合原位荧光杂交技术使检测具有分子生物学和形态学的双重保证，更加提高了鉴定的准确率。本发明建立了固相荧光原位杂交检测方法，并优化了杂交条件。PNA-FISH法具有快速特点，一般整个鉴定过程耗时不超过4个小时；PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性低，且PNA-FISH法可省去繁琐DNA提取的步骤。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。

一、PNA探针的设计

在NCBI 的网站上(http://www.ncbi.hlm.nih.gov/BLAST/)选取了27个分别来自8个种的李斯特菌的16S rRNA的基因，用MegAlign 软件(version 5.0; DNASTAR, Madison, WI)的ClustalV算法进行排序。在排序后的在变异区域设计了单增李斯特菌特异性探针Lm-16S-2。探针序列见表1。

二、探针敏感度和灵敏度的理论验证

为了验证探针的敏感度和特异性，用BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）和ProbeCheck（http://131.130.66.200/cgi-bin/probecheck/）对探针进行了验证。BLAST 搜索发现，所设计的探针具有较高的特异性。但也发现李斯特菌L. marthii 与Lm-16S-2序列上存在重合，但L. marthii目前只在美国纽约的一处湖泊中发现，其他地区都未有发现的报道，因此一般并不会与我们的目标细菌混淆。

ProbeCheck的验证结果显示：探针Lm-16S-2能检测到数据库中所有的101个目标单增李斯特菌，但和BLAST的结果一致，不能区分单增和L. marthii。而其他检测到的非目标细菌，与李斯特菌关系都较疏远，也并非食品中常见的致病菌（表2）。随后将PNA探针与大亚基(23S/28S)数据库匹配检测，发现探针Lm-16S-2不与23S rRNA存在错配。

经过BLAST和ProbeCheck验证，所设计的探针理论上具有很高的灵敏度和特异性。

表1 PNA 探针

探针	序列 (5’-3’)荧光标记	探针位置碱基序列 ; GenBank 号
			BacUin^a	CTGCCTCCCGTAGGA-FAM	－
Lm-16S-2	TAGTACAAAGGGTCG-FAM	1247-1261; FJ434468

^a BacUin为阳性对照探针；引用自Perry-O'Keefe, H., Stender, H., Broomer, A., Oliveira, K., Coull, J., Hyldig-Nielsen, J.J., 2001. Filter-based PNA in situ hybridization for rapid detection, identification and enumeration of specific micro-organisms. J Appl Microbiol 90(2): 180-189.

探针合成和标记由韩国Panagene完成.

表2 ProbeCheck检测PNA探针的敏感度和特异性

探针名	可检测到的目标菌数/数据库中所有的目标菌数	检测到的非目标菌菌数^b	特异性^c(%)	敏感度^d(%)
					Lm-16S-2	^a L.monocytogenes 101/101	10	99.99	100

^a检测到了ProbeCheck 16S/18S数据库中的所有101个单增李斯特菌；

^bProbeCheck的16S/18S数据库中共有菌株数460,783；非单增李斯特菌的菌株数460,682；

^c特异性=没有检测到的非目标菌菌株数/数据库中所有的非目标菌菌株数；

^d敏感度=检测到的目标菌菌株数/数据库中所有的目标菌菌株数。

三、固相PNA荧光原位杂交

离心（2000g，5min）收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS调整菌液浓度至OD₆₀₀=0.5-2.0,取10μl 菌液于98%酒精清洗过的玻片上涂匀，火焰固定，将玻片于80%的酒精中浸泡15分钟，风干；25μl含500pmole/mlPNA的杂交缓冲液（pH7.5，10%（w/v）硫酸葡聚糖，10 mM NaCl，30% (v/v)甲酰胺，0.1%（w/v）焦磷酸钠，0.2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮，0.2%（w/v）聚蔗糖，5 mM Na₂EDTA，0.2% (v/v) TritonX-100，50 mM Tris/HCl）滴加于玻片上，55℃作用1-1.5小时，杂交后玻片于55℃预热的洗涤缓冲液（pH10， 5 mM Tris，15mM NaCl，0.1% (v/v) TritonX-100）中洗涤2次，每次10分钟，取2～5μl菌液涂片，风干后显微镜观察其荧光亮度及细菌的形态。

试验例1 PNA-FISH敏感度验证

对9株不同血清型的单增李斯特菌进行敏感度验证。试验方法如上所述。每次试验（包括以下实例2和3）都同步进行阳性对照和阴性对照试验，阳性对照试验，用探针BacUin替代其他探针，而阴性对照试验中，用空白替代其他探针。

结果显示，所有的菌株都能和阳性对照探针BacUin和探针Lm-16S-2结合（见表3）。上述结果和预设结果一致，探针Lm-16S-2能检测到自己的目标菌株，有较高的敏感度。

表 3 PNA探针敏感度试验

*同L.murrayi.

-- 无血清型描述.

试验例2 PNA-FISH特异性验证

选取李斯特菌属内其他五种非单增李斯特菌，包括2株伊氏李斯特菌、2株李无害李斯特菌、2株格氏李斯特菌、2株塞氏李斯特菌、2株威氏李斯特菌，以及其他八个与李斯特菌属相近细菌株，分别为蜡状芽孢杆菌、枯草杆菌、田野环丝菌、粪肠球菌、乳酸杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌2、河弧菌。试验方法如上所述。结果显示只有阳性对照探针BacUin与所有细菌都能结合，而探针Lm-16S-2不能与这些非目标菌株结合（表4）。与预期结果一致， Lm-16S-2有很好的特异性。

表4 PNA探针特异性验证

物种	菌株	BacUin	Lm-16S-2
				L. ivanovii	Li01	+	－
L. ivanovii	ATCC19119	+	－
				L. innocua	ATCC1603	+	－
L. innocua	ATCC33090	+	－
				L. grayi	Li08	+	－
L. grayi	Li07*	+	－
				L. seeligeri	ATCC35967	+	－
L. seeligeri	--	+	－
				L. welsshimeri	C15	+	－
L. welsshimeri	--	+	－
				Bacillus cereus	--	+	－
Bacillus subtilis	--	+	－
				Brochothrix campestris	--	+	－
Enterococcus faecalis	--	+	－
				Lactobacillus	ATCC4356	+	－
Staphylococcus aureus	Y1P28	+	－
				Streptococcus suis2	5995	+	－
Vibrio flurialis	ATCC33810	+	－

-- 无菌株号描述

试验例3 食品和环境来源李斯特菌分离株PNA-FISH法和API法鉴定比对

同时采用PNA-FISH法和API法（法国梅里埃公司的API LISTERIA strep，10300），对780个来自浙江省内食品加工企业和零售商店的食品样品和环境样品进行李斯特菌检测。经过样品收集、增菌、分离等步骤后，用PNA-FISH法参照前述的方法进行鉴定，同时使用API法参照试剂盒说明书进行鉴定比对。

结果显示（表5），用PNA探针Lm-16S-2检测到的L. monocytogenes阳性样品和用API法检测到的均能一一对应。表明探针Lm-16S-2和PNA-FISH方法本身能被有效的用于不同来源单增李斯特菌的鉴定。

表 5 PAN-FISH法和API法在实际样品中的检测结果比较

序列表

<110>浙江省检验检疫科学技术研究院

<120>单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法及PNA探针

<160>1

<210>1

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

TAGTACAAAG GGTCG 15

Claims

1.单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）的肽核酸原位荧光鉴定用PNA探针，其特征在于：该PNA探针的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

2.单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

4）取2～5μl菌液涂片，风干后显微镜观察其荧光亮度及细菌的形态；

上述的方法不应用于疾病的诊断。

3.根据权利要求2所述的单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法，其特征在于：杂交缓冲液，pH7.5，该杂交缓冲液包括10%（w/v）硫酸葡聚糖，10 mM NaCl，30% (v/v)甲酰胺，0.1%（w/v）焦磷酸钠，0.2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮，0.2%（w/v）聚蔗糖，5 mM Na₂EDTA，0.2% (v/v) TritonX-100和50 mM Tris/HCl。

4.根据权利要求2所述的单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法，其特征在于：洗涤缓冲液，pH10，该洗涤缓冲液包括5 mM Tris，15mM NaCl和0.1% (v/v) TritonX-100。