CN102586233B - 一种酵母中总rna的快速提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酵母中RNA的快速提取方法，其通过裂解缓冲液和玻璃珠的作用达到破壁效果，然后利用苯酚和氯仿沉淀去蛋白，再通过异丙醇沉淀RNA，75％乙醇洗涤沉淀后自然晾干，最后溶解保存。该方法操作简单，成本低，所得RNA质量也比较好，适合于实验室或商业公司试剂盒的生产。
Description
技术领域
本发明涉及酵母中RNA的提取，属于基因工程技术领域。
背景技术
RNA即Ribonucleic Acid，是生物细胞以及部分病毒、类病毒中重要的遗传信息的载体，是由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸，因含有核糖而简称为RNA。RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内，RNA和蛋白质的合成有密切的关系。
RNA作为沟通DNA和蛋白质之间的遗传信息的载体，其稳定性较差，在生物体内，一般半衰期也比较短。在体外，由于受温度和RNA酶等各种因素的限制，其稳定性就更差了。加之在人体皮肤表面和呼吸的气体中，都遍布这种RNA酶，且RNA酶抗逆能力极强，高温和酸性都很难使其变性，所以对RNA进行实际操作时，RNA极易被降解。
提取组织中的RNA时，首先面对的是对组织的破壁问题，目前比较常用的方法是液氮冷冻研磨或冷冻匀浆，国内外各种RNA提取试剂盒的原理主要是利用酸性硫氰酸胍及苯酚、氯仿等有机溶剂的作用破壁离心沉淀的方法得到RNA。最早文献报道见于Chomczynski P和Sacchi N，此种方法较为经典，至今已沿用了20多年。但其自身使用到硫氰酸胍且在酸性条件下，因而也存在着较大的诟病，硫氰酸胍的危险类别码为R32：与酸接触释放出毒性很高的气体。另外，目前商业化的RNA提取试剂盒也存在着步骤多、操作较为繁琐、耗时长和价格昂贵等问题，此外市场上这类产品也是良莠不齐，有时即使严格按照说明步骤操作也无法达到令人满意的效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一种快速、简单的RNA提取方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：收集菌体后，用DEPC处理过的超纯水洗涤；洗涤后的菌体沉淀中加入裂解缓冲液，悬浮细胞沉淀，然后加入0.3g玻璃珠及1∶1的苯酚和氯仿，涡旋混匀；加入TE溶液高速离心；取上清，加入氯仿，剧烈摇晃，高速离心；取上清，加入异丙醇沉淀RNA，并用75％乙醇洗涤沉淀，获得总RNA，所述离心均需要低温控制。
所述裂解缓冲液成分为：2％体积百分比Trition-100、1％质量百分比SDS、100mM NaCl、100mM Tris，pH8和100mM EDTA。
本发明提供的方法步骤简单，操作过程对设备要求低，对操作人员要求较低，使用到的试剂均为实验室常用试剂，较大程度上避免了使用毒性较高试剂对操作人员的伤害；采用本方法提取的RNA浓度和质量都很好，可直接用于逆转录。
说明书附图
图1实施例1逆转录PCR结果
M：1kb marker 1：crtBY 2：crtE
图2实施例2逆转录PCR结果
M：1kb marker 1：hmg1
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。
材料和试剂：
裂解缓冲液：2％(V/V)Trition-100
1％(w/v)SDS
100mM NaCl(AC)
100mM Tris，pH8(AC)
100mM EDTA(AC)
PC苯酚-氯仿1∶1(V/V)
TE(Tris-EDTA)：10mM Tris-HCl，1mM Na2EDTA，pH8
100％EtOH
玻璃珠(0.45mm)
(配制制剂的水均为DEPC-treated water；所用的枪头和EP管也均为无RNA酶污染；AC：121摄氏度灭菌。)
实施例1：红发夫酵母中RNA的提取
1、取1.5mL红发夫酵母细胞培养液，离心去上清，用DEPC处理过的超纯水洗涤沉淀一次；
2、向洗涤后的细胞沉淀中加入200ul裂解缓冲液，悬浮细胞沉淀，然后加入0.3g玻璃珠及200ul PC，涡旋3min；然后加入200ul TE，4度14000rmp离心5min；
3、将上清液转移到一个干净的离心管，加入0.2mL氯仿，剧烈摇晃15s，在室温下放置10min，12000rpm、4度离心15min；
4、取上层无色水相置于一个干净的离心管，加入500ul异丙醇，混匀，在室温下放置10min，12000rpm、4度离心10min，弃上清液；
5、加入1mL75％乙醇，涡旋混匀，12000rpm、4度离心5min；
6、弃上清，让RNA自然干燥10min，加入40ul DEPC水溶解RNA沉淀，-20保存。
结果：
在此以crtE(GGPP合成酶，大小1131bp)和crtBY(编码双功能酶：八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶，大小2022bp)为例，所得总RNA经过核酸定量仪的测定，终浓度约700ng/ul，n260/280在1.8到2.1之间。逆转录获得cDNA后经PCR扩增得到所需目的条带，如图1所示。
实施例2：酿酒酵母中RNA的提取
1、取1.5mL酿酒酵母细胞培养液，离心去上清，用DEPC处理过的超纯水洗涤沉淀一次；
2、向洗涤后的细胞沉淀中加入200ul裂解缓冲液，悬浮细胞沉淀，然后加入0.3g玻璃珠及200ul PC，涡旋3min；然后加入200ul TE，4度14000rmp离心5min；
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6、弃上清，让RNA自然干燥10min，加入40ul DEPC水溶解RNA沉淀，-20保存。
结果：
在此以hmg1功能域(编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，功能域大小1575bp)为例，所得总RNA经过核酸定量仪的测定，终浓度约1000ng/ul，n260/280在1.8到2.0之间。逆转录获得cDNA后经PCR扩增得到所需目的条带，如图2。
Claims (1)
1.一种酵母中总RNA的快速提取方法，其特征在于离心收集菌体后，用DEPC处理过的超纯水洗涤；洗涤后的菌体沉淀中加入200ul裂解缓冲液，悬浮细胞沉淀，然后加入0.3g玻璃珠及200ul体积比1:1的苯酚和氯仿，涡旋混匀；加入TE溶液高速离心；取上清，加入200ul氯仿，剧烈摇晃，高速离心；取上清，加500ul异丙醇沉淀RNA，并用1ml75%乙醇洗涤沉淀，获得总RNA；所述裂解缓冲液成分为：2%体积百分比Trition-100、1%质量百分比SDS、100mM NaCl、100mM Tris，pH8和100mM EDTA；所述离心均需要低温控制。
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