KR101200316B1 - 바실러스 세리우스의 구토독소 및 설사독소를 동시에 검출할 수 있도록 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바실러스 세리우스(Bacillus cereus)의 구토독소 및 설사독소를 동시에 검출할 수 있도록 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트(multiplex polymerase chain reaction primer set), 이를 이용한 바실러스 세리우스의 구토독소 및 설사독소 검출방법 및 바실러스 세리우스의 구토독소 및 설사독소 검출용 검사 키트에 관한 것이다.
바실러스 세리우스에 의한 식중독과 관련하여 종래 설사형 독소 검출법으로는 HPLC, GC, MS 등이 이용되었고, 최근 중합 효소 연쇄 반응, ELISA 등이 개발되어 있다. 그러나 구토형 독소 검출방법과 관련된 연구는 전무한 실정이다.
이에 본 발명은 구토형 독소를 생성하는 바실러스세리우스를 신속, 정확하게 검출할 수 있고, 나아가 구토독소 및 설사독소를 동시에 검출할 수 있도록 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트를 제공한다.

Description

바실러스 세리우스의 구토독소 및 설사독소를 동시에 검출할 수 있도록 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트{Recombinant multiplex polymerase chain reaction primer set detecting diarrhoeal typed toxin and emetic typed toxin simultaneously}

본 발명은 바실러스 세리우스(Bacillus cereus)의 구토독소 및 설사독소를 동시에 검출할 수 있도록 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트(multiplex PCR primer set)에 관한 것이다.

상기 프라이머와 주형 DNA 간의 결합력을 강하게 유지할 수 있도록 G+C 비율이 40~60%인 것을 특징으로 하는 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트를 이용하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세리우스의 구토독소 및 설사독소 검출방법에 관한 것이다.

그리고 상기 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세리우스의 구토독소 및 설사독소 검출용 검사 키트에 관한 것이다.

종래 샐러드, 김밥류 등의 즉석섭취식품, 편의식품류에 대한 식중독균과 관련하여 ‘불검출’ 기준을 적용해 왔다. 그러나 최근 현실에 맞게 개선하여 식품공전 상 새로운 유형으로 고시하였고, 미생물기준규격이 입안예고 됨에 따라 상기 비가열 즉석 섭취식품에 대한 바실러스 세리우스 정량기준을 신설하였다. 보다 상세하게는 즉석섭취식품, 편의식품류에 있어 바실러스 세리우스는 별도의 개별기준이 정하여지지 않은 가공식품의 경우 g 당 1,000마리 이하로 규정하였다.

바실러스 세리우스에 의한 식중독에는 엔테로톡신(enterotoxin)을 원인 독소로 하는 설사형(diarrhoeal type)과 emetic toxin에 의한 구토형(emetic type) 두 가지가 존재한다. 우선 설사형의 경우 향신료를 사용한 요리, 육류 및 채소의 수프, 푸딩, 바닐라 소스, 소시지, 크림 등의 여러 가지 식품에 의하여 발생하고 있다. 다음으로 구토형은 주로 쌀밥이나 그 요리식품인 볶음밥 등 탄수화물 식품에 의해 발생됨이 일반적이다.

양자를 비교하면 우선 설사형 독소 (enterotoxin)는 분자량이 5.5 ? 6만의 고분자단백질로 약 17개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 장관 내에서 바실러스 세리우스균이 증식하여 생산되고, 열에 약하여 60℃에서 20분간의 가열로 파괴되며 pH 변화에도 민감하다. 반면 구토형 독소(emetic toxin)는 음식물 내에서 생산된 독소로 분자량이 1만 이하의 저분자 펩타이드이며(cerulide), 128℃로 90분간 가열하여도 파괴되지 않는 등 열에 대한 저항성이 강하고 산, 알칼리, 단백질 가수분해효소에도 저항력이 매우 강하다. 따라서 식중독의 구토형 독소에 의해 발병되는 경우가 더욱 많다.

바실러스 세리우스에 의한 설사형 증상은 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringenes)식중독과 그 증상이 유사하며, 음식섭취 6?16시간 이후에 수인성 설사, 어지러움과 복통 등이 일어난다. 반면 바실러스 세리우스에 의한 구토형의 증상은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의해 발생되는 식중독 증상과 유사하며 1?5시간의 잠복기에 메스꺼움, 구토를 일으키지만, 가끔 심한 복통 및 설사를 일으키기도 하며, 증상은 24시간 내에 가라앉는 특성이 있다.

설사형 식중독의 경우 내열성이 약한 장독소에 의해 발생하며 설사와 복통의 임상 증상을 나타내며 주로 노르웨이, 헝가리, 핀란드 등 북유럽지역에서 발생하는 것으로 보고되고 있다. 한편 현재까지 설사형 독소생성 유전자로서 hblA, hblC, hblD, nheA, nheB, nheC, cytK 등 다양한 유전자가 밝혀져 있으며, 국내에서도 바실러스 세리우스 분리 균주의 장독소 생산과 독소 유전자 분포에 관한 연구가 다양하게 진행되고 있다.

본 발명에 관련된 종래기술은 한국특허등록 10-0431586(독소 생산 마이크로시스티스 검출방법)로서 독소 생산 마이크로시스티스를 특이적으로 검출할 수 있는 유전자 탐침을 이용하여 정확하고 신속하게 독소 생산 마이크로시스티스를 검출하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명은 남조류 균주들이 혼합되어 있는 시료에 서도 독소 생산 여부에 따라 독소 생산 마이크로시스티스를 정확히 검출해 낼 수 있어, 녹조 발생 시 큰 문제가 되고 있는 유독 마이크로시스티스의 조기 감지를 위한 환경 모니터링 수단으로 사용될 수 있는 기술이다.

또한 한국특허등록 10-0671501(식중독 검출용 프라이머 및 이를 이용한 세균성 식중독 검출방법)로서 식중독 검출용 프라이머 및 이를 이용한 세균성 식중독 검출방법에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명은 살모넬라 속 균주, 스타필로코커스 아우레우스, 대장균 O157, 리스테리아 모노사이토게네스 및 비브리오 파라헤몰리티쿠스 각각의 특이 유전자를 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머, 상기 프라이머를 이용한 식중독 검출방법 및 검출키트에 관한 것이다. 그러나 이들 종래기술은 본 발명과 기술적구성이 다른 것이다.

1.기술적 측면

종래 설사형 독소 검출법으로는 HPLC(High performance liquid chromatography), GC(gas chromatography), MS(Mass spectrometry) 등이 이용되었다.

최근에는 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 hblA, hblB, hblC, nheA, nheB, nheC, cytK 등 설사 독소 유전자를 검출함으로써 동정하는 방법을 이용하기도 한다. 나아가 독소 단백질을 확인하는 ELISA(enzyme linked immunoassay)와 RPLA(reversed passive latex agglutination)를 이용한 상품화된 kit가 개발되어있는 상황이다.

반면, 구토 독소 생산 바실러스 세리우스균은 균주 분리 동정과 독소 생성 기작 등과 관련된 생리적 측면에 대한 연구가 현재까지 설사 독소 균주 분리에 비해 상대적으로 매우 미흡한 실정이다. 이는 우리나라에서는 바실러스 세리우스에 의한 구토형 식중독 보고가 거의 전무했기 때문으로 사료된다.

구토형 식중독은 설사형 식중독과는 달리 저분자의 내열성을 가진 환상 도데카 뎁시펩티드(cyclic dodeca depsipeptide) 세레울라이드(cereulide) 구토독소에 의해 발생하며 영국, 미국, 일본 등에서 분리 보고되고 있다.

다만 상기 Cereulide 생산 유전자가 아직 정확하게 밝혀지지 않았기 때문에 저분자 환상구조의 아미노산 펩타이드가 리보솜(ribosome)에서 생산되지 않는다는 과학적 사실에 근거해 NRPS(Non-ribosomal peptide synthetase) 유전자를 target으로 PCR을 실시하여 구토독소 바실러스 세리우스균주를 동정하고 있는 실정이다. 또한 리보솜에서 독소유전자가 발현되지 않기 때문에 항원항체반응에 의한 상업적 kit가 개발되지 못하고 있다.

즉 구토형 독소 생산 바실러스 세리우스균은 균주 분리 동정과 독소 생성 기작 등과 관련된 생리적 측면에 대한 연구가 현재까지 설사형 독소 균주 분리에 비해 상대적으로 미흡한 실정이며 우리나라에서는 관련 연구조차 없는 실정이다.

현재 PCR을 이용한 구토독소 생산 관련 유전자 검색으로 구토독소 생산 바실러스 세리우스균주를 정확하게 동정하기 곤란하기 때문에, 독소생성 확인방법으로 바실러스 세리우스균주 가 생산하는 cereulide 구토독소를 스펌어세이(sperm assay) 또는 세포배양(cell culture)으로 정성 하거나, cereulide와 화학적 구조와 분자량이 매우 유사한 valinomycin을 표준물질로 HPLC-MS를 이용한 정량분석 방법이 사용되고 있다. 다만 아직 국내에서는 구토형 독소 분석을 위한 상기와 같은 방법들이 확립되어 있는 실정은 아니다. 따라서 하기와 같은 기술개발이 요구된다.

첫째, 우리나라와 식문화가 유사한 일본의 경우 설사형 보다 구토형 식중독이 10배 가량 많이 보고되는 것으로 보아, 국내 바실러스 세리우스에 의한 구토형 식중독은 발생 가능성은 매우 높다고 판단되므로, 구토형 독소 생성 바실러스 세리우스를 신속, 정확하게 검출할 수 있는 PCR Primer 개발이 매우 필요하다고 예상된다.

둘째, 본 연구의 선행 실험 결과와 국외 연구 결과에 따르면 바실러스 세리우스균이 구토형 독소와 설사형 독소를 동시에 생성한다는 보고가 있다. 따라서 설사형 독소와 구토 형 독소를 동시 에 검출할 수 있는 multiplex PCR primer kit를 개발하여 설사형 및 구토형 독소 생산 바실러스 세리우스균을 screening하고 동정하는 기술의 개발이 필요하다고 할 것이다.

2.경제적 측면

현재 국내에서는 식품위생과 식중독 관리 방안에 대한 체계가 수립되고 개선방안이 시행되고 있지만 국내 외적으로 여전히 병원성 미생물로 인한 식중독의 발생 수는 대량화, 집단화 추세를 보이고 있다.

또한 우리나라 원인 식품별 식중독 발생 현황을 살펴보면 복합조리 식품이 식중독의 주요 원인 식품으로 보고되고 있으며 해마다 수없이 많은 식중독이 발생하고 있으며 그 가운데 병인 물질이 판명된 것의 80～90%는 세균에 의한 것으로 식중독에 있어서 세균이 접하는 비중은 대단히 크다.

*한편 바실러스 세리우스는 식중독 발생건수 자체가 그리 많지는 않으나 2007년의 경우, 1건의 사고에서 50명의 환자가 발생된 것처럼 점차 대형화되고 있어 단체급식이나 대규모 식품업소의 철저한 위생관리가 필요한 실정이다.

우리나라에서 연간 발생하는 식중독 환자는 약 1,185만 명이고, 입원 환자수는 총 15.4만 명 으로 전체 인구의 약 0.3%정도를 차지하며 이러한 식중독 환자에 의한 사회 경제적 손실 비용은 1조 3,107억 원으로 추정되었는데 이는 2000년도 우리나라 GNP의 0.28%, 2002년도 정부 예산의 1.16%에 해당된다(Park, 2001).

미국에서는 식중독에 의한 의료비용과 생산성 손실이 US$ 6.6~37.1 billion의 손실이 있었 으며(Buzby , 1997), 영국에서도 5종의 병원성세균에 의한 의료비용 및 생산선 감소에 따른 경제적 효과가 연간 ~700 million에 달한다고 평가하였으며(Roberts, 1989), 호주에서도 연간 11,500건의 식중독 사고에 의해 연간 A$ 2.6 billion의 경제적 손실을 보았다고 보고 하였으며(ANZFA, 1999), 캐나다에서도 식중독에 의한 경제적 손실을 US$ 1.3 billion으로 평가한 바 있다(Todd, 1989).

따라서 수입식품을 포함한 국내 유통식품들의 미생물학적 위해요소를 규명하기 위하여 PCR방법을 구축하여 보다 신속하고 효율적으로 관련 제품으로부터 기인될 수 있는 식중독사고의 예방 및 사후처리를 함으로서 식중독사고로 발생할 수 있는 경제적 제반 손실비용을 최소화할 필요성이 있다.

3.사회 및 문화적 측면

최근 산업 문명이 고도로 발달함에 따라 우리의 생활양식과 식생활의 습관이 급격히 변화함에 따라 가공식품의 섭취가 급격히 늘고 있으며 이에 따라 제품의 생산, 가공, 저장 및 유통 단계에 이르기까지 병원성 미생물에 의해 야기되는 식중독과 관련된 식품의 안전성에 대한 문제가 심각하게 대두되어 큰 사회적 문제를 야기할 수 있다.

국내 즉석섭취식품에서 바실러스 세리우스로 인한 사회적 이슈는 최근에 언론보도를 통하여 안전성에 대한 우려가 많이 지적 되었는데, 특히 김밥전문점에서 판매하는 김밥(한국소비자보호원, 2007), 길거리에서 판매되는 어묵, 떡볶이, 튀김, 김밥, 순대 등 길거리 음식의 위생상태 불량(한국보건산업진흥원, 2007), 고속도로휴게소에서 판매되는 김밥, 햄버거 (조선일보, 2008), 전국 버스터미널, 기차역 및 해수욕장 식품조리업소에서 판매하는 김밥, 샌드위치 등 (조선일보, 2008) 곡류나 전분질 함량이 높은 가공식품에서 바실러스 세리우스균의 검출율이 높은 것으로 나타났다.

따라서 바실러스 세리우스를 포함한 각종 식중독 미생물에 의한 식중독 사고 발생의 급격한 증가에 따라 이의 신속, 정확한 검출방법에 의한 사고 예방과 신속한 대처가 요구되고 있다. 나아가 식중독 사고의 예방, 진단 그리고 정확한 역학 조사는 신속, 정확하고 표준화된 식품 유해 물질 검출법의 유무가 전제가 되고 있다고 할 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위해서 본 발명에서는 바실러스 세리우스(Bacillus cereus)의 구토독소 및 설사독소를 동시에 검출할 수 있도록 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트(multiplex PCR primer set)를 제공한다.

상기 프라이머와 주형 DNA 간의 결합력을 강하게 유지할 수 있도록 G+C 비율이 40~60%인 것을 특징으로 하는 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트일 수 있다.

또한 상기 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트를 이용하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세리우스의 구토독소 및 설사독소 검출방법 및 바실러스 세리우스의 구토독소 및 설사독소 검출용 검사 키트를 제공한다.

1. 기술적 측면

본 발명인 PCR Primer를 통해 구토형 독소 생성 바실러스 세리우스를 신속, 정확하게 검출할 수 있다. 일본의 경우와 마찬가지로 향후 우리나라에서도 바실러스 세리우스에 의한 구토형 식중독은 발생 가능성은 매우 높다. 또한 최근 연구 결과에 따르면 B. cereus균이 구토형 독소와 설사형 독소를 동시에 생성한다는 보고가 있다. 따라서 본 발명은 PCR Primer 을 제공함으로써 구토형 독소 생성 바실러스 세리우스를 신속, 정확하게 검출할 수 있는 유리한 효과가 있고, 나아가 본 발명에서는 multiplex PCR을 개발하여 설사형 독소 유전자와 구토형 독소 유전자를 동시에 신속하게 검출할 수 있는 유리한 효과가 있다.

2. 경제적 측면

식품 유해물질 검사는 국민의 건강과 식품 안전에 대한 관심과 욕구의 증대, 식품안전성에 대한 규제의 강화, 생산자와 품질 향상을 통한 경쟁력 제고, 수입식품의 안전 관리 등으로 인해 기하급수적으로 증가하고 있다.

따라서 B. cereus균으로부터 식품의 안전성을 확보하기 위하여 식중독 원인 미생물 진단에 대한 정확한 진단이 요구된다 할 것이다. 따라서 식품의 안전성 확보를 위한 새로운 기술로서 설사형 및 구토형 독소를 생성하는 B. cereus균의 신속검출기법을 개발하는 PCR primer kit의 개발이 그 어느 때보다 중요하다고 할 것이다.

식품 검사 시장의 기하급수적인 성장과 생명공학 기술의 발달로 첨단 기술을 탑재한 식품 유해 물질 진단 kit가 지속적으로 개발되고 있으며, 따라서 상용화된 설사형 및 구토형 독소를 동시에 검출하는 PCR primer kit를 공정한 검증을 거쳐 지혜롭게 개발하면 비용, 시간 노동력 절감 등 경제적 측면에서의 유리한 효과를 얻을 수 있을 것이다.

3.사회문화적 측면

본 발명은 B. cereus균으로부터 식품의 안전성을 확보하기 위하여 식중독 원인 미생물 진단에 대한 정확한 진단이 요구됨에 따라 식품의 안전성 확보를 위한 새로운 기술로서, 설사형 독소 유전자와 구토형 독소 유전자를 동시에 신속하게 검출할 수 있는 multiplex PCR 시스템을 개발하여 B. cereus균에 의한 독소생성을 정확하고 효율적으로 탐색하여 검출율을 높임으로써 식중독사고의 예방에 기여하며 식품업체의 HACCP(Hazard Analysis Critical Control Point) 운영의 표준화된 시험법을 제공함으로써 식중독 발생을 사전에 예방하고, 식품의 안전성을 확보할 수 있다. 이로써 사회문화적 측면에서 삶의 질 향상에 기여하는 유리한 효과가 있다고 할 것이다.

도 1은 본 발명의 PCR product amplified with multiplex primer에 대한 Gel electrophoresis 결과이다. Line 1은 Marker를 나타내고, Line 2는 B. cereus JNHE 36 (emetic strain)을 나타내며, Line 3은 B. cereus KFDA 213 (entrotoxic strain)을 나타내고, Line 4는 B. cereus KNIH 28 (emetic strain)을 나타내며, Line 5은 B. cereus ATCC 12480 (entrotoxic reference strain)을 나타내고, Line 6은 B. cereus F4810/72 (emetic reference strain)을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 PCR product amplified with multiplex primer에 대한 Gel electrophoresis 결과이다. Line 1은 Marker를 나타내고, Line 2는 B. cereus JNHE 36(multiplex)을 나타내며, Line 3은 B. cereus JNHE 36(cyt K)을 나타내고, Line 4는 B. cereus JNHE 36(nhe A)을 나타내며, Line 5은 B. cereus JNHE 36(ces)을 나타내고, Line 6은 B. cereus JNHE 36(CER)을 나타내며, Line 7은 B. cereus JNHE 36(hblC)을 나타내고, Line 8은 B. cereus JNHE 36(enrFM)을 나타내며, Line 9는 B. cereus ATCC 12480 (entrotoxic reference strain)을 나타내고, Line 10은 B. cereus F4810/72 (emetic reference strain)을 나타내며, Line 11은 Negative를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 PCR product amplified with multiplex primer에 대한 Gel electrophoresis 결과이다. Line 1은 Marker를 나타내고, Line 2는 B. cereus F4810/72 (emetic reference strain)을 나타내며, Line 3은 B. cereus ATCC 12480 (entrotoxic reference strain)을 나타내고, Line 4는 E. coli KCCM 32396 을 나타내며, Line 5은 Staphylococcus aureus ATCC 27729 을 나타내고, Line 6은 Salmonella typhimurium ATCC 14028 을 나타내며, Line 7은 Listeria monocytogenes ATCC 19119을 나타내고, Line 8은 Bacillus subtilis KCCM 11316 을 나타내며, Line 9는 Escherichia coli O157:H7ATCC 43895 을 나타내고, Line 10은 Marker를 나타낸다.

본 발명은 바실러스 세리우스(Bacillus cereus)의 구토독소 및 설사독소를 동시에 검출할 수 있도록 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트(multiplex PCR primer set)에 관한 것이다.

상기 프라이머는 인체, 식품 및 환경 유래의 바실러스 세리우스를 분리, 동정하고, 상기 분리 동정된 바실러스 세리우스의 유전자 서열을 확인함으로써 얻은 실험결과를 토대로 작성하였다.

상기 프라이머와 주형 DNA 간의 결합력을 강하게 유지할 수 있도록 G+C 비율이 40~60%인 것을 특징으로 하는 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트일 수 있다.

상기 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트는 서열번호 1의 포워드프라이머(Forward primer)와 서열번호 2의 리버스프라이머(Reverse primer), 서열번호 3의 포워드프라이머와 서열번호 4의 리버스프라이머, 서열번호 5의 포워드프라이머와 서열번호 6의 리버스프라이머, 서열번호 7의 포워드프라이머와 서열번호 8의 리버스프라이머, 서열번호 9의 포워드프라이머와 서열번호 10의 리버스프라이머, 서열번호 11의 포워드프라이머와 서열번호 12의 리버스프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트일 수 있다.

그리고 본 발명은 상기 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트를 이용하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세리우스의 구토독소 및 설사독소 검출방법에 관한 것이다.

또한 바실러스 세리우스의 구토독소 및 설사독소 검출용 검사 키트에 관한 것이다.

이하에서 실시예에 의거하여 구체적으로 설명한다. 그러나 이는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니다.

<실시예 1> 실험재료 및 실험균주의 선정

1. 실험 재료의 선정

2009년 3월부터 2009년 5월까지 강원도 춘천 지역의 소매점과 재래시장에서 떡 52 검체와 김밥 56 검체를 구매하여 실험재료로 사용하였다.

2. 실험 균주의 선정

본 실험에 사용된 B. cereus 균주는 하기 [표 1]과 같이 인체분리 81주, 곡류분리 65주 및 식품분리 14주, 총 160주를 선정하였다. 구토독소를 생성하는 것으로 보고된 B. cereus F4810/72를 표준균주로 사용하였다.

실험에 사용된 균주는 떡 및 김밥에서 분리한 4주를 포함하여 전라북도보건환경연구원에서 23주, 질병관리본부에서 13주, 서울시보건환경연구원에서 6주 및 인천시보건환경연구원에서 9주와 본 연구팀이 보관중인 103주, 총 160주를 선정하였다.

이들 균주는 20% 글리세롤(glycerol)를 함유 하는 TSB(Trypticase soy btoth)배지(Oxoid, England)를 사용하여 -70℃ 저온 냉동고에 보관하면서 사용하였다.

선정된 B. cereus 실험균주

Origin	Total
Clinical strains (total 81)	-
Feces	77
Vomit	4
Grain strains (total 65)	-
Brown rice	14
Glutinous rice	22
Barely	12
Job’s tear	17
Food strains (total 14)	-
Sunshik	5
Gimbab	3
Meat	2
Korean rice cake	2
Unknown	2
Total	160

<실시예 2> B. cereus 분리 동정

B. cereus의 분리 동정은 식품공전에 준하여 각 시료에서 25g을 무균적으로 취하여 225 mL의 완충희석액(Oxoid, England)을 가하고, 균질기(Bagmixer 400 Stomacher, Interscience, France)로 15분 동안 균질화한 후, 상기 균질화한 검액을 MYP(Mannitol egg Yolk Polymyxin agar) 한천배지(Difo, Fetroit, Mich)에 회석 도말한 후 37 ℃에서 24시간동안 배양하였다.

배양된 집락 중 선홍색의 전형적인 집락을 선별하여 TSA배지(Oxoid, England)에 도말하고 37℃에서 24시간 배양한 후 그람염색을 실시하여 포자를 갖는 그람양성, 긴 형태의 간균으로 운동성이 확인된 균을 API 50CHB(bioMerieix Inc. Durham, N.C) 및 API 20E(bioMerieix Inc. Durham, N.C) 생화학 동정 Kit를 이용하여 B. cereus임을 확인하였다. 최종 확인된 B. cereus는 -70℃에서 보관하며 실험에 사용하였다.

<실시예 3> B. cereus의 설사독소 유전자 분석

1. DNA의 분리

구토독소 생산 분리균주는 TSB(Trypticase soy btoth) 배지(Oxoid, England)에 35℃에서 12시간 배양하여, 에펜도프 튜브(Eppendorf Tube)에 1 ml 취한 후 원심분리 하여 상층액을 제거하고 균체 만 남긴 후 끓는 물에 10분간 충분히 방치한 후, DNA 추출키트(extraction kit)를 사용하여 얼음에서 2시간 방치한 후 원심분리 후 상층액 사용하였다.

설사독소 생산균주는 TSB 배지에 35℃에서 12시간 배양한 후 얻은 검액을 에펜도프 튜브에 1 ml 취한 후 원심분리(14,000 rpm, 3분)하여 상층액을 제거한 후 남은 균체를 멸균 증류수 500 로 현탁시키고, 세척하는 과정을 2회 반복하였다. 균체에 DNA 추출액(Celex 100) 100 를 첨가하고 균질화하여 균체를 현탁시키고, 95℃에서 20분간 충분히 가열하여 세포를 완전히 파괴한 후 원심분리(14,000 rpm, 10분)하여 상등액을 DNA template로 사용하였다.

2. 설사유전자 검출

반응액의 조성은 10 mM Tris-HCl, 1.5 mM MgCl2, 40 mM KCl, 0.001% gelatin, 250 μM dNTP, primer 30 pM, 1 U Taq polymerase를 함유하도록 조제한 후, 하기 [표 2]의 프라이머를 사용하여 각각의 반응 조건에서 DNA 증폭, 증폭된 DNA는 1.5% agarose gel에 TBE buffer를 사용하여 100 volt로 50분간 전기영동 후 imege analysis system을 이용하여 PCR 결과를 확인하였다.

Sequences of primers and PCR reaction conditions used in this study

Amplification target	Primer	Sequence (5'-3')	Reaction condition	Amplicon size (bp)
nheA	NHA F	GTTAGGATCACAATCACCGC	94℃ 2 min →(94℃ 60 sec→56℃ 60 sec →72℃ 120 sec) 35 cycle →2℃ 5 min	755
	NHA R	ACGAATGTAATTTGAGTCGC
nheB	NHB F	TTTAGTAGTGGATCTGTACGC	94℃ 2 min →(94℃ 60 sec→54℃ 60 sec →72℃ 120 sec) 35 cycle →2℃ 5 min	743
	NHB R	TTAATGTTCGTTAATCCTGC
nheC	NHC F	TGGATTCCAAGATGTAACG	94℃ 2 min →(94℃ 60 sec→54℃ 60 sec →72℃ 120 sec) 35 cycle →2℃ 5 min	683
	NHC R	ATTACGACTTCTGCTTGTGC
hblC	HBC F	GATACTCAATGTGGCAACTGC	94℃ 2 min→(94℃ 60 sec→58℃ 60 sec →72℃ 120 sec) 35 cycle →2℃ 5 min	740
	HBC R	TTGAGACTGCTCGTCTAGTTG
hblD	HBD F	ACCGGTAACACTATTCATGC	94℃ 2 min→(94℃ 60 sec→58℃ 60 sec →72℃ 120 sec) 35 cycle →2℃, 5 min	829
	HBD R	GAGTCCATATGCTTAGATGC
hblA	HBA F	AAGCAATGGAATACAATGGG	94℃, 2 min → (94℃, 60 sec→56℃, 60 sec →72℃, 120 sec) 35 cycle →72℃, 5 min	1,154
	HBA R	AGAATCTAAATCATGCCACTGC
entFM	ENT F	AAAGAAATTAATGGACAAACTCAAACTCA	95℃ 3 min →(95℃ 30 sec→60℃ 30 sec →72℃ 60 sec) 35 cycle →2℃ 5 min	596
	ENT R	GTATGTAGCTGGGCCTGTACGT
cytK	CYK F	GTAACTTTCATTGATGATCC	95℃ 1 min→(95℃ 60 sec→48℃ 60 sec →72℃ 60 sec) 30 cycle →2℃ 7 min	505
	CYK R	GAATACTAAATAATTGGTTTCC

<실시예 4> 유전자 염기서열 분석

유전자은행(Gene Bank, NCBI, National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있는 B. cereus의 구토형 독소 관련 유전자 염기서열을 확보하여 구토형 독소 관련 유전자를 증폭시킬 수 있는 일반적인 프라이머(universal primer)를 제작, 위 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고 증폭된 DNA 절편에 대해 염기서열을 결정(sequencing)하였다.

<실시예 5> 구토독소 검출 PCR primer의 민감도, 특이도 및 정확도 분석

기존 보고되어 있는 구토독소 유전자 검출 PCR primer의 민감도, 특이도 및 정확도를 측정하기 위하여 하기 [표 3]에 나타난 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 민감도, 특이도 및 정확도는 Greenhalgh (1997)에 따라 계산하였다.

PCR primers and cycling conditions for the detection of emetic toxin producing B. cereus

Primer name	Primer sequence (5'-3')	PCR cycling conditions	Amplicon size (bp)
CER	ATCATAAAGGTGCGAACAAGAAAGATCAACCGAATGCAACTG	95℃ 10min→(94℃ 60sec→52℃ 60sec →72℃ 60sec) 35 cycle →2℃ 5min	188
EM1	GACAAGAGAAATTTCTACGAGCAAGTACAATGCAGCCTTCCAATTACTCCTTCTGCCACAGT	95℃ 15min→(95℃ 30sec→60℃ 30sec →72℃ 60sec) 30 cycle →2℃ 5min	635
RE234	AACGTCGGTATGATTTTAGGCTCTTCTGCTCTCTATTTATGTC	95℃ 1min →(95℃ 5sec→54℃ 10sec →72℃ 20sec) 35 cycle →2℃ 5min	234
CES	GGTGACACATTATCATATAAGGTGGTAAGCGAACCTGTCTGTAACAACA	95℃ 15min →(95℃ 60sec→53℃ 75sec→ 72℃ 50sec) 5 cycle →(95℃ 60sec→58℃ 75sec →72℃ 50sec) 25 cycle →72℃ 5min	1,271
Ces3R CESR2	TTGTTGGAATTGTCGCAGAGGTAAGCGAACCTGTCTGTAACAACA	95℃ 3min →(95℃ 30sec→60℃, 30sec →72℃ 60sec) 35 cycle →2℃ 5min	405

<실시예 6> B. cereus 동시 검출 PCR primer kit 개발

1. PCR primer 설계

B. cereus의 독소 유전자를 확인하기 위하여 독소유전자 염기서열을 Gene bank를 통하여 검색하고, NCBI(미국 국립생물정보센터)를 통해 이미 발표된 독소 유전자의 염기서열을 확보하였다. 확보된 독소 유전자 단편의 양 말단에서 약 20 bp 내외의 염기서열에 대응하는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 합성하였다.

프라이머(primer)와 주형 DNA 간의 결합력을 강하게 유지할 수 있도록 G+C 비율이 약 50% 되게 디자인하였으며, 각각의 프라이머들의 어닐링(annealing) 온도를 일치 시켜 각 독소 유전자를 동시에 검출할 수 있도록 하였다. 또한 각 primer 간의 상보적인 염기 결합이 발생하지 않도록 디자인하였다.

2. PCR primer kit의 민감도 및 특이도 검사

민감도와 특이도 검사는 식품과 환경, 인체에서 분리한 B. cereus 중 HPLC/MS를 통해 구토 독소가 확인된 균주와 구토 독소가 확인되지 않은 균주 및 이 콜라이(E. coli), 스타필로코쿠스 어리우스(Staphylococcus aureus) 등 식중독 균주를 대상으로 개발된 독소 유전자 동시 검출 프라이머 키트(Primer kit)를 이용하여 PCR을 수행하였다.

3. PCR primer kit의 최소검출한계 탐색

TSB 배지에 B. cereus를 접종하여 하룻밤 배양한 후 균수가 105 101 CFU/ml가 되도록 TSB로 희석한 후 DNA extraction kit (Wizatd Genomic DNA purification kit, Promega, USA)를 이용하여 DNA를 추출하여 PCR 수행하였다. 식품에 대한 B. cereus 검출한계를 조사하기 위하여 25 ml의 탈지유를 225 ml의 멸균인산완충액으로 희석한 후 B. cereus를 105 CFU/ml의 농도가 되도록 접종 후 filter bag에 넣어 pulsifier에서 1 분간 진탕하였다. 균질화된 여액 1 ml을 취하여 10배 계단 희석하였으며 각각의 희석액의 균수를 측정하는 한편, DNA extraction kit를 이용하여 DNA를 추출 PCR 수행하였다.

<실시예 7> 식품 중 B. cereus 분리 동정

2009년 3월부터 2009년 4월까지 강원도와 경기도 지역의 대형 마트와 재래시장에서 판매되는 떡 52건, 김밥 56건을 수거하여 B. cereus를 분포 현황을 조사하였으며 그 결과는 하기 [표 4]에 나타내었다. 떡 1건(1.1%)과 김밥 3건(5.4%)에서 B. cereus가 검출되어 떡과 김밥 총 108건 중 4건 3.7%의 검출율을 나타내었다. Tegifeel 등은 쌀(raw rice)에서 40 ? 100% 검출 된다고 하였으나 본 연구 결과 김밥과 떡에서 낮은 검출율을 나타낸 것은 제조 과정 중 세척공정과 가열공정 중 B. cereus가 사멸되어 낮은 검출율을 나타낸 것으로 판단된다. 또한, 떡에 비하여 김밥의 검출율이 높은 것은 떡에 비해 김밥의 제조공정에 더 많은 수작업이 행하여지기 때문인 것으로 판단된다.

Bacillus cersus isolates from Korean rice cakes and Kimbab

Sample	No. of samples	No. of detection samples	Detection rate (%)
Korean rice cake	52	1	1.9
Kimbab	56	3	5.4
Total	108	4	3.7

<실시예 8> 설사독소 생산 B. cereus 독소 유전자 분석

B. cereus의 주요 설사독소는 헤모리신 BL (haemolysin BL), 논헤몰리틱 엔테로톡신(non-haemolytic enterotoxin), 싸이토톡신 K(cytotoxin K) 및 엔테로톡신(entrotoxin) FM으로 보고되어 있으며, 이 설사형 독소들은 열에 민감하여 56°C에서 5분간의 열처리로 불활성화 되는 것으로 알려져 있다.

장독소 활성을 가진 헤모리신 BL은 B, L₁과 L₂의 3가지 단백질로 구성되어 있으며 B. cereus 독소 중 최초로 그 특성이 밝혀진 엔테로톡신이다. 상기 장독소 활성을 가진 헤모리신 BL은 B.cereus 설사의 주요 독성인자로 보고되어져 왔으며, 장독소 활성을 발현하기 위하여 세 가지 구성성분이 모두 필요하다고 보고되었다.

Lund와 Granum(1996)에 의하여 논헤몰리틱 엔테로톡신이 최초로 보고되었으며, 상기 논헤몰리틱 엔테로톡신의 세 가지 구성성분은 1995년 노르웨이에서 발생한 대규모의 식중독 사고 후 분리된 B. cereus로부터 분리 정제되었다. Granum 등은 B. cereus 균주 대부분이 논헤몰리틱 엔테로톡신을 생산하고 약 50%가 HBL을 생산한다고 보고하였다.

국내 B. cereus 식중독의 주요 설사독소를 파악하고자 분리 및 수집된 B. cereus 160주 중 HPLC/MS분석을 통해 구토독소 생성이 확인되지 않은 설사형 B. cereus 120주의 주요 설사 독소 유전자를 분석하였다.

분석한 독소유전자는 B. cereus의 설사유전자인 nheA, nheB, nheC, hblC, hblD, hblA, entFM과 cytK 독소 유전자로서 그 분석 결과는 하기 [표 5]에 나타내었다.

Distribution of toxin genes among 120 enterotoxic Bacillus cereus isolated from varios sources in Korea

Toxin gene	No. (%) ofclinical strains(n=45)	No. (%) ofgrain strains(n=64)	No. (%) offood strains(n=11)	Total(n=120)
nheABC	44 (97.8%)	59 (92.2%)	10 (90.9%)	113 (94.2%)
hblCDA	40 (90.9%)	59 (92.2%)	8 (66.7%)	107 (89.2%)
entFM	34 (75.6%)	39 (60.9%)	6 (54.5%)	79 (65.8%)
cytK	20 (44.5%)	36 (56.3%)	7 (63.6%)	63 (52.5%)

상기 [표 5]와 같이 120주의 B. cereus중 113주(94.2%)의 B. cereus에서 nheABC 가 확인 되었으며, hblCDA의 경우 107주(89.2%)에서 확인되었고, entFM과 cytK은 각각 79주(65.8%)와 63주(52.5%)가 검출 되었다.

또한 설사형 B. cereus 120주의 설사독소 유전자 pattern을 분석한 결과는 하기 [표 6]에 나타내었으며 nheABC, hblCDA, entFM과 cytK 설사 독소 유전자를 가지고 있는 B. cereus (pattern Ⅰ)가 120주 중 47주(39.2%)로 가장 높은 비율을 나타내었으며, nheABC, hblCDA와 entFM 설사 독소 유전자를 가지고 있는 B. cereus (pattern Ⅱ)가 24주(20%), nheABC와 hblCDA 설사 독소 유전자를 가지고 있는 B. cereus (pattern Ⅵ)가 24주(20%)로 분석 되었다.

이러한 결과는 B. cereus 균주의 92-100%가 NHE 설사독소를 함유한다는 보고 (Buchanan and Schultz, 1994; Day et al., 1994)와 일치하는 결과이다. 분석 결과 국내 분리 설사형 B. cereus 균주의 대표적 설사독소는 nheABC와 hblCDA로 나타났으며 본 실험에 사용된 B. cereus 균주는 하나 이상의 설사 독소유전자를 포함하고 있는 것으로 확인되었다. 따라서 국내 분리 B. cereus 균주는 식중독을 유발시킬 가능성이 매우 높을 것으로 사료된다.

Different toxin gene profilies of 120 enterotoxic Bacillus cereus strains

Pattern	nheABC	hblCDA	entFM	cytK	No. (%) of B. cereus strains
Ⅰ	+	+	+	+	47 (39.2%)
Ⅱ	+	+	+	-	24 (20.0%)
Ⅲ	+	+	-	+	9 (7.5%)
Ⅳ	+	-	+	+	3 (2.5%)
Ⅴ	-	+	+	+	2 (1.7%)
Ⅵ	+	+	-	-	24 (20.0%)
Ⅶ	+	-	+	-	3 (2.5%)
Ⅷ	+	-	-	+	1 (0.8%)
Ⅸ	-	+	-	+	1 (0.8%)
Ⅹ	+	-	-	-	2 (1.7%)
ⅩⅠ	-	+	-	-	3 (2.5%)
ⅩⅡ	-	-	-	+	1 (0.8%)

<실시예 9> 구토독소 생산 B. cereus 독소 유전자 분석

베타 락탐 안티바이오틱(β-lactam antibiotic)과 싸이클로스포린(cyclosporin)과 같은 주요한 바이오엑티브 펩타이드(Bioactive peptide)들은 NRPS(non-ribosomal peptide synthetases)을 통해 합성되는 것으로 알려져 있다 (Chong et al., 1998; Weber and Marahiel, 2001).

세레울라이드(Cereulide)로 명명된 B. cereus의 구토 독소는 4개의 아미노(amino)기와 옥시 에시드(oxy acid)가 3반복된 고리구조(ring) 형태로 이루어져 있다. [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val]₃의 고리구조는 환외 여과막을 통과하는 분자량 1.2 kDa의 저분자 펩타이드이며, 화학적으로 포타슘 이오노포어 발리노마이신(potassium ionophore valinomycin)과 매우 유사하여 구토독소인 세레울라이드도 NRPS를 통해 합성되는 것으로 보고되고 있다(Agataet al., 1995).

구토독소는 126°C로 90분간 가열하여도 파괴되지 않는 열 저항성과 산, 알칼리, 단백질 가수분해효소에도 저항성을 가지고, 항체를 형성하지 않는다. 이러한 이유로 구토를 일으키는 독소가 더 쉽게 질병을 일으키지만 아직까지 구토독소의 생합성 경로와 작용 기작은 정확하게 밝혀지지 않았다. B. cereus 160주 중 HPLC/MS분석을 통하여 구토독소 생성이 확인된 구토독소 생산 B. cereus 40주의 주요 설사독소 유전자를 파악하기 위하여 nheA, nheB, nheC, hblC, hblD, hblA, entFM, cytK과 NRPS gene 유전자를 분석하였다.

Distribution of enterotoxin toxin genes in 40 emetic type of Bacillus cereus isolated in Korea

Toxin gene	No. (%) offeces strains(n=33)	No. (%) ofvomit strains(n=3)	No. (%) offood strains(n=4)	Total(n=40)
nheABC	26 (78.8%)	3 (100%)	4 (100%)	33 (82.5%)
hblCDA	3 (9.1%)	0 (0%)	0 (0%)	3 (7.5%)
entFM	15 (45.5%)	3 (100%)	2 (5.0%)	20 (50.0%)
cytK	11 (33.3%)	0 (0%)	0 (0%)	11 (27.5%)

상기 [표 7]의 분석 결과와 같이 구토독소 생산 B. cereus 40주 모두에서 NRPS gene이 확인 되었으며 40주의 B. cereus 중에서 33주 (82.5%)에서 nheABC가 확인 되었으며 20주(50%)에서 entFM이 확인 되었다.

또한 구토독소 생산 B. cereus의 설사독소 유전자 pattern을 분석한 결과 40주의 B. cereus 중 nheABC와 entFM 설사독소 유전자를 동시에 가지고 있는 B. cereus (pattern Ⅲ)가 13주(32.5%)로 확인 되었으며, nheABC 설사독소 유전자를 가지고 있는 B. cereus (Pattern Ⅴ)가 9주(22.5%)로 확인 되었다. 분석 결과 국내 분리 구토독소 생산 B. cereus 균주의 대표적 설사독소는 nheABC와 entFM으로 나타났으며, 구토형의 경우 설사형과 대조적으로 hblCDA 독소 유전자가 매우 낮게 검출되어 구토독소 생산 B. cereus에 의한 설사증상은 대부분 NHE 독소에 의한 것으로 판단된다.

이러한 결과는 다양한 분리원에서 분리된 대부분의 B. cereus 균주가 NHE 독소를 가진다는 보고와 구토독소 생산 B. cereus의 경우 구토독소와 NHE 독소를 동시에 가진다는 보고와 일치하는 결과이다 (Anderson et al., 2001; Guinebretiere et al., 2002; Kim et al., 2009).

하기 [표 8]와 같이 구토독소 생산 B. cereus 균주의 독소유전자 pattern을 분석한 결과 본 실험에 사용된 85%의 구토독소 생산 B. cereus 균주는 하나 이상의 설사 독소를 포함하고 있는 것으로 확인되었다.

Different toxin gene profilies in emetic type of Bacillus cereus strains used in this study

Pattern	NRPS gene	nheABC	hblCDA	entFM	cytK	No. (%) ofB . cereus strains
Ⅰ	+	+	+	+	+	3 (7.5%)
Ⅱ	+	+	-	+	+	3 (7.5%)
Ⅲ	+	+	-	+	-	13 (32.5%)
Ⅳ	+	+	-	-	+	5 (12.5%)
Ⅴ	+	+	-	-	-	9 (22.5%)
Ⅵ	+	-	-	+	-	1 (2.5%)
Ⅶ	+	-	-	-	-	6 (15.0%)

이러한 결과는 국내에서 분리된 구토독소 생산 B. cereus 대부분은 구토독소와 설사독소 모두 생성 할 수 있을 것으로 사료되며, 구토독소 생산 B. cereus는 설사형 식중독을 동시에 유발 시킬 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 설사형 및 구토형 B cereus를 정확히 동정하기 위하여 구토독소 및 설사독소를 동시에 분석하여야 할 것으로 판단되며, 설사독소와 구토독소 유전자를 동시에 검출할 수 있는 multiplex-PCR kit가 절실히 필요하다고 할 것이다.

<실시예 10> 기존 구토독소 생산 B. cereus 검출 PCR primer 검증

베타 락탐 안티바이오틱과 싸이클로스포린과 같은 주요한 바이오엑티브 펩타이드들은 NRPS(non-ribosomal peptide synthetases)을 통해 합성되는 것으로 알려져 있다(Chong et al., 1998; Weber and Marahiel, 2001). B. cereus 구토독소의 헤테로싸이클릭(heterocyclic) 구조와 펩타이드(peptide)의 D-아미노산(D-amino acid)의 존재는 NRPS gene과 구토 독소 생성과의 연관성을 제시해 주고 있으며 (Horwood et al., 2004; Toh et al., 2004), B. cereus의 구토독소 유전자 검출을 위한 PCR 분석방법은 구토독소 생산에 원인으로 밝혀진 NRPS gene을 기초로 발전해 왔다 (Ehling-Schulz et al., 2004a 2005a Horwoodet al., 2004; Seong et al., 2008).

본 실험에서는 기존 보고되어 있는 구토독소 생산 B. cereus 검출 PCR primer의 민감도, 특이도 및 정확도를 분석하기 위하여 HPLC/MS로 구토독소 생산이 확인된 40주와 비생산균주 120주 총 160주를 실험균주로 PCR을 수행하였다.

하기 [표 9]의 분석결과와 같이 구토독소 생산 B. cereus 40주에서는 (Group Ⅰ) 구토독소 관련 유전자가 검색 되었으며, 구토독소 비생산 B. cereus 4주에서 (Group Ⅱ) 구토독소 관련 유전자가 검색되었다. 기타 구토독소 비생산 B. cereus 116주에서는 (Group Ⅲ) 구토독소 관련 유전자가 검색되지 않았다.

기존 보고된 구토형 B. cereus 검출 PCR primer를 이용 국내 분리 구토형 B. cereus 균주에 대한 민감도, 특이도 및 정확도를 측정한 결과는 하기 [표 10]에 나타내었다. 구토독소인 cereulide 생성과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려진 NRPS 유전자를 Target으로 디자인된 CER primer(Horwood t al., 2004)는 실험에 사용된 Primer중 가장 높은 민감도(100%)를 나타냈으며 EM1 primer(Ehling-Schulz etal., 2004a)는 85% 민감도를 나타내었다.

그러나 NRPS gene을 바탕으로 디자인된 CER primer와 EM1 primer는 구토 독소를 생성하지 않는 설사형 B. cereus 6주에도 PCR band가 검출되어 특이도가 민감도에 비해 다소 낮게 나타났다. RE234 primer 쌍의 경우 RAPD(random amplified polymorphic DNA) PCR 결과 구토독소 생성 B. cereus의 특정 증폭 밴드를 분리, 염기서열을 분석하여 설계한 primer로 (Nakano et al., 2004) 구토독소 생성 B. cereus에 대하여 RE234 primer는 90.0 %의 민감도를 나타냈다.

다만 RE234 primer의 경우 구토독소를 생산하지 않는 설사형 B. cereus 4주에서 PCR band를 나타내었다. CES와 Ces3R/CESR2 primer의 경우 다른 primer 보다 낮은 57.5 %와 35 %의 민감도를 나타내었다. CES primer는 구토독소를 생산하는 B. cereus의 NRPS 유전자 중 valine modules을 기초로 디자인 되었으며 Ces3R/CESR2 primer는 CES primer를 바탕으로 다시 디자인 되었다 (Seong et al., 2008).

CES primer는 100%의 특이도를 나타내었으며 CER primer는 구토독소를 생산하지 않는 JNHE 38, KNIH 29, KUGH 143과 KUGH 13균주에서 PCR band가 확인되어 96.7 %의 특이도를 나타내었다. EM1과 Ces3R/CESR2 primer는 설사형 B. cereus인 KUGH 143에서 PCR band가 확인 되어 99.2 % 특이도를 나타내었다. RE234 primer는 구토 독소를 생성하지 않는 KUGH 143과 KUGH 139에서 PCR band가 확인되어 98.3 % 의 특이도를 나타내었다. Nakano (2004)등의 연구에 따르면 RE234 primer를 이용한 PCR 분석 결과 실험에 사용된 구토형 B. cereus 모두에서 PCR band가 확인 되었으나, 구토 독소를 생성하지 않는 설사형 B. cereus (ATCC 7004)에서도 PCR band가 확인 되었다고 보고된 바 있다.

각 primer의 정확도를 분석한 결과 CER은 97.5 %, EM1 95.6 %, RE234은 96.3 %, CES는 89.4 % 그리고 Ces3R/CESR2는 83.1 %의 정확도를 나타내는 것으로 확인되었다. 각각 primer 간의 민감도, 특이도 및 정확도의 차이는 각각 primer가 구토독소 생산 관련 유전자의 다른 부위를 target으로 디자인되었기 때문으로 사료된다. 본 실험 결과 CER primer가 가장 높은 민감도와 정확도를 나타내는 것으로 확인 되었으며 CES primer가 가장 높은 특이성을 나타내는 것으로 확인 되었다. 따라서 본연구에서는 CER과 CES primer를 개발하는데 바탕이된 유전자를 Multi-PCR primer kit 개발에 이용하였다.

1) HPLC/MS with ion trap detector was performed to detect emetic toxin.

2)Clinical strains contained GIHE 5609, 5616, 5618, 5619, 5625, 5629, 5633, 5674~ 5677, 5679~5689, 6011, 6013, ICHE 0901~0909, SEHE 4153, 4154, 4158, 4165, 4300, 4303, JNHE 63, 66.

3) Grain strains contained GIHE 5603, 5605, 5610~5615, 5620, 5621, 5623, 5624, 5626~5628, 5630, 5632, 5634~5668, 5670~5673, 5691~5698.

4) Food strains contained GIHE 5617, 6007, 6008, 5602, 5607, 5601, 4605, 4616, 4618, 4628, 4629.

Evaluation of PCR assays compared with emetic toxin producing Bacillus cereus strains confirmed from HPLC/MS analysis

PCR primers	Emetic toxin producing strains (n=40)		Enterotoxin producing strains (n=120)		Sensitivity1 ) (%)	Specificity2 ) (%)	Accuracy3 ) (%)
	Detection of emetic toxin related gene amplicon (a)	Non-detection of emetic toxin related gene amplicon (b)	Detection of emetic toxin related gene amplicon (c)	Non-detection of emetic toxin related gene amplicon (d)
CER	40	0	4	116	100.0	96.7	97.5
EM1	34	6	1	119	85.0	99.2	95.6
RE234	36	4	2	118	90.0	98.3	96.3
CES	23	17	0	120	57.5	100.0	89.4
Ces3R/CESR2	14	26	1	119	35.0	99.2	83.1

1) Sensitivity was calculated by the number of true positive (a) divided by the sum of true positive (a) plus false negative (b).

2)Specificity was calculated by the number of true negative (d) divided by the sum of false positive (c) plus true negative (d).

3) Accuracy was calculated by the sum of true positive (a) plus true negative (d) divided by the number of total strains tested.

<실시예 11> PCR primer 설계

본 연구결과 국내 분리 구토형 B. cereus 40주 중 34주(85%)에서 하나 이상의 설사 독소 유전자를 포함하고 있는 것으로 확인 되었으며, BDE-VIA (NHE)와 BCET-RPLA (HBL) kit 검사를 통한 설사독소 생산능을 측정한 결과 설사 독소 유전자를 포함하고 있는 구토형 B. cereus 모두에서 설사독소 생산이 확인 되었다.

이러한 결과는 구토형 B. cereus도 NHE 설사독소 생성이 가능하다는 보고(Ehling-Schulz et al., 2005b 2006)와, Yang 등의 (2005) 구토형 B. cereus가 구토형 식중독과 설사형 식중독 모두를 유발 시킬 수 있다는 보고와 일치하는 결과이다.

본 연구 결과 구토 및 설사 독소 유전자를 동시에 검색할 수 있는 multiplex PCR primer를 개발이 절실히 필요한 것으로 판단되며, 설사독소 유전자 중 검출빈도가 높은 nheA, hblC, entFM, cytK 유전자와 기존 보고된 구토독소 유전자 검출 primer 중 가장 높은 민감도와 특이도를 나타낸 CER과 CES 유전자를 target으로 multiplex PCR primer디자인 하였다. 또한 구토형 B. cereus 균주의 유전자 염기서열을 확보하기 위하여 CES primer를 이용 PCR을 실시한 후 유전자 염기서열을 확인한 결과 국내 분리 구토형 B. cereus의 유전자 염기서열이 매우 유사함을 알 수 있었다.

Primer 디자인은 NCBI에 각 독소 유전자를 검색, NCBI에 등재된 염기서열을 기초로 디자인 하였으며 확보된 독소 유전자 단편의 양 말단에서 약 20 bp 내외의 염기서열에 대응하는 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. primer 디자인 프로그램은 진피셔(Genefisher, http://www.genefisher.de/)를 이용하여 primer를 디자인 하였으며, primer와 주형 DNA 간의 결합력을 강하게 유지할 수 있도록 G+C 비율 40~60% 로 디자인하였다.

각각의 프라이머(primer)들의 어닐링(annealing) 온도를 일정 온도로 설정하여 각 독소 유전자를 동시에 검출할 수 있도록 하였으며 또한 각 primer 간의 상보적인 염기 결합이 발생하지 않도록 디자인하였다. Primer의 반응 조건은 initial Denaturation은 95℃에서 10분간 처리하였다. 그리고 Denaturation단계로서 94℃에서 60초, Annealing단계로서 54℃에서 60초, Extension단계로서 72℃에서 60초를 35 cycle 부여하였다. 그리고 Final Extension은 72℃에서 5분으로 설정하였다.

B. cereus의 구토 및 설사독소 유전자 검출을 위하여 디자인된 [서열번호 1] 내지 [서열번호 12]와 같은 Primer sequence의 Product length 및 Design source는 하기 [표 11]에 나타내었다.

Sequence of multiplex PCR primer (New Design)

target gene	sequence		Product length	Design source1 )
cytK	Forward multiplex PCR primer	TGCTAGTAGTGCTGTAACTC	881	DQ019311
	Reverse multiplex PCR primer	CGTTGTTTCCAACCCAGT
nheA	Forward multiplex PCR primer	GGAGGGGCAAACAGAAGTGAA	750	DQ019312
	Reverse multiplex PCR primer	CGAAGAGCTGCTTCTCTCGT
ces	Forward multiplex PCR primer	TTCCGCTCTCAATAAATGGG	634	AY691650
	Reverse multiplex PCR primer	TCACAGCACATTCCAAATGC
CER	Forward multiplex PCR primer	GCGTACCAAATCACCCGTTC	546	AY576054
	Reverse multiplex PCR primer	TGCAGGTGGCACACTTGTTA
hblC	Forward multiplex PCR primer	CGCAACGACAAATCAATGAA	421	AY786407
	Reverse multiplex PCR primer	ATTGCTTCACGAGCTGCTTT
entFM	Forward multiplex PCR primer	AGGCCCAGCTACATACAACG	327	AY789084
	Reverse multiplex PCR primer	CCACTGCAGTCAAAACCAGC

1) NCBI Accession number.

<실시예 12> PCR primer kit의 민감도 특이도 분석

구토 및 설사독소 유전자 검색을 위하여 디자인된 multiplex PCR primer의 민감도, 특이도 및 정확도를 평가하기 위하여 식품, 인체, 환경에서 분리한 160주의 바실러스 세리우스(B. cereus)와 이 콜라이(E. coli), 스타필로코쿠스 어리우스(Staphylococcus aureus) 등 식중독 균주를 대상으로 등 식중독 균주 및 바실러스 세리우스 ATCC 14579와 F4810/72 균주를 대상으로 개발된 독소 유전자 동시 검출 Primer kit를 이용하여 PCR을 수행하였다.

설사독소인 nheA, hblC, entFM, cytK 유전자의 검출은 바실러스 세리우스 160주를 대상으로 기존 보고된 PCR primer를 이용한 실험결과와 동일한 결과를 도출하였으며 E. coli 등 기타 식중독 균주에서는 band가 확인되지 않아 새로 디자인된 설사독소 PCR primer의 민감도, 특이도 및 정확도가 매우 띄어난 것을 확인할 수 있었다. 또한 구토독소 유전자인 CER를 대상으로 설계된 primer는 구토형 B. cereus 40주 모두에서 목적 band (546 bp)를 확인하여 뛰어난 민감도를 나타내었으나 설사형 B. cereus 120주 중 2주에서 밴드를 나타내어 특이도는 민감도에 비하여 다소 낮게 나타났다.

그러나 기존 CER primer 실험결과 설사형 120주 중 4주에서 밴드를 나타낸 것에 비하면 새로 디자인된 PCR primer가 기존 primer에 비하여 특이도가 뛰어남을 확인할 수 있었다 (도 1, 도 2 및 도 3 참조).

<실시예 13> PCR primer kit의 최소 검출한계 분석

상기와 같이 디자인된 multiplex PCR primer의 최소 검출한계를 설정하기 위하여 순수배양지(Pure culture)와 식품(탈지유)에서의 최소 검출한계를 측정하였다. 구토독소 생산 레퍼런스(reference) 균주인 F4810/72균주와 수집된 구토형 B. cereus 중 2주 (JNHE36, KUGH11)를 선정하여 multiplex PCR의 최소 검출 한계를 측정하였다.

하기 [표 12]에서와 같이 F4810/72와 JNHE36는 각각 4.3X10²와 7.2X10² 로 확인 되었으며 KUGH11는 ces, entFM은 8.8X10² 로 확인되었고, CER과 nheA는 8.8X10¹ 수준에서도 검출이 가능한 것으로 나타났다. 그러나 탈지유에서는 F4810/72, JNHE36와 KUGH11의 최소 검출수준이 각각 4.3X10³, 7.2X103, 8.8X10³ 으로 높아지는 것으로 나타났다.

탈지유에서 최소 검출 한계가 높아지는 것은 일반적으로 우유에 존재하는 고농도의 양이온(cations), 프로테아제(proteases), 뉴클레아제(nucleases), 지방산(fatty acid) 등의 PCR 저해물질 때문인 것으로 사료된다. 이러한 PCR 저해물질은 디엔에이 폴리머레이즈(DNA polymerase)나 템플릿 디엔에이(templet DNA)를 둘러싸 PCR 반응을 저해하기 때문이다. Alarcon (2005)등의 연구에서와 같이 식품에 균체를 접종 후 PCR 분석을 시행했을 경우 최소 검출한계가 높아진다는 보고와 일치하는 결과라 할 수 있다.

Detection limits of multiplex PCR assay

Strain No.

CFU/ tube

Pure culture

Artificially inoculated milk1 )

ces

CER

nheA

hblC

entFM

cytK

ces

CER

nheA

hblC

entFM

cytK

F4810/72

4.3X100

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4.3X101

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4.3X102

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4.3X103

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4.3X104

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JNHE36

7.2X100

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7.2X101

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7.2X102

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7.2X103

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7.2X104

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KUGH11

8.8X100

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8.8X101

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8.8X102

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8.8X103

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8.8X104

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1)DNA isolated from 1 mL aliquots of artificially inoculated milk without enrichment was used as template.

국민의 건강과 식품 안전에 대한 관심의 증폭, 식품안전성에 대한 규제의 강화, 생산자와 품질 향상을 통한 경쟁력 제고, 수입식품의 증가에 따른 식품안전 관리의 필요성 대두 등으로 인해 식품 유해물질 검사는 기하급수적으로 증가하고 있다.

이에 바실러스 세리우스에 의한 식중독과 관련하여 설사형 독소 검출법으로 종래 HPLC, GC, MS 등이 이용되었고, 최근 중합 효소 연쇄 반응, ELISA(enzyme linked immunoassay)와 RPLA(reversed passive latex agglutination) 등이 개발되어 있다. 그러나 구토형 독소 검출방법과 관련된 연구는 전무한 실정이다.

따라서 본 발명은 구토형 독소를 생성하는 바실러스세리우스를 신속, 정확하게 검출할 수 있고, 나아가 구토독소 및 설사독소를 동시에 검출할 수 있도록 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트를 제공함으로써, 식중독 발생을 사전에 예방할 수 있도록 하므로 산업상 이용가능성이 우수하다.

나아가 본 발명은 식품안전평가에 대한 표준화된 시험법 등에 사용될 수 있는바, 식품의 안전성을 확보하여 궁극적으로는 식중독에 따른 경제적 또는 사회문화적 손실을 방지할 수 있으므로 산업상 이용가능성이 매우 우수하다 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

1. 바실러스 세리우스(Bacillus cereus)의 구토독소 및 설사독소를 동시에 검출할 수 있도록 재조합되고, 서열번호 7의 포워드프라이머(Forward primer) 및 서열번호 8의 리버스프라이머(Reverse primer)로 구성된 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트(multiplex PCR primer set).
2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트와 주형 DNA 간의 결합력을 강하게 유지할 수 있도록 G+C 비율이 40~60%인 것을 특징으로 하는 재조합된 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트.
3. 제1항에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트는 서열번호 1의 포워드프라이머 및 서열번호 2의 리버스프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트.
4. 제1항에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트는 서열번호 3의 포워드프라이머 및 서열번호 4의 리버스프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트.
5. 제1항에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트는 서열번호 9의 포워드프라이머 및 서열번호 10의 리버스프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트.
6. 제1항에 있어서, 상기 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트는 서열번호 11의 포워드프라이머 및 서열번호 12의 리버스프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트.

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