JP2017158470A - カビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キット - Google Patents
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Abstract
Description
このようなカビの検査では、一般的に、環境中からカビを採取して前培養し、次いで菌種ごとに最適な培地で20日程度の培養を行った後に、形態的特徴を観察することで、カビを同定する形態観察法(培養法)が行われている(特許文献1参照)。
ところで、環境中の検出対象のカビには様々な種類があるため、1個のDNAチップにより複数のカビを同時に検出できることが望ましい。そのためには、DNAチップ上に複数のカビから選択されたプローブを固定化する必要がある。
しかしながら、複数の標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスPCRを行う場合には、プローブにもより高い精度で機能するものが求められる。また、同時に増幅させる検出対象のカビの数が増加すれば、プローブに要求される精度は一層高くなる。
これら複数種類のカビのそれぞれのDNAにおける特定の標的領域のうち、それぞれのカビにのみ特異的に結合する塩基配列を有し、かつ他の種類のカビには結合しない塩基配列を選択してプローブを作成すれば、理論上、各プローブによりこれら複数種類のカビをそれぞれ特異的に検出することが可能である。
しかしながら、ムーコル・ラセモサス、リクテイミア・コリムビフェラ、モナスカス・ルバー、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、ニグロスポラ・オリゼー、ニューロスポラ・クラッサ、エメリセラ・ニデュランス、タラロマイセス・フラバス、及びタラロマイセス・バチリスポラスの11種類のカビを、それぞれ精度高く特異的に検出することが可能なプローブを固定化したカビ検出用担体は知られていない。
(a)配列番号1〜22に示す塩基配列からなるプローブ。
(b)配列番号1〜22に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
(c)(a)又は(b)のプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ。
(検出対象カビ)
本実施形態のカビ検出用担体により検出する対象のカビは、耐熱性カビである、ムーコル・ラセモサス(Mucor racemosus)、リクテイミア・コリムビフェラ(Lichtheimia corymbifera)、モナスカス・ルバー(Monascus ruber)、サーモアスカス・クラスタセウス(Thermoascus crustaceus)、サーモアスカス・オーランティアカス(Thermoascus aurantiacus)、サーモアスカス・サーモフィラス(Thermoascus thermophilus)、ニグロスポラ・オリゼー(Nigrospora oryzae)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、エメリセラ・ニデュランス(Emericella nidulans)、タラロマイセス・フラバス(Talaromyces flavus)、及びタラロマイセス・バチリスポラス(Talaromyces bacillisporus)の11種類である。また、これらに、同じく耐熱性カビである、ペシロマイセス・バリオッティ(Paecilomyces variotii)、ビソクラミス・ゾラニアエ(Byssochlamys zollerniae)を加えた13種類とすることも好ましい。
本実施形態の対象カビを検出するためのプローブは、図1〜図2に示す配列番号1〜22によりそれぞれ特定される塩基配列からなる核酸断片である。
配列番号5〜7に示す塩基配列からなるプローブは、リクテイミア・コリムビフェラを検出するためのITS領域から選択されたプローブである。
配列番号8〜9に示す塩基配列からなるプローブは、モナスカス・ルバーを検出するためのITS領域から選択されたプローブである。
配列番号10〜11に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・クラスタセウスを検出するためのITS領域から選択されたプローブである。
配列番号12に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・オーランティアカスを検出するためのITS領域から選択されたプローブである。
配列番号13に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・サーモフィラスを検出するためのITS領域から選択されたプローブである。
配列番号14〜15に示す塩基配列からなるプローブは、ニグロスポラ・オリゼーを検出するためのITS領域から選択されたプローブである。
配列番号18〜19に示す塩基配列からなるプローブは、エメリセラ・ニデュランスを検出するためのβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
配列番号20に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・フラバスを検出するためのβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
配列番号21〜22に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・バチリスポラスを検出するためのβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
具体的には、図1に示すムーコル・ラセモサス、リクテイミア・コリムビフェラ、モナスカス・ルバー、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、ニグロスポラ・オリゼーの7種類については、ITS領域から選択されたプローブの特異性が高く、偽陽性反応が比較的生じにくいため、これらのプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができる。
また、図2に示すニューロスポラ・クラッサ、エメリセラ・ニデュランス、タラロマイセス・フラバス、及びタラロマイセス・バチリスポラスの4種類については、β-チューブリン遺伝子から選択されたプローブの特異性が高く、偽陽性反応が比較的生じにくいため、これらのプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができる。
本実施形態のカビ検出用担体に固定化される上記プローブは、いずれも18〜30塩基程度の長さであり、一般的なDNA合成装置により合成できる。後述する実施例でカビ検出用担体に固定化した配列番号1〜26に示す塩基配列からなるプローブは、いずれもDNA合成装置により合成したものを使用した。なお、後述する実施例でPCRに用いた配列番号27〜30に示す塩基配列からなるプライマーも19〜26塩基程度の長さであり、DNA合成装置により合成したものを使用した。
本実施形態のカビ検出用担体は、配列番号1〜26に示す塩基配列からなるプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、本実施形態のカビ検出用担体として貼り付け型のDNAチップを作成する場合は、DNAスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型DNAチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴDNAを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
さらに、本実施形態のカビ検出用担体は、ITS領域から選択されたプローブ、及びβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブのグループ毎に、それぞれのグループのカビを検出するためのプローブを固定化したものとすることができる。
本実施形態のカビの検出方法は、検出対象のカビのDNAにおける標的領域をPCRにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、標的領域の増幅を行うためのPCR用反応液において、上記のITS領域を増幅させるためのプライマーセット、及び/又は、β-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、試料に検出対象のカビの少なくともいずれかのDNAが含有されている場合、PCR用反応液を使用して、試料に含有されるDNAにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を上述したカビ検出用担体に滴下して、増幅産物を相補的な塩基配列を有するプローブに結合させる方法であれば良く、具体的な実施形態及び実施例の構成に限定されるものではないが、例えば(1)カビの採取、(2)DNAの抽出、(3)標的領域の増幅、及び(4)増幅産物の確認を含むものとすることができる。
例えば空中浮遊カビを採取する場合、検査対象の環境中における室内又は屋外の空気を採取する。そして、採取した空気を専用培地に吹き付けて、空気中に含まれるカビの培養を行う。培地としては、所定の寒天培地などをエアーサンプラー用にストリップ形状にしたものを使用することが好ましい。培養条件としては、25℃で暗所に65時間以上静置することが好ましい。
次に、ストリップにおいて培養されたカビのコロニーを、コロニー毎に個別に採取し、又は二以上のコロニーを一括して採取し、液体窒素などによりコロニーを凍結して、コロニーに含まれるカビの細胞を破砕する。
例えば植物検体のカビを採取する場合、ハサミやカッターなどを用いて、検査対象の罹病組織片あるいは健全組織片を採取する。そして採取した植物組織片を次亜塩素酸やエタノールで表面殺菌後、専用培地に置床して、植物組織中に含まれるカビの培養を行う。培養条件としては、20℃〜25℃の範囲内で65時間以上静置することが好ましい。
次に、このようにして得られたカビの細胞の破砕物からゲノムDNAを抽出する。ゲノムDNAの抽出は、CTAB法(Cetyl trimethyl ammonium bromide)による方法やDNA抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
また土壌中から直接カビのDNAを抽出することもできる。DNAの抽出は直接溶菌法(Direct Lysis Method)による方法や土壌DNA抽出キットを用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
次に、抽出したゲノムDNAにおける標的領域を増幅させる。すなわち、ゲノムDNAにおける標的領域を含むDNA断片を増幅させる。この標的領域の増幅方法は、特に限定されないが、PCR法を好適に用いることができる。PCR法では、標的領域を増幅させるためのプライマーセットを含有するPCR反応液を用いて、標的領域を増幅させる。PCR装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
本実施形態のカビの検出方法では、例えば以下のような反応条件でPCRを行うことにより、各種カビの標的領域を好適に増幅させることができる。
(a)95℃ 10分、(b)95℃(DNA変性工程) 30秒、(c)56℃(アニーリング工程) 30秒、(d)72℃(DNA合成工程) 60秒((b)〜(d)を40サイクル)、(e)72℃ 10分
このとき、ITS領域を増幅させるためのプライマーセットとしては、図3に示す配列番号27及び28の塩基配列からなるもの(配列番号27:フォワードプライマー、配列番号28:リバースプライマー)を用いることが好ましい。
また、β-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとしては、同図に示す配列番号29及び30の塩基配列からなるもの(配列番号29:フォワードプライマー、配列番号30:リバースプライマー)を用いることが好ましい。
次に、増幅産物を本実施形態のカビ検出用担体に滴下し、このカビ検出用担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認する。これによって、検査対象の環境中に存在しているカビを特定することができる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のBIOSHOT(登録商標)を用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、S/N比(Signal to Noise ratio)値として得ることが好ましい。S/N比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを精度高く判定することができるためであり、一般にS/N比値が3以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のS/N比値は、(メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値)÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
本実施形態のカビ検出用キットには、カビのDNAにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定されたカビ検出用担体とが含まれる。本実施形態のカビ検出用キットは、プライマーセットを用いて増幅された増幅産物をカビ検出用担体に滴下して、増幅産物を相補的な塩基配列を有するプローブに結合させることによってカビを検出するために用いられる。
プライマーセット及びカビ検出用担体は、上述したITS領域から選択されたプローブ、及びβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブのグループ毎に、それぞれ以下の構成とすることができる。
検出対象のカビが、ムーコル・ラセモサス、リクテイミア・コリムビフェラ、モナスカス・ルバー、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、ニグロスポラ・オリゼーの少なくともいずれかの場合、プライマーセットとしては、ITS領域を増幅させるための配列番号27に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号28に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いることが好ましい。
ムーコル・ラセモサス(Mucor racemosus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号1〜4に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第一のプローブ群、
リクテイミア・コリムビフェラ(Lichtheimia corymbifera)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号5〜7に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第二のプローブ群、
モナスカス・ルバー(Monascus ruber)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号8〜9に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、
サーモアスカス・クラスタセウス(Thermoascus crustaceus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号10〜11に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第四のプローブ群、
サーモアスカス・オーランティアカス(Thermoascus aurantiacus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号12に示す塩基配列からなるプローブからなる第五のプローブ群、
サーモアスカス・サーモフィラス(Thermoascus thermophilus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号13に示す塩基配列からなるプローブからなる第六のプローブ群、並びに、
ニグロスポラ・オリゼー(Nigrospora oryzae)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号14〜15に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群のプローブを固定化したカビ検出用担体。
検出対象のカビが、ニューロスポラ・クラッサ、エメリセラ・ニデュランス、タラロマイセス・フラバス、及びタラロマイセス・バチリスポラスの少なくともいずれかの場合、プライマーセットとしては、β-チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号29に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号30に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いることが好ましい。
ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号16〜17に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、
エメリセラ・ニデュランス(Emericella nidulans)を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号18〜19に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第九のプローブ群、
タラロマイセス・フラバス(Talaromyces flavus)を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号20に示す塩基配列からなるプローブからなる第十のプローブ群、並びに、
タラロマイセス・バチリスポラス(Talaromyces bacillisporus)を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号21〜22に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十一のプローブ群のプローブを固定化したカビ検出用担体。
カビ検出用担体としては、ジーンシリコン(登録商標)(東洋鋼鈑株式会社製)を用い、図1〜2に示される配列番号1〜26のプローブを固定化したものを使用した。各プローブは、シグマ アルドリッチジャパン株式会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、マイクロアレイヤーにより行った。
(2)リクテイミア・コリムビフェラ NBRC4009
(3)モナスカス・ルバー NBRC4483
(4)サーモアスカス・クラスタセウス NBRC9129
(5)サーモアスカス・オーランティアカス NBRC6766
(6)サーモアスカス・サーモフィラス NBRC9643
(7)ニグロスポラ・オリゼー NBRC32860
(8)ニューロスポラ・クラッサ NBRC6067
(9)エメリセラ・ニデュランス NBRC4340
(10)タラロマイセス・フラバス NBRC7232
(11)タラロマイセス・バチリスポラス NBRC31150
(12)ペシロマイセス・バリオッティ NBRC100534
(13)ビソクラミス・ゾラニアエ JCM12808
さらに、培養したカビのコロニーを採取し、φ0.5mmジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に個別に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。
次いで、DNA抽出装置によりカビのゲノムDNAを抽出して、PCR法により、各カビのITS領域又はβ-チューブリン遺伝子を菌株毎に増幅した。
ITS領域増幅用プライマーセットとしては、図3に示す配列番号27の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号28の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。また、β-チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとしては、同図に示す配列番号29の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号30の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。これらのプライマーは、シグマ アルドリッチジャパン株式会社により合成したものを使用した。
1.Ampdirect(G/Crich) 4.0μl
2.Ampdirect(addition-4) 4.0μl
3.dNTPmix 1.0μl
4.Cy-5dCTP 0.2μl
5.ITS1-Fw primer(配列番号27)(2.5μM) 1.0μl
6.ITS1-Rv primer(配列番号28)(2.5μM) 1.0μl
7.BtF primer(配列番号29)(10μM) 1.0μl
8.BtR primer(配列番号30)(10μM) 1.0μl
9.Template DNA 1.0μl
10.NovaTaq HotStart DNA polymerase 0.2μl
11.水(全体が20.0μlになるまで加水)
(a)95℃ 10分
(b)95℃ 30秒
(c)56℃ 30秒
(d)72℃ 60秒((b)〜(d)を40サイクル)
(e)72℃ 10分
そして、標識検出装置(BIOSHOT,東洋鋼鈑株式会社製)を用いて、カビ検出用担体に固定化された各プローブにおける蛍光強度(プローブに結合した増幅産物の蛍光強度)を測定して、各プローブにおけるS/N比値を算出した。その結果を図4〜図5に示す。
検出対象の複数のカビのDNAにおける標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスPCRを行った場合に、本実施形態のカビ検出用担体に固定化したプローブが有効に機能するかを確認するための試験を行った。
本試験では、図6に示すように、これらのカビをランダムに5種類ずつ組み合わせ、以下の5つのグループの混合DNA試料を作成した。したがって、一部のカビは、複数の試料に重複して含まれている。培養は、PDA培地またはM40Y培地を用いて、25℃の暗所で、7日間静置させて行った。
(1)ムーコル・ラセモサス NBRC4555
(4)サーモアスカス・クラスタセウス NBRC9129
(6)サーモアスカス・サーモフィラス NBRC9643
(9)エメリセラ・ニデュランス NBRC4340
(11)タラロマイセス・バチリスポラス NBRC31150
(2)リクテイミア・コリムビフェラ NBRC4009
(5)サーモアスカス・オーランティアカス NBRC6766
(8)ニューロスポラ・クラッサ NBRC6067
(10)タラロマイセス・フラバス NBRC7232
(13)ビソクラミス・ゾラニアエ JCM12808
(3)モナスカス・ルバー NBRC4483
(6)サーモアスカス・サーモフィラス NBRC9643
(7)ニグロスポラ・オリゼー NBRC32860
(12)ペシロマイセス・バリオッティ NBRC100534
(13)ビソクラミス・ゾラニアエ JCM12808
次いで、DNA抽出装置により各カビのゲノムDNAを抽出したものを、上記試料1〜3に示す通りに混合した。そして、PCR法により、各カビのITS領域及び/又はβ-チューブリン遺伝子を試料毎に同時に増幅した。PCR法で用いたプライマーセットは、試験1におけるものと同一であり、ITS領域を増幅するためのプライマーセットとして、配列番号27及び28に示される塩基配列からなるプライマーを使用し、β-チューブリン遺伝子を増幅するためのプライマーセットとして、配列番号29及び30に示される塩基配列からなるプライマーを使用した。
1.Ampdirect(G/Crich) 4.0μl
2.Ampdirect(addition-4) 4.0μl
3.dNTPmix 1.0μl
4.Cy-5dCTP 0.2μl
5.ITS1-Fw primer(2.5μM) 1.0μl
6.ITS1-Rv primer(2.5μM) 1.0μl
7.BtF primer(10μM) 1.0μl
8.BtR primer(10μM) 1.0μl
9.Template DNA(1.0μl/菌株) 1.0μl×菌株数
10.NovaTaq HotStart DNA polymerase 0.2μl
11.水(全体が20.0μlになるまで加水)
(a)95℃ 10分
(b)95℃ 30秒
(c)56℃ 30秒
(d)72℃ 60秒((b)〜(d)を40サイクル)
(e)72℃ 10分
そして、標識検出装置(BIOSHOT,東洋鋼鈑株式会社製)を用いて、カビ検出用担体に固定化された各プローブにおける蛍光強度(プローブに結合した増幅産物の蛍光強度)を測定し、各プローブにおけるS/N比値を取得した。その結果を図7に示す。
配列番号1〜4に示す塩基配列からなるプローブは、ムーコル・ラセモサスを検出するためのプローブである。このうち、配列番号1,2,4については、S/N比値はいずれも3以上であり、陽性反応を示している。配列番号3については、5種類のカビを含むマルチプレックスPCRを行った試験2では陽性反応は示さなかったが、1種類のカビのみを個別に増幅した試験1においては、陽性反応を示している。
配列番号10,11に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・クラスタセウスを検出するためのプローブである。これらについては、S/N比値はいずれも3以上であり、陽性反応を示している。
配列番号13に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・サーモフィラスを検出するためのプローブである。これについては、S/N比値は3以上であり、陽性反応を示している。
配列番号18,19に示す塩基配列からなるプローブは、エメリセラ・ニデュランスを検出するためのプローブである。これらについては、S/N比値はいずれも3以上であり、陽性反応を示している。
配列番号21〜23に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・バチリスポラスを検出するためのプローブである。これらについては、S/N比値はいずれも3以上であり、陽性反応を示している。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応は生じておらず、試料1に含まれるカビを検出するための各プローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
配列番号5〜7に示す塩基配列からなるプローブは、リクテイミア・コリムビフェラを検出するためのプローブである。これらについては、S/N比値はいずれも3以上であり、陽性反応を示している。
配列番号12に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・オーランティアカスを検出するためのプローブである。これについては、S/N比値は3以上であり、陽性反応を示している。
配列番号16,17に示す塩基配列からなるプローブは、ニューロスポラ・クラッサを検出するためのプローブである。これらについては、S/N比値はいずれも3以上であり、陽性反応を示している。
配列番号20に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・フラバスを検出するためのプローブである。これについては、S/N比値は3以上であり、陽性反応を示している。
配列番号26に示す塩基配列からなるプローブは、ビソクラミス・ゾラニアエを検出するためのプローブである。これについては、S/N比値は3以上であり、陽性反応を示している。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応は生じておらず、試料2に含まれるカビを検出するための各プローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
配列番号8,9に示す塩基配列からなるプローブは、モナスカス・ルバーを検出するためのプローブである。これらについては、S/N比値はいずれも3以上であり、陽性反応を示している。
配列番号13に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・サーモフィラスを検出するためのプローブである。これについては、S/N比値は3以上であり、陽性反応を示している。
配列番号14,15に示す塩基配列からなるプローブは、ニグロスポラ・オリゼーを検出するためのプローブである。これらについては、S/N比値はいずれも3以上であり、陽性反応を示している。
配列番号24,25に示す塩基配列からなるプローブは、ペシロマイセス・バリオッティを検出するためのプローブである。これらについては、S/N比値はいずれも3以上であり、陽性反応を示している。
配列番号26に示す塩基配列からなるプローブは、ビソクラミス・ゾラニアエを検出するためのプローブである。これについては、S/N比値は3以上であり、陽性反応を示している。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応は生じておらず、試料3に含まれるカビを検出するための各プローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
例えば、本実施形態のカビ検出用担体に固定化するプローブは、1種類につき1スポットずつに限定されるものではなく、それぞれのプローブを複数スポットずつ固定化しても良い。また、本実施形態の検出対象カビ以外のカビを検出するためのその他のプローブが、本実施形態におけるプローブと共に本実施形態のカビ検出用担体に固定化されていても良く、適宜変更することが可能である。
また、本発明における対象カビに関連するアナモルフ型・テレオモルフ型・異名を持つカビも当然検出可能であり、検出対象カビ名は最新の系統分類研究に準ずるものとする。
Claims (10)
- 以下の(a)、(b)、又は(c)に記載の塩基配列からなるプローブ群から選択された二以上のプローブを固定化したことを特徴とするカビ検出用担体。
(a)配列番号1〜22に示す塩基配列からなるプローブ。
(b)配列番号1〜22に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
(c)(a)又は(b)のプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ。 - ムーコル・ラセモサス(Mucor racemosus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号1〜4に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第一のプローブ群、
リクテイミア・コリムビフェラ(Lichtheimia corymbifera)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号5〜7に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第二のプローブ群、
モナスカス・ルバー(Monascus ruber)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号8〜9に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、
サーモアスカス・クラスタセウス(Thermoascus crustaceus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号10〜11に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第四のプローブ群、
サーモアスカス・オーランティアカス(Thermoascus aurantiacus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号12に示す塩基配列からなるプローブからなる第五のプローブ群、
サーモアスカス・サーモフィラス(Thermoascus thermophilus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号13に示す塩基配列からなるプローブからなる第六のプローブ群、並びに、
ニグロスポラ・オリゼー(Nigrospora oryzae)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号14〜15に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群のプローブを固定化した
ことを特徴とする請求項1記載のカビ検出用担体。 - ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号16〜17に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、
エメリセラ・ニデュランス(Emericella nidulans)を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号18〜19に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第九のプローブ群、
タラロマイセス・フラバス(Talaromyces flavus)を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号20に示す塩基配列からなるプローブからなる第十のプローブ群、並びに、
タラロマイセス・バチリスポラス(Talaromyces bacillisporus)を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号21〜22に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十一のプローブ群のプローブを固定化した
ことを特徴とする請求項1記載のカビ検出用担体。 - 請求項2記載の第一乃至第七のプローブ群のプローブ、及び、請求項3記載の第八乃至第十一のプローブ群のプローブを固定化したことを特徴とするカビ検出用担体。
- 検出対象のカビのDNAにおける標的領域をPCRにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、
前記標的領域としてITS領域を用い、
PCR用反応液に、配列番号27に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号28に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるITS領域を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、ムーコル・ラセモサス(Mucor racemosus)、リクテイミア・コリムビフェラ(Lichtheimia corymbifera)、モナスカス・ルバー(Monascus ruber)、サーモアスカス・クラスタセウス(Thermoascus crustaceus)、サーモアスカス・オーランティアカス(Thermoascus aurantiacus)、サーモアスカス・サーモフィラス(Thermoascus thermophilus)、及びニグロスポラ・オリゼー(Nigrospora oryzae)の少なくともいずれかのDNAが含有されている場合、
前記PCR用反応液を使用して、前記試料に含有されるDNAにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項2又は4記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。 - 検出対象のカビのDNAにおける標的領域をPCRにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、
前記標的領域としてβ-チューブリン遺伝子を用い、
PCR用反応液に、配列番号29に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号30に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、エメリセラ・ニデュランス(Emericella nidulans)、タラロマイセス・フラバス(Talaromyces flavus)、及びタラロマイセス・バチリスポラス(Talaromyces bacillisporus)の少なくともいずれかのDNAが含有されている場合、
前記PCR用反応液を使用して、前記試料に含有されるDNAにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項3又は4記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。 - 検出対象のカビのDNAにおける標的領域をPCRにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、
前記標的領域としてITS領域及びβ-チューブリン遺伝子を用い、
PCR用反応液に、配列番号27に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号28に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるITS領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号29に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号30に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、ムーコル・ラセモサス(Mucor racemosus)、リクテイミア・コリムビフェラ(Lichtheimia corymbifera)、モナスカス・ルバー(Monascus ruber)、サーモアスカス・クラスタセウス(Thermoascus crustaceus)、サーモアスカス・オーランティアカス(Thermoascus aurantiacus)、サーモアスカス・サーモフィラス(Thermoascus thermophilus)、ニグロスポラ・オリゼー(Nigrospora oryzae)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、エメリセラ・ニデュランス(Emericella nidulans)、タラロマイセス・フラバス(Talaromyces flavus)、及びタラロマイセス・バチリスポラス(Talaromyces bacillisporus)の少なくともいずれかのDNAが含有されている場合、
前記PCR用反応液を使用して、前記試料に含有されるDNAにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項4記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。 - 検出対象のカビのDNAにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、
前記プライマーセットが、
配列番号27に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号28に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるITS領域を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、
ムーコル・ラセモサス(Mucor racemosus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号1〜4に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第一のプローブ群、
リクテイミア・コリムビフェラ(Lichtheimia corymbifera)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号5〜7に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第二のプローブ群、
モナスカス・ルバー(Monascus ruber)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号8〜9に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、
サーモアスカス・クラスタセウス(Thermoascus crustaceus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号10〜11に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第四のプローブ群、
サーモアスカス・オーランティアカス(Thermoascus aurantiacus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号12に示す塩基配列からなるプローブからなる第五のプローブ群、
サーモアスカス・サーモフィラス(Thermoascus thermophilus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号13に示す塩基配列からなるプローブからなる第六のプローブ群、並びに、
ニグロスポラ・オリゼー(Nigrospora oryzae)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号14〜15に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群のプローブを固定化した
ことを特徴とするカビ検出用キット。 - 検出対象のカビのDNAにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、
前記プライマーセットが、
配列番号29に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号30に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、
ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号16〜17に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、
エメリセラ・ニデュランス(Emericella nidulans)を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号18〜19に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第九のプローブ群、
タラロマイセス・フラバス(Talaromyces flavus)を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号20に示す塩基配列からなるプローブからなる第十のプローブ群、並びに、
タラロマイセス・バチリスポラス(Talaromyces bacillisporus)を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号21〜22に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十一のプローブ群のプローブを固定化した
ことを特徴とするカビ検出用キット。 - 検出対象のカビのDNAにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、
前記プライマーセットが、
配列番号27に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号28に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるITS領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号29に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号30に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、
ムーコル・ラセモサス(Mucor racemosus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号1〜4に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第一のプローブ群、
リクテイミア・コリムビフェラ(Lichtheimia corymbifera)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号5〜7に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第二のプローブ群、
モナスカス・ルバー(Monascus ruber)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号8〜9に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、
サーモアスカス・クラスタセウス(Thermoascus crustaceus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号10〜11に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第四のプローブ群、
サーモアスカス・オーランティアカス(Thermoascus aurantiacus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号12に示す塩基配列からなるプローブからなる第五のプローブ群、
サーモアスカス・サーモフィラス(Thermoascus thermophilus)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号13に示す塩基配列からなるプローブからなる第六のプローブ群、
ニグロスポラ・オリゼー(Nigrospora oryzae)を検出するための、ITS領域から選択された配列番号14〜15に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群、
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タラロマイセス・フラバス(Talaromyces flavus)を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号20に示す塩基配列からなるプローブからなる第十のプローブ群、並びに、
タラロマイセス・バチリスポラス(Talaromyces bacillisporus)を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号21〜22に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十一のプローブ群のプローブを固定化した
ことを特徴とするカビ検出用キット。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112746122A (zh) * | 2021-01-28 | 2021-05-04 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重pcr检测引物、试剂盒及方法 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007174903A (ja) * | 2005-12-26 | 2007-07-12 | Mitsui Norin Co Ltd | 食品汚染糸状菌の鑑別方法及び鑑別キット |
JP2008278848A (ja) * | 2007-05-14 | 2008-11-20 | Canon Inc | プローブ、プローブセット、プローブ担体及び検査方法 |
JP2010004881A (ja) * | 2008-05-29 | 2010-01-14 | Kao Corp | パエシロマイセスバリオッティの検出方法 |
JP2010042005A (ja) * | 1997-05-02 | 2010-02-25 | Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services | Aspergillus種および他の糸状菌を検出するための核酸 |
WO2012169099A1 (ja) * | 2011-06-09 | 2012-12-13 | 東洋製罐株式会社 | カビの検出方法、pcr用反応液、及びカビ検出用担体 |
JP2013099256A (ja) * | 2011-11-07 | 2013-05-23 | Kao Corp | タラロマイセス属真菌の検出方法 |
JP2014003946A (ja) * | 2012-06-25 | 2014-01-16 | Kao Corp | サーモアスカス属真菌の検出方法 |
-
2016
- 2016-03-09 JP JP2016045460A patent/JP6880554B2/ja active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010042005A (ja) * | 1997-05-02 | 2010-02-25 | Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services | Aspergillus種および他の糸状菌を検出するための核酸 |
JP2007174903A (ja) * | 2005-12-26 | 2007-07-12 | Mitsui Norin Co Ltd | 食品汚染糸状菌の鑑別方法及び鑑別キット |
JP2008278848A (ja) * | 2007-05-14 | 2008-11-20 | Canon Inc | プローブ、プローブセット、プローブ担体及び検査方法 |
JP2010004881A (ja) * | 2008-05-29 | 2010-01-14 | Kao Corp | パエシロマイセスバリオッティの検出方法 |
WO2012169099A1 (ja) * | 2011-06-09 | 2012-12-13 | 東洋製罐株式会社 | カビの検出方法、pcr用反応液、及びカビ検出用担体 |
JP2013099256A (ja) * | 2011-11-07 | 2013-05-23 | Kao Corp | タラロマイセス属真菌の検出方法 |
JP2014003946A (ja) * | 2012-06-25 | 2014-01-16 | Kao Corp | サーモアスカス属真菌の検出方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MYCOTOXINS, 2002, VOL.52, NO.1, P.45-55, JPN6020008535, ISSN: 0004407094 * |
第29回GMPとバリデーションをめぐる諸問題に関するシンポジウム要旨集, 2014, P.45-50, JPN6020047971, ISSN: 0004407095 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112746122A (zh) * | 2021-01-28 | 2021-05-04 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 水稻胡麻叶斑病菌和稻黑孢霉菌的双重pcr检测引物、试剂盒及方法 |
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