CN104388581A - 新型等温多自配引发扩增技术(imsa) - Google Patents

Abstract

本发明涉及到一种新型的等温核酸扩增技术，即等温多自配引发扩增技术(IMSA)。该技术无需热循环仪器，在等温条件和单一功能性酶作用下即可实现对病原基因的扩增。等温多自配引发扩增技术(IMSA)的结果判定可通过观察副产物焦磷酸镁白色沉淀、于扩增前或后加入显色剂观察颜色变化等简单措施实现。其最大特点是，在扩增过程中会产生多倍数的能自我配对继而引发循环扩增的寡核苷酸结构，使得随后循环扩增引发几率明显增加，继而使得扩增效率和检测灵敏度提升。于此，基于等温多自配引发扩增技术(IMSA)我们建立了对手足口病病原柯萨奇病毒A16型(CVA16)和人肠道病毒EV71型(EV71)的VP1基因的检测，以及对人甲型H7N9流感病毒的HA基因的快速检测方法。该发明可实现简单、快速、高灵敏性高特异性检测。

Description

新型等温多自配引发扩增技术(IMSA)

技术领域：

本发明涉及到一种新型的等温核酸扩增技术，其主要特点是在等温条件下扩增过程中会产生多倍数的能自我配对继而引发循环扩增的特殊核苷酸结构。本发明能够被应用于病原基因的快速、高灵敏性和高特异性检测，实现对疾病病原现场快速检测。 

背景技术：

近几十年来，核酸扩增技术为分子生物研究和病原微生物检测做出了革命性的贡献。到目前为主，核酸扩增技术主要基于两种策略：一种是通过具备热循环仪器实现升温降温来完成模板核酸解链、引物退火结合模板以及随后引物延伸的三个过程；另一种是在等温条件和特殊功能性酶作用下完成前述三个过程。 

聚合酶链式反应(PCR)就是典型的基于热循环的核酸分子扩增技术。随着PCR的不断发展，其许多相关性的改进技术也不断被开发出来，如多重PCR、巢式PCR、实时PCR及逆转录PCR等。PCR技术虽然被广泛采用并作为分子诊断的标准分析技术，但是在现场和床旁检测(POCT)中却受到限制，这与它本身无法逾越的缺陷有关。一方面，PCR必须依赖不易携带的热循环仪器；另一方面，对于PCR结果处理操作过于繁冗。此外，在扩增时间上PCR难以满足快速的需求。而等温技术却能在POCT上发挥独特优势。等温技术可以在简单的恒温装置如水浴锅中实现扩增，且同PCR比，其能在短时间达到同等扩增效果或具备更高的检测线水平。但是，考虑到成本和稳健性因素，并不是所有的等温技术都具备POCT应用价值，如链置换扩增(SDA)和等温嵌合引物引发核酸扩增(ICAN)等。这两种等温技术需要至少两种以上的特殊功能性酶，而且扩增不稳健，需要繁琐的体系优化。因此，快速、灵敏、有成本效益的稳健性等温技术才是POCT真正的需求。 

基于此，我们发明了一种新型的等温核酸扩增技术，即等温多自配引发扩增(isothermal multiple self-matching-initiated amplification,IMSA)。该发明是从一种高特异性、一管式密闭巢式PCR即聚合酶链置换反应(PCDR)技术中得到启发。虽然PCDR具备快速检测性，但其同普通PCR一样在POCT应用上受到阻碍。于此，在IMSA技术中，我们将PCDR技术中的四条引物(内外各一对)进行了特殊的改变，引入四条混合式具备自我配对功能的引物，使得其不需要热循环仪器，在等温条件和单一功能性酶下，即可实现对病原基因的快速、高灵敏、高特异扩增。在结 果判定上，IMSA能够通过观察副产物焦磷酸镁白色沉淀、于扩增前或后加入显色剂观察颜色变化等简单措施进行判定。IMSA技术最大特点就是，在等温核酸扩增过程中会产生多倍数的能自我配对继而引发循环扩增的特殊核苷酸结构。这种结构的大量产生富集，使得随后循环扩增引发几率明显增加，继而使得扩增效率增加，最终使得检测灵敏度提升。 

发明内容：

1.本发明主要是介绍一种新型的等温核酸扩增技术，是对目前核酸分子检测技术手段的改进和补充，具有简单、快速、高灵敏性高特异性的优势。图1所示，为IMSA技术中相关引物设计的位点和组合。在IMSA中一共有六条引物，四条混合式引物(DsF、DsR、FIT和RIT)和两条非混合式引物(SteR和SteF)。六条引物由目的基因片段上的七个位点组成，如图1所示，F3、F2、F1、T、R1、R2和R3。引物DsF由F1c(F1的互补序列，下同)和F3组成，DsR由R1c和R3组成，FIT由Tc和F2组成，RIT由T和R2组成，SteR即位点F1c，SteF即位点R1c。在Bst DNA聚合酶作用和等温条件下(60～65℃)，上述的四条混合式引物可产生四种原始自我配对结构，如图2所示。在随后的引发循环扩增过程中，四条混合式引物可基于该四种结构产生多倍数的能自我配对并不断引发循环扩增的自我配对结构，从而决定了扩增反应的高灵敏性和高特异性；同时，扩增中引入两条非混合式引物，可反应明显加速。针对RNA病毒的检测，可以通过添加逆转录酶，建立逆转录等温多自配引发扩增(RT-IMSA)来实现扩增。 

IMSA检测技术特点主要体现在以下几个方面。首先，检测时间短、灵敏度高。整个检测时间可缩短至1小时内，检测灵敏度可与实时荧光定量PCR媲美。其次，检测特异性高。所设计的六条特异性引物，只在其与识别靶序列中七个结合区完全匹配的情况下扩增才能顺利进行。再则，所有的扩增过程都可在60～65℃等温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求。最后，污染机会低和结果可视化。 

2.基于IMSA技术建立了对手足口病病原柯萨奇病毒A16型(CVA16)和人肠道病毒EV71型(EV71)的VP1基因的快速检测方法。选择CVA16(GenBank accession no.GQ279371.1)和EV71(GenBank accession no.GQ279370.1))VP1基因区域分别进行CVA16-IMSA和EV71-IMSA的引物设计，包括四条混合式引物(DsF、DsR、FIT和RIT)和两条非混合式引物(SteR和SteF)。所有引物的具体序列见表1和表2。 

表1:RT-IMSA检测柯萨奇病毒A16型VP1基因的引物序列 

Primer names	Sequences(5′-3′)
		CVA16-DsF	TTGTCACTAGCATTAGACGACGCCAGATTAGGCACTGGTGTTG
CVA16-DsR	CAGGAGACAGCCATTGGGACGTGGTGGGCATTGTGA
		CVA16-FIT	TGGAATGATGGTTCAACACACATCTAAGCCGCGGAGACAGG
CVA16-RIT	AGATGTGTGTTGAACCATCATTCCACTGACAAGACCAGCACGG
		CVA16-SteR	TTGTCACTAGCATTAGACGACGC
CVA16-SteF	CAGGAGACAGCCATTGGGA

表2:RT-IMSA检测人肠道病毒EV71型VP1基因的引物序列 

Primer names	Sequences(5′-3′)
		EV71-DsF	ACCATTGATAAGCACTCGCAGGGTCAAGCTGTCAGACCCTCC
EV71-DsR	GAACACAAACAGGAGAAAGATCTTGTGAGAACGTGCCCATCA
		EV71-FIP	TCCGAATGTGGGATATCCGTCATAAGTTTCAGTGCCATTCATGTC
EV71-RIT	TTATGACGGATATCCCACATTCGGAAGGACATGCCCCGTATT
		EV71-SteR	ACCATTGATAAGCACTCGCAGG
EV71-SteF	GAACACAAACAGGAGAAAGATCTTG

3.基于IMSA技术建立了对人甲型H7N9流感病毒的HA基因的快速检测方法。选择人甲型H7N9流感HA基因(GISAID:EPI439507)的HA基因进行H7-IMSA的引物设计，所有引物的具体序列见表3。 

表3:RT-IMSA检测人甲型H7N9流感病毒HA基因的引物序列 

Primer names	Sequences(5′-3′)
		H7-DsF	GCCTGATTCTCTGAGAATTTGCCTTGATGTCTGTTATCCTGGGA
H7-DsR	ACAGTGGAATAAGAACTAATGGAGCGAGCCATTTCATTTCTGCA
		H7-FIP	GAATCCCATTGCTTCCTTGTCACGTGAATGAAGAAGCTCTG
H7-RIT	TGACAAGGAAGCAATGGGATTCTCCTGATCTCCTACATGCA
		H7-SteR	GCCTGATTCTCTGAGAATTTGCCT
H7-SteF	ACAGTGGAATAAGAACTAATGGAGC

4.建立了如下的检测过程，详见如下： 

(1)合成引物：使用北京生工生物技术有限公司合成仪合成并纯化(推荐用HPLC 纯化)。 

(2)将待测标本按Qiagen公司的病毒RNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的RNA。 

(3)RT-IMSA反应。 

(4)阳性反应结果用肉眼可观察到白色沉淀，或者于扩增前加入羟基萘芬蓝(HNB)染料后颜色从紫色变成天蓝色，或于扩增后加入HNB改良染料(GeneFinder^TM与HNB的混合染料)颜色从灰色变成深绿色，或采用1％琼脂糖凝胶电泳可见梯子状，也可用650nm的吸光值判定。 

附图说明

图1 IMSA引物设计位点和组合示意图； 

图2 IMSA扩增过程最初产生的四种原始自我配对结构。 

具体实施方式：

实施方案1：基于RT-IMSA检测CVA16、EV71和人甲型H7N9流感的特异性 

核酸提取：按照Qiagen试剂盒说明书提取不同来源的手足口病原RNA或流感病原RNA。针对不同的病原检测均建立如下IMSA扩增反应体系：12.5μL(2×)反应液(广州迪澳生物科技有限公司)、对应于特定基因的6条IMSA引物各1.0μL[引物浓度为DsF与DsR(5pmol/μL)、FIT与RIT(20pmol/μL)、SteR与SteF(40pmol/μL)]、1μLBst2.0DNA聚合酶(8U/μL，NEB公司)、0.5μLAMV反转录酶(10U/μL，Promega公司)和4μL RNA样品，添加无核酸酶水至体系总体积为25μL。混匀，置于温度为63℃恒温装置如(水浴锅或日本荣公司浊度仪)中反应1.5h，然后85℃放置2min终止反应。结果判定：方法一，观察反应管内有无白色沉淀；方法二，于扩增前加入1μL HNB(3mmol/L)，待反应完，观察反应管颜色变化；方法三，于扩增后加入1μLHNB改良染料(GeneFinder^TM与HNB的混合染料)，观察反应管颜色变化；方法四，取5μL扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察有无梯度状条带出现。只有对应的病原RNA才有特异性扩增或者阳性现象结果。 

实施方案2：基于RT-IMSA检测CVA16、EV71和人甲型H7N9流感的灵敏度 

10倍梯度稀释从样本提取的对应不同病原RNA，分别至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、和10^-7和稀释度，RT-IMSA检测的体系同实施方案1。CVA16VP1基因检测的灵敏度可达到10^-7稀释度RNA，EV71VP1基基因检测的可达10^-5稀释度RNA， H7N9HA基因检测的灵敏度可达10^-6稀释度RNA。 

实施方案3：可视化RT-IMSA检测特定病原的结果判定 

可视化判定方法一：RT-IMSA反应完成后，直接取出反应管，用肉眼观察管底的白色沉淀，也可取20μL测定650nm的吸收值；可视化判定方法二：于RT-IMSA扩增前加入HNB时，可见阳性反应管颜色变成天蓝色，而阴性反应管颜色呈紫色；可视化判定方法三：于RT-IMSA扩增后加入HNB改良染料(GeneFinder^TM与HNB的混合染料)时，可见阳性反应管颜色变成深绿色，而阴性反应管颜色呈灰色。 

Claims (7)

1.一种新型的等温核酸扩增技术，即等温多自配引发扩增(isothermal multiple self-matching-initiated amplification，IMSA)，可应用于病原基因的快速、高灵敏性和高特异性检测。其中包括：(1)IMSA检测技术的引物设计，及其对应靶序列位点的组合。四条混合式引物(DsF、DsR、FIT和RIT)和两条非混合式引物(SteR和SteF)。六条引物由目的基因片段上的七个位点组成(F3、F2、F1、T、R1、R2和R3)。引物DsF由F1c(F1的互补序列，下同)和F3组成，DsR由R1c和R3组成，FIT由Tc和F2组成，RIT由T和R2组成，SteR即位点F1c，SteF即位点R1c。(2)IMSA检测技术的引物比例组合为DsF／DsR：FIT／RIT：SteR／SteF=1：4：8。(3)基于IMSA技术建立了对手足口病病原柯萨奇病毒A16型(CVA16)和人肠道病毒EV71型(EV71)的VP1基因的检测，以及对人甲型H7N9流感病毒的HA基因的快速检测方法。含每种病原IMSA检测方法所用的6条寡核苷酸引物。(4)HNB(羟基萘酚蓝)染料及其改良染料(GeneFinder^TM与HNB的混合染料)。 

2.权利要求1所述的IMSA检测技术的引物设计和其对应靶序列位点的组合，包括应用IMSA技术所开发的其他病原的检测试剂盒。 

3.权利要求1所述的IMSA检测技术的引物比例组合为DsF／DsR：FIT／RIT：SteR／SteF=1：4：8或DsF／DsR：FIT／RIT=1：4。 

4.权利要求1所述的手足口病病原柯萨奇病毒A16型(CVA16)和人肠道病毒EV71型(EV71)，及人甲型H7N9流感病毒检测的逆转录等温多自配引发扩增技术(RT-IMSA)的引物，包括表1、表2和表3所列的基因序列及其每种序列的互补序列或变体。 

5.权利要求1所述的CVA16、EV71和人甲型H7N9流感病毒检测的逆转录等温多自配引发扩增技术(RT-IMSA)，包括CVA16、EV71和人甲型H7N9流感病毒及其变异株。 

6.权利要求5所述的本发明的应用范围包括各级疾病预防控制机构，流感检测网络实验室，哨点医院用于CVA16、EV71和人甲型H7N9流感病毒检测和监测。 

7.权利要求1所述的CVA16、EV71和人甲型H7N9流感病毒的基于HNB(羟基萘酚蓝)染料及其改良染料(GeneFinder^TM与HNB的混合染料)肉眼可视化颜色的逆转录等温多自配引发扩增技(RT-IMSA)的反应程序和检测程序。