CN109666767A

CN109666767A - 检测并区分h7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量pcr引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN109666767A
Application number: CN201910104444.2A
Authority: CN
Inventors: 刘秀梵; 刘�东; 张竹君; 何丽红; 刘娇; 石磊; 胡娇; 顾敏; 刘晓文; 王晓泉
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-02-01
Filing date: 2019-02-01
Publication date: 2019-04-23

Abstract

本发明涉及一种检测并区分H7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量PCR引物、探针及试剂盒。所述引物是检测H7亚型禽流感病毒强弱毒的通用引物H7‑FP和H7‑RP，所述探针是检测H7N9亚型禽流感病毒强毒的探针H7‑HPProbe:和检测H7N9亚型禽流感病毒弱毒的探针H7‑LPProbe。本发明还公开了包括上述引物和探针的试剂盒。本发明可以特异性地检测H7亚型禽流感病毒并区分其强毒和弱毒，对其他亚型禽流感病毒或其他禽类病毒均无明显扩增曲线。单个反应系统可以同时检测出最低50拷贝每反应体系的H7亚型禽流感病毒弱毒的基因片段或50拷贝每反应体系的H7亚型禽流感病毒弱毒的基因片段。

Description

检测并区分H7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量 PCR引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明属于生命科学与生物技术领域，涉及一种检测并区分H7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量PCR引物、探针及试剂盒。本发明根据H7亚型禽流感病毒强毒和弱毒特有的保守基因序列，设计强弱毒通用的引物，并根据扩增片段中强毒和弱毒裂解位点处的不同序列模式设计分别检测强弱毒的探针，然后利用双通道荧光定量PCR技术进行检测，从而达到快速高通量检测H7亚型禽流感病毒并对毒力进行判断的目的，适用于H7亚型禽流感病毒的检测和流行病学监测。

背景技术

流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，分节段基因组的单股负链RNA病毒。流感病毒分为A、B、C三型。A型流感病毒抗原变异性最强，感染人和动物，常引起世界性大流行，多种禽类均可感染(Yoon SW,Webby RJ,Webster RG:Evolution and Ecology ofInfluenza A Viruses.Microbiological Reviews 1992,56(1):152-179.)。根据其包膜表面血凝素(Hemagglutinin)和神经氨酸酶(Neuraminidase)的抗原性分为若干亚型。

H7N9亚型禽流感病毒自2013年在我国被报道以来，已经形成了五波流行高峰，截至2018年9月5日，世界卫生组织WHO共报道了1567例人感染H7N9病例，死亡率高达40％。在五波流行高峰中，首次在人感染病例样本中分离到了裂解位点具有多个氨基酸插入的新型H7N9突变株，提示高致病性H7N9病毒的出现，与此同时，2016年底至2017年初，在广东省活禽市场收集的样本中也检测到类似的H7N9突变株，经动物实验研究表明这些病毒对鸡具有高致病性(Liu D,Zhang Z,He L,et al.Characteristics of the emerging chicken-origin highly pathogenic H7N9viruses:A new threat to public health andpoultry industry.Journal of Infection,2017,76(2))。在活禽市场发现高致病性H7N9病毒后不久，养鸡场同样也发现了该病毒，并在多个养殖场爆发了严重的疫情。研究已证实，携带病毒的家禽是人感染禽流感病毒的传染源，人感染H7N9病毒的途径则是人类通过直接接触带毒家禽或被其排泄物污染环境而感染，而高致病性H7N9禽流感病毒在出现及流行后不久，也逐渐获得了对哺乳动物毒力增强的趋势。我国拥有密度非常高的活禽交易市场(Live pourltry market，LPM)，这样的大环境给H7N9亚型禽流感病毒的流通、增殖以及传播提供了优良的环境，同时也增加了人类与禽类之间的频繁接触。因此，监测禽群中的H7N9成了防控该疾病的首要任务，快速检测方法的建立是H7N9防控的必要手段。

官方推荐快速检测H7N9病毒的方法是核酸检测，国家卫计委和中国动物疫病控制中心都采用的是WHO和OIE推荐的实时逆转录荧光定量PCR(Real-time reversetranscriptasepolymerase chain reaction,RRT-PCR)。其他检测方法亦有报道，如胶体金免疫层析法、基因芯片、免疫传感器、免疫荧光法、ELISA法等也被广泛用于禽流感病毒检测(Peng D,Hu S,Hua Y,et al.Comparison of a new gold-immunochromatographic assayfor the detection of antibodies against avian influenza virus withhemagglutination inhibition and agar gel immunodiffusion assays.VeterinaryImmunology&Immunopathology,2007,117(1-2):17.)。然而，其中一些方法不能对禽流感病毒进行亚型分类，或者灵敏度不足因此不能用于早期诊断和病毒筛查。RRT-PCR是一种具有高度特异性和灵敏度的方法，但当前市场上检测流感病毒常用的RRT PCR探针多为Taqman-LNA型探针、FRET探针等等。目前在H7N9病毒鉴定过程中所选用的RRT-PCR试剂盒通常是选用HA和NA基因的保守区域作为扩增靶区域，设计特异性引物探针，对H7N9禽流感病毒进行定性检测，不能区分强弱毒。而当前H7N9亚型禽流感病毒强弱毒共存，有必要建立能够区分强弱毒的RRT检测方法，对有效监测H7N9的流行情况很有必要。

MGB基团是新一代猝灭基团。MGB探针3′端的猝灭基团取代传统的TAMRA后自身不发光，荧光本底降低，改善了荧光光谱分辨率(Mingxiao M,Jinhua L,Yingjin S,Li L,Yongfei L:TaqMan MGB probe fluorescence real-time quantitative PCR for rapiddetection of Chinese Sacbrood virus.PlosOne 2013,8(2):e52670-e52670.)。Taqman-MGB探针是在TaqMan探针的3’端偶联结了小沟结合物(Minorgroovebinding,MGB)，它可以缩短探针长度，提高探针Tm值，增强探针与模板的结合，并实现分辨一个碱基的差异(Ma M,Liu J,Song Y,Li L,Li Y:TaqMan MGB Probe Fluorescence Real-Time QuantitativePCR for Rapid Detection of Chinese SacbroodVirus.Plos One 2013,8(2):e52670-e52670.,Saha R,Donofrio RS,Bagley ST:Quantitative real-time PCRdetection ofPseudomonas oleovorans subsp.lubricantis using TaqMan-MGB assayincontaminated metalworking fluids.International Biodeterioration&Biodegradation 2011,65(3):460-464)，因此在SNP检测、病原体检测方面都有应用。

本试剂盒用两条MGB探针及同一对引物进行H7AIV强弱毒的检测和区分，有较高的灵敏性、特异性，一次可以同时分析近百个样本，在H7亚型禽流感病毒早期快速检测并区分强弱毒方面具有很好的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一步法实时荧光定量PCR试剂盒，用于同时检测并区分H7亚型禽流感病毒强毒和弱毒。由于是直接检测病原体核酸，因此具有高敏感、高特异和短检测窗口期等优点，能为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间，为H7亚型禽流感病毒监测提供技术支撑。

本发明用于检测并区分H7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量PCR引物和探针如下：

(1)检测H7亚型禽流感病毒强弱毒的通用引物：

H7-FP:GCCATTTCAGAACATAGATAGCAG(SEQ ID No.1)

H7-RP:GCCTTCCCATCCATTTTCAAT(SEQ ID No.2)

(2)检测H7亚型禽流感病毒强毒的探针：

H7-HPProbe:FAM-CCTCTCGCARTCCGTTT(SEQ ID No.3)-MGB

(3)检测H7亚型禽流感病毒弱毒的探针：

H7-LPProbe:VIC-TAGGCCTCTTCCCTTTG(SEQ ID No.4)-MGB

探针H7-HP的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有猝灭荧光染料MGB；所述探针H7-LP的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有猝灭荧光染料MGB，可在双通道同步进行检测。

本发明还提供了包括上述引物组和探针的荧光定量PCR检测试剂盒。所述试剂盒的具体组成为：

(1)A液：12.5x酶Mix：包括1U/μL的热启动Taq DNA聚合酶、7U/μL的RNase抑制剂、100U/μL的反转录酶；

(2)B液：5xPCR缓冲液：包括5mM dNTP、12mM MgCl₂、Taq Buffer等；

(3)C液：引物Mix:包括10μM H7-FP、10μM H7-RP；

(4)D液：探针Mix:包括10μM H7-HPProbe、10μM H7-LPProbe；

(5)50x ROX I/ROX II reference dye；

(6)阳性对照：H7强弱毒质粒混合液(10⁶拷贝/μL)作为反应的阳性对照；

(7)阴性对照：RNase-free H₂O作为反应的阴性对照。

为了实现上述目的，通过用于联合检测H5亚型禽流感与新城疫强毒的一步法实时荧光定量PCR试剂盒进行检测，该试剂盒包括20uL的PCR扩增检测体系：

A液：12.5x酶Mix 1.6μL；

B液：5xPCR缓冲液4μL；

C液：引物Mix 1μL；

D液：探针Mix 1μL；

50x ROX I/ROX II reference dye：0.4μL；

模板样品：5μL；

加RNase-free H₂O补至20μL体系。

用一步法实时荧光定量PCR反应程序进行扩增：在孔板中加入试剂，加样完毕后，将孔板放入ABI 7500或ABI 7300或Roche 480仪器中，设置反应条件为：55℃15min反转录；95℃5min预变性；95℃10sec，60℃31sec共40个循环。

本发明中引物和探针的特异性：本发明选择病毒的保守区设计引物并根据扩增区域中强毒和弱毒裂解位点处的不同序列模式分别设计检测强毒和弱毒的探针，可以特异性地检测H7亚型禽流感病毒并区分其强毒和弱毒，对其他亚型禽流感病毒或其他禽类病毒均无明显扩增曲线。

用于检测并区分H7亚型禽流感与新城疫强毒的一步法荧光定量PCR试剂盒的敏感性：本方法单个反应系统可以同时检测出最低50拷贝每反应体系的H7亚型禽流感病毒弱毒的基因片段或50拷贝每反应体系的H7亚型禽流感病毒弱毒的基因片段。标准曲线的线性关系、反应效率均较佳。

附图说明

图1双通道检测中H7亚型禽流感病毒强毒标准曲线。

图2双通道检测中H7亚型禽流感病毒强毒的扩增曲线。

图3双通道检测中H7亚型禽流感病毒弱毒标准曲线。

图4双通道检测中H7亚型禽流感病毒弱毒的扩增曲线。

图5双通道检测方法和病毒分离检测强毒感染的临床样品(n＝72)。

图6双通道检测方法和病毒分离检测弱毒感染的临床样品(n＝72)。

具体实施方式

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用材料、试剂若无特殊说明，均可从商业途径得到。凡在本发明的精神和原则以内所做的修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

所用的材料和试剂如下：

ABI 7500荧光定量PCR仪、Roche 480qPCR仪、96孔荧光定量反应板、8联排管均购自ABI公司。反转录酶HiScript II Reverse Transcriptase、热启动Taq DNA聚合酶Champagne Taq DNA Polymerase及Taq buffer均购自诺唯赞生物科技有限公司，RNase抑制剂Recombinant RNase Inhibitor购自大连宝生物公司。病毒DNA/RNA提取试剂购自Roche公司。

1.一步法实时荧光定量PCR试剂盒检测方法的建立：

(1)核酸抽提按试剂盒说明书进行，具体步骤如下：

a.Poly ACarrier RNA与Binding Buffer 1:50混匀，称为MIX A；

b.每个样品取100-200μL上清，加入200uL MIX A与50μL蛋白酶K，混匀；

c.72℃孵育15min；

d.装好吸附柱，将混合液转移至柱内，12000rpm离心1min，弃去下层液体，更换下层收集管；

e.加入500μL Inhibitor Removal Buffer，12000rpm离心1min，弃去下层液体，更换下层收集管；

f.加入450μL Wash Buffer，12000rpm离心1min，弃去下层液体，更换下层收集管，并重复此步骤一次；

g.12000rpm离心1min，弃去下层收集管，换1.5mL离心管；

h.在柱内加入50μL Elution Buffer，室温放置1min，12000rpm离心1min洗脱RNA后弃柱。

(2)一步法实时荧光定量PCR试剂盒检测体系：

通过不同荧光标记的两条探针，完成一例样本在一管反应体系中同时检测H7亚型强弱毒。具体操作步骤如下：

a.使用检测H7亚型禽流感病毒强弱毒的通用引物和强弱毒探针在单管PCR反应体系中对步骤(1)得到的RNA进行实时荧光定量PCR检测，一个样品做两个重复。

b.RRT-PCR检测体系为20μL，包括：

A液：12.5x酶Mix 1.6μL；

B液：5xPCR缓冲液4μL；

C液：引物Mix 1μL；

D液：探针Mix 1μL；

50x ROX I/ROX II reference dye：0.4μL；

模板样品：5μL；

加RNase-free H₂O补至20μL体系。

c.RRT-PCR反应程序：55℃15min反转录；95℃5min预变性；95℃10sec，60℃34sec(ABI 7500等60℃34s，Roche lightcycler 480等60℃31s)，40个循环结束反应，耗时共约80分钟。

(3)判断结果的方法：

根据一步法实时荧光定量PCR检测结果，可以对检测样本是否感染AIV H7进行判断并对病毒进行强弱毒区分。将阳性对照(10⁶拷贝数/μL的质粒)，进行10倍梯度连续稀释至10¹拷贝数/μL，每阳性梯度做2个重复绘制双通道的标准曲线。其中FAM通道用于检测H7AIV强毒；VIC通道用于检测H7AIV弱毒。

具体方法为：

a.每次检测，H7AIV强毒和弱毒的阳性质粒均应有扩增曲线且Ct值≤35，阴性对照Ct>35，否则本次结果无效。

b.在a的前提下，如果FAM标记的H7-HPProbe探针在一个样品的两个孔内均有扩增，且Ct≤35，则判定为H7AIV强毒阳性，否则判为H7AIV强毒阴性。

c.在a的前提下，如果VIC标记的H7-LPProbe探针在一个样品的两个孔内均有扩增，且Ct≤35，则判定为H7AIV弱毒阳性，否则判定样品为H7AIV弱毒阴性。

d.如果H7-HPProbe、H7-LPProbe探针同时为阳性，则样品是H7AIV强弱毒共感染；

如果H7-HPProbe阳性H7-LPProbe阴性，则样品含H7AIV强毒不含H7AIV弱毒；

如果H7-LPProbe阳性H7-HPProbe阴性，则样品含H7AIV弱毒不含H7AIV强毒；

如果如果H7-HPProbe、H7-LPProbe同为阴性，则样品不含H7AIV病毒。

2.实例

利用优化好的一步法实时荧光定量PCR反应体系，对H7AIV强毒、H7AIV弱毒、多种AIV、常见禽类病毒用鸡胚传代，收集阳性鸡胚的尿囊液上清，提取核酸后用本试剂盒绘制标准曲线并进行定量qPCR实验。每个样品做两个重复，各孔收集FAM、VIC双通道的荧光信号。

其中，使用的病毒毒株如表1：

表1本研究用病毒毒株

如表1的数据结果显示，仅H7AIV强毒在FAM通道中有扩增曲线，仅H7AIV弱毒在VIC通道中有扩增曲线。而其他亚型的禽流感病毒、其他常见禽病毒在VIC、FAM通道中均无扩增，因此本方法有较强的特异性。

将(10⁶拷贝/μL)的混合质粒阳性对照依次稀释为10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL后绘制标准曲线，如图1与图3所示。FAM与VIC通道的标准曲线的线性关系式分别为：y＝-3.102x+42.608(R²＝0.989)和y＝-3.19x+39.5(R²＝0.997)。双通道标准曲线相应的扩增曲线如图2与图4所示。可见本试剂盒在双通道均有很好的扩增效率。

用H7N9强毒株GD15(KY751058)株和弱毒株RG126(KY751048)通过滴鼻途径感染6周龄SPF鸡，强毒GD15和弱毒RG126感染剂量分别为10^3.0EID₅₀和10^6.0EID₅₀，每只鸡100μL，每组12只。分别于攻毒后12h、24h、36h和1d、3d、5d采取每只鸡的泄殖腔和喉头棉拭子，将每份棉拭样品一分为二，一份做鸡胚病毒分离，另一份用本发明中优化好的一步法实时荧光定量PCR反应体系做平行检测。如图5与图6结果所示，144份临床样品中，FAM-MGB通道和VIC-MGB通道分别检测出阳性样品43份和55份，而鸡胚病毒分离方法分别检出HPH7N9样品40份和LP H7N9样品51份，因此本方法与鸡胚病毒分离方法的总符合率为92.7％，敏感性高于传统方法，同时对于H7强弱毒的区分也极为显著，样品处理到病毒检出的时间也大大缩短，具有在临床上的应用价值。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 检测并区分H7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量PCR引物、探针及试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gccatttcag aacatagata gcag 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gccttcccat ccattttcaa t 21

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cctctcgcar tccgttt 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

taggcctctt ccctttg 17

Claims

1.用于检测并区分H7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量PCR引物及探针，其特征在于，所述引物及探针是：

(1)检测H7亚型禽流感病毒强弱毒的通用引物：

H7-FP:GCCATTTCAGAACATAGATAGCAG

H7-RP:GCCTTCCCATCCATTTTCAAT

(2)检测H7N9亚型禽流感病毒强毒的探针：

H7-HPProbe:FAM-CCTCTCGCARTCCGTTT-MGB

(3)检测H7N9亚型禽流感病毒弱毒的探针：

H7-LPProbe:VIC-TAGGCCTCTTCCCTTTG-MGB。

2.一种检测并区分H7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，试剂盒组成是：

(2)B液：5xPCR缓冲液：包括5mM dNTP、12mM MgCl₂、Taq Buffer；

(3)C液：引物Mix:包括10μM H7-FP、10μM H7-RP；

H7-FP:GCCATTTCAGAACATAGATAGCAG

H7-RP:GCCTTCCCATCCATTTTCAAT

(4)D液：探针Mix:包括10μM H7-HPProbe、10μM H7-LPProbe；H7-HPProbe:FAM-CCTCTCGCARTCCGTTT-MGB

H7-LPProbe:VIC-TAGGCCTCTTCCCTTTG-MGB

(5)50x ROX I/ROX II reference dye；

(6)阳性对照：H7强弱毒质粒混合液(10⁶拷贝数/μL)作为反应的阳性对照；

(7)阴性对照：RNase-free H₂O作为反应的阴性对照。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于使用时体系如下所示：

A液：12.5x酶Mix 1.6μL；

B液：5xPCR缓冲液4μL；

C液：引物Mix 1μL；

D液：探针Mix 1μL；

50x ROX I/ROX II reference dye：0.4μL；

模板样品：5μL；

加RNase-free H₂O补至20μL体系。