CN102272305B

CN102272305B - 属于Geosmithia属的菌类的检测方法

Info

Publication number: CN102272305B
Application number: CN2009801542211A
Authority: CN
Inventors: 细谷幸一; 中山素一; 德田一; 矢口贵志; 弘佑介
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2008-11-11
Filing date: 2009-11-11
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2029-11-11
Also published as: EP2363474A1; EP2363474B1; JP5562007B2; CN102272305A; JP2010136719A; US20120129166A1; EP2363474A4; US8748093B2; WO2010055868A1

Abstract

本发明提供一种属于Geosmithia属的菌类的检测方法。本发明的属于Geosmithia属的菌类的检测方法用以下述(a)或者(b)所记载的碱基序列表示的核酸，对属于Geosmithia属的菌类进行鉴定，(a)序列号1～3中任一个所记载的β-微管蛋白基因的部分碱基序列或者其互补序列；(b)在序列号1～3中任一个所记载的碱基序列中1个或者数个碱基被缺失、置换、插入或者添加而得到的碱基序列或者其互补序列。

Description

属于Geosmithia属的菌类的检测方法

技术领域

本发明涉及属于Geosmithia属的菌类的检测方法。

背景技术

属于Geosmithia属的菌类广泛分布于自然界，在蔬菜、水果等农作物上繁殖，并污染以这些农作物为原料的饮食品。然而，由于属于Geosmithia属的菌类形成了具有高耐热性的厚膜孢子，因此即使进行对通常的其它真菌类的杀菌处理工序，例如对酸性饮料进行加热灭菌处理等，属于Geosmithia属的菌类也可以生存、繁殖，从而成为造成发霉的原因。因此，属于Geosmithia属的菌类被作为引起重大品质事故的重要有害菌而被戒备。为了防止由于饮食品及其原材料中的属于Geosmithia属的菌类造成的事故，属于Geosmithia属的菌类的检测和鉴定变得非常重要。

现在，属于Geosmithia属的菌类的检测和鉴定是在菌体培养后，通过观察形态学上的特征来进行的。由于这种方法需要持续培养直至产生形态学上的特征，因此最短也需要14天以上的长时间。此外，由于基于细微的形态学上的特征来鉴定菌类而需要高度的专业知识，因而不可否认存在判定者不同而鉴定结果不同的危险性。而且，还存在由于加热或者药剂等造成损伤菌体等失去形态形成能力的情况，由于这些菌体即使进行长时间培养也无法形成特征形态而在鉴定结果的信赖性方面产生问题。这样的菌类的检测需要长时间，这从饮食品的卫生管理、原材料的鲜度保证、流通上的限制等观点来看，肯定无法得到满足。因此，需要确立解决了迅速性以及信赖性的问题的检测、鉴定方法。

作为菌类的迅速且信赖性高的检测方法，已知有将基因的特定的碱基序列作为目标的扩增法(例如PCR)法进行的检测方法(例如，参考专利文献1～4)。但是，上述方法对于属于Geosmithia属的菌类的特异性基因区域没有进行阐明。因此，具有难于特异性且迅速地检测属于Geosmithia属的菌类的问题。

专利文献1：特表平11-505728号公报

专利文献2：特开2006-61152号公报

专利文献3：特开2006-304763号公报

专利文献4：特开2007-174903号公报

发明内容

本发明的课题在于提供一种能够特异性、简便且迅速地检测作为饮食品污染的主要的原因菌之一的属于Geosmithia属的菌类的方法。此外，本发明的课题还在于提供用于该检测方法的属于Geosmithia属的菌类的特异性碱基序列所表示的DNA、能够与该碱基序列所表示的核酸杂交的寡核苷酸、以及使用该寡核苷酸的引物对和检测试剂盒。

鉴于上述课题，本发明人对能够特异性识别属于Geosmithia属的菌类的方法进行了探索和深入的研究，其结果发现：在属于Geosmithia属的菌类的β-微管蛋白基因序列中，存在着与其他真菌的属有明显区别的具有特异性碱基序列的区域(以下，称其为“可变区域”)。将该可变区域作为靶点，就可以特异性且迅速地检测属于Geosmithia属的菌类。基于此发现从而完成了本发明。

本发明涉及一种属于Geosmithia属的菌类的检测方法，其特征在于，用以下述(a)或者(b)所记载的碱基序列表示的核酸，对属于Geosmithia属的菌类进行鉴定，

(a)序列号1～3中任一个所记载的β-微管蛋白基因的部分碱基序列或者其互补序列；

(b)在序列号1～3中任一个所记载的碱基序列中1个或者数个碱基被缺失、置换、插入或者添加而得到的碱基序列或者其互补序列。

此外，本发明涉及一种由前述(a)或者(b)所记载的碱基序列来表示的DNA，其用于检测属于Geosmithia属的菌类。

此外，本发明涉及一种属于Geosmithia属的菌类检测用寡核苷酸，其能够与以前述(a)或者(b)所记载的碱基序列表示的核酸进行杂交，并且作为用于特异性检测属于Geosmithia属的菌类的核酸探针或者核酸引物而发挥功能。

此外，本发明涉及一种属于Geosmithia属的菌类检测用寡核苷酸，其特征在于，所述检测用寡核苷酸为下述(c)或(d)的寡核苷酸；以及本发明涉及一种属于Geosmithia属的菌类检测用试剂盒，其中，所述试剂盒含有下述(c)或(d)的寡核苷酸。

以(c)序列号4所记载的碱基序列或其互补序列表示的寡核苷酸、或者相对于该碱基序列或其互补序列具有70％以上的同源性并且能够作为检测用寡核苷酸使用的寡核苷酸；

以(d)序列号5所记载的碱基序列或其互补序列表示的寡核苷酸、或者相对于该碱基序列或其互补序列具有70％以上的同源性并且能够作为检测用寡核苷酸使用的寡核苷酸。

进而，本发明涉及一种属于Geosmithia属的菌类检测用核酸引物对，其中，所述检测用核酸引物对由下述(e)和(f)的寡核苷酸构成；以及，本发明涉及一种属于Geosmithia属的菌类检测用试剂盒，其中，所述检测用试剂盒含有该引物对。

以(e)序列号4所记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者以相对于该碱基序列具有70％以上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸；

以(f)序列号5所记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者以相对于该碱基序列具有70％以上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸。

根据本发明，提供能够特异性、简便且迅速地检测作为饮食品污染的主要的原因菌之一的属于Geosmithia属的菌类。此外，根据本发明，还提供用于在该检测方法中使用的属于Geosmithia属的菌类的特异性β-微管蛋白基因的碱基序列所表示的DNA，能够与该碱基序列所表示的核酸进行杂交的寡核苷酸，以及使用该寡核苷酸的引物对和检测试剂盒。

本发明的上述以及其他特征和优点，通过参考适当的附图并从下述记载中更为明确。

附图说明

图1是实施例中PCR产物的电泳图。

图2是实施例中PCR产物的电泳图。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

本发明是使用属于Geosmithia属的菌类的β-微管蛋白基因的特定的部分碱基序列，即属于Geosmithia属的菌类的β-微管蛋白基因序列中存在的Geosmithia属的特异性区域(可变区域)的碱基序列所表示的核酸，进行属于Geosmithia属的菌类的鉴定，对属于Geosmithia属的菌类进行特异性识别、检测的方法。

本发明中的“属于Geosmithia属的菌类”是丝状不完全菌类的一种。属于Geosmithia属的菌类形成有即使在无性世代的生活环境下经过75℃、30分钟的加热处理后也能够生存的具有高耐热性的厚膜孢子。作为属于Geosmithia属的菌类中危害性特别高的菌种，可列举Geosmithia eburneus、Geosmithia byssochlamydoide、以及Geosmithiaemersonii。此外，在本发明的Geosmithia属的菌种还包含作为同属的有性世代的Talaromyces eburneus、Talaromyces byssochlamydoides、以及埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)。

“β-微管蛋白”是指构成微管的蛋白质，“β-微管蛋白基因”是指编码β-微管蛋白的基因。此外，本发明中“β-微管蛋白基因的可变区域”是指在β-微管蛋白基因中，碱基的变异容易积累的特定区域。在本发明的检测方法中“使用β-微管蛋白的部分碱基序列所表示的核酸进行鉴定”是指，使用该部分碱基序列的全部或者其一部分的序列所表示的核酸进行鉴定。

本发明的检测方法的特征在于：使用属于Geosmithia属的菌类的β-微管蛋白基因中的特定(可变)区域的碱基序列所表示的核酸。

本发明人鉴定了含有Geosmithia属的各种菌类的β-微管蛋白基因的碱基序列，并对真菌属之间的遗传距离与碱基序列的同源性进行了分析。具体而言，通过测序法来鉴定各真菌的β-微管蛋白基因的碱基序列，通过比对分析对共同的碱基区域进行研究。其结果发现，β-微管蛋白基因中具有同一属内保守性高而不同属之间保守性低的，即，具有属固有的碱基序列的区域(可变区域)。在此可变区域中属于Geosmithia属的菌类具有其固有的碱基序列。因此，该区域作为用于属水平上识别、鉴定属于Geosmithia属的菌类的遗传学的指标有用。

此外，本发明人对在上述可变区域中，从该区域中选择的满足以下4个条件的部分区域进行了进一步研究：(1)含有属于Geosmithia属的菌类所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域；(2)寡核苷酸的GC含量大概为30％～80％；(3)寡核苷酸的自退火的可能性低；(4)寡核苷酸的Tm(解链温度：melting temperature)值大概为55℃以上。其结果发现了来源于可变区域的碱基序列的15～25个碱基的寡核苷酸。

本发明将该可变区域以及来源于该可变区域的寡核苷酸作为目标。

本发明的检测方法中所使用的属于Geosmithia属的菌类的β-微管蛋白基因的部分碱基序列(可变区域的碱基序列)所表示的核酸是以序列号1、序列号2或者序列号3所记载的碱基序列或者其互补序列表示的核酸。

序列号1所记载的碱基序列及其互补序列是从Geosmithiaeburneus分离、鉴定的β-微管蛋白基因的可变区域的碱基序列。序列号2所记载的碱基序列及其互补序列是从Geosmithiabyssochlamydoides分离、鉴定的β-微管蛋白基因的可变区域的碱基序列。序列号3所记载的碱基序列及其互补序列是从Geosmithia emersonii分离、鉴定的β-微管蛋白基因的可变区域的碱基序列。由于这些序列在属于Geosmithia属的菌类间的同源性非常高，并且与属于Geosmithia属的菌类以外的菌类的同源性低，因此，通过确认被检测体是否具有这些碱基序列，从而能够特异性地识别、鉴定仅属于Geosmithia属的菌类。

此外，即使使用在序列号1、序列号2或者序列号3所记载的碱基序列中1个或者数个碱基被缺失、置换、插入或者添加而得到的碱基序列或者其互补序列所表示的核酸，也能够特异性地识别、鉴定仅属于Geosmithia属的菌类。在此，“1个或者数个”优选为1～25个，更优选为1～20个，更优选为1～15个，进一步优选为1～10个，更进一步优选为1～5个。(以下，将序列号1、序列号2或者序列号3所记载的碱基序列或者其互补序列，以及在序列号1、序列号2或者序列号3所记载的碱基序列中1个或者数个碱基被缺失、置换、插入或者添加而得到的碱基序列或者其互补序列统称为“本发明的β-微管蛋白基因的可变区域的碱基序列”。)

作为使用上述本发明的β-微管蛋白基因的可变区域的碱基序列所表示的核酸来鉴定属于Geosmithia属的菌类的方法没有特别限制，可以用基因工程中通常使用的方法如测序法、杂交法、PCR法、LAMP法等进行。

在本发明的检测方法中，使用上述本发明的β-微管蛋白基因的可变区域的碱基序列所表示的核酸来进行属于Geosmithia属的菌类的鉴定时，优选测定被检测体的β-微管蛋白基因区域的碱基序列，然后确认在该基因的碱基序列中是否含有上述(a)或者(b)所记载的核酸的碱基序列。具体而言，本发明的检测方法是：分析、测定被检测体所具有的β-微管蛋白基因的碱基序列，将测定后的碱基序列与本发明的β-微管蛋白基因的可变区域的碱基序列进行比较，根据其是否一致或者不同来进行属于Geosmithia属的菌类的鉴定。

作为碱基序列的分析、测定方法并没有特别限定，可以利用通常进行的RNA或者DNA测序的方法。

具体地，可以列举Maxam-Gilbert法、Sanger法等的电泳法、质谱法、杂交法等。在Sanger法中，可以列举用放射性标记法、荧光标记法等来标记引物或者终止子的方法。

在本发明的检测方法中，在使用上述本发明的β-微管蛋白基因的可变区域的碱基序列所表示的核酸来进行属于Geosmithia属的菌类的鉴定时，优选将碱基序列的全部或者部分的区域作为目标，进行使用了核酸探针的杂交。

在本发明中，为了使用上述本发明的β-微管蛋白基因的可变区域的碱基序列所表示的核酸对属于Geosmithia属的菌类进行鉴定、检测，可以使用能够与本发明的β-微管蛋白基因的可变区域的碱基序列所表示的核酸进行杂交，并且能够作为核酸探针或者核酸引物而发挥功能的检测用寡核苷酸。

本发明的检测用寡核苷酸，只要是能够用于属于Geosmithia属的菌类的检测的寡核苷酸即可。具体而言，可以是能够作为用于检测属于Geosmithia属的菌类的核酸引物或者核酸探针来使用的寡核苷酸，或者是在严格条件下能够与属于Geosmithia属的菌类的β-微管蛋白基因进行杂交的寡核苷酸。另外，这里，作为“严格条件”，例如可以列举Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook，David W.Russell.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress]所记载的方法，例如，将含有6×SSC(1×SSC的组成：0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)，0.5％SDS，5×Denhardt′s溶液以及100mg/ml鲱鱼精DNA的溶液与探针一起在65℃下保温8～16小时并进行杂交的条件。

作为本发明的上述检测用寡核苷酸，是从前述本发明的β-微管蛋白基因的可变区域的碱基序列中选择的区域，优选能够与满足以下4个条件的区域杂交的寡核苷酸：(1)含有属于Geosmithia属的菌类所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域；(2)寡核苷酸的GC含量大概为30％～80％；(3)寡核苷酸的自退火的可能性低；(4)寡核苷酸的Tm值大概为55℃以上。在此，“GC含量”是指鸟嘌呤和胞嘧啶的总数相对于寡核苷酸的全部碱基数的比例(％)。

在上述(1)中，“含有属于Geosmithia属的菌类所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域”是指，即使在前述本发明的β-微管蛋白基因的可变区域中，不同属之间的碱基序列的保守性特别低(即，属于Geosmithia属的菌类的特异性特别高)，属于Geosmithia属的菌类所固有的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域。

此外，在上述(3)中，“寡核苷酸的自退火的可能性低”是指，从引物的碱基序列预想到引物之间无法结合。

作为本发明的检测用寡核苷酸的碱基数，没有特别限制，优选为13个碱基～30个碱基，更优选为18个碱基～23个碱基。杂交时的寡核苷酸的Tm值优选在55℃～65℃的范围内，更优选在59℃～62℃的范围内。寡核苷酸的GC含量优选为30％～80％，更优选为45％～65％，进一步优选为55％左右。

作为本发明的上述检测用寡核苷酸，更优选以序列号4或者5所记载的碱基序列或者其互补序列表示的寡核苷酸。此外，本发明的检测用寡核苷酸也可以是以相对于序列号4或者5所记载的碱基序列具有70％以上的同源性的碱基序列或者其互补序列表示的寡核苷酸，更优选同源性为80％以上，进一步优选同源性为90％以上，特别优选同源性为95％以上。此外，能够在本发明中使用的检测用寡核苷酸中还包括，在序列号4或者5所记载的碱基序列或者其互补序列中1个或者数个、更优选为1～4个、进一步优选为1～3个、更进一步优选为1～2个、特别优选为1个碱基经缺失、插入或者置换等变异或者修饰后的碱基序列所表示的寡核苷酸。此外，还可以在序列号4或者5所记载的碱基序列或者其互补序列中添加适当的碱基序列。

关于碱基序列的同源性，是由Lipman-Pearson法(Science，227，1435，1985)等计算的。具体地，可以使用基因信息处理软件Genetyx-Win(Software开发制)的同源分析(Search homology)程序，将参数Unit size to compare(ktup)设定为2进行分析而算出来的。

本发明的检测用寡核苷酸可以作为核酸引物以及核酸探针使用。核酸探针可以通过用标记物标记上述寡核苷酸来制备。作为上述标记物没有特别的限定，可以使用放射性物质、酶、荧光物质、发光物质、抗原、半抗原、酶底物、不溶性载体等通常的标记物。标记方法，既可以是末端标记，也可以是在序列的途中标记，此外，也可以是在糖、磷酸基、碱基部分上的标记。作为该标记的检测方法，例如，在用放射性同位素对核酸探针进行标记时可以列举放射自显影等，在用荧光物质标记时可以列举荧光显微镜等，在用化学发光物质标记时可以列举使用感光胶卷分析或者使用CCD照相机的数码分析等。

此外，上述检测用寡核苷酸可以与固相载体结合而作为捕捉探针使用。此时，可以通过联合捕捉探针和标记核酸探针来进行夹心杂交(sandwich assay)，也可以对目标核酸进行标记并捕捉。

在本发明的检测法中，为了鉴定、检测属于Geosmithia属的菌类，优选使用下述(c)和/或(d)的寡核苷酸作为核酸探针进行杂交，进一步优选使用以序列号4和序列号5所记载的碱基序列表示的寡核苷酸；

以(c)序列号4所记载的碱基序列或其互补序列表示的寡核苷酸、或者以相对于该碱基序列或其互补序列具有70％以上的同源性并且能够作为核酸探针使用的碱基序列表示的寡核苷酸；

以(d)序列号5所记载的碱基序列或其互补序列表示的寡核苷酸、或者以相对于该碱基序列或其互补序列具有70％以上的同源性并且能够作为核酸探针使用的碱基序列表示的寡核苷酸。

为了检测被检测体中的属于Geosmithia属的菌类，可以将前述(c)和/或(d)所示的寡核苷酸标记作为核酸探针，使得到的核酸探针与DNA或RNA杂交，通过适当的检测法来检测杂交后的探针的标记。由于上述核酸探针与属于Geosmithia属的菌类的β-微管蛋白基因的可变区域的一部分特异性杂交，因此能够迅速且简便地检测被检测体中的属于Geosmithia属的菌类。此外，作为测定与DNA或者RNA杂交后的核酸探针标记的方法，可以使用通常的方法(FISH法、点杂交(dotblot)法、DNA杂交(southern blot)法、RNA杂交(northern blot)法等)。

在本发明的检测法中，为了使用前述本发明的β-微管蛋白基因的可变区域的碱基序列所表示的核酸来进行属于Geosmithia属的菌类的鉴定，优选对包含该碱基序列的全部或者部分的DNA片段进行扩增，确认有无扩增产物。作为对包含该区域的DNA片段进行括增的方法，没有特别限制，可以使用PCR(聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction))法、LCR(连接酶链反应(Ligase Chain Reaction))法、SDA(链置换扩增(Strand Displacement Amplification))法、NASBA(核酸序列依赖性扩增(Nucleic Acid Sequence-based Amplification))法、RCA(滚环扩增(Rolling-circle amplification))法、LAMP(环介导等温扩增(Loop mediated isothermal amplification))法等通常的方法。但是，本发明中，从迅速性以及简便性的观点来看，优选使用PCR法。

在本发明中，对使用PCR法进行属于Geosmithia属的菌类的检测的情况进行说明。

为了检测属于Geosmithia属的菌类，优选使用下述(e)或(f)的寡核苷酸作为核酸引物，进一步优选使用以序列号4和序列号5所记载的碱基序列表示的寡核苷酸；

此外，本发明的属于Geosmithia属的菌类检测用核酸引物对是由前述(e)的寡核苷酸和前述(f)的寡核苷酸构成的寡核苷酸对。

序列号4和序列号5所表示的寡核苷酸是存在于β-微管蛋白基因区域，并具有与可变区域的一部分碱基序列或者其互补序列相同的碱基序列的寡核苷酸。这些寡核苷酸能够与属于Geosmithia属的菌类的DNA的一部分特异性杂交。

前述(e)和(f)所表示的寡核苷酸分别与序列号1所记载的碱基序列中的62位～79位、223位～243位的区域相对应；分别与序列号2所记载的碱基序列中的49位～66位、196位～214位的区域相对应；以及分别与序列号3所记载的碱基序列中的45位～61位、182位～200位的区域相对应。因此，通过使前述寡核苷酸与属于Geosmithia属的菌类的β-微管蛋白基因进行杂交，能够特异性检测属于Geosmithia属的菌类。

本发明的PCR反应的条件，只要能够将目标DNA片段扩增至能够检出的程度，就没有特别的限制。作为PCR的反应条件的优选的一个例子，例如，在95～98℃下进行使双链DNA变成单链DNA的热变性反应10～60秒，在55～59℃下进行引物对与单链DNA杂交的退火反应约60秒，在约72℃下进行使DNA聚合酶起作用的延伸反应约60秒，上述反应构成一个循环，进行约30～35次该循环。

在本发明中，利用PCR法扩增的基因片段的确认可以用通常的方法进行。例如可以列举将PCR反应产物进行电泳以确认是否具有与扩增了的基因的大小相对应的条带的方法；经时测量PCR反应产物量的方法；解读PCR反应产物的碱基序列的方法，但本发明并不限定于这些方法。在本发明中，优选在基因扩增处理后进行电泳，以确认是否具有与扩增了的基因的大小相对应的条带的方法。此外，在本发明中，检测通过PCR法扩增的基因片段可以采用通常的方法进行。例如，在扩增反应时，引入被放射性物质标记的核苷酸的方法；使用被荧光物质标记的引物的方法；在扩增了的DNA双链之间加入溴化乙锭等通过与DNA结合而增强荧光强度的荧光物质的方法等，但本发明并不限定于这些方法。在本发明中，优选在扩增了的DNA双链之间加入通过与DNA结合而增强荧光强度的荧光物质的方法。

在被检测体中含有属于Geosmithia属的菌类的情况下，使用本发明的寡核苷酸对作为引物组来进行PCR反应，对得到的PCR反应产物进行电泳，确认这些菌类中具有特异性的约150～180bp的DNA片段的扩增。通过进行该操作，从而不管是有性还是无性世代，均能够确认被检测体中是否含有属于Geosmithia属的菌类。

本发明中所用的检测用寡核苷酸、核酸引物以及核酸探针，可以根据设计的序列进行化学合成，也可以从试剂制造商处购入。具体地，可以用寡核苷酸合成装置进行合成。此外，也可以使用在合成后用吸附柱、高效液相色谱、或者电泳法进行纯化后的产物。另外，对于含有1个或者数个碱基被置换、缺失、插入或者添加的碱基序列的寡核苷酸，也可以用公认的方法合成。

上述检测用寡核苷酸、核酸引物或者核酸探针的结合方式，不仅可以是天然核酸中存在的磷酸二酯键，还可以是，例如磷酰胺键、硫代磷酸酯键等。

作为在本发明中使用的被检测体没有特别限制，可以使用饮食品自身、饮食品的原材料、分离的菌体、培养的菌体等。

作为从被检测体中制备DNA的方法，只要能够得到足够纯度和量的DNA用于进行属于Geosmithia属的菌类的检测，就没有特别限制，即使是没有纯化的状态也可以使用，也可以经过进一步分离、提取、浓缩、纯化等前处理再使用。例如，可以进行苯酚和氯仿的提取来纯化，或者用市售的纯化试剂盒来纯化，从而提高核酸的纯度后使用。

可以将本发明的前述检测用寡核苷酸、核酸探针或者核酸引物与进行属于Geosmithia属的菌类的检测时所必需的各种试剂一起预先打包，做成属于Geosmithia属的菌类检测用试剂盒。

本发明的检测用试剂盒是例如含有前述本发明的检测用寡核苷酸作为核酸探针的试剂盒，或者是含有前述本发明的检测用寡核苷酸对作为核酸引物对的试剂盒。这些试剂盒优选用于通过杂交法或者PCR法来检测属于Geosmithia属的菌类的情况。本发明的试剂盒除了含有前述检测用寡核苷酸、核酸探针或者核酸引物以外，也可以根据目的含有标记检测物质、缓冲液、核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)、酶底物(dNTP，rNTP等)等菌类检测中常用的物质。

根据本发明的方法，可以在约5～12小时的短时间内进行从被检测体的制备工序到菌类的检测工序。

实施例

以下，基于实施例进一步详细说明本发明，但是本发明不受其限制。

实施例1 属于Geosmithia属的菌类的特异性碱基序列的分析

通过下述方法确定Geosmithia属的各种β-微管蛋白基因的碱基序列。使用GenTorukun^TM(Takara Bio(株)社制)，从用马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基在25℃、暗处培养7天的Geosmithia属菌体，提取DNA。作为目标部位的PCR扩增，使用PuRe TaqTM Ready-To-GoPCR Beads(GE Health Care UK LTD制)，作为引物使用Bt2a(5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’：序列号6)、Bt2b(5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’：序列号7)(Glass andDonaldson，Appl Environ Microbiol 61：1323-1330，1995)。扩增条件为：变性温度为95℃，退火温度为59℃，延伸温度为72℃，实施35次循环。PCR产物使用Auto SegTM G-50(AmershamPharmacia Biotech社制)进行纯化。PCR产物使用BigDye terminatorVer.1.1(商品名：Applied Biosystems社制)标记，以ABI PRISM3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社制)实施电泳。在从电泳时的荧光信号来确定碱基序列时，使用软件“ATGC Ver.4”(Genetyx社制)。

基于利用测序法确定的各种菌类(Geosmithia eburneus、Geosmithia byssochlamydoides、Geosmithia emersonii、黑曲霉(Aspergillus niger)(保藏编号：AY585535)、以及芽枝状枝孢(Cladosporium cladosporioides)(参照特愿2008-139999))的β-微管蛋白基因的碱基序列信息，使用DNA分析软件(商品名：DNAsis pro，日立软件社制)进行比对分析，确定含有属于Geosmithia属的菌类的特异性碱基序列的β-微管蛋白基因中的特定区域(序列号1～3)。

实施例2 利用PCR法的属于Geosmithia属的菌类的检测

(1)引物的制作

在上述得到的属于Geosmithia属的菌类的特异性碱基序列区域(碱序列号1～3)中，从3’末端侧属于Geosmithia属的菌类的特异性特别高的区域开始，对满足如下4个条件的部分区域进行了研究：1)属固有的基因的碱基序列为大约10个碱基连续，2)寡核苷酸的GC含量大概为30％～80％，3)寡核苷酸的自退火的可能性低，4)寡核苷酸的Tm值大概为55～65℃左右。基于该部分区域的碱基序列，设计5组引物对，使用从各种菌体提取的DNA作为模板，利用PCR反应研究Geosmithia属检测的有效性。即，进行了以下研究：在以Geosmithia属DNA作为模板的反应中，确认150～180bp的DNA扩增反应，在以其它霉菌的基因组DNA作为模板的反应中，没有确认扩增产物。结果确认了5组引物对中的1组引物对对于Geosmithia属检测的有效性。确认了有效性的引物对是由序列号4和5记载的碱基序列所表示的寡核苷酸构成的引物对。另外，使用的引物是委托Sigma Aldrich Japan公司合成(脱盐纯化品，0.02μmol等级)后购入的。

(2)被检测体的制备

使用表1和表2中记载的菌作为属于Geosmithia属的菌类。还使用表1和表2所示的其它属于Geosmithia属的菌类以及其它菌类，以示出序列号4和5中记载的碱基序列所表示的寡核苷酸构成的引物相对于属于Geosmithia属的菌类的β-微管蛋白基因的特异性。这些购入并使用的菌类由千叶大学医学部真菌医学研究中心所保管，并利用IFM序号进行管理。

在最适条件下培养各菌体。培养条件为：使用马铃薯葡萄糖培养基(商品名：Pearlcore马铃薯葡萄糖琼脂培养基，荣研化学株式会社制)，在25℃下培养7天。

表1

试样编号	菌种	菌株名
			1	Geosmithia eburneus	IFM53622(T7)
2	Geosmithia eburneus	IFM55257
			3	Geosmithia byssochlamydoides	IFM51198(T41)
4	Geosmithia byssochlamydoides	IFM48180
			5	Geosmithia emersonii	NBRC31232
6	Geosmithia emersonii	NBRC31169
			7	黄色篮状菌(Talaromyces flavus)	IFM42243
8	黄色篮状菌(Talaromyces flavus)	IFM52233
			9	藤黄篮状菌(Talaromyces luteus)	IFM53242
10	藤黄篮状菌(Talaromyces luteus)	IFM53241
			11	糙孢篮状菌(Talaromyces trachyspermus)	IFM42247
12	糙孢篮状菌(Talaromyces trachyspermus)	IFM52252
			13	沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)	IFM52255
14	沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)	IFM52262
			15	纯黄丝衣菌(Byssochlamys fulva)	IFM48421
16	纯黄丝衣菌(Byssochlamys fulva)	IFM51213
			17	雪白丝衣菌(Byssochlamys nivea)	IFM51244
18	雪白丝衣菌(Byssochlamys nivea)	IFM51245
			19	榛色钩囊菌(Hamigera avellanea)	IFM42323
20	榛色钩囊菌(Hamigera avellanea)	IFM52241

表2

试样编号	菌种	菌株名
			1	Geosmithia eburneus	IFM53622(T7)
2	Geosmithia emersonii	NBRC31232
			3	宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)	IFM40913
4	宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)	IFM40915
			5	费希尔新萨托菌(Neosartorya ficheri)	IFM46945
6	刺孢新萨托菌(Neosartorya spinosa)	IFM46967
			7	光滑新萨托菌(Neosartorya glabra)	IFM46949
8	平塚新萨托菌(Neosartorya hiratsukae)	IFM47036
			9	烟曲霉(Aspergillus fumigatus)	A125
10	黑曲霉(Aspergillus niger)	An15
			11	土曲霉(Aspergillus terreus)	A229
12	黄曲霉(Aspergillus flavus)	As17
			13	构巢裸胞壳(Emericella nidulans)	As18
14	荨麻青霉(Penicillium griseofulvum)	IFM54313
			15	桔青霉(Penicillium citirinum)	IFM54314
16	链格孢(Alternaria alternata)	IFM41348
			17	出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)	IFM41409
18	球毛壳(Chaetomium globosum)	IFM40869
			19	尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)	IFM50002
20	尖孢镰孢(Trichoderma viride)	IFM40938
			21	芽枝状枝孢(Cladosporium cladosporioides)	IFM41450

(3)基因组DNA的制备

使用铂环从琼脂培养基回收各菌体。

使用基因组DNA制备用试剂盒(商品名：PrepMan ultra，AppliedBiosystems社制)，由回收的菌体制备基因组DNA溶液。DNA溶液的浓度制备为50ng/μl。

(4)PCR反应

作为DNA模板，混合1μl上述制备的基因组DNA溶液、13μl的Pre Mix Taq(商品名，Takara Bio社制)、10μl无菌蒸馏水，添加0.5μl序列号4记载的碱基序列所表示的寡核苷酸构成的引物(Te1F引物：GTGGCCCTCACGTTCGAG，20pmol/μL)和0.5μl序列号5记载的碱基序列所表示的寡核苷酸构成的引物(Te1R引物：GCCATTGTAGCATGTGCCAA，20pmol/μL)，制备25μl的PCR反应液。

对PCR反应液，使用自动基因扩增装置热循环仪DICE(TakaraBio)进行基因扩增处理。PCR反应条件为：(i)95℃、1分钟的热变性反应，(ii)55℃、1分钟的退火反应和(iii)72℃、1分钟的延伸反应，以此为1次循环，进行35次循环。

(5)扩增的基因片段的确认

PCR反应后，从PCR反应液分取2.5μl，以2％的琼脂糖凝胶进行电泳，以SYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE(Invitrogen)将DNA染色之后，通过在紫外线下检测荧光来确认有无扩增的DNA片段。图1和图2中示出琼脂糖凝胶的电泳图。另外，图1示出表1所记载的菌类试样的电泳图，图2示出表2所记载的菌类试样的电泳图。图中的编号表示使用从对应于表记载的试样编号的试样中提取的DNA而进行反应的循环。

其结果，在含有属于Geosmithia属的菌类的基因组DNA的试样(图1的1～6列)以及(图2的1～2列)中，确认了约150～180bp左右的基因片段的扩增。另一方面，在不含有属于Geosmithia属的菌类的基因组DNA试样中，没有确认基因片段的扩增。由以上结果可知，通过使用本发明的寡核苷酸，能够特异性检测属于Geosmithia属的菌类。

通过本发明，能够特异性、简便并迅速地检测属于Geosmithia属的菌类。因此，本发明能够用于饮料和食品等的品质检查、医药品和化妆品等的品质检查，此外，还能用于饮料、食品、医药品、化妆品等的生产线中的环境检查等的领域中。

尽管将本发明与其实施方式一起进行说明，但是，除非特别指定，本发明并不限于说明的任意详细部分，可以在不违反附加的权利要求所示的发明精神和范围的情况下进行广泛的解释。

本发明是基于2008年11月11日在日本进行专利申请的特愿2008-288639而主张优先权的，在此参照其并作为本说明书的记载的一部分而引入。

Claims

1.一种属于Geosmithia属的菌类的检测方法，其特征在于，

所述检测方法使用下述(e)和(f)的寡核苷酸作为核酸引物通过聚合酶链反应(PCR)法进行基因扩增反应，

(e)以序列号4所记载的碱基序列表示的寡核苷酸；

(f)以序列号5所记载的碱基序列表示的寡核苷酸。

2.如权利要求1所述的检测方法，其中，

所述属于Geosmithia属的菌类为选自Geosmithia eburneus、Geosmithia emersonii和Geosmithia byssochlamydoides中的至少1种菌类。

3.一种属于Geosmithia属的菌类检测用核酸引物对，其中，

所述检测用核酸引物对由下述(e)和(f)的寡核苷酸构成，

(e)以序列号4所记载的碱基序列表示的寡核苷酸；

(f)以序列号5所记载的碱基序列表示的寡核苷酸。

4.如权利要求3所述的属于Geosmithia属的菌类检测用核酸引物对，其中，

5.一种属于Geosmithia属的菌类检测用试剂盒，其中，

所述检测用试剂盒含有如权利要求3所述的核酸引物对。

6.如权利要求5所述的属于Geosmithia属的菌类检测用试剂盒，其中，