CN107904287A - 金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法 - Google Patents

金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌扩增引物及探针引物，金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，包括以下步骤：称取样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为1:10的样品匀液，进行增菌培养；提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；将所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液；对反应液进行检测与分析；结果表明引物（nuc和16s）分别针对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的扩增具有特异性；同时微滴数字PCR对其扩增，金黄色葡萄菌数据结果平均值为88(copies/μL)，蜡样芽胞杆菌数据结果平均值为233(copies/μL)，具有重复性；取浓度为108‑103的基因序列进行检测，灵敏度良好。

Description

金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法。
背景技术
微滴数字PCR方法（Droplet digital PCR, dd PCR）是近年来在PCR技术基础上发展起来的另一种快速、准确、可实现DNA绝对定量一种PCR方法。在鉴别金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的工作中，微滴数字PCR检测方法是前沿的技术手段，也是最精确和最敏感的检测方法。本发明的原理是通过微滴数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割，根据金黄色葡萄球菌的nuc特异性基因序列和蜡样芽孢杆菌的16s保守基因序列对饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌进行鉴定；经PCR扩增后，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，实现对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的快速定性检验。与实时荧光定量PCR方法相比，本方法无需根据外部核酸标准品，无需标准曲线，工作流程简单，又兼具实时荧光定量PCR方法的优点，可实现核酸绝对定量分析，并且又具有高通量样品处理能力，实用性强。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)均属于革兰氏阳性菌，引起症状相似，并且这两种致病菌主要来源于患病的人和动物及其带菌者，其中饲料和水源的污染是导致相互传染的主要原因。各种饲料中均可发现金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌，家禽家畜感染这两种致病菌可引起相应的传染病，并且属于畜禽的常见病，发病率较高，危害很大。养殖业收入在吉林省经济总产值占有重要比重，建立饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的快速高效检测方法，对于预防检测牲畜疫情疫病，降低养殖户和牧民的经济损失，保护我省饲养业食品安全和经济利益具有十分重要的意义。因此，在饲料产品质量安全领域迫切需要开发一种快速简便地检测和鉴定金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌的技术。
在食品卫生检测工作中，对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的检测一直以来都是重要内容，为了更好地完成工作任务，本领域技术人员期待一种能够实现对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速准确并且同时检测的方法。现阶段我国没有饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的微滴数字PCR检测方法，因此本发明通过提供一种能够同时检测饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的双重微滴数字PCR法，即通过对相应基因的特异扩增，来实现对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的检测。此法是对饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的相关检测标准的有益补充。如上文所述，本发明提供的双重微滴式数字PCR技术是在实时荧光PCR技术基础上发展而来的，在扩增反应体系中添加特异性的荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，保证了检测结果的可靠性，灵敏度也更高。
高营养饲料在消毒不好等情况下，易生长有害菌，可使饲料变质变色变味直至产生毒素，危害畜牧生产。金黄色葡萄球菌多为致病菌，致病力最强；蜡样芽孢杆菌，是芽孢杆菌属中的一种，易引起食物中毒。因此建立一种溯源技术来排查饲料污染，控制饲料安全的关键环节具有重要意义。确定饲料中致病菌在食物链中相关的食品，寻找预防食品污染的关键环节，具备对突发事件的反应能力，建立和完善食源性致病菌及食源性疾病的监测系统和预警系统。以上两种菌均属于革兰氏阳性菌，目前国内外鉴别金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的方法很多，现阶段我国没有饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的微滴数字PCR检测方法，微滴数字PCR检测技术是全新的技术手段，可以弥补传统培养法等现有技术的不足。
发明内容
本发明目的是为解决传统方法检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌费时、复杂等问题，而提供一种方便、快速的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法。
金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，包括以下步骤：
1）称取25g样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打成匀液；增菌培养，金黄色葡萄球菌增菌培养按照GB/T 23743方法进行，蜡样芽胞杆菌增菌培养按照GB/T 26427方法进行；所述的样品为饲料或食品；
2）提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；
3）以提取的DNA为模板，加入金黄色葡萄球菌检测用nuc特异性引物和探针、蜡样芽孢杆菌的16s保守引物和探针以及酶反应液进行双重微滴数字PCR反应；
4）反应结束后，进行检测与分析；
所述的金黄色葡萄球菌检测用nuc特异性引物和探针、蜡样芽孢杆菌的16s保守引物和探针，分别包括以下碱基序列：
nuc基因上游引物： GGTTTTTCTTTTTCGCTACTAGTTG；
nuc基因下游引物： TGGATCTTCAGAACCACTTCTATTT；
nuc探针：5’-（FAM）-CAGCAAATGCATCACAAACAGATAACGGC-（BHQ1）-3’；
16s保守基因上游引物：CCTTATGACCTGGGCTACAC；
16s保守基因下游引物：AACGGTTTTATGAGATTAGCTCC；
16s探针：5’-（HEX）-TGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGT-（ECLIPSE）-3’；
步骤3）中所述的双重微滴数字PCR反应体系为：
2×dd PCR预混液 10µL
10 µmol/L nuc基因上游引物 1.6µL
10 µmol/L nuc基因下游引物 1.6µL
10 µmol/L rfbE基因探针 0.8µL
10 µmol/L 16s保守基因上游引物 0.4µL
10 µmol/L 16s保守基因下游引物 0.4µL
10 µmol/L16s保守基因探针 0.2µL
1～100 ng/µL模板DNA（金黄色葡萄球菌） 4µL
1～100 ng/µL模板DNA（蜡样芽孢杆菌） 1µL；
反应条件为：95℃/5min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；98℃/10min（1℃/s），12℃保存反应产物；
步骤4）中所述的反应与分析，是双重微滴数字PCR反应结束后，检测所有微滴的荧光信号值并设定阈值，根据荧光信号的阈值确定微滴是否包裹模板DNA，高于阈值的微滴包裹模板DNA，为阳性微滴；低于阈值的微滴不包裹模板DNA为阴性微滴，再根据阳性微滴数计算模板DNA的拷贝数，根据阳性拷贝数值判定结果；
所述的判定结果的方法为：
1）待测样品金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因仅有一种得到扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值，可判定该样品结果为阳性，报告检出金黄色葡萄球菌或蜡样芽胞杆菌基因；
2）待测样品金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因得到扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值，可判定该样品结果为阳性，报告检出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因；
3）待测样品金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因均未得到扩增，扩增终点荧光信号小于阈值，可判定样品结果为阴性，可报告未检出金黄色葡萄球菌或蜡样芽胞杆菌基因。
所述的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，还设有空白对照、阴性对照和阳性对照，判定标准为：
1）阳性对照：以金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌阳性成分DNA为模板，按照所述的双重微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行双重微滴数字PCR反应，检测出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌阳性基因有明显扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值；
2）阴性对照：以非目标源性成分DNA为模板，按照所述的双重微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行双重微滴数字PCR反应，检测出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因均无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值；
3）空白对照：以双蒸水为模板，按照所述的双重微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行双重微滴数字PCR反应，检测出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因均无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值。
本发明提供了鉴定金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌扩增引物及探针引物，金黄色葡萄球菌（ATCC 12600）nuc的扩增引物和探针引物包括：正向序列5’-GGTTTTTCTTTTTCGCTACTAGTTG-3’；反向序列5’-TGGATCTTCAGAACCACTTCTATTT-3’；探针序列5’-（FAM）-CAGCAAATGCATCACAAACAGATAACGGC-（BHQ1）-3’；蜡样芽孢杆菌（ATCC 11176）的16s保守基因序列的扩增引物和探针引物包括：正向序列5’-CCTTATGACCTGGGCTACAC-3’；反向序列5’-AACGGTTTTATGAGATTAGCTCC-3’；探针序列5’-（HEX）-TGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGT-（ECLIPSE）-3’；金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，包括以下步骤：称取样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为1:10的样品匀液，进行增菌培养；提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；将所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液；对反应液进行检测与分析；结果表明引物（nuc和16s）分别针对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的扩增具有特异性；同时微滴数字PCR对其扩增，金黄色葡萄菌数据结果平均值为88 (copies/μL)，蜡样芽胞杆菌数据结果平均值为233(copies/μL)，具有重复性；取浓度为108-103的基因序列进行检测，灵敏度良好。本发明根据金黄色葡萄球菌的nuc特异性基因序列和蜡样芽孢杆菌的16s保守基因序列对饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌进行鉴定，其克服传统致病微生物检测方法的诸多不便，为病原菌检测开辟了新的技术领域。
附图说明
图1 金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌双重引物特异性实时荧光PCR；
图2 金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌双重引物特异性微滴数字PCR；
图3 金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌重复性实验，A为金黄色葡萄球菌，B为蜡样芽胞杆菌；
图4 金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌双重灵敏性实验，A为金黄色葡萄球菌，B为蜡样芽胞杆菌。
具体实施方式
实施例1 样品制备
针对市场上常见的肉用仔鸡中期浓缩饲料、蛋鸡育雏配合饲料、产蛋鸡高峰期浓缩饲料、肉食鸡中期浓缩饲料、肉用仔鸡中期浓缩饲料、生长肥育猪浓缩饲料、小猪浓缩饲料、仔猪浓缩饲料、维生素添加剂预混料、羔羊精料补充料，10种常见饲料产品进行本底实验，每种平行3次。取样方法依照GB/T 14699.1《饲料采样方法》的相关规定，在无菌条件下对饲料进行取样并均质。
对未添加标准物质的样品进行本底测试实验，检测样品本底是否有含有目标菌。不含目标菌确定为阴性样品；将阴性样品用已购置的待检测2种标准菌：
金黄色葡萄球菌（ATCC 12600）
蜡样芽胞杆菌（ATCC 11176）
复壮，制成阳性对照品，制成一定浓度的菌悬液；按照浓度0.5 CFU/ mL，1 CFU/mL，5CFU/mL，10 CFU/mL对原样品进行添、均质，做敏感性实验及特异性实验；
选用的非目标菌株如上处理进行特异性实验，选用的菌株如下：猪霍乱沙门氏菌（ATCC13311）、李斯特菌（ATCC 19119）、普通变形杆菌（ATCC 33420）、小肠耶尔森菌（ATCC23715）、大肠杆菌（ATCC 11229）、克雷伯氏菌（ATCC 43086）、粪肠球菌（ATCC 14500）、沙门氏菌（ATCC 12011）、单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC 19111）、副溶血弧菌（ATCC 17802）、霍乱弧菌（JL.08108）、阴沟肠杆菌（ATCC10146）、志贺氏菌（JL08036）。
实施例2 增菌培养
称取25g样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打2 min，制成1:10的样品匀液。金黄色葡萄球菌按照GB/T 23743方法进行；蜡样芽胞杆菌按照GB/T 26427方法进行；非目标菌株增菌采用LB培养液36℃培养24 h。
实施例3 细菌模板DNA的提取
对于实施例2培养的金黄色葡萄球菌增菌液和蜡样芽胞杆菌增菌液各取1 mL，同时在MYP培养基选取一个疑似菌落到盛有1 mL 无菌生理盐水的1.5 mL 无菌离心管中，12 000r/min离心10 min，吸弃上清；加入50 μL DNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清，保存于 - 20℃保存；
对于实施例2培养的非目标菌株增菌液，各取增菌液1 mL均加到一个1.5 mL无菌离心管中，8 000 r/min离心5 min，尽量吸弃上清液，加入500 μL CTAB、40 μL蛋白酶K，震荡均匀，65 ℃温浴30 min；加入500 μL三氯甲烷：异戊醇(24∶1) ，震荡，12 000 r/ min 离心15min；吸取上层水相至1. 5 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，震荡均匀，12 000 r/ min离心10 min；弃上清液，用预热至65 ℃ TE缓冲液溶解DNA（TE量视DNA沉淀的多少而定）；加入5 μL RNA 酶溶液，37 ℃温浴30 min；加入200 μL三氯甲烷：异戊醇(24∶1)，震荡，12 000r/ min 离心15 min；吸取上层水相至新的1. 5 mL 离心管中，加入等体积的异丙醇，震荡均匀，12 000 r/ min 离心10 min；弃上清液，加入70%乙醇洗涤沉淀DNA，12 000 r/ min离心1 min；弃上清液，干燥，加50 μL预热至65 ℃ TE缓冲液溶解DNA；如不能及时检验，可将上清液于-20 ℃保存；
也可使用商业化的细菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA，如不能及时检验，提取的DNA可于-20℃保存。
测定DNA浓度和纯度：取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260 nm和280 nm处的吸收值，从而确定DNA浓度最优浓度范围。
实施例4 PCR扩增反应
金黄色葡萄球菌的nuc特异性基因序列、蜡样芽孢杆菌的16s保守基因序列对饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌进行鉴定，设计引物及探针如表1。
将得到如下的反应体系和扩增参数：模板DNA 5μL，上、下游引物共4μL，探针1μL，2×dd PCR预混液10μL，总体积20μL (见表2)。利用微滴生成仪完成20µL反应体系的分割。采用Bio-Rad公司生产的微滴数字PCR耗材及试剂。反应条件：95℃/5min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；98℃/10min（1℃/s），12℃保存反应产物。体系完成后，进行双重微滴数字PCR反应。荧光分析步骤采用FAM单荧光通道。
双重微滴数字PCR反应结束后，检测所有微滴的荧光信号值并设定阈值，根据荧光信号的阈值确定微滴是否包裹模板DNA，高于阈值的微滴包裹模板DNA，为阳性微滴，低于阈值的微滴不包裹模板DNA为阴性微滴，再根据阳性微滴数计算模板DNA的拷贝数，根据阳性拷贝数值判定结果。
双重微滴数字PCR反应的有效分割体系数不得低于理论分割体系数的50%，根据数字PCR体系中阴性分割体系的终点荧光值设定荧光的阈值限，阈值限需要对空白和阳性扩增结果进行明显的区分。
确定质量控制指标：
1）阳性对照：以金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌阳性成分DNA为模板，按照所述的微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行双重微滴数字PCR反应，检测出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌阳性基因有明显扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值；
2）阴性对照：以非目标源性成分DNA为模板，按照所述的微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行双重微滴数字PCR反应，检测出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因均无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值；
3）空白对照：以双蒸水为模板，按照所述的微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行双重微滴数字PCR反应，检测出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因均无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值。
结果判定方法具体为：
1）待测样品金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因仅有一种得到扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值，可判定该样品结果为阳性，报告检出金黄色葡萄球菌或蜡样芽胞杆菌基因；
2）待测样品金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因得到扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值，可判定该样品结果为阳性，报告检出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因；
3）待测样品金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因均未得到扩增，扩增终点荧光信号小于阈值，可判定样品结果为阴性，可报告未检出金黄色葡萄球菌或蜡样芽胞杆菌基因。
实施例5 检测方法
1、微滴数字PCR扩增的特异性实验
微滴数字PCR是基于实时荧光PCR基础上的技术。首先利用实时荧光PCR对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的引物进行特异性研究（见图1，图2）。阴性菌为：猪霍乱沙门氏菌（ATCC 13311）、李斯特菌（ATCC 19119）、普通变形杆菌（ATCC 33420）、小肠耶尔森菌（ATCC23715）、大肠杆菌（ATCC 11229）、克雷伯氏菌（ATCC 43086）、粪肠球菌（ATCC 14500）、沙门氏菌（ATCC 12011）、单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC 19111）、副溶血弧菌（ATCC 17802）、霍乱弧菌（JL.08108）、阴沟肠杆菌（ATCC10146）、志贺氏菌（JL08036）。实验结果表明引物（nuc及16s）对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的扩增具有特异性。
2、微滴数字PCR扩增的重复性实验
设定6次重复对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌进行重复性实验（见图3），金黄色葡萄菌数据结果平均值为88 (copies/μL) （SD为6.8 RSD为6.37%），蜡样芽胞杆菌数据结果平均值为233 (copies/μL) （SD为19.7 RSD为2.03%），表明微滴数字PCR对其扩增稳定，实验数据可信。
3、微滴数字PCR扩增的灵敏度实验
将测得浓度为108的DNA溶液按照10倍浓度依次稀释，取浓度为108 -103的基因序列进行检测，每个梯度设置三个重复，其结果见图4及表3。
4、微滴数字PCR本底实验
本实验采用肉用仔鸡中期浓缩饲料、蛋鸡育雏配合饲料、产蛋鸡高峰期浓缩饲料、肉食鸡中期浓缩饲料、肉用仔鸡中期浓缩饲料、生长肥育猪浓缩饲料、小猪浓缩饲料、仔猪浓缩饲料、维生素添加剂预混料、羔羊精料补充料，10种常见饲料产品进行本底实验，每种平行3次，进行本底实验，经实验验证均未检出金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌。
上述实施例的菌株均来自吉林出入境检验检疫局技术中心。

Claims (5)

1.金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，包括以下步骤：
1）称取25g样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打成匀液；增菌培养，金黄色葡萄球菌增菌培养按照GB/T 23743方法进行，蜡样芽胞杆菌增菌培养按照GB/T 26427方法进行；所述的样品为饲料或食品；
2）提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；
3）以提取的DNA为模板，加入金黄色葡萄球菌检测用nuc特异性引物和探针、蜡样芽孢杆菌的16s保守引物和探针以及酶反应液进行双重微滴数字PCR反应；
4）反应结束后，进行检测与分析；
所述的金黄色葡萄球菌检测用nuc特异性引物和探针、蜡样芽孢杆菌的16s保守引物和探针为：
nuc基因上游引物： GGTTTTTCTTTTTCGCTACTAGTTG；
nuc基因下游引物： TGGATCTTCAGAACCACTTCTATTT；
nuc探针：5’-（FAM）-CAGCAAATGCATCACAAACAGATAACGGC-（BHQ1）-3’；
16s保守基因上游引物：CCTTATGACCTGGGCTACAC；
16s保守基因下游引物：AACGGTTTTATGAGATTAGCTCC；
16s探针：5’-（HEX）-TGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGT-（ECLIPSE）-3’。
2. 根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，其特征在于：步骤3）中所述的双重微滴数字PCR反应体系为：
2×dd PCR预混液 10µL
10 µmol/L nuc基因上游引物 1.6µL
10 µmol/L nuc基因下游引物 1.6µL
10 µmol/L rfbE基因探针 0.8µL
10 µmol/L 16s保守基因上游引物 0.4µL
10 µmol/L 16s保守基因下游引物 0.4µL
10 µmol/L16s保守基因探针 0.2µL
1～100 ng/µL模板DNA（金黄色葡萄球菌） 4µL
1～100 ng/µL模板DNA（蜡样芽孢杆菌） 1µL；
所述的双重微滴数字PCR反应条件为：95℃/5min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；98℃/10min（1℃/s），12℃保存反应产物。
3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，其特征在于：步骤4）中所述的反应与分析，是双重微滴数字PCR反应结束后，检测所有微滴的荧光信号值并设定阈值，根据荧光信号的阈值确定微滴是否包裹模板DNA，高于阈值的微滴包裹模板DNA，为阳性微滴；低于阈值的微滴不包裹模板DNA为阴性微滴，再根据阳性微滴数计算模板DNA的拷贝数，根据阳性拷贝数值判定结果。
4.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，其特征在于：所述的判定结果的方法为：
1）待测样品金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因仅有一种得到扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值，可判定该样品结果为阳性，报告检出金黄色葡萄球菌或蜡样芽胞杆菌基因；
2）待测样品金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因得到扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值，可判定该样品结果为阳性，报告检出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因；
3）待测样品金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因均未得到扩增，扩增终点荧光信号小于阈值，可判定样品结果为阴性，可报告未检出金黄色葡萄球菌或蜡样芽胞杆菌基因。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌快速检测方法，还设有空白对照、阴性对照和阳性对照，判定标准为：
1）阳性对照：以金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌阳性成分DNA为模板，按照所述的双重微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行双重微滴数字PCR反应，检测出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌阳性基因有明显扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值；
2）阴性对照：以非目标源性成分DNA为模板，按照所述的双重微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行双重微滴数字PCR反应，检测出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因均无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值；
3）空白对照：以双蒸水为模板，按照所述的双重微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行双重微滴数字PCR反应，检测出金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌基因均无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值。
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