CN101113465A

CN101113465A - 一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒

Info

Publication number: CN101113465A
Application number: CNA2006100293489A
Authority: CN
Inventors: 李晓虹; 韩伟; 阎东丽
Original assignee: Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of PRC
Current assignee: Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of PRC
Priority date: 2006-07-25
Filing date: 2006-07-25
Publication date: 2008-01-30
Anticipated expiration: 2026-07-25
Also published as: CN101113465B

Abstract

本发明涉及一种检测样品中细菌的试剂盒，特别涉及一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒。主要解决常规电泳检测方法速度慢、灵敏度低的技术问题。本发明的技术方案为：一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，其特征是该试剂盒由以下试剂组成：试剂A：DNA提取液；试剂B：PCR引物和探针；试剂C：PCR反应液，其中含有特定的1对引物：LM1，5’端被地高辛标记的LM2，其序列分别为：5’－GAAAAAGCATTTGCCAT－3’和5’－GCAACTTCCGGCTCAGC－3’；试剂D：ELISA反应液，其中含有特定的1对引物：5’端被生物素标记的探针LM4和IS5，序列分别为：5’－GGTCAGAGTGAAGCTCATGT－3’和5’－TACGTACTCTCGATCACGTC－3’。本发明主要用于对样品中单增李斯特菌的快速检测。

Description

一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒

技术领域：本发明涉及一种检测样品中细菌的试剂盒，特别涉及一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒。

背景技术：单核细胞增生李斯特氏菌(简称单增李斯特菌L monocytogenes)是一种人畜共患致病菌，可使人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症及造成怀孕妇女流产、死胎等疾病，死亡率高达30～70％。该病广泛存在于土壤、人和动物的粪便中，很容易污染食品而引起食物中毒和李斯特病大爆发。近年来已有不少国家报道了由于污染单增李斯特菌发生的食物中毒事件。早在1929年，就有报道该菌对人有致病性，最严重的一次是1985年在美国加里福尼亚地区，应食用乳酪引起的单增李斯特菌食物中毒。目前该菌每年在美国已成为由食物污染引起死亡的四大病原菌之一。此外由于该菌在4℃冰箱保存的食品中也可生长繁殖，故其危害性进一步增大。因此世界各国政府部门对其菌越来越重视，纷纷制定一些新的食品安全法规，并把单增李斯特菌纳入法定强检项目。我国每年大量进口水产品，加入WTO以来，进出口贸易呈直线上升态势，传统的单增李斯特菌检验方法，检验周期冗长，至少需要5～14d才能得出结果，步骤繁琐且检验精度低。为了适应对外贸易发展的新需要，实现与国际检测技术接轨，有必要建立一种简便、快速、准确的检出方法，以更好的为检验检疫事业服务。

近年来，国内外的研究人员建立了多种快速检测食品中单增李斯特菌的方法，包括商海涛等的“李斯特氏菌因子血清的制备及食品检测的免疫磁性分离-PCR(MIPA)方法的建立”(中国兽医学报，1999，19(4)：339-343)、寇运同等.的“用免疫磁珠捕集法快速检测食品中的单核细胞增生李斯特菌”(检验检疫科学，2001，11(6)：12-13)、O‘Connor等的PCR/DNA探针方法、孙焕冬等“半套式聚合酶链反应检测牛奶中部分肠道致病菌”(职业与健康，2002，18(3)：43-44)等方法。上述方法样品均需前增菌，延长了检出的时间且检测的灵敏度低。还没有解决快速检出单增李斯特菌的问题。

随着分子生物学技术的发展，聚合酶链反应(PCR)技术在国际上得到了越来越广泛的应用，不少用PCR检测致病菌的方法已十分成熟，并在某些国家成为官方认可的方法。

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其它物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

PCR-ELISA技术的原理是PCR 5’端标记上地高辛或生物素等非放射性标记物，扩增产物滴加到固定有特异性探针的微孔板上，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物，最终加底物显色。在酶标板上测定OD值判定结果。根据内标的读数作出标准曲线，并利用标准曲线读出样品单增李斯特菌的含量。本发明采用PCR-ELISA方法，利用单增李斯特菌毒力簇金属蛋白酶基因(mpl)作为PCR的靶基因，应用地高辛标记的DIG-PCR-ELISA技术进行检测单增李斯特菌的研究。

发明内容：本发明的目的是提供一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，以便可以快速、灵敏、准确地检出样品中单增李斯特菌，适合于各种样品的大批量检测。本发明的技术方案为：本发明的试剂盒主要由以下几种试剂配方组成：

试剂A：DNA提取液；

试剂B：PCR引物和探针；

试剂C：PCR反应液，其中含有特定一对引物(LM1；5’端被地高辛标记的LM2)，其序列分别为：5’-GAAAAAGCATTTGCCAT-3’和5’-GCAACTTCCGGCTCAGC-3’；

试剂D：ELISA反应液(1.结合buffer；2.生物素标记的捕获探针LM4和IS5；3.变性液；4.杂交液；5.洗液I；6.anti-DIG-POD；7.洗液II；8.显色底物A；9.显色底物B；10.终止液)，其中5’端被生物素标记的探针LM4和IS5序列分别为：5’-GGTCAGAGTGAAGCTCATGT-3’和5’-TACGTACTCTCGATCACGTC-3’。

链(霉)亲和素包被的96孔板。

试剂C、D中所含的特定引物每种含量应不少于0.4μM。

本发明所提供的快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒的使用方法如下：

一、前处理样品及DNA的提取

1.离心机选取参数10000g，将1mL的待测细菌培养液离心10分钟，弃上清液。

2.沉淀重悬在500μL 50mM NaOH中，且重悬液在加热器中95℃温育10分钟，用80μL 1M Tris-HCl中和；

3.-20℃保存DNA留用。

二、PCR反应

取1μL待检样品DNA加入反应管C中，混匀后在PCR仪中进行以下反应：

95℃ 10分钟

72℃ 5分钟

4℃ 停止

三、ELISA反应

1.200μL结合buffer加入1μL 2.5μM生物素标记的捕获探针LM4(终浓度为2.5pM)，加入链(霉)亲和素包被的96孔板中，20℃～25℃孵育2小时，去掉buffer。

2.PCR产物通过加入等体积的变性液孵育10min变性，10μL已变性的PCR产物与100μL杂交液混合后加入反应板中，50℃杂交30min，然后用预热的wash buffer I 50℃洗4次。

3.每孔加入稀释的anti-DIG-POD(原浓度150U/mL，1∶2000稀释)100μL，37℃孵育30min。

4.室温用wash buffer II洗4次。

5.加入显色底物A和B后反应15min。最后加终止液100μL终止反应，

用酶标仪450nm检测吸光度。

反应结束后，根据内标的读数作出标准曲线，并利用标准曲线中单增李斯特菌的拷贝数。使用本发明的试剂盒，经实际试验，证明可以快速、准确、半定量地检出样品中的单增李斯特菌。

本发明的有益效果是：本发明检测单增李斯特菌PCR-ELISA试剂盒，可对单增李斯特菌能进行半定量检测，其方法比常规电泳检测方法灵敏度高，可达10⁴CFU/mL，在5～6小时即可完成检验。可以快速、准确、半定量地检出样品中的单增李斯特菌，适合于各种样品的大批量检测。

具体实施方式：猪肉糜和青菜用快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒检测。试剂盒组成为：

试剂A：DNA提取液，其组成为50mM NaOH，1M Tris-HCl；

试剂B：PCR引物LM1、LM2和探针LM4和IS5；

试剂C：PCR反应液，每管25μL扩增反应体系组成中含2μL 0.025mol1^-1MgCl₂；0.4μM 1对引物LM1和LM2为1μL；10×PCR buffre 2.5μL；200μMdNTP1μL；Taq酶0.75U；15U尿嘧啶-DNA糖基化酶；DNA 1μL(终浓度为10～100ng/mL)；ddH₂O 15.85μL；

试剂D：ELISA反应液，组成为1.结合buffer(10mMTris-HCl，100mMNaCl，1mMEDTA(乙二胺四乙酸二钠)，0.15％(V/V)TritonX-100，pH 7.5)；2.生物素标记探针LM4、IS5(终浓度为2.5pM)；3.变性液(125mMNaOH；20mM EDTA)；4.杂交液(2.5×SSC，2×Denhardt’s solution，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5)；5.洗液I(1×SSC，2×Denhardt’s solution，10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH7.5)；6.抗-DIG(地高辛)-POD(150U/mL，用时1∶2000稀释)7.洗液II(100mMTris-HCl，150mM NaCl，0.05％(V/V)Tween(吐温)20，0.5％(W/V)blocking reagent(反应终止剂)，100μg/mL DNA from herring sperm(鲱鱼精DNA)，pH7.5；8.显色底物A：0.4 mM TMB(四甲基联苯胺)、显色底物B(0.02％H₂O₂)；9.终止液(50mM H₂SO₄)

按本发明所提供的快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒的使用方法，先用试剂A提取样品中的DNA，进行PCR反应，反应结束后取20μLPCR反应液加至ELISA反应液中根据OD值换算样品中单增李斯特菌的拷贝数。

Claims

1.一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，其特征是，该试剂盒由以下试剂组成：

试剂A：DNA提取液；

试剂B：PCR引物和探针；

试剂C：PCR反应液，其中含有特定的1对引物：LM1，5’端被地高辛标记的LM2，其序列分别为：5’-GAAAAAGCATTTGCCAT-3’和5’-GCAACTTCCGGCTCAGC-3’；

试剂D：ELISA反应液，其中含有特定的1对引物：5’端被生物素标记的探针LM4和IS5，序列分别为：5’-GGTCAGAGTGAAGCTCATGT-3’和5’-TACGTACTCTCGATCACGTC-3’。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，其特征是所述的DNA提取液其组成为50mM NaOH，1M Tris-HCl。

3.根据权利要求1所述的一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，其特征是所述的PCR引物为LM1、LM2，探针为LM4和IS5。

4.根据权利要求1所述的一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，其特征是所述的PCR反应液为每管25μL扩增反应体系组成中含2μL 0.025mol1^-1MgCl₂；0.4μM 1对引物LM1和LM2为1μL；10×PCR buffre 2.5μL；200μMdNTP 1μL；Taq酶0.75U；15U尿嘧啶-DNA糖基化酶；DNA 1μL；ddH₂O15.85μL。

5.根据权利要求4所述的一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，其特征是DNA的终浓度为10～100ng/mL。

6.根据权利要求1所述的一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，其特征是ELISA反应液由以下组成：

结合buffer：10mMTris-HCl，100mMNaCl，1Mmedta，体积比为0.15％TritonX-100，pH7.5；

生物素标记探针LM4、IS5，终浓度为2.5pM；

变性液：125mMNaOH，20mMEDTA；

杂交液：2.5×SSC，2×Denhardt’s solution，10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH7.5；

洗液I：1×SSC，2×Denhardt’s solution，10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH7.5；

抗-DIG-POD：原浓度为150U/mL，用时1∶2000稀释；

洗液II：100mM Tris-HCl，150mM NaCl，体积比为0.05％Tween 20，重量体积比为0.5％blocking reagent，100μg/mL DNA from herring sperm，pH7.5；

显色底物A：0.4mM TMB；

显色底物B：0.02％H₂O₂；

终止液：50mM H₂SO₄。

7.根据权利要求1所述的一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒，其特征是试剂C、D中所含的特定引物每种含量应不少于0.4μM。