KR20170071111A

KR20170071111A - 감나무 둥근무늬낙엽병균 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20170071111A
Application number: KR1020150179071A
Authority: KR
Inventors: 임양숙; 조두현; 정희영; 이승열
Original assignee: 경상북도(농업기술원); 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2015-12-15
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2017-06-23
Also published as: KR101767371B1

Abstract

본 발명은 감나무 둥근무늬낙엽병균 검출 또는 진단을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 감나무 둥근무늬낙엽병균을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있는 프라이머 세트; 이를 포함하는 감나무 둥근무늬낙엽병 진단용 조성물; 진단 키트; 및 이를 이용한 감나무 둥근무늬낙엽병균 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PCR 반응용 프라이머 세트는 감나무 둥근무늬낙엽병균(Mycosphaerella nawae)이 갖는 유전자 영역을 특이적으로 증폭시킬 수 있어, 이를 이용하는 경우 검체로부터 단시간 내에 효과적으로 감나무 둥근무늬낙엽병균을 종-특이적으로 검출할 수 있다. 따라서 감 재배농가에 막대한 피해를 줄 수 있는 감나무 둥근무늬낙엽병균(Mycosphaerella nawae)을 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 진단 시스템을 구축할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 감나무 둥근무늬낙엽병균(Mycosphaerella nawae) 감염으로 인한 경제적 손실을 방지할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

감나무 둥근무늬낙엽병균 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer set for detecting of Mycosphaerella nawae and uses thereof}

본 발명은 감나무 둥근무늬낙엽병균 검출 또는 진단을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 감나무 둥근무늬낙엽병균을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있는 프라이머 세트; 이를 포함하는 감나무 둥근무늬낙엽병 진단용 조성물; 진단 키트; 및 이를 이용한 감나무 둥근무늬낙엽병균 검출 방법에 관한 것이다.

감나무 둥근무늬낙엽병(circular leaf spot, CLS)은 감나무에서 피해가 가장 심한 병으로 5월 중하순부터 자낭포자 형태로 잎에 침입하며 8월 하순 이후에 병징이 나타나서 잎을 일찍 떨어뜨린다. 주로 잎에 발생하며, 드물게 감꼭지에도 발생한다. 처음 흑색의 둥근반점이 잎에 형성되고, 병반이 확대되면서 병반의 내부에는 담갈색 내지 적갈색을 띠며 병반의 테두리는 흑녹색을 띤다. 그후 원형병반이 융합하여 부정형 병반으로 커지고, 병 발생이 심한 잎은 일찍 떨어져 낙엽이 된다. 이는 나무의 생장 및 수량에 큰 영향을 미치고 동해를 받기 쉽다.

이러한 감나무 둥근무늬낙엽병을 일으키는 병원균은 마이코스파에렐라 나와애(Mycosphaerella nawae)로 진균계의 자낭균문에 속하며, 자낭포자와 분생포자를 형성한다. 자낭각은 흑갈색의 구형내지 계란모양이며, 그 안에 여러 개의 자낭이 들어있다. 병원균의 생육적온은 20∼25℃이고, 인공배양은 가능하나 분리하기가 매우 어렵다. 감나무 둥근무늬낙엽병의 발명 조건 및 전염경로를 살펴보면, 낙엽 된 병반에서 균사 또는 균사덩어리 형태로 월동한 다음, 4월경 위자낭각(pseudothecium)이 형성되어 5∼7월에 비산되어 감염되는 것으로 알려져 있고, 병징 발현은 9∼10월에 이루어진다. 감잎에 침입한 병원균은 일정한 잠복기를 거쳐 발병되는데, 2개월에서 4개월까지 긴 잠복기간을 거치며, 2차 전염은 하지 않는 것으로 생각된다. 6∼7월, 강우가 많고 비배관리가 부실한 과원에서 많이 발생한다.

감나무 둥근무늬낙엽병은 한국의 감 재배지에서 흔히 발생되는 병으로 특히 남부지방의 단감재배지에서는 해마다 발생하여 가장 큰 피해를 주는 병이다(감 수확량의 약 30 % 이상을 감소시킴). 이 병은 감염되어 병징이 나타나는 시기까지의 시간이 아주 길고 일단 병이 발생하고 나면 방제 방법이 없기 때문에 지금까지도 확실한 방제 대책을 세우지 못한 채 해마다 피해를 입고 있는 농가가 많다. 이 병에 걸리게 되면 심하게 감염된 잎은 낙엽되므로 미성숙과실, 탈과 등의 생산성 저하의 원인이 되어 과원의 황폐화를 가져오는 무서운 병이다. 이 병은 대부분 1차 전염원에 의해서 감염되며 감염에서부터 병징이 나타나기까지 잠복기가 매우 길어서(감염 후 약 90-120일간의 잠복기) 방제에 큰 어려움이 있고, 병징 발현 후 방제는 불가능한 병이다. 따라서, 효과적인 감나무 둥근무늬낙엽병 방제를 위해서는 자낭포자 비산시기에 맞추어 선제적 살균제 처리가 필수적이다. 감 재배농가에서는 본 병해를 방제하기 위해, 연간 6회 이상의 살균제를 살포하고 있어, 재배농가에 경제적인 부담을 가중시키고 있다.

따라서 감나무 둥근무늬낙엽병의 피해를 최소화하기 위해서는 질병이 발병되기 이전에 약제처리에 의한 예방이 필수불가결하기 때문에, 감나무 둥근무늬낙엽병의 감염을 조기에 신속하게 진단할 수 있는 기술개발이 절실히 요구되어지고 있다.

이에, 본 발명자들은 감나무 둥근무늬낙엽병의 감염을 조기에 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 방법을 찾고자 노력하였으며, 그 결과 병원균인 마이코스파에렐라 나와애(Mycosphaerella nawae) 유전자의 특이적 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하고 상기 프라이머를 사용하여 PCR을 진행하는 경우, 감나무 둥근무늬낙엽병을 정확하게 진단 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

한국공개특허 제10-2015-0118344호

따라서 본 발명의 목적은 감나무 둥근무늬낙엽병을 효과적으로 진단할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 감나무 둥근무늬낙엽병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 감나무 둥근무늬낙엽병 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 감나무 둥근무늬낙엽병균을 효과적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍을 포함하는, 감나무 둥근무늬낙엽병 진단용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제 1 프라이머 쌍은 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 599bp의 감나무 둥근무늬낙엽병균 특이 PCR 산물을 증폭할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제 2 프라이머 쌍은 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 204bp의 감나무 둥근무늬낙엽병균 특이 PCR 산물을 증폭할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 감나무 둥근무늬낙엽병 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍 이외에 PCR 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 감나무 둥근무늬낙엽병 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 식물체 검체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 감나무 둥근무늬낙엽병균을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 PCR 반응용 프라이머 세트는 감나무 둥근무늬낙엽병균(Mycosphaerella nawae)이 갖는 유전자 영역을 특이적으로 증폭시킬 수 있어, 이를 이용하는 경우 검체로부터 단시간 내에 효과적으로 감나무 둥근무늬낙엽병균을 종-특이적으로 검출할 수 있다. 따라서 감 재배농가에 막대한 피해를 줄 수 있는 감나무 둥근무늬낙엽병균(Mycosphaerella nawae)을 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 진단 시스템을 구축할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 감나무 둥근무늬낙엽병균(Mycosphaerella nawae) 감염으로 인한 경제적 손실을 방지할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 둥근무늬낙엽병균 진단용 PCR법 반응조건을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 실험에 사용된 시료를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 감나무 둥근무늬낙엽병균 검출용 프라이머 세트(MN-F1/MN-R1, MN-F2/MN-R2)를 이용하여 수행한 PCR 결과는 나타낸 것이다: M(Mycosphaerella nawae), DL(diseased leaf), HF(healthy leaf).
도 4는 본 발명의 감나무 둥근무늬낙엽병균 검출용 프라이머 세트(MN-F1/MN-R1, MN-F2/MN-R2)를 이용하여 9개의 M. nawae의 근연종 및 7종의 감에서 발생하는 다른 병원균을 대상으로한 PCR 진단 결과를 나타낸 것이다: AA(Amycosphaerella africana), PM(Paramycospherella marksii), PI(Paramycospherella intermedia), ZP(Zasmidium parkii), MM(Mycosphaerella medeirae), LA(Lecanosticta acicola), PF(Passalora fulva), MG(Mycospherella graminicola), MM(Mycospherella musae), BC(Botrytis cinerea), PD(Pestalotiopsis diospyri), PE(Penicillium expansum), PhD(Phomopsis diospyri), CC(Cladosporium cladosporioides), CG(Colletotrichum gloeosporioides), PK(Pseudocercospora kaki), Po(Positive control; Mycosphaerella nawae).
도 5는 본 발명의 감나무 둥근무늬낙엽병균 검출용 프라이머 세트(MN-F1/MN-R1, MN-F2/MN-R2)를 이용하여 13가지의 품종별 건전 감잎을 대상으로한 PCR 진단 결과를 나타낸 것이다: 1(상주둥시), 2(사곡시), 3(도근조생), 4(차광), 5(갑주백목), 6(함안수시), 7(수홍), 8(청도반시), 9(고종시), 10(단상시), 11(월하시), 12(운풍준시), 13(경산반시), 14(둥근무늬낙엽병 감염잎), 15(DDW: Negative control).

본 발명은 감나무 둥근무늬낙엽병을 진단할 수 있는 프라이머 세트를 제공함에 그 특징이 있다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 감나무 둥근무늬낙엽병을 일으키는 감나무 둥근무늬낙엽병균(Mycosphaerella nawae) 만을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있다.

본 발명에서 “특이적”이라는 용어는 감나무 둥근무늬낙엽병을 일으키는 병원체에 해당하는 감나무 둥근무늬낙엽병균(Mycosphaerella nawae)에 해당하는 종만을 표적하는 것을 의미한다.

본 발명에서 상기 “프라이머”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

한편, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 감나무 둥근무늬낙엽병균(Mycosphaerella nawae) 종 특이적인 Glycoside hydrolase family 3 gene(putative domain 포함) 유전자의 일부 영역을 증폭할 수 있도록 고안된 정방향과 역방향의 프라이머이다. 본 발명의 일실시예에서는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍을 사용하였다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍을 이용하는 경우 약 600bp의 감나무 둥근무늬낙엽병균 특이 PCR 산물이 증폭될 수 있으며, 본 발명의 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍을 이용하는 경우 약 200bp의 감나무 둥근무늬낙엽병균 특이 PCR 산물이 증폭될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제 1 프라이머 쌍을 이용하여 증폭되는 599bp의 감나무 둥근무늬낙엽병균 특이 PCR 산물은 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 상기 제 2 프라이머 쌍을 이용하여 증폭되는 204bp의 감나무 둥근무늬낙엽병균 특이 PCR 산물은 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명자들은 감나무 둥근무늬낙엽병 검출용 프라이머 세트를 개발하기 위하여, 먼저 병원균에 해당하는 마이코스파에렐라 나와애(Mycosphaerella nawae)를 수집하여 무작위적인 시퀀싱을 수행하고, 이들의 염기서열 비교를 위해 미국 국립생물공학정보센터 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 데이터 베이스에 등록된 Mycosphaerella 속 곰팡이에 등록된 각 유전자들을 수집하여 이들 유전자들과 multiple alignment를 통해 감나무 둥근무늬낙엽병균에 특이적으로 나타나는 염기서열을 분석하였으며, 상기 종 특이적 시퀀스(서열번호 5)를 바탕으로 종-특이적 프라이머를 제작하였다. 이렇게 제작된 프라이머는 상기에서 언급한 바와 같이 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍으로 나타내었다.

본 발명의 하기 실시예에서, 상기 제작된 감나무 둥근무늬낙엽병균 종-특이적 프라이머를 이용하여, 총 9종의 감나무 둥근무늬낙엽병균 근연종 및 7종의 감에서 발생하는 다른 병원균를 대상으로 PCR을 수행하였으며, 그 결과 감나무 둥근무늬낙엽병균에서만 밴드가 증폭된 반면, 9종의 근영종 및 7종의 다른 병원균에서는 밴드가 검출되지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 프라이머 세트가 감나무 둥근무늬낙엽병균만을 특이적으로 증폭시킴으로써 감나무 둥근무늬낙엽병균 종-특이적임을 확인할 수 있었다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍을 포함하는 감나무 둥근무늬낙엽병 진단용 조성물을 제공한다.

상기 프라이머는 감나무 둥근무늬낙엽병균 유전자 영역에 존재하는 종 특이적으로 나타나는 염기 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍을 이용하는 경우 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 599bp의 감나무 둥근무늬낙엽병균 특이 PCR 산물이 증폭될 수 있으며, 본 발명의 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍을 이용하는 경우 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 204bp의 감나무 둥근무늬낙엽병균 특이 PCR 산물이 증폭될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 조성물은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍 이외에 추가로 PCR 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍을 포함하는 감나무 둥근무늬낙엽병 진단을 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍을 포함하는, 감나무 둥근무늬낙엽병 진단용 프라이머 세트 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 본 발명의 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍) 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 설명서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한, (a) 식물체 검체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍)를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 감나무 둥근무늬낙엽병균을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 분자유전학적 기법인 PCR 반응을 이용하여 감나무 둥근무늬낙엽병균(Mycosphaerella nawae) 종 특이적 유전자 영역을 증폭하여 감나무 둥근무늬낙엽병을 신속하고 정확하게 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 식물체 검체로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 상기 식물체 검체는 감염이 의심되는 감나무 잎을 사용할 수 있다.

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍)를 이용하여 PCR을 수행하여 감나무 둥근무늬낙엽병균(Mycosphaerella nawae) 종 특이적 유전자 표적 서열을 증폭할 수 있다.

상기 PCR 수행을 통해 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다.

상기 증폭된 산물의 검출은 DNA 칩. 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

감나무 둥근무늬낙엽병균의 종 특이적 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트

본 발명의 감나무 둥근무늬낙엽병 검출용 프라이머 세트를 개발하기 위하여, 먼저 병원균에 해당하는 마이코스파에렐라 나와애(Mycosphaerella nawae)를 수집하여 무작위적인 시퀀싱을 수행하였다. 이들의 염기서열 비교를 위해 미국 국립생물공학정보센터 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 데이터 베이스에 등록된 Mycosphaerella 속 곰팡이에 등록된 각 유전자들을 수집한 후 이들 유전자들과 multiple alignment를 통해 감나무 둥근무늬낙엽병균(M. nawae) 종 특이적 시퀀스 유전자 염기서열을 분석한 결과, 상기 종 특이적 시퀀스가 약 2,036bp 크기의 DNA 단편(서열번호 5)에 해당하였으며, 이를 단백질로 변환하여 확인한 결과 partial sequence of Glycoside hydrolase family 3 gene(putative domain 포함)로 확인할 수 있었다.

본 발명자들은 상기 과정을 통해 규명된 서열번호 5로 표시되는 감나무 둥근무늬낙엽병균(M. nawae) 종 특이적 시퀀스를 이용하여, 본 발명의 감나무 둥근무늬낙엽병균을 검출, 진단할 수 있는 PCR 증폭반응용 프라이머 세트를 하기 표 1과 같이 제작하였다.

본 발명의 감나무 둥근무늬낙엽병균 검출/진단을 위한 프라이머 세트

Primer name	Sequence(5‘-3’)	Orientation	Length(mer)	서열번호
MN-F1	GCG GTG AAC TCA CTA AAG CT	F(forward)	20	1
MN-R1	CTT ATC GTA TGC AGT GAT CTC C	R(reverse)	22	2
MN-F2	CGG ATG AAG AAG AAT ACA AGC	F(forward)	21	3
MN-R2	GAT TGA ATA CCA GAA CCG TCG GG	R(reverse)	23	4

<실시예 2>

검체의 채집

둥근무늬낙엽병균, 둥근무늬낙엽병 감염잎, 건전 감잎을 채집하여 전체 게놈 DNA를 추출하고 이후 PCR 반응을 위한 주형(template)으로 사용하였다.

자세하게는, 둥근무늬낙엽병 감염잎과 건전잎을 무작위로 채집한 뒤, 채집한 잎에서 일정 부분을 채집하고, Biofact^TM Genomic DNA Prep Kit (Cat.No.GD141-050 Biofact, Korea)를 이용하여 제조사의 방법대로 total DNA를 추출하고, 추출된 산물을 주형(template) DNA로 사용하였다.

< 실시예 3>

본 발명의 감나무 둥근무늬낙엽병균 검출용 프라이머 세트의 유용성 확인

상기 실시예 1에서 제작된 본 발명의 PCR 프라이머 세트를 감나무 둥근무늬낙엽병균만을 특이적으로 검출하는데 사용 가능한지를 확인하기 위하여, PCR 프라이머 조성물을 제조하였다. 이의 조성과 반응조건은 하기 표 2에서 나타내었다.

감나무 둥근무늬낙엽병균 증폭용 반응 조성물

내용물	용량(μl)
10X Taq Reaction buffer	2
10mM dNTP mixture	0.5
Forward primer (10 pM)	1
Reverse primer (10 pM)	1
Taq polymerase (5U/㎕)	0.2
template	0.5
멸균증류수	16
최종 용량	14.8

상기 표 2의 조성으로 제조된 증폭 반응 조성물을 PCR 반응은 95℃에서 1분 간 예비변성(predenaturation)을 한 후, 95℃ 30초, 60℃ 60초, 72℃ 90초로 35 주기(cycles) 동안 반복하고, 72℃에서 5분간 연장(extension) 하여 수행하였다(도 1 참조). 이후 PCR 반응의 증폭산물은 아가로즈젤 전기영동으로 분석하였다.

<3-1> 둥근무늬낙엽병균 , 둥근무늬낙엽병 감염잎 , 건전 감잎에서의 PCR 결과

상기 표 2의 조성물을 이용하여 준비된 둥근무늬낙엽병균, 둥근무늬낙엽병 감염잎, 건전 감잎 전체 게놈 DNA를 대상으로 PCR 반응을 수행하였다.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 둥근무늬낙엽병균과 둥근무늬낙엽병 감염잎에서 MN-F1/MN-R1 및 MN-F2/MN-R2 프라이머 세트의 목적하는 약 600bp와 200bp의 DNA 단편이 확인되었다. 또한 MN-F1/MN-R1으로 증폭된 산물을 이용하여 MN-F2/ MN-R2로 PCR을 진행한 결과, 건전 감잎을 제외한 나머지 시료에서 목적한 단편을 확인할 수 있었다.

<3-2> 감나무 둥근무늬낙엽병균 ( Mycosphaerella nawae )의 근연종 9종 및 감에 발생하는 다른 병원균 7종에서의 PCR 결과

본 발명의 프라이머 세트의 종 특이성을 확인하기 위하여, M. nawae의 근연종 9종 및 감에 발생하는 다른 병원균 7종 균을 확보하여, MN-F1/MN-R1 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다.

감에서 발생하는 7종의 균류; Botrytis cinerea , Pestalotiopsis diospyri , Penicillium expansum , Phomopsis diospyri , Cladosporium cladosporioides , Colletotrichum gloeosporioides , Pseudocercospora kaki는 한국미생물유전자원센터(KACC)에서 분양받은 것을 사용하였으며, 또한 M. nawae와 계통학적으로 유사한 종으로 보고된 9종의 균류; Amycosphaerella africana , Paramycospherella marksii , Paramycospherella intermedia , Zasmidium parkii , Mycospherella medeirae , Lecanosticta acicola , Passalora fulva , Mycospherella graminicola , Mycospherella musae는 네덜란드 균주 분양센터(Fungal biodiversity centre, CBS)에서 분양 받아은 것을 사용하였다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 감나무 둥근무늬낙엽병균에서는 밴드가 증폭된 반면, 근연종 9종 및 다른 병원균 7종은 모두 목적한 영역의 단편은 증폭되지 않는 것으로 확인하였다.

<3-3> 다양한 품종별 건전 감잎(총 13종)을 이용한 PCR 결과

본 실험에서는 13종의 서로 다른 품종의 감 잎의 전체 게놈 DNA로 실험을 수행하였다. 먼저, MN-F1/MN-R1 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 수행하였으며, 이후 PCR product를 이용하여 MN-F2/ MN-R2 프라이머 세트로 수행하였다.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 감나무 둥근무늬낙엽병균으로 감염된 잎에서는 목적한 영역의 단편이 증폭된 반면, 13종의 서로 다른 품종의 건전 감잎에서는 목적한 영역의 단편은 증폭되지 않는 것으로 확인하였다.

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 프라이머 세트는(MN-F1/MN-R1, MN-F2/MN-R2)는 감나무 둥근무늬낙엽병균만을 특이적으로 검출할 수 있는 종-특이적임을 입증하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Kyongsangbuk-do Agricultural Technology Administration <120> Primer set for detecting of Mycosphaerella nawae and uses thereof <130> PN1512-344 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MN-F1_forward primer <400> 1 gcggtgaact cactaaagct 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MN-R1_reverse primer <400> 2 cttatcgtat gcagtgatct cc 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MN-F2_forward primer <400> 3 cggatgaaga agaatacaag c 21 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MN-F2_reverse primer <400> 4 gattgaatac cagaaccgtc ggg 23 <210> 5 <211> 2036 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycosphaerella nawae_partial sequence of Glycoside hydrolase family 3 gene <400> 5 ggtgtgccag aggatggaga gtcagatgca tggtatcctt cgcctttggg aggaacgcta 60 gatgcgtggg tggagagcta tcgaaaagct ggggagctgg tcgatcagat gacgcttgtg 120 gagaaggtga acatcacctc aggcacaggc tggcagatgg gaccttgtgt gggcaatact 180 ggaccagtcg atcgtctagg cttcccgagc ttgtgtttgc aggacggacc actgggcatg 240 cgattcgtgg acaacgggac tgcttggcca gctggagtta ctgtgggcgc aacctggaac 300 aaggacttga tgtaccagcg aggcaaggca catgggtttg aggctaagtt gaagggcatc 360 aatgtcattc ttgggccctc aatgggaggc atcggacgat tgcctgctgg tggtcggaac 420 tgggaagcat tcgggccgga cccggtcctc caaggaatcg cttcagcgca gacgatcaaa 480 ggtatccagg agaacggcgt gatcgctaca gcgaaacatt tcgtggggaa tgagcaagag 540 cacttccggc aagcctggga gtgggccaac cctaacgcca tctcttcgaa tatcggagac 600 agagcgcttc atgaaatcta cgcgtggccc ttcgcggact caataaaggc tggagtggca 660 agcgtcatgt gttcctacaa ccaagtgaac aactcgtacg cctgccagaa cagcaagctc 720 atgaacggcg tgctcaagga cgagatgggc ttccaaggtt tcatccagag cgattggctg 780 gcgcagcgat ctggtgtcgc aagcgcgctg gcaggtcttg acatgacaat gcctggagac 840 ggtttgagat ggcaggatgg caagacactt tggggcggtg aactcactaa agctgcgctg 900 aacggctccg tgcccatgaa gcgcttgaat gacgctgtac tgcgcattgt ggcggcttgg 960 tatcagcttc gtcaagataa cgagacagcc tggccgagaa agacgctcag cagctcggca 1020 actttcagca gctggacgga tgaagaagaa tacaagcttc accctggctc gcctggcagc 1080 gaggagaatg gcaaaattaa cgagtatgtt ccagtccggg aaaccgagga gggtggcaat 1140 cacgacgatt tggcccgaaa gattgctgct gaaggcattg ttatggtcaa gaatgacgac 1200 aatgtactgc ccatcaagcc cgacggttct ggtattcaat cttcgagagc cggccagagc 1260 tttggaaaga aattcaagat cggcattttt ggagaagacg ccttcgccaa cccgaaaggt 1320 ccgaacgcct gcgaggaccg aggctgcaac gagtacacac ttggtagcgg atggggatct 1380 ggtgcagcag actttccgca tctggtcgca cctttcgatg ctttgaattc gaccttcaac 1440 cattcggctg tggagatcac tgcatacgat aagcaggcgg ctaagcatgc cggagggatt 1500 gctgagaacc aggacctgtg cattgtcttt gccaactcgg atgctggaga aggcttcctc 1560 agttggggtc ctgtgaaggg agaccgacca gatcttaaga cacagaagaa tggcgatgca 1620 ctgatcaccg aggttgcgaa gaagtgtggg aacgcactgc aagctcatgg caacgcagca 1680 aacaccattg tcgtgttgca cacggtgggt gcggtcatca tggaacactg gatcgacctc 1740 ccgggcgtga agacagttct ggtcgcgcat cttcctggac aagaatccgg caatgcgctc 1800 gcggatgtca tctttggcaa aatcaacccg tctggcagac tgccatacac cgttgccaaa 1860 gacgaggagg attacggccc gacgagcaag atcctcacca ttcctaacca cgttgtacca 1920 caacagaact tcacagaagg catctacttc gactatcgat acttcgacaa gcacaacatt 1980 actcctcgat acgaattcgg ctacggcctc tcatacacgg acttccatct gtcttc 2036 <210> 6 <211> 599 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycosphaerella nawae specific PCR product(599bp) <400> 6 gcggtgaact cactaaagct gcgctgaacg gctccgtgcc catgaagcgc ttgaatgacg 60 ctgtactgcg cattgtggcg gcttggtatc agcttcgtca agataacgag acagcctggc 120 cgagaaagac gctcagcagc tcggcaactt tcagcagctg gacggatgaa gaagaataca 180 agcttcaccc tggctcgcct ggcagcgagg agaatggcaa aattaacgag tatgttccag 240 tccgggaaac cgaggagggt ggcaatcacg acgatttggc ccgaaagatt gctgctgaag 300 gcattgttat ggtcaagaat gacgacaatg tactgcccat caagcccgac ggttctggta 360 ttcaatcttc gagagccggc cagagctttg gaaagaaatt caagatcggc atttttggag 420 aagacgcctt cgccaacccg aaaggtccga acgcctgcga ggaccgaggc tgcaacgagt 480 acacacttgg tagcggatgg ggatctggtg cagcagactt tccgcatctg gtcgcacctt 540 tcgatgcttt gaattcgacc ttcaaccatt cggctgtgga gatcactgca tacgataag 599 <210> 7 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycosphaerella nawae specific PCR product(204bp) <400> 7 cggatgaaga agaatacaag cttcaccctg gctcgcctgg cagcgaggag aatggcaaaa 60 ttaacgagta tgttccagtc cgggaaaccg aggagggtgg caatcacgac gatttggccc 120 gaaagattgc tgctgaaggc attgttatgg tcaagaatga cgacaatgta ctgcccatca 180 agcccgacgg ttctggtatt caat 204

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제 1 프라이머 쌍; 또는
서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제 2 프라이머 쌍을 포함하는,
감나무 둥근무늬낙엽병 진단용 프라이머 세트.
제1항에 있어서,
상기 제 1 프라이머 쌍은 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 599bp의 감나무 둥근무늬낙엽병균 특이 PCR 산물을 증폭하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
제1항에 있어서,
상기 제 2 프라이머 쌍은 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 204bp의 감나무 둥근무늬낙엽병균 특이 PCR 산물을 증폭하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
제1항의 프라이머 세트를 포함하는 감나무 둥근무늬낙엽병 진단용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 조성물은 PCR 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 반응버퍼 및 증류수를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 감나무 둥근무늬낙엽병 진단용 조성물.
제4항의 조성물을 포함하는 감나무 둥근무늬낙엽병 진단 키트.
(a) 식물체 검체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 감나무 둥근무늬낙엽병균 검출 방법.
제7항에 있어서,
상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 감나무 둥근무늬낙엽병균 검출 방법.