TWI617810B - 用於鑑別犬呼吸道疾病之寡核酸微陣列及其鑑定方法 - Google Patents

Abstract

本發明為一種用於檢測犬呼道疾病之寡核酸微陣列及其鑑定方法，其可同步鑑定出樣品中犬流行性病毒、犬皰疹病毒、支氣管敗血性博得氏菌及犬黴漿菌。其中，本發明之寡核酸微陣列可鑑定出犬瘟熱病毒為野外型犬瘟熱病毒或疫苗型犬瘟熱病毒，並更進一步檢測出傳統疫苗型犬瘟熱病毒或當代疫苗型犬瘟熱病毒，具有高鑑定性。

Description

用於鑑別犬呼吸道疾病之寡核酸微陣列及其鑑定方法

本發明係關於一種感染性病原體之偵測，更具體而言，為藉由使用寡核酸探針及包含該探針之套組以快速鑑定犬呼吸道疾病之病原性。

犬呼吸道疾病為常見的犬隻疾病，感染源包含病毒性及細菌性感染，前者如犬瘟熱病毒(CDV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬皰疹病毒(CHV)、犬腺病毒(CAV-2)及犬呼吸道冠狀病毒(CRCoV)等，後者如支氣管敗血型博德氏菌(Bordetella bronchiseptica)等。

犬呼吸道感染中，以犬瘟熱病毒(CDV)為高度傳染性及致命的呼吸道傳染疾病。縱使已多年實施犬瘟熱疫苗控制疫情，仍持續有犬瘟熱疫情爆發，特別是幼犬容易被傳染。目前，除了支持性療法，尚未有其他方法可治癒犬瘟熱。

在過去，全球犬瘟熱被分類為六大基因血緣譜系，分別為美洲、歐洲、亞洲第1型(Asia-1)、亞洲第二型(Asia-1)及疫苗型。在過去的五十年之中，疫苗型的犬瘟熱譜系是用來製備疫苗使用，係為傳統型疫苗型犬瘟熱病毒，例如安德斯普特(Onderstepoort)及新德希(Synder Hill)。近期， 逐步有發展出新的疫苗，係為當代犬疫苗型犬瘟熱病毒，如疫苗X(基因庫：EU072198)。從基因定序顯示，當代犬疫苗型犬瘟熱病毒在基因上，與傳統型疫苗型犬瘟熱病毒並不相同。

目前例行性的犬瘟熱檢查，係利用血清抗體檢驗，此方法難以判別感染動物是由注射疫苗還是在野外感染而有犬瘟熱的抗體。此現象會造成無法判別抗體來源是因動物感染所產生，還是防疫疫苗所提供，因而無法掌控是否有犬瘟熱爆發與否。現今，雖然已有分子生物方法可分析，鑑定確認犬隻的犬瘟熱病度株種類，然而，這些方法只能鑑別出犬瘟熱為野外型犬瘟熱或傳統型疫苗型犬瘟熱，並無法鑑定出當代犬疫苗型犬瘟熱，而當代犬疫苗型犬瘟熱則往往被鑑別成野外型犬瘟熱。

犬流感會在犬隻之間不斷傳染，造成呼吸道疾病爆發，例如H3N8及H3N2；其中，流感A屬於正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)，而由於其基質基因(matrix gene)具有高度的保守性，因此常用以來檢測病毒。犬皰疹病毒為皰疹病毒科(Herpesviridae)的一族，常見於受傳染的老犬上呼吸道，因為其醣蛋白B基因具有高度的保守性，因此被作為最常用的檢測方法。支氣管敗血性博得氏菌(B.bronchiseptica)係造成狗窩咳嗽(kennel cough)的主要病菌，最常用的檢測方法是定序其上游鞭毛蛋白基因。犬黴漿菌(Mycoplasmas cyno)其實為一種病毒，為原生生物，而其主要檢測方法是使用PCR法檢測它的16S/23S rRNA的基因區隔間(intergenic spacer,IGS)。

當犬隻感染呼吸道疾病時，往往會有複合性感染發生，而不同疾病在臨床上症狀都非常相似，因此不易診斷出為何種感染病毒。現今，已有報導使用多套式PCR(multiplex PCR)搭配電泳分析，以同時檢測犬隻的 病毒性呼吸道疾病，但並無法檢測出致病性細菌，且無法辨別出為野外型或疫苗型的犬瘟病毒。

鑒於上述之犬呼吸道疾病往往是複合性感染，各別進行的病毒檢測需要耗費大量的時間及人力，而可同步檢測的多套式PCR電泳分析法，存有無法檢測致病性細菌及辨別犬瘟病毒為野外型或疫苗型之缺陷，本發明者研發出一種寡核酸微陣列，其可同時檢測辨別犬呼吸道病原，包含鑑定出犬瘟病毒為野外型、傳統疫苗型或當代疫苗型，且偵測犬隻是否感染犬流行性病毒、犬皰疹病毒、支氣管敗血性博得氏菌及犬黴漿菌；此類犬呼吸道疾病皆為具代表性的感染疾病，較具有致命性，且通常為獸醫以評估用藥的選擇。

本發明之檢測用的寡核酸微陣片，提供良好的檢測方法，能有效並全面性地鑑定臨床上的犬呼吸道病原，可協助疾病控制及治療。

是以，本發明提供一種用於鑑別犬呼吸道病原之寡核酸微陣列，其包含於一微陣列基材上，佈有下列(a)~(e)之探針：(a)SEQ NO：1、SEQ NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6之至少其中之一者；(b)SEQ NO：7；(c)SEQ NO：8；(d)SEQ NO：9；及(e)SEQ NO：10。

於較佳實施例中，該寡核酸微陣列進一步包含一寡核酸序列SEQ ID NO：11佈於該寡核酸微陣列之基材上作為一陽性控制探針。

於較佳實施例中，該探針進一步於尾端加入15個T鹼基，以佈於該寡核酸微陣列之基材上。

本發明另提供一種用於鑑定一樣品中犬呼吸道病原之方法，包含：(1)由該樣品中取得一核酸；(2)將該核酸與一探針進行雜交，其中該探針包含下列(a)~(e)之探針：(a)SEQ NO：1、SEQ NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6之至少其中之一者；(b)SEQ NO：7；(c)SEQ NO：8；(d)SEQ NO：9；及(e)SEQ NO：10；(3)基於該雜交結果鑑定該樣品病原：當該核酸與選自由SEQ NO：1、SEQ NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所組成之群組之探針雜交時，鑑定為犬瘟熱病毒；當該核酸與SEQ NO：7雜交時，鑑定為犬流感病毒；當核酸與SEQ NO：8雜交時，鑑定為犬皰疹病毒；當該核酸與SEQ NO：9雜交時，鑑定為支氣管敗血性博得氏菌；當該核酸與SEQ NO：10雜交時，鑑定為犬黴漿菌。

於較佳實施例中，當該核酸與SEQ NO：1及SEQ NO：2之探針雜交時，鑑定為台灣、日本、南韓或中國境內之野外型犬瘟熱病毒。

於較佳實施例中，該核酸與SEQ NO：1及SEQ NO：3之探針雜交時，鑑定為日本或南韓境內之野外型犬瘟熱病毒。

於較佳實施例中，該核酸與SEQ NO：1及SEQ NO：4之探針雜交時，鑑定為中國境內之野外型犬瘟熱病毒

於較佳實施例中，該核酸與SEQ NO：1及SEQ NO：5之探針雜交時，鑑定為傳統疫苗型犬瘟熱病毒。

於較佳實施例中，該核酸與SEQ NO：1及SEQ NO：6之探針雜交時，鑑定為當代疫苗型犬瘟熱病毒。

於較佳實施例中，該核酸更進一步包含一標記。

於較佳實施例中，該標記可為一螢光標記、一化學發光標記、一有色染料標記、一放射標記、一放射不透標記、一含有一酵素、一胜肽或一配體之蛋白質。

圖1為本發明之寡核酸微陣列檢測各犬呼吸道疾病的示意圖，圖1(A)為各病毒存在的呈色位置；圖1(B)為檢測樣品的呈色示例。

圖2為使用單套或多套PCR電泳分析時，各種犬呼吸道疾病會出現亮帶的位置。

圖3為測試例比較本發明之寡核酸微陣列及多套PCR電泳分析的偵測極限，(A)犬瘟熱病毒；(B)犬流感病毒；(C)犬皰疹病毒；(D)支氣管敗血型博得氏菌；(E)犬黴漿菌。

圖4為實施例2比較(A)多套PCR電泳分析及(B)本發明之寡核酸微陣列，檢測7件犬鼻涕的檢測結果。

本發明以下敘述為此技術領域中通常知識者可輕易明瞭此發明之必要技術，且只要不違反其中的精神及範圍，就可以多樣的改變及修飾這個發明來適應不同的用途及狀況。如此，其他的實施例亦包含於申請專利範圍中。

本發明中「犬瘟熱病毒(CVD)」之種類依病毒來源分為「野外型(wild type)」及「疫苗型(vaccine)」，而疫苗型包含「傳統疫苗型(conventional distemper vaccines)」及「當代疫苗型(contemporary vaccine strains)」；所謂「野外型」犬瘟熱病毒係指犬隻的感染犬瘟熱病毒來源，係 在一般環境中接觸到犬瘟熱病毒，例如飛沫傳播，即以非人工方式接觸而獲得病毒；所謂「疫苗型」犬瘟熱病毒係指犬隻的感染犬瘟熱病毒來源，係經由人工方式接觸而感染犬瘟熱，例如疫苗。本發明中，「傳統疫苗型」的犬瘟熱病毒係安德斯普特(Onderstepoort)株、帝斯特彼得(Distemperoid)株、連德勒(Lederle)株及BA株的犬瘟熱疫苗病毒株，而「當代疫苗型」的犬瘟熱病毒係指N-CDV株，其與疫苗X(Vaccine X，基因庫：EU072198)有高度同源性。

本發明中「犬流感病毒(CIV)」係指犬流行性感冒，通常為A型流感病毒所造成，例如H3N2、H3N8。

本發明中「犬皰疹病毒(CHV)」係指感染犬隻的皰疹病毒科(Herpesviridae)。

本發明中「支氣管敗血性博得氏菌(Bb)」係指感染犬隻的博得氏菌，症狀為狗百日咳。

本發明中「犬黴漿菌(Mc)」係指可感染犬隻的黴漿菌，存在於犬隻的下呼吸道，例如支氣管-肺泡，會導致犬隻發燒、呼吸困難等症狀。

本發明中「樣品」係指取自任何懷疑可能帶有犬呼吸道傳染疾病之個體之樣品，其可為任何取自於受感染個體包含犬呼吸道傳染病毒之樣品，包含組織或液體樣品，例如飛沫、口沫、痰液、黏液、血液、血清、血漿、周邊血液細胞包含淋巴球及單核球細胞、尿液、糞便、咽喉拭抹樣品、皮膚損傷拭抹樣品、腦脊髓液、膿及組織包含脾臟、腎及肝。

[鑑別犬呼吸道病原之寡核酸微陣列]

本發明之用於鑑別犬呼吸道病原之寡核酸微陣列，其包含於 一微陣列基材上，佈有下列(a)~(e)之探針：(a)SEQ NO：1、SEQ NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6之至少其中之一者；(b)SEQ NO：7；(c)SEQ NO：8；(d)SEQ NO：9；及(e)SEQ NO：10，其可用以鑑定樣品中犬瘟熱病毒、犬流感病毒、犬皰疹病毒、支氣管敗血性博得氏菌及犬黴漿菌；更進一步地，可鑑別出樣品中犬瘟熱病毒為野外型、傳統疫苗型或當代疫苗型。

本發明之寡核酸微陣列進一步地包含一寡核酸序列SEQ ID NO：11佈於該寡核酸微陣列之基材上作為一陽性控制探針，其可用於鑑定樣品是否有與寡核酸微陣列上的探針真正進行雜交反應。

本發明之寡核酸微陣列之探針進一步地於尾端加入15個T鹼基，以佈於寡核酸微陣列之基材上，該15個T鹼基可增強上述之探針與該寡核酸微陣列之基材間的結合力。

[鑑定樣品中犬呼吸道病原之方法]

本發明之一種用於鑑定一樣品中犬呼吸道病原之方法，其包含：(1)由該樣品中取得一核酸；(2)將該核酸與一探針進行雜交，其中該探針包含下列(a)~(e)之探針：(a)SEQ NO：1、SEQ NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6之至少其中之一者；(b)SEQ NO：7；(c)SEQ NO：8；(d)SEQ NO：9；及(e)SEQ NO：10；(3)基於該雜交結果鑑定該樣品病原：當該核酸與選自由SEQ NO：1、SEQ NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所組成之群組之探針雜交時，鑑定為犬瘟熱病毒；當該核酸與SEQ NO：7雜交時，鑑定為犬流感病毒；當核酸與SEQ NO：8雜交時，鑑定為犬皰疹病毒； 當該核酸與SEQ NO：9雜交時，鑑定為支氣管敗血性博得氏菌；當該核酸與SEQ NO：10雜交時，鑑定為犬黴漿菌。

上述步驟(3)鑑定中，當該核酸與SEQ NO：1及SEQ NO：2之探針雜交時，鑑定為台灣、日本、南韓或中國境內之野外型犬瘟熱病毒；當該核酸與SEQ NO：1及SEQ NO：3之探針雜交時，鑑定為日本或南韓境內之野外型犬瘟熱病毒；當該核酸與SEQ NO：1及SEQ NO：4之探針雜交時，鑑定為中國境內之野外型犬瘟熱病毒。

上述步驟(3)鑑定中，當該核酸與SEQ NO：1及SEQ NO：5之探針雜交時，鑑定為傳統疫苗型犬瘟熱病毒；當該核酸與SEQ NO：1及SEQ NO：6之探針雜交時，鑑定為當代疫苗型犬瘟熱病毒。

上述之步驟(1)中，該樣品中的核酸較佳為由樣品中萃取出的RNA或DNA；萃取出的RNA會進行反轉錄成DNA(即cDNA)，並將該cDNA再進一步經由PCR反應放大。更進一步地，該核酸包含一標記，於標記後在於上述之步驟(2)中與探針進行雜交，該標記包含一螢光標記、一化學發光標記、一有色染料標記、一放射標記、一放射不透標記、一含有一酵素、一胜肽或一配體之蛋白質。

上述之PCR放大可為任何通用的PCR，例如單套PCR或多套PCR，為通用之步驟包含DNA變性、引子與聚合酶黏合及引子延長等步驟。而各種犬呼吸道病源的PCR目標基因及對應之引子對如表1所示，犬瘟病毒為血凝素基因，犬流感病毒為基質基因，犬皰疹病毒為糖蛋白B基因，支氣管敗血性博得氏菌為鞭毛基因，犬黴漿菌為16S/23S rRNA基因區隔間。

[具體實施例]

以下實施方式不應視為過度地限制本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。

實施例1-寡核酸微陣列與PCR電泳分析之比較

1.探針設計

本發明之寡核酸微陣列所使用的探針為針對每種犬呼吸道病原之表1中引子經放大的序列片段中，最保守段的核酸序列。其中，用來檢測犬瘟熱病毒的探針，會依據不同類型的病毒株，選擇不同的放大序 列片段而設計。所有探針係取自基因銀行(GenBank)，並使用MedAlign軟體(DNASTAR,Madison,WI)序列比對及分析所獲得，欲檢驗的目標病毒株及其所示使用之探針如表2所示；通用型(Generic)係指該疾病之所有病毒之PCR產物都能與之結合的探針，如所有樣品為犬瘟熱病毒之PCR產物都具能與CDVG探針結合，因此當鑑定出有與CDVG探針結合之核酸序列，則代表樣品中有犬瘟熱，無論是野外型還是疫苗型犬瘟熱病毒。另外，使用人類腸道病毒71型的衣殼蛋白VP1基因作為陽性控制探針，其基因序列為5’-ATGAAGCATGTCAGGGCTTGGATACCTCG-3’(SEQ ID NO：11)。

2.探針佈於微陣列基材

將上述之探針之5’端分別加上15個T鹼基，並分別取20μM，使用自動化佈放機器(DR.Chip Biotech)各別佈於該微陣列基材上的特定位置，並使用UV光連結儀(Stratagene UV Stratalinker 1800)進行以0.6J交聯將探針固定於微陣列基材。

以下，本發明之測試例、實施例1及比較例中，所使用之萃取樣品中的核酸方法、單套PCR、單套PCR電泳分析、多套PCR、多套PCR電泳分析、核酸與寡核酸微陣列之雜交方法及寡核酸微陣列的鑑定，分別如以下所述之方法完成，而本發明之測試例、實施例1及比較例中將不再贅述。

[樣品來源]

(1)野外型犬瘟熱病毒(CDV)及犬流感病毒(CIV)係由台灣大學獸醫學系之野外型犬瘟熱病毒株(NTU311)及犬流感病毒株(A/canine/Taiwan/E01/2014)所分離出。

(2)傳統疫苗型犬瘟熱病毒(CDV)分別由商業所購：安德斯普特(Onderstepoort)株購自荷蘭Nobivac®所產LDHPPi,Boxmeer及美國Fort Dodge®所產Mas 5-CvK/4L,the Puppyshot® Booster；帝斯特彼得(Distemperoid)株購自荷蘭Nobivac®所產Canine 1-DAPPvL2+Cv；連德勒(Lederle)株購自法國Virbac®所產Canigen DHAPPiLR。

(3)當代疫苗型犬瘟熱病毒(CDV)分別由商業所購：BA株購自法國Merial®所產Eurican DHPPI2-L及N-CDV株購自荷蘭Pfizer®所產Vanguard Plus 5 L4 CV。

(4)犬皰疹病毒(CHV)、犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感病毒(CPIV)及犬呼吸道冠狀病毒(CRCoV)分別由台灣大學獸醫學系生物分子研究室所提供，該等病毒係經過PCR及定序確認為陽性之臨床樣本。

(5)支氣管敗血型博德氏菌(Bordetella bronchiseptica)係購自荷蘭Nobivac® KC所產Boxmeer。

(6)犬黴漿菌係由苗栗農業科技研究院所提供，其係ATCC®所產27544TM。

[萃取樣品中的核酸方法]

使用核酸萃取套組(PetNADTM Nucleic Acid Co-prep kit，GeneReach Biotechnology Corp.)萃取樣品中的核酸，以鑑定各種犬呼吸道病毒的所需目標基因(如表1所示)，包含DNA及RNA。其中，若萃取出的核酸為RNA，則使用高保真轉錄cDNA合成套組(Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit，Roche,Mannheim)將RNA反轉錄為cDNA。

[單套PCR]

由樣品萃取出的核酸會各別進行單套PCR，過程：PCR反應總體基為25μl，包含2μl核酸模板2μl、0.5μl引子及5μl的5x聚合酶(5x taq Master Mix，Protech)；各犬呼吸道病毒株用於擴增之反應溫度曲線為：(1)犬瘟熱病毒(CDV)：94℃持續3分鐘後，重複循環階段34回(94℃持續30秒，50℃持續30秒及70℃持續40秒)，於75℃持續5分鐘；(2)犬 瘟熱病毒(CIV)：94℃持續2分鐘後，重複34回循環階段(94℃持續1分鐘，55℃持續2分鐘及72℃持續3分鐘)，在72℃持續10分鐘；(3)犬皰疹病毒：94℃持續3分鐘後，重複循環階段34回(94℃下30秒，50℃下30秒及72℃下40秒)，在72℃持續5分鐘；(4)支氣管敗血型博德氏菌：94℃持續4分鐘後，重複循環階段34回(94℃下1分，57℃下30秒及72℃下40秒)34回後，在72℃持續5分；(5)犬黴漿：94℃持續5分鐘後，重複循環階段(94℃分鐘1分，54℃分鐘40秒及72℃分鐘1分)，在72℃持續5分。隨後，各別得到單套PCR產物。

[單套PCR電泳分析]

取單套PCR產物10μl於洋菜膠2.0%進行分離，於400ml 0.5x TBE緩衝溶液及20μl(10mg/ml)溴化乙錠於100V之電壓下持續50分鐘之電泳，並於UV燈下觀察結果；各種犬呼吸病毒於電泳分析結果的亮帶位置如圖2所示，1為犬流感病毒(245bp)、2為支氣管敗血性博得氏菌(292bp)、3為犬皰疹病毒(427bp)、4為犬黴漿菌(449bp)及5為犬瘟熱病毒(531bp)，其餘6為犬腺病毒、7為犬副流感病毒及8為犬呼吸道冠狀病毒如預期並未放大因此並無亮帶，而不同犬流感病毒株無法由洋菜膠上分辨。

[多套PCR]

由樣品萃取出的核酸進行多套PCR，此多套PCR與單套PCR之反應溶液均與單套PCR相同，惟同時使用表1所示的5對引子對且5’端有生物素標定；過程：用於擴增之反應溫度曲線為94℃持續3分鐘，重覆34回循環(94℃持續30秒，50℃持續30秒，75℃持續40秒)，72℃持續5分。隨後，得到多套PCR產物。

[多套PCR電泳分析]

取10μl多套PCR產物於洋菜膠2.0%進行分離，於400ml之0.5x TBE緩衝溶液及20μl(10mg/ml)溴化乙錠於100V之電壓下持續60分鐘之電泳，並於UV燈下觀察結果；各種犬呼吸病毒於電泳分析結果的亮帶位置如圖2所示第9泳道之亮帶所示。

[核酸與寡核酸微陣列之雜交方法]

使用DR.Chip DIY套組(DR.Chip Biotech)將多套PCR產物(即PCR後之核酸樣品)與實施例1之寡核酸微陣列的探針進行雜交反應，其過程為將多套PCR產物以95℃持續5分鐘進行變性作用後，於冰浴中降溫5分鐘，在該寡核酸微陣列的腔室內加入200ml雜交溶液後，加入2μl已變性的多套PCR產物，於培養於56℃震動培養1小時。使用250μl的清洗緩衝液於室溫下清洗樣品2次後，加入0.2μl鏈黴抗生物素蛋白共軛鹼性磷酸酶及200μl阻斷劑混合，於室溫下進行30分鐘之阻斷反應，而後以清洗緩衝液清洗2次。加入4μl NBT/BCIP及196μl偵測溶液於該腔室中，以進行比色反應，並於暗房中於室溫下顯影5~10分鐘，而後以蒸餾水清洗2次，呈色結果可使用肉眼直接判讀。

[寡核酸微陣列的鑑定]

請參閱圖1及表2。如圖1(A)所示，寡核酸微陣列之基材上各孔分別代表一種犬呼吸道病原，CDVG代表犬瘟熱；CDVW1代表台灣、日本、南韓及中國區域野外型株；CDVW2代表日本、南韓野外型株；CDVW3代表中國區域野外型株；CDVV1代表傳統疫苗型株(Onderstepooryt、Distemperoid、Lederle、BA)；CDVV2代表當代疫苗型株(N-CDV)；IVF代 表犬流感；CHVG代表犬皰疹；Bb代表支氣管敗血性博得氏菌；Mc代表犬黴漿菌；P代表陽性控制組。當孔洞若有呈色，則代表樣品中此呼吸道病原，而陽性控制組是代表樣品有成功與寡核酸序列雜交。需注意的是，若CDVW2及CDVW3有呈色，則CDVW1不會有呈色反應；作為陰性控制組之犬腺病毒(CAV-2)、犬副流感(CPIV)、犬呼吸道冠狀病毒(CRCoV)及健康犬隻之樣品，僅P有呈色，其餘孔洞皆無呈色，代表本寡核酸微陣列具有高度特異性而不會與其他病毒交叉反應。

測試例-寡核酸微陣列的偵測極限

利用犬呼吸道病毒株之樣品，以測試實施例1之寡核酸微陣列的偵測極限。

使用萃取純化套組(GenepHlowTM Gel/PCR Kit,Geneaid)由實施例1中之單套PCR電泳分析的洋菜膠中，取出分離後的目標基因片段。將該目標基因片段用殖入裝置(pGEM-T EasyVector Systems,Promega)殖入質體，並將質體送入最大效率DH5α化學性競爭22大腸桿菌(Max EfficiencyDH5α chemically competent 22 E.Coli，Invitrogen)於LB培養液(Bector Dickson and Company)中培養。培養的大腸桿菌會使用T7及SP6引子進行PCR，以確認是否有成功選殖。該PCR確認過程，係先將大腸桿菌群中的質體DNA使用萃取系統(Mini PlusTM Plasmid DNA Extraction System,Viogen)萃取，將所插入基因片段並進行定序，並使用BLAST比對核酸序列是否正確。隨後，使用LB培養液進行增殖培養確認無誤的大腸桿菌群，使目標基因放大。

使用分光光度計(GeneQuant II,Pharmacia)定量上述之大腸 桿菌群中，犬皰疹、支氣管敗血性博得氏菌及犬黴漿菌病毒株的質體DNA，計算DNA拷貝數量，並使用TE緩衝劑進行系列稀釋，以作為多套PCR的DNA模板。

使用限制酶(SacI,New England Biolabs)切斷上述之大腸桿菌群中，犬瘟病毒及犬流感病毒株的質體DNA，並將其懸吊3’端的與DNA聚合酶(Klenow,Promega)結合，使用體外核酸轉錄系統(Promega,Madison)搭配T7RNA聚合酶轉錄出RNA，並使用DNA分解酶(Promega,Madison)將殘餘的DNA移除。隨後，使用分光光度計定量(GeneQuant II,Pharmacia)轉錄出的病毒RNA，計算RNA數量，並使用DEPC處理水稀釋該等RNA，以作為多套PCR的RNA模板，以進行後續的反轉錄及多套PCR複製放大為1、10、50、100、1000及10000拷貝數。

將上述步驟4中之多套PCR產物分別與實施例1之寡核酸微陣列進行雜交反應以鑑定，及進行多套PCR電泳分析。測試結果如圖3所示，使用多套PCR電泳分析針測犬瘟熱病毒、犬流感病毒、犬皰疹病毒、支氣管敗血型博德氏菌及犬黴漿菌的極限分別為50、50、100、100及100個拷貝數，然而，若使用本發明之寡核酸微陣列，則偵測極限分別為10、10、100、50及50個拷貝數。

實施例2-鑑定臨床樣本之犬呼吸道病源

1.樣品來源：56件犬鼻涕樣品係由台灣獸醫院從2015年1月至8月所收集而來的臨床樣本，該犬鼻涕樣本的犬隻係在臨床上有呼吸道病癥的犬隻。

2.鑑定樣品中犬呼吸道病源：由上述之樣品中萃取出核 酸，並分別進行多套PCR。將多套PCR產物與實施例1之寡核酸微陣列雜交以鑑定樣品中，犬呼吸道感染情況，結果如表3所示。

比較例-多套PCR搭配洋菜膠鑑定樣品犬呼吸道病源

此比較例係將實施例2中之多套PCR產物，各別進行多套PCR電泳分析，以比較與實施例2中使用寡核酸微陣列鑑定的分析，如表3所示。

為更臻明確比較實施例2及比較例之分析結果，另提供圖4，其係上述其中7件之犬鼻涕臨床樣本，分別使用寡核酸微陣列及多套PCR電泳分析之結果。

由實施例2及比較例可知，如表3所示，實施例2使用本發明之寡核酸微陣列，可鑑別出不同犬呼吸道疾病，且可進一步鑑別出野外型及疫苗型之犬瘟熱病毒；相較之下，比較例使用多套PCR電泳分析，並無法鑑別出有犬瘟熱以外之病毒，更無法鑑別出不同類型的犬瘟熱病毒。以圖4 中7件臨床樣本為例，圖4(A)為使用多套PCR電泳分析結果，僅有樣本2、3及5至7於犬瘟熱病毒位置處有亮帶，但從圖4(B)顯示，由寡核酸微陣列鑑定結果，樣本1及2為野外型犬瘟熱病毒(台灣、日本、南韓及中國區域)，樣本3為傳統型疫苗犬瘟熱病毒，樣本4為支氣管敗血性博得氏菌，樣本5為野外型犬瘟熱病毒(台灣、日本、南韓及中國區域)及犬流感病毒，樣本6為野外型犬瘟熱病毒(台灣、日本、南韓及中國區域)及犬皰疹病毒，樣本7為野外型犬瘟熱病毒(台灣、日本、南韓及中國區域)及支氣管敗血性博得氏菌。

是以，本發明之寡核酸微陣列可一次鑑定出多種犬呼吸道病毒，且可特對犬瘟熱病毒區分為野外型及疫苗型，其中，可進一步區分出不同區域之野外型犬瘟熱病毒，又可進一步區分出為傳統疫苗型或當代疫苗型犬瘟熱病毒。

本發明之寡核酸微陣列可同步檢驗多種犬呼吸道病毒，且鑑定出的呈色結果可直接用肉眼辨識，無須其他設備輔助鑑別，具有高感度、高識別度及高效率的優點，相較於傳統分子學的鑑定方法，減少耗費時間及人力，可用加強犬呼吸道傳染疾病的防疫及檢測，因此具有產業利用性、新穎性及進步性。

<110> 國立臺灣大學

<120> 用於鑑別犬呼吸道疾病之寡核酸微陣列及其鑑定方法

<130> P171307TW

<160> 21

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 犬瘟熱CDVG

<220>

<221> misc_特徵

<222> (1)..(26)

<400> 1

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 犬瘟熱CDVW1

<220>

<221> misc_特徵

<222> (1)..(18)

<400> 2

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 犬瘟熱CDVW2

<220>

<221> misc_特徵

<222> (1)..(18)

<400> 3

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 犬瘟熱CDVW3

<220>

<221> misc_特徵

<222> (1)..(18)

<400> 4

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 犬瘟熱CDVV1

<220>

<221> misc_特徵

<222> (1)..(24)

<400> 5

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 犬瘟熱CDVV2

<220>

<221> misc_特徵

<222> (1)..(20)

<400> 6

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 犬流感IVG

<220>

<221> misc_特徵

<222> (1)..(22)

<400> 7

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 犬皰疹CHVG

<220>

<221> misc_特徵

<222> (1)..(26)

<400> 8

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 支氣管敗血性博得氏菌Bb

<220>

<221> misc_特徵

<222> (1)..(23)

<400> 9

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 犬黴漿菌Mc

<220>

<221> misc_特徵

<222> (1)..(26)

<400> 10

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人類腸道病毒71型的衣殼蛋白VP1基因

<220>

<221> misc_特徵

<222> (1)..(29)

<400> 11

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 犬瘟熱血凝素CDHF1d

<220>

<221> 引子黏接

<222> (1)..(19)

<400> 12

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 犬瘟熱血凝素CDHR1

<220>

<221> 引子黏接

<222> (1)..(21)

<400> 13

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 犬流感基質M52C

<220>

<221> 引子黏接

<222> (1)..(21)

<400> 14

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 犬流感基質M253R

<220>

<221> 引子黏接

<222> (1)..(24)

<400> 15

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 犬皰疹糖蛋白B CHVF2

<220>

<221> 引子黏接

<222> (1)..(20)

<400> 16

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 犬皰疹糖蛋白B CHVR2

<220>

<221> 引子黏接

<222> (1)..(20)

<400> 17

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 支氣管敗血性博得氏菌鞭毛Fla3m

<220>

<221> 引子黏接

<222> (1)..(18)

<400> 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 支氣管敗血性博得氏菌鞭毛Fla2m

<220>

<221> 引子黏接

<222> (1)..(20)

<400> 19

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 犬黴漿菌16S/23S rRNA基因區隔間Myc1

<220>

<221> 引子黏接

<222> (1)..(17)

<400> 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 犬黴漿菌16S/23S rRNA基因區隔間Myc2

<220>

<221> 引子黏接

<222> (1)..(22)

<400> 21

Claims (10)

1. 一種用於鑑別野外型犬瘟熱病毒、傳統疫苗型犬瘟熱病毒、當代疫苗型犬瘟熱病毒、犬流行性病毒、犬泡疹病毒、支氣管敗血性博得氏菌及犬黴漿菌之寡核酸微陣列，其包含於一微陣列基材上，佈有下列(a)~(e)之探針：(a)SEQ NO：1、SEQ NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6之至少其中之一者；(b)SEQ NO：7；(c)SEQ NO：8；(d)SEQ NO：9；及(e)SEQ NO：10。
2. 如請求項1之寡核酸微陣列，進一步包含一寡核酸序列SEQ ID NO：11佈於該寡核酸微陣列之基材上作為一陽性控制探針。
3. 一種用於鑑定一樣品中野外型犬瘟熱病毒、傳統疫苗型犬瘟熱病毒、當代疫苗型犬瘟熱病毒、犬流行性病毒、犬泡疹病毒、支氣管敗血性博得氏菌及犬黴漿菌之方法，包含：(1)由該樣品中取得一核酸；(2)將該核酸與一探針進行雜交，其中該探針包含下列(a)~(e)之探針：(a)SEQ NO：1、SEQ NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6之至少其中之一者；(b)SEQ NO：7；(c)SEQ NO：8；(d)SEQ NO：9；及(e)SEQ NO：10；(3)基於該雜交結果鑑定該樣品中病原：當該核酸與選自由SEQ NO：1、SEQ NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所組成之群組之探針雜交時，鑑定為犬瘟熱病毒；當該核酸與SEQ NO：7雜交時，鑑定為犬流感病毒；當核酸與SEQ NO：8雜交時，鑑定為犬皰疹病毒；當該核酸與SEQ NO：9雜交時，鑑定為支氣管敗血性博得氏菌；當該核酸與SEQ NO：10雜交時，鑑定為犬黴漿菌。
4. 如請求項3之方法，其中當該核酸與SEQ NO：1及SEQ NO：2之探針雜交時，鑑定為台灣、日本、南韓或中國境內之野外型犬瘟熱病毒。
5. 如請求項3之方法，其中當該核酸與SEQ NO：1及SEQ NO：3之探針雜交時，鑑定為日本或南韓境內之野外型犬瘟熱病毒。
6. 如請求項3之方法，其中該核酸與SEQ NO：1及SEQ NO：4之探針雜交時，鑑定為中國境內之野外型犬瘟熱病毒。
7. 如請求項3之方法，其中該核酸與SEQ NO：1及SEQ NO：5之探針雜交時，鑑定為傳統疫苗型犬瘟熱病毒。
8. 如請求項3之方法，其中該核酸與SEQ NO：1及SEQ NO：6之探針雜交時，鑑定為當代疫苗型犬瘟熱病毒。
9. 如請求項4至8任一項之方法，其中該核酸更進一步包含一標記。
10. 如請求項9之方法，其中該標記可為一螢光標記、一化學發光標記、一有色染料標記、一放射標記、一放射不透標記、一含有一酵素、一胜肽或一配體之蛋白質。