CN109609615A - 一种缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法 - Google Patents

一种缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于本发明属于生物医学技术领域，公开了一种缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法，miRNA标记物是以miR‑622和miR‑221共同作为标记物；选取成熟miR‑622和成熟miR‑221为缺血性脑卒中miRNA标记物；分别确定miR‑622和miR‑221与缺血性脑卒中的相关性，利用高通量测序技术检测外周全血中关于miR‑622和miR‑221的表达水平；制备缺血性脑卒中产品：检测芯片和检测试剂盒。本发明打破只是单一的一种标记物的检测方法，对于检测做到双保险，免表达水平不明显，提高检测结果的准确性，为患者赢得宝贵的治疗时间。

Description

一种缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
缺血性脑卒中是指由于脑的供血动脉(颈动脉和椎动脉)狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑组织坏死的总称。有四种类型的脑缺血：短暂性脑缺血发作(TIA)；可逆性神经功能障碍(RIND)；进展性卒中(SIE)；完全性卒中(CS)。TIA无脑梗死存在，而RIND、SIE和CS有不同程度的脑梗死存在。从缺血的影响范围可将脑缺血分为局限性脑缺血和弥漫性脑缺血。局限性脑缺血的病因有：大脑中动脉栓塞；颅外颈内动脉或椎动脉狭窄、闭塞或血栓形成；脑动脉痉挛。弥漫性脑缺血的病因有：心搏骤停、低血压、贫血、低血糖等。对于缺血性脑卒中传统的诊断方法有:头颅CT及MRI扫描；脑血管检查；经颅多普勒检查(TCD)。传统的检测方法受到是否发病、发病时间、发病程度的限制，不能快速、准确的对病症进行确诊；此外，现有的应用于缺血性脑卒中的miRNA标记物，只是单一的一种miRNA标记物，不能做到检测的双保险，若是这种标记物出现表达水平不明显的情况，降低检测结果的准确性，从而影响患者治疗的时效性。
miRNA为一种非编码、小分子、单链、内源性RNA，其长度大约在19～25个核苷酸，广泛存在于真核生物中。其主要是由核内的miRNA基因通过RNA-polⅡ的催化作用，将其转录成为原始miRNA(pri-miRNA)，再通过Drosha酶将其多聚腺苷酸尾与帽子结合等去除，使前体miRNA形成，然后通过Exportin5将其运输至细胞浆中，通过Dicer酶作用产生长度为20～22个核苷酸的小分子、双链miRNA，而其中一条会被双螺旋解链迅速降解，另一条则形成为成熟的miRNA。
急性缺血性脑卒中对于人们的身体健康及生安全均具有严重的危害，故寻找一种便捷、准确的检测方法对其患者的治疗需求进行满足，给予患者及时、准确的诊治，将其死亡率及残疾率降低，具有重要的意义。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)传统的检测方法CT及MRI扫描、脑血管检查、经颅多普勒检查，受到是否发病、发病时间、发病程度的限制，同时不能快速、准确的对病症进行确诊；
(2)现有的应用于缺血性脑卒中的miRNA标记物，只是单一的一种miRNA标记物，不能做到检测的双保险，若是这种标记物出现表达水平不明显的情况，降低检测结果的准确性，从而影响患者治疗的时效性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法。
本发明是这样实现的，一种缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法，所述缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法以miR-622和miR-221共同作为标记物进行联合检测，具体包括：
依据靶序列富集多重PCR，采用特异性的套式PCR标记物和探针，并在各内标记物加上能被通用标记物识别的标签序列，Primer Mix的浓度为0.25μM，反应的退火温度为55℃。
DNA微阵列制备：通过原位合成法将寡核苷酸固定到基片上，采用玻片为基因芯片的支持物，在聚合反应之前，要使表面衍生出羟基或氨基；
从细胞培养物或组织病料中提取核酸，通过TEM-PCR方法进行扩增，所有扩增产物用荧光标记素对产物进行标记，将荧光素标记在下游标记物末端；
芯片的杂交；
杂交反应过后，各阵列将带有不同浓度的荧光标记，借助激光共聚焦显微扫描仪或CCD成像设备，根据探针标记所用的荧光素种类选择激发光波长进行扫描，然后应用数据分析软件自动获取基因芯片上的各种信息，并对信息进行处理获得结果。
PCR扩增中，通过DNAMAN比较同源性，选取保守序列。
所述PCR扩增中基因芯片探针在靶序列区段内，设计FMDV-O型、ASFV、PRV、SVDV的特异性探针，基因芯片探针序列及修饰方法：
每条探针的5’端均通过16个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基，使用一段随机序列作为位置质控，其5’端连接有一个氨基，3’端连接一个Cy3荧光基团；使用烟草花叶病毒的一段基因作为杂交质控其5’端连接有一个Cy3荧光基团，并使用它的互补序列作为杂交质控探针其5’端同样通过16个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。
所述PCR扩增的反应体系：
反应体系50μL：2×Premix rTaq 25μL，2μM Primer Mix 5μL，10μM Fs 2μL，10μMRs 2μL，RNase-free ddH2O 12μL,DNA 4μL。
所述基因芯片的杂交；
将Tem-PCR产物8μl，杂交质控(1μM)1μl，2×样品杂交液8μl置于PCR仪中，在95℃条件下变性5min，取出置于冰上，冰浴5min；
打开芯片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入500～1000μL超纯水；将芯片正面朝上放入杂交盒内两个定位销之间；放上芯片盖片，注意有凸台的一面朝向芯片，上端先接触芯片，再缓缓盖下；
然后用移液器通过盖片加样孔注入17μL变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜，盖紧杂交盒盖，安装上铝合金封条，置42℃杂交盒中避光杂交3h；
杂交后，取出芯片放在42℃预热好的洗液I中，42℃震荡清洗4min，再用42℃预热好的洗液II，42℃震荡清洗4min，最后用42℃预热好的清水清洗一次，装于塑料玻片盒，以1000g/min速度离心干燥5min后进行扫拭芯片信息。
进一步，miR-622标记物选自以下组中一种或两种及以上:miR-622初始miRNA、miR-622前体miRNA和成熟miR-622；
所述miR-622初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miR-622；
所述miR-622前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miR-622；
进一步，miR-622核酸分子可以以单链或双链的形式存在，双链miR-622核酸分子，一条被双螺旋解链迅速降解，另一条成为成熟的miRNA；
进一步，miR-221标记物选自以下组中一种或两种及以上:miR-221初始miRNA、miR-221前体miRNA和成熟miR-221；
所述miR-221初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成为成熟miR-221；
所述miR-221前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成为成熟miR-221；
进一步，miR-221核酸分子可以以单链或双链的形式存在，双链miR-221核酸分子，一条被双螺旋解链迅速降解，另一条成为成熟的miRNA。
本发明的另一目的在于提供一种缺血性脑卒中miRNA标记物产品的制备方法：
步骤一：选取成熟miR-622和成熟miR-221为缺血性脑卒中miRNA标记物；
步骤二：分别确定miR-622和miR-221与缺血性脑卒中的相关性，利用高通量测序技术检测外周全血中关于miR-622和miR-221的表达水平；
步骤三：制备缺血性脑卒中产品：检测芯片和检测试剂盒。
进一步，步骤三中，检测芯片为miRNA real-time PCR芯片。
进一步，步骤三中，芯片包含miR-622和miR-221这两种检测探针，同步通过检测miR-622和miR-221的表达水平，共同作为判断缺血性脑卒中(IS)的依据；这两种检测探针包括特异性地对应miR-622和miR-221的部分或者全部的核苷酸序列。
进一步，所述部分核苷酸序列为能互补配对上目标miRNA分子的绝大部分核苷酸序列。
进一步，步骤三中，试剂盒包含miR-622和miR-221所需的标记物，分别以不发生缺血性脑卒中miR-622和miR-221表达水平为对照组，同步检测待测样本的miR-622和miR-221的表达水平。
本发明的另一目的在于提供的一种利用本发明制备的缺血性脑卒中miRNA标记物产品，选择外周全血为样本，进行缺血性脑卒中检测。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明提供的一种缺血性脑卒中miRNA标记物，与传统的检测方法相比，不受到是否发病、发病时间、发病程度的限制，都能快速、准确的对病症进行确诊；
本发明提供的一种缺血性脑卒中miRNA标记物，打破只是单一的一种miRNA标记物的检测方法，对于检测可以做到双保险，采用miR-622和miR-221为标记物，避免表达水平不明显，提高检测结果的准确性，从而给患者赢得宝贵的治疗时间。
本发明采用Tem-PCR(靶序列富集多重PCR,Target-Enriched MultiplexPCR)扩增技术来扩增靶序列，克服了传统PCR方法的诸多缺点，其兼容性、特异性、灵活性等都比传统PCR方法好得多；且本发明对Tem-PCR的反应条件作了优化，建立了一套准确高效，方便快捷的检测方法，临床样品可在短时间内完成检测，为疾病的早期诊断和治疗提供了重要的契机。
基于Tem-PCR，用于基因芯片信号检测的荧光标记Cy3只需要加在通用超级标记物下游(Rs)就能实现所有待检靶序列都被加上荧光标记，降低了反应的背景噪音，且大大的节省了实验经费。
本发明首次结合了先进的Tem-PCR多重扩增技术和基因芯片检测技术，建立了在一张芯片上可同时检测多种病原的体系，为以后的重要病原微生物的分子生物学检测奠定了基础。
在单管反应中实现多种不同基因的高通量检测，避免了多重PCR扩增效率因多对标记物不兼容而受到影响，没有统一的反应条件，存在标记物扩增偏爱性。
附图说明
图1是本发明实施例提供的缺血性脑卒中miRNA标记物产品的制备方法。
图2是本发明实施例提供的杂交结果图；
图中：1-8：PC、HC、ASFV、FMDV-O、PRV、SVDV、NC、PC图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为了解决上述技术的不足，做到快速、准确的得到诊断结果，从而给患者赢得宝贵的治疗时间。
本发明所涉及的miR-622和miR-221标记物。初始miRNA、miR-622前体miRNA和成熟miR-622；初始miRNA、miR-221前体miRNA和成熟miR-221；可采用现有技术或具有相同功能的标记标记物，本发明的创新点在于提供一种利用miR-622和miR-221标记物进行检测的方法。
本发明实施例提供的miR-622核酸分子可以以单链或双链的形式存在，双链miR-622核酸分子，一条被双螺旋解链迅速降解，另一条成为成熟的miRNA
本发明实施例提供的种缺血性脑卒中miRNA标记物，所述miRNA标记物是miR-622和miR-221作为标记物。
本发明实施例提供的miR-622标记物选自以下组中一种或两种及以上:miR-622初始miRNA、miR-622前体miRNA和成熟miR-622；
所述miR-622初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miR-622；
所述miR-622前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miR-622；
本发明实施例提供的miR-622核酸分子可以以单链或双链的形式存在，双链miR-622核酸分子，一条被双螺旋解链迅速降解，另一条成为成熟的miRNA；
本发明实施例提供的miR-221标记物选自以下组中一种或两种及以上:miR-221初始miRNA、miR-221前体miRNA和成熟miR-221；
所述miR-221初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miR-221；
所述miR-221前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miR-221；
本发明实施例提供的miR-221核酸分子可以以单链或双链的形式存在，双链miR-221核酸分子，一条被双螺旋解链迅速降解，另一条成为成熟的miRNA。
本发明实施例提供的缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法，所述缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法以miR-622和miR-221共同作为标记物进行联合检测，具体包括：
依据靶序列富集多重PCR，采用特异性的套式PCR标记物和探针，并在各内标记物加上能被通用标记物识别的标签序列，Primer Mix的浓度为0.25μM，反应的退火温度为55℃。
DNA微阵列制备：通过原位合成法将寡核苷酸固定到基片上，采用玻片为基因芯片的支持物，在聚合反应之前，要使表面衍生出羟基或氨基；
从细胞培养物或组织病料中提取核酸，通过TEM-PCR方法进行扩增，所有扩增产物用荧光标记素对产物进行标记，将荧光素标记在下游标记物末端；
芯片的杂交；
杂交反应过后，各阵列将带有不同浓度的荧光标记，借助激光共聚焦显微扫描仪或CCD成像设备，根据探针标记所用的荧光素种类选择激发光波长进行扫描，然后应用数据分析软件自动获取基因芯片上的各种信息，并对信息进行处理获得结果。
PCR扩增中，通过DNAMAN比较同源性，选取保守序列。
所述PCR扩增中基因芯片探针在靶序列区段内，设计FMDV-O型、ASFV、PRV、SVDV的特异性探针，基因芯片探针序列及修饰方法：
每条探针的5’端均通过16个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基，使用一段随机序列作为位置质控，其5’端连接有一个氨基，3’端连接一个Cy3荧光基团；使用烟草花叶病毒的一段基因作为杂交质控其5’端连接有一个Cy3荧光基团，并使用它的互补序列作为杂交质控探针其5’端同样通过16个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。
所述PCR扩增的反应体系：
反应体系50μL：2×Premix rTaq 25μL，2μM Primer Mix 5μL，10μM Fs 2μL，10μMRs 2μL，RNase-free ddH2O 12μL,DNA 4μL。
所述基因芯片的杂交；
将Tem-PCR产物8μl，杂交质控(1μM)1μl，2×样品杂交液8μl置于PCR仪中，在95℃条件下变性5min，取出置于冰上，冰浴5min；
打开芯片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入500～1000μL超纯水；将芯片正面朝上放入杂交盒内两个定位销之间；放上芯片盖片，注意有凸台的一面朝向芯片，上端先接触芯片，再缓缓盖下；
然后用移液器通过盖片加样孔注入17μL变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜，盖紧杂交盒盖，安装上铝合金封条，置42℃杂交盒中避光杂交3h；
杂交后，取出芯片放在42℃预热好的洗液I中，42℃震荡清洗4min，再用42℃预热好的洗液II，42℃震荡清洗4min，最后用42℃预热好的清水清洗一次，装于塑料玻片盒，以1000g/min速度离心干燥5min后进行扫拭芯片信息。
图2是本发明实施例提供的杂交结果图。
下面结合附图对本发明进行进一步详细说明；
如图1所示，本发明实施例提供的缺血性脑卒中miRNA标记物产品的制备方法：
S101：选取成熟miR-622和成熟miR-221为缺血性脑卒中miRNA标记物；
S102：分别确定miR-622和miR-221与缺血性脑卒中的相关性，利用高通量测序技术检测外周全血中关于miR-622和miR-221的表达水平；
S103：制备缺血性脑卒中产品：检测芯片和检测试剂盒。
步骤S103中，本发明实施例提供的检测芯片为miRNA real-time PCR芯片。
步骤S103中，本发明实施例提供的芯片包含miR-622和miR-221这两种检测探针，同步通过检测miR-622和miR-221的表达水平，共同诊断缺血性脑卒中症状；这两种检测探针包括特异性地对应miR-622和miR-221的部分或者全部的核苷酸序列。
本发明实施例提供的所述部分核苷酸序列为能互补配对上目标miRNA分子的绝大部分核苷酸序列。
步骤S103中，本发明实施例提供的试剂盒包含miR-622和miR-221所需的标记物，分别以不发生缺血性脑卒中miR-622和miR-221表达水平为对照组，同步检测待测样本的miR-622和miR-221的表达水平。
本发明实施例提供的利用本发明制备的缺血性脑卒中miRNA标记物产品，选择外周全血为样本，进行缺血性脑卒中检测。
下面结合具体实验对本发明的应用原理进行进一步详细说明；
实验1；
本发明收集50例缺血性脑卒的血液样本，选取50例健康人员血液样本为对照组，检测两组血液中miRNA的表达水平，miR-221、miR-622病例与健康对照间进行q RT-PCR实验，内参为U6，由公式：
ΔCt＝Ct miRNA–Ct U6，
即得出缺血性脑卒中与健康对照样本相应的miRNA的相对表达量：2–ΔCt，进行统计学分析，结果见表1：
表1：对照组与缺血性脑卒中组miR-221、miR-622相对表达量的比较
如表1所示，miR-221在缺血性脑卒中的相对表达量均值标准差为0.64±0.20，低于健康对照组的相对表达量0.90±0.21(P＜0.001)，miR-622在缺血性脑卒中的相对表达量均值标准差为0.71×10-3±0.16×10-3，低于健康对照组的相对表达量1.04×10-3±0.02×10-3(P＜0.001)。
实验2；
本发明收集50例缺血性脑卒的血液样本，血液样本中包括男女患者，年龄在14～35周岁之间，测定miR-221、miR-622差异性表达在缺血性脑卒中的病例TOAST分型情况如表2所示；
表2：miR-221、miR-622在缺血性脑卒中病例TOAST分型中分析
2<sup>–ΔCt</sup> LAA SAA SUE P
miR-221 0.688±0.212 0.701±0.137 0.576±0.213 0.561
miR-622 (0.657±0.322)×10<sup>-3</sup> (0.697±0.275)×10<sup>-3</sup> (0.361±0.117)×10<sup>-3</sup> 0.513
注：ΔCt＝(miRNACt值–内参U6Ct值)；2–ΔCt：miRNA相对表达量；LAA：大动脉粥样硬化卒中；SAA：小动脉闭塞性卒中或腔隙性卒中；SUE：不明原因的缺血性卒中；*为多个独立样本秩和检验
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法，其特征在于，所述缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法以miR-622和miR-221共同作为标记物进行联合检测，具体包括：
依据靶序列富集多重PCR，采用特异性的套式PCR标记物和探针，并在各内标记物加上能被通用标记物识别的标签序列，Primer Mix的浓度为0.25μM，反应的退火温度为55℃。
2.如权利要求1所述的缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法，其特征在于，所述缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法具体包括：
DNA微阵列制备：通过原位合成法将寡核苷酸固定到基片上，采用玻片为基因芯片的支持物，在聚合反应之前，要使表面衍生出羟基或氨基；
从细胞培养物或组织病料中提取核酸，通过TEM-PCR方法进行扩增，所有扩增产物用荧光标记素对产物进行标记，将荧光素标记在下游标记物末端；
基因芯片的杂交；
将Tem-PCR产物8μl，杂交质控(1μM)1μl，2×样品杂交液8μl置于PCR仪中，在95℃条件下变性5min，取出置于冰上，冰浴5min；
打开芯片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入500～1000μL超纯水；将芯片正面朝上放入杂交盒内两个定位销之间；放上芯片盖片，注意有凸台的一面朝向芯片，上端先接触芯片，再缓缓盖下；
然后用移液器通过盖片加样孔注入17μL变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜，盖紧杂交盒盖，安装上铝合金封条，置42℃杂交盒中避光杂交3h；
杂交后，取出芯片放在42℃预热好的洗液I中，42℃震荡清洗4min，再用42℃预热好的洗液II，42℃震荡清洗4min，最后用42℃预热好的清水清洗一次，装于塑料玻片盒，以1000g/min速度离心干燥5min后进行扫拭芯片信息。
3.如权利要求1所述的缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法，其特征在于，所述miR-622标记物选自以下组中一种或两种及以上:miR-622初始miRNA、miR-622前体miRNA和成熟miR-622；
所述miR-622初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成为成熟miR-622；
所述miR-622前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成为成熟miR-622；
miR-622核酸分子可以以单链或双链的形式存在，双链miR-622核酸分子，一条被双螺旋解链迅速降解，另一条成为成熟的miRNA。
4.如权利要求1所述的缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法，其特征在于，所述miR-221标记物选自以下组中一种或两种及以上:miR-221初始miRNA、miR-221前体miRNA和成熟miR-221；
所述miR-221初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成为成熟miR-221；
所述miR-221前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成为成熟miR-221；
miR-221核酸分子可以以单链或双链的形式存在，双链miR-221核酸分子，一条被双螺旋解链迅速降解，另一条成为成熟的miRNA。
5.一种在权利要求1所述缺血性脑卒中miRNA标记物的检测方法过程中缺血性脑卒中miRNA标记物产品的制备方法，其特征在于，所述缺血性脑卒中miRNA标记物产品的制备方法：
步骤一：选取成熟miR-622和成熟miR-221为缺血性脑卒中miRNA标记物；
步骤二：分别确定miR-622和miR-221与缺血性脑卒中的相关性，利用高通量测序技术检测外周全血中关于miR-622和miR-221的表达水平；
步骤三：制备缺血性脑卒中产品：检测芯片和检测试剂盒。
6.如权利要求5所述的缺血性脑卒中miRNA标记物产品的制备方法，其特征在于，所述检测芯片为miRNA real-time PCR芯片。
7.如权利要求5所述的缺血性脑卒中miRNA标记物产品的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，芯片包含miR-622和miR-221这两种检测探针，同步通过检测miR-622和miR-221的表达水平，共同作为判断缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)的依据；这两种检测探针包括特异性地对应miR-622和miR-221的部分或者全部的核苷酸序列。
8.如权利要求7所述的缺血性脑卒中miRNA标记物产品的制备方法，其特征在于，所述部分核苷酸序列为能互补配对上目标miRNA分子的绝大部分核苷酸序列。
9.如权利要求5所述的缺血性脑卒中miRNA标记物产品的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，试剂盒包含miR-622和miR-221所需的标记物，分别以不发生缺血性脑卒中miR-622和miR-221表达水平为对照组，同步检测待测样本的miR-622和miR-221的表达水平。
10.一种利用权利要求4所述缺血性脑卒中miRNA标记物产品的制备方法制备的缺血性脑卒中miRNA标记物产品，选择外周全血为样本，应用于缺血性脑卒中检测。
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