CN108384897A - 鉴别h7亚型hpaiv和lpaiv的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

鉴别h7亚型hpaiv和lpaiv的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于禽类病毒检测技术领域，尤其涉及一种鉴别H7亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感弱毒株的RT‑LAMP检测引物组、试剂盒及其应用。本发明基于LAMP核酸检测技术，充分考虑到了H7亚型AIV HA蛋白切割位点氨基酸序列，有针对性地建立了通用LAMP和鉴别LAMP两种检测方法。通用LAMP可以同时检出H7亚型HPAIV和LPAIV，鉴别LAMP只能检出H7亚型LPAIV，本发明为H7亚型AIV的初步分型提供一种新方法。通过优化各反应条件，建立了H7亚型禽流感和H7亚型弱毒株的检测方法，对检测方法进行特异性和敏感性试验验证。在浊度仪62℃反应2h，能特异性鉴别出H7亚型禽流感和H7亚型弱毒株，与其他亚型禽流感无交叉反应，最低能检出10copy/μL病毒核酸。

Description

鉴别H7亚型HPAIV和LPAIV的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其 应用
技术领域
本发明属于禽类病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于鉴别H7亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感弱毒株的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
流感病毒(Avian influenza，AIB)型属于正粘病毒科流感病毒属，为分节段的单股负链RNA病毒，含8个单体RNA链可编码达17种蛋白(HA，NA，NP，M1，M2，M42，NS1，NS2，NS3，PA，PA-X，PA-N155，PA-N182，PB1，PB1-F2，PB1-N40，PB2)。根据表面抗原HA和NA蛋白的变异情况，目前A型流感病毒目前又进一步分为18种HA亚型(H1-H18)，11种NA亚型(NA1-NA11)。
依据病毒对鸡的致病性不同，禽流感(AIV)可以分为高致病性禽流感(HPAIV)和低致病性禽流感(LPAIV)。自2017年在活禽市场发现突变型H7亚型HPAIV以来，全国各地陆续有H7亚型HPAIV疫情发生的报道。已知H7亚型的低致病性禽流感病毒(LPAIV)HA蛋白切割位点碱性氨基酸的插入，会使HA被普遍表达的宿主蛋白酶切割，从而LPAIV向HPAIV转变。考虑到当前H7亚型HPAIV对公共卫生安全影响较大，在禽流感监测工作中必要鉴别HPAIV和LPAIV。传统的鉴别的方法有HA基因序列测定，但耗时间长，不适合基层运用。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种用于鉴别H7亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感弱毒株的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其应用，本发明基于LAMP核酸检测技术，充分考虑到了H7亚型AIV HA蛋白切割位点氨基酸序列，有针对性地建立了通用LAMP和鉴别LAMP两种检测方法。通用LAMP可以同时检出H7亚型HPAIV和LPAIV，鉴别LAMP只能检出H7亚型LPAIV，为H7亚型AIV的初步分型提供一种新方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种鉴别H7亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感弱毒株的RT-LAMP检测引物组，其特征在于，包括4对特异性引物，分别是引物对H7-F3和H7-B3、引物对H7-FIP和H7-BIP、引物对LPH7-F3和LPH7-B3、引物对LPH7-FIP和LPH7-BIP，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQ IDNo.8所示的序列。
作为优选，所述的鉴别H7亚型禽流感病毒RT-LAMP检测引物组，包括2对特异性引物，分别是引物对H7-F3和H7-B3、引物对H7-FIP和H7-BIP，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQID No.4所示的序列；所述的用于鉴别H7亚型禽流感弱毒株的RT-LAMP检测引物组，包括2对特异性引物，分别是引物对LPH7-F3和LPH7-B3、引物对LPH7-FIP和LPH7-BIP，其分别具有如SEQ ID No.5至SEQ ID No.8所示的序列。
一种鉴别H7亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感弱毒株的RT-LAMP检测试剂盒，包括：2×缓冲液12.5μL，Bst DNA聚合酶1μL、F3和B3引物5pmol、FIP和BIP引物40pmol、模板cDNA2μL、去离子水补充体系。
作为优选，所述的F3和B3引物为H7-F3和H7-B3、LPH7-F3和LPH7-B3，其分别具有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的序列；所述的FIP和BIP引物为H7-FIP和H7-BIP、LPH7-FIP和LPH7-BIP，其分别具有如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQID No.7、SEQ ID No.8所示的序列。
本发明还提供了所述的鉴别H7亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感弱毒株的RT-LAMP检测引物组或所述的用于鉴别H7亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感弱毒株的RT-LAMP检测试剂盒在鉴别H7亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感弱毒株中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明基于LAMP核酸检测技术，充分考虑到了H7亚型AIV HA蛋白切割位点氨基酸序列，有针对性地建立了通用LAMP和鉴别LAMP两种检测方法。通用LAMP可以同时检出H7亚型HPAIV和LPAIV，鉴别LAMP只能检出H7亚型LPAIV，本研究为H7亚型AIV的初步分型提供一种新方法。
(2)本发明根据GeneBank中H7亚型禽流感的HA基因序列，选取强弱毒株保守区域序列，分别设计二套LAMP引物，用于H7亚型禽流感和H7亚型禽流感弱毒株的检测。优化各反应条件，建立了H7亚型禽流感和H7亚型弱毒株的检测方法，对检测方法进行特异性和敏感性试验验证。在浊度仪62℃反应2h，能特异性鉴别出H7亚型禽流感和H7亚型弱毒株，与其他亚型禽流感无交叉反应，最低能检出10copy/μL病毒核酸。结果表明所建立的方法操作简便、快速、灵敏，可用于H7亚型禽流感和H7亚型弱毒株的诊断，适用于临床样品的检测。
附图说明
图1为H7亚型AIV通用LAMP敏感性试验结果；
图2为H7亚型LPAIV鉴别LAMP敏感性试验结果；
其中，1为107copies/μL；2为106copies/μL；3为105copies/μL；4为104copies/μL；5为103copies/μL；6为102copies/μL；7为101copies/μL；8为100copies/μL。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
H1亚AIV、H3亚型AIV、H4亚型AIV、H6亚型AIV、H9亚型AIV、H11亚型AIV由广西兽医研究所(GVRI)分离保存；H2亚型AIV、H8亚型AIV、H10亚型AIV、H12亚型AIV、H13亚型AIV由香港大学(HKU)惠赠；H5亚AIV、H7亚型AIV的RNA由美国宾夕法尼亚大学(PU)、美国康涅狄格大学(UCONN)和中国农业大学(CAU)惠赠。
RNA抽提试剂RNAIso plus、反转录试剂(AMV酶、RNA抑制剂)、PCR试剂购自大连TakaRa公司，连接试剂pEASY-Blunt Cloning Kit和胶回收试剂盒购自北京全式金公司，引物由大连TakaRa公司合成，Bst DNA聚合酶购自New England Biolabs公司。
实施例1：引物的设计与合成
在GeneBank中下载H7亚型AIV的HA基因序列，利用MEGA6.0软件进行序列比对，依据H7亚型AIV保守序列和特异性序列，利用在线软件Primer Explorer V4分别设计了两组LAMP引物，用于H7亚型和H7亚型LPAIV的检测，引物序列见表1。
表1 H7亚型AIV和H7亚型LPAIV检测引物序列
实施例2：RT-LAMP检测体系的建立与优化
2.1病毒核酸提取和cDNA的合成
参照RNA抽提试剂RNAIso plus说明书抽提病毒尿囊液RNA,最后用DEPC水溶解RNA，用于反转录。50μL反转录体系：5×缓冲液10μL，dNTP(10mmol/L)2μL,反转录引物1.5μL(浓度)，AMV反转录酶1μL(10U/μL)，RNA抑制剂0.5μL(40U/μL)，病毒RNA 35μL。混匀后42℃作用30min。
2.2标准品的制备
用表1中H7-F3、H7-B3和H7-F3、H7-B3两对引物扩增H7亚型AIV HA和NA基因的目的片段，将PCR产物跑电泳后切目的片段胶回收，连接载体pEASY，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，用含Amp的LB平板筛选大肠杆菌，挑取阳性菌落用PCR鉴定，阳性克隆送深圳华大基因测序。经测序验证的阳性克隆分别命名为V-H7和V-LPH7，LB培养菌液并抽提质粒，测定质粒浓度，将其稀释至107-100拷贝/μL，用于敏感性试验。
2.3 RT-LAMP条件优化
25μL反应体系包括：2×缓冲液12.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、F3和B3引物5pmol、FIP和BIP引物40pmol、模版cDNA 2μL、去离子水补足体系。扩增温度按59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃依次递增，通过等温扩增实时浊度仪来确定最佳反应温度。
通过比较不同温度的扩增效率、起峰时间，最终确定最佳反应温度为62℃，反应结果判定为120min。
实施例3：RT-LAMP特异性和敏感性试验
运用优化好的反应条件，不同亚型AIV样品进行检测，检验RT-LAMP方法的特异性。将制备好的标准品用建立的方法进行扩增，检验其敏感性。
如图1-2所示，用所建立的H7亚型AIV LAMP可检测到10拷贝/μL的标准品；用所建立的H7亚型LPAIV LAMP可检测到10拷贝/μL的标准品。
表2 RT-LAMP特异性检测
如表2所示，H7亚型AIV RNA的RT-LAMP检测结果为阳性，其他HA亚型AIV的检测结果为阴性。
实施例4：重复性检测
利用所建立的方法对实验室保存的4份H7亚型AIV核酸样品进行RT-LAMP检测，验证该方法的可靠性。
表3 RT-LAMP检测结果
如表3所示，对4份H7亚型AIV的核酸样品进行RT-LAMP鉴别检测，鉴别结果与基因测序分析结果一致。
相对于H5亚型AIV的HA基因遗传进化差异大，H7亚型AIV目前序列相对变异不大，这有利于检测引物的设计。在NCBI下载H7亚型AIV HA序列，运用MEGA6.0软件对HPAIV和LPAIV的序列进行比对，选取保守区域设计通用引物，选取HA蛋白酶切位点差异性序列设计鉴别引物。例如，通常LPAIV的HA蛋白酶切位点氨基酸序列为PKGR↓GLF，有些HPAIV为PKRKRTAR↓GLF，HPAIV中间存在几个氨基酸的插入，在此位点设计的LPAIV鉴别引物能有效结合并扩增H7亚型LPAIV基因而不能结合扩增HPAIV，从而达到鉴别诊断的目的。考虑到AIV变异大，为保证引物的结合效率，本研究保留了4条必要的引物而没有设计环引物，LAMP反应时间稍微延长至2h(加环引物反应约为1h)。检测反应结束，阳性样品管浑浊，阴性管清亮，检测结果可通过肉眼观察。
综上所述，本发明建立了H7亚型AIV通用LAMP法和H7亚型LPAIV鉴别LAMP法，检测方法通过敏感性、特异性试验和临床样品检测的验证，结果表明该检测方法特异性强、敏感性高。由于该方法不需要昂贵的仪器，操作简捷，肉眼可判断结果，具有很高的基层运用前景，对AIV的鉴别诊断和监测具有重要意义。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 防城港市动物疫病预防控制中心
<120> 鉴别H7亚型HPAIV和LPAIV的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其应用
<130> ZYWS
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(鉴别H7亚型HPAIV和LPAIV的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其应用)
<400> 1
gtgatgatga ctgyatggcc 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(鉴别H7亚型HPAIV和LPAIV的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其应用)
<400> 2
tagtgcaccg catgtttc 18
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(鉴别H7亚型HPAIV和LPAIV的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其应用)
<400> 3
gcttagtttg actgggtcaa tytgttagaa ataacaccta tgatcacag 49
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(鉴别H7亚型HPAIV和LPAIV的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其应用)
<400> 4
gatactttgg tttagcttcg gggtyacaca tatgaagaca aggc 44
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(鉴别H7亚型HPAIV和LPAIV的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其应用)
<400> 5
tgagattcca aagggaagag 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(鉴别H7亚型HPAIV和LPAIV的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其应用)
<400> 6
tgtctatcaa ctcaaattgt tgg 23
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(鉴别H7亚型HPAIV和LPAIV的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其应用)
<400> 7
ttctggtgtc tgaaaccata ccagggtttc attgaaaatg gatgg 45
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(鉴别H7亚型HPAIV和LPAIV的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及其应用)
<400> 8
ggaactgctg cagattacaa aagtggtttt ttctataagc cgg 43

Claims (5)

1.一种鉴别H7亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感弱毒株的RT-LAMP检测引物组，其特征在于，包括4对特异性引物，分别是引物对H7-F3和H7-B3、引物对H7-FIP和H7-BIP、引物对LPH7-F3和LPH7-B3、引物对LPH7-FIP和LPH7-BIP，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQ IDNo.8所示的序列。
2.根据权利要求1所述的鉴别H7亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感弱毒株的RT-LAMP检测引物组，其特征在于，用于鉴别H7亚型禽流感病毒RT-LAMP检测引物组，包括2对特异性引物，分别是引物对H7-F3和H7-B3、引物对H7-FIP和H7-BIP，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQID No.4所示的序列；用于鉴别H7亚型禽流感弱毒株的RT-LAMP检测引物组，包括2对特异性引物，分别是引物对LPH7-F3和LPH7-B3、引物对LPH7-FIP和LPH7-BIP，其分别具有如SEQ IDNo.5至SEQ ID No.8所示的序列。
3.一种鉴别H7亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感弱毒株的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括：2×缓冲液12.5μL，Bst DNA聚合酶1μL、F3和B3引物5pmol、FIP和BIP引物40pmol、模板cDNA2μL、去离子水补充体系。
4.根据权利要求3所述的鉴别H7亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感弱毒株的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的F3和B3引物为H7-F3和H7-B3、LPH7-F3和LPH7-B3，其分别具有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的序列；所述的FIP和BIP引物为H7-FIP和H7-BIP、LPH7-FIP和LPH7-BIP，其分别具有如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的序列。
5.根据权利要求1-2任一所述的鉴别H7亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感弱毒株的RT-LAMP检测引物组或权利要求3或4所述的用于鉴别H7亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感弱毒株的RT-LAMP检测试剂盒在鉴别H7亚型禽流感病毒和H7亚型禽流感弱毒株中的应用。
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