KR102003919B1 - 필로스틱타 그로술라리애를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

필로스틱타 그로술라리애를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102003919B1
KR102003919B1 KR1020170159642A KR20170159642A KR102003919B1 KR 102003919 B1 KR102003919 B1 KR 102003919B1 KR 1020170159642 A KR1020170159642 A KR 1020170159642A KR 20170159642 A KR20170159642 A KR 20170159642A KR 102003919 B1 KR102003919 B1 KR 102003919B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
primer set
cbs
primer
grossulariae
phyllosticta
Prior art date
Application number
KR1020170159642A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190061352A (ko
Inventor
김현주
고경봉
김혜리
김준영
이근식
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020170159642A priority Critical patent/KR102003919B1/ko
Publication of KR20190061352A publication Critical patent/KR20190061352A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102003919B1 publication Critical patent/KR102003919B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 검역 식물 진균인 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트는 필로스틱타 그로술라리애를 특이적으로 신속하고 정확하게 검출할 수 있으므로, 필로스틱타 그로술라리애의 국내로의 유입을 효과적으로 방지할 수 있을 것으로 사료된다.

Description

필로스틱타 그로술라리애를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도{Specific primer set for detecting Phyllosticta grossulariae and uses thereof}
본 발명은 필로스틱타 그로술라리애를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근에 고소득 작물인 외국산 과수류에 대한 관심이 증가하면서 국내에서 재배가 가능한 올리브, 체리, 참다래, 월귤, 블루베리, 양벚 등의 재식용 묘목 수입이 급속히 증가하고 있는 추세이다. 특히, 자유무역의 영향으로 다양한 종류의 식물들이 국내로 수입되고 있으며, 이에 따라 잠재적이거나 동정되지 않은 식물 병원성 진균들이 농작물, 종자, 야채, 과일, 견목 및 한약재 등을 통해서 함께 수입될 가능성이 높아지고 있다.
식물의 진균병이 발병될 경우 전파가 매우 빨라 피해가 클 뿐만 아니라 방제가 어려워 식물검역에 있어서 매우 중요하게 다루어지고 있다. 특히, 필로스틱타(Phyllosticta) 속 균주는 주로 잎마름병, 가지마름병 등을 일으키며, 주로 시트러스 과일에서의 생산량 감소를 초래하는 등 그 피해가 크기 때문에 필로스틱타 속 중 5종이 검역병으로 지정되어 있다.
필로스틱타 속 균주는 수입 묘목류 또는 종자에서 주로 검출이 되고 있으나, 필로스틱타 속의 정확한 형태적 분류 동정이 매우 어렵고, 국내 병자각균(柄子殼菌)의 형태 동정 전문가가 전무하며, 수입 종자류는 대부분 습지배양에 의한 형태적 동정에 의존하므로, 배양시 포자형성까지 긴 시간이 소요되기 때문에 효율적인 검역을 위한 새로운 검사방법 개발이 반드시 필요하다.
이에, 본 발명에서는 검역 식물 진균인 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트를 제작하여 필로스틱타 그로술라리애를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 방법을 개발하였다.
한편, 한국등록특허 제1429185호에는 'PCR을 이용한 병자각균 포마 글로메라타 균주의 진단 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2017-0073286호에는 '작물 생육 증대 및 점무늬 병원균인 Phoma sp. 균에 대한 항균성에 특화된 미생물 활용 작물 재배방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 필로스틱타 그로술라리애를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae)의 베타-튜불린(beta-tubulin) 유전자 염기서열에 기반한 프라이머 세트를 제작하였고, 유연관계 및 기주 유사관계 진균에는 결합하지 않으며, 기주 식물의 게노믹 DNA에도 결합하지 않는 필로스틱타 그로술라리애에 특이적인 프라이머 세트를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 필로스틱타 그로술라리애를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 필로스틱타 그로술라리애를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 최종 선발된 프라이머 세트는 검역 식물 진균인 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae)를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 검역 대상인 필로스틱타 그로술라리애에 대한 검출이 쉽고 빠르게 수행되어 필로스틱타 그로술라리애의 국내로의 유입을 효과적으로 방지할 수 있을 것으로 사료된다.
도 1은 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae)의 베타-튜불린 유전자의 염기서열에 기반하여 제작된 필로스틱타 그로술라리애 검출용 프라이머 세트의 필로스틱타 그로술라리애 특이성을 확인하기 위한 PCR 결과를 나타낸 것이다. M; DNA 크기 마커.
도 2는 4개의 필로스틱타 그로술라리애 검출용 프라이머 세트를 이용하여 유연관계의 필로스틱타 속 균주에 대한 반응성 확인 결과이다. M; DNA 크기 마커, 각 프라이머 세트에 대해, 왼쪽 레인부터 오른쪽으로 순서대로 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae), 음성대조군(DNA 시료 무첨가), 필로스틱타 카피탈렌시스(Phyllosticta capitalensis) CBS 128856, 필로스틱타 카피탈렌시스 CBS 226.77, 필로스틱타 드라코니스(P. draconis) CBS. 186.83, 필로스틱타 시트리아시아나(P. citriasiana) CBS 123370, 필로스틱타 시트리아시아나 CBS 120487, 필로스틱타 스피나룸(P. spinarum) CBS 937.70, 필로스틱타 히포글로씨(P. hypoglossi) CBS 434.92, 필로스틱타 시트리브라질리엔시스(P. citribraziliensis) CBS 100098, 필로스틱타 시트리카르파(P. citricarpa).
도 3은 4개의 필로스틱타 그로술라리애 검출용 프라이머 세트를 이용하여 유연관계 및 기주 유사관계의 마이코스패렐라 속(Mycosphaerella) 속 균주에 대한 반응성 확인 결과이다. M; DNA 크기 마커, 각 프라이머 세트에 대해, 왼쪽 레인부터 오른쪽으로 순서대로 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae), 음성대조군(DNA 시료 무첨가), 마이코스패렐라 브라씨시코라(M. brassicicola) CBS 173.88, 마이코스패렐라 브라씨시코라 CBS 228.32, 마이코스패렐라 브라씨시코라 CBS 267.53, 마이코스패렐라 카리캐(M. caricae) CBS 102399, 마이코스패렐라 카리캐 CBS 248.90, 마이코스패렐라 무지코라(M. musicola) CBS 116634, 마이코스패렐라 포푸리코라(M. populicola) CBS 100042, 마이코스패렐라 벌버리디스(M. berberidis) CBS 324.52, 마이코스패렐라 캅셀래(M. capsellae) CBS 112032, 마이코스패렐라 유무재(M. eumusae) CBS 121381, 마이코스패렐라 피지엔시스(M. fijiensis) CBS 120258.
도 4는 4개의 필로스틱타 그로술라리애 검출용 프라이머 세트의 종 특이적 검출능을 확인하기 위해, 토양 병원균을 대상으로 PCR을 수행한 결과이다. M; DNA 크기 마커, 각 프라이머 세트에 대해, 왼쪽 레인부터 오른쪽으로 순서대로 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae), 음성대조군(DNA 시료 무첨가), 페스탈로티옵시스 아라키디스(Pestalotiopsis arachidis CBS 115451), 파이토프쏘라 칵토룸(Phythophthora cactorum KACC 40174), 파이토프쏘라 칵토룸 KACC 40175, 버티실리움 알보아툼(Verticillium alboatum KACC 130340).
도 5는 최종적으로 선발된 필로스틱타 그로술라리애 검출용 프라이머 세트(조합 4)의 종 특이적 검출능을 확인하기 위해, 기주 식물의 게노믹 DNA를 대상으로 PCR을 수행한 결과이다. M; DNA 크기 마커, 각 프라이머 세트에 대해, 왼쪽 레인부터 오른쪽으로 순서대로 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae), 음성대조군(DNA 시료 무첨가), 블랙커런트 DNA, 구스베리 DNA.
도 6은 최종적으로 선발된 프라이머 세트(조합 4)를 이용하여 필로스틱타 그로술라리애 게노믹 DNA에 대한 end-point PCR 결과를 나타낸 것이다. M; DNA 크기 마커, 각 프라이머 세트에 대해, 왼쪽 레인부터 오른쪽으로 순서대로 음성대조군(DNA 시료 무첨가), 1 ng/㎕, 1/10 ng/㎕, 1/100 ng/㎕, 1/1,000 ng/㎕, 1/10,000 ng/㎕, 1/100,000 ng/㎕
도 7은 선발된 필로스틱타 그로술라리애 검출용 프라이머 세트(조합 4)를 포함하는 필로스틱타 그로술라리애 검출용 키트의 제품 사진이다.
도 8은 필로스틱타 그로술라리애와 유연관계의 필로스틱타 속 균주(A) 및 마이코스패렐라 속 균주(B)의 DNA 시료를 이용하여 개발된 키트의 검출능을 분석한 결과이다. Ladder; DNA 크기 마커, (A) 왼쪽 레인부터 오른쪽으로 순서대로 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae), 음성대조군(DNA 시료 무첨가), 필로스틱타 카피탈렌시스 CBS 226.77, 필로스틱타 카피탈렌시스(Phyllosticta capitalensis) CBS 128856, 필로스틱타 드라코니스(P. draconis) CBS. 186.83, 필로스틱타 시트리아시아나(P. citriasiana) CBS 123370, 필로스틱타 콘센트리카(P. concentrica CBS 937.70), 필로스틱타 히포글로씨(P. hypoglossi) CBS 434.92, 필로스틱타 시트리브라질리엔시스(P. citribraziliensis) CBS 100098, 필로스틱타 스트라미넬라(P. straminella CBS 268.31), 필로스틱타 시트리카르파(P. citricarpa) CBS 102373. (B) 왼쪽 레인부터 오른쪽으로 순서대로 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae), 음성대조군(DNA 시료 무첨가), 마이코스패렐라 브라씨시코라(M. brassicicola) CBS 173.88, 마이코스패렐라 브라씨시코라 CBS 228.32, 마이코스패렐라 브라씨시코라 CBS 267.53, 마이코스패렐라 카리캐(M. caricae) CBS 102399, 마이코스패렐라 카리캐 CBS 248.90, 마이코스패렐라 무지코라(M. musicola) CBS 116634, 마이코스패렐라 포푸리코라(M. populicola) CBS 100042, 마이코스패렐라 벌버리디스(M. berberidis) CBS 324.52, 마이코스패렐라 캅셀래(M. capsellae) CBS 112032, 마이코스패렐라 유무재(M. eumusae) CBS 121381, 마이코스패렐라 피지엔시스(M. fijiensis) CBS 120258.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 2 및 4의 서열 내의 14개이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2의 프라이머(18개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 2 및 4의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명의 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드는 정방향(forward) 프라이머이고, 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드는 역방향(reverse) 프라이머이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae)를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은
필로스틱타 속 진균병 감염 의심 시료에서 총 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 총 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae)를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 필로스틱타 속 진균병 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 필로스틱타 속 진균병 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 필로스틱타 속 진균병 감염 의심 시료는 감염 의심 식물체의 잎, 묘목, 줄기, 과수 또는 종자 등일 수 있고, 상기 식물체는 블랙커런트(blackcurrant) 또는 구스베리(gooseberry) 등일 수 있으나, 필로스틱타 그로술라리애에 감염될 수 있는 식물이면 그 종류에 제한이 없다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae)를 검출하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 필로스틱타 그로술라리애 특이 프라이머의 설계 및 조합
필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae) 검출용 프라이머의 설계를 위해 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)에 등록되어 있는 필로스틱타 그로술라리애의 전체 염기서열들을 다운받았다. 다운로드한 염기서열은 Multalign 프로그램을 이용하여 다중정렬하였고, 필로스틱타 그로술라리애의 공통적인 서열을 탐색하였다. 종 특이적 영역인 베타-튜불린(beta-tubulin) 영역에 기반한 프라이머 세트를 제작하였으며, 상기 제작된 프라이머 중 필로스틱타(Phyllosticta) 속 및 마이코스패렐라 속(Mycosphaerella) 속에는 반응하지 않고, 필로스틱타 그로술라리애에서만 특이적으로 반응하는 프라이머를 선발하였다. 필로스틱타 그로술라리애 검출용 프라이머의 설계는 Primer 3과 NCBI primer-Blast 프로그램을 이용하여 디자인하였다(표 1).
필로스틱타 그로술라리애 검출용 프라이머 정보
프라이머 명칭
정방향 프라이머
(5'→3') (서열번호) 		프라이머 명칭
역방향 프라이머
(5'→3') (서열번호)
MR_F4 TTGACCTTCGCGCGTTGACGA (1) MR_R5 TCAGGAAAGCGTGTCATTTC (3)
MR_F5 GCGTTGACGACAGCTCAC (2) MR_R6 CCTTCAGGTAGTTTCTGGTG (4)
이후, 이들 정방향 및 역방향 프라이머를 조합하여 PCR 증폭이 가능한 4가지 세트를 조합하였다.
필로스틱타 그로술라리애 검출용 프라이머 세트 조합
Primer
set No. 		정방향
프라이머 		역방향
프라이머 		산물 크기
(bp)
1 MR_F4 MR_R5 231
2 MR_R6 281
3 MR_F5 MR_R5 217
4 MR_R6 267
실시예 2. 필로스틱타 그로술라리애 검출을 위한 최적의 프라이머 세트 선발
실시예 1에서 제작한 프라이머 세트 4개의 조합으로 필로스틱타 그로술라리애 검출을 위한 최적의 프라이머를 선발하기 위해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 상기 PCR 결과의 확인은 PCR 산물을 LabChip 장비(LabchipGX, PerkinElmer, 미국)로 시그널을 읽어 분석하였다. PCR 조건은 하기 표 3과 같다.
PCR 반응 조건
단계 온도(℃) 시간
전-변성 94 2분
변성 94 1분
결합 60 1분
신장 72 1분
변성 단계로 돌아가 35회 추가 반복
최종 신장 72 7분
보관 4 ∞
2-1. 필로스틱타 그로술라리애 검출능 확인
필로스틱타 그로술라리애를 대상으로, 프라이머 개발대상인 필로스틱타 그로술라리애의 베타-튜불린 유전자에 기반한 프라이머 세트(1 내지 4)의 1차 선발을 수행하였다.
그 결과, 1, 2, 3 및 4 조합의 프라이머 세트 4개 모두 필로스틱타 그로술라리애에 대한 검출능이 있음을 확인할 수 있었다(도 1).
2-2. 필로스틱타 속 균주에서의 종 특이적 프라이머 선발
본 발명의 상기 4개의 프라이머 세트를 이용하여 총 6종의 필로스틱타 속 균주와의 교차 반응성 유무를 확인하기 위한 PCR을 실시하였다.
비교 균주로 사용된 6종의 필로스틱타 속 균주는 다음과 같다: 필로스틱타 카피탈렌시스(Phyllosticta capitalensis) CBS 128856(레인 3), 필로스틱타 카피탈렌시스 CBS 226.77(레인 4), 필로스틱타 드라코니스(P. draconis) CBS 186.83(레인 5), 필로스틱타 시트리아시아나(P. citriasiana) CBS 123370(레인 6), 필로스틱타 시트리아시아나(P, citriasiana) CBS 120487(레인 7), 필로스틱타 스피나룸(P. spinarum) CBS 937.70(레인 8), 필로스틱타 히포글로씨(P. hypoglossi) CBS 434.92(레인 9), 필로스틱타 시트리브라질리엔시스(P. citribraziliensis) CBS 100098(레인 10), 필로스틱타 시트리카르파(P. citricarpa)(레인 11).
그 결과, 4개의 프라이머 세트 모두 필로스틱타 그로술라리애에서만 증폭 밴드가 확인되었고, 비교균주인 9종의 필로스틱타 속 균주에서는 밴드가 확인되지 않아 본 발명의 프라이머 세트가 필로스틱타 그로술라리애에 특이성이 우수함을 확인할 수 있었다(도 2).
2-3. 마이코스패렐라 속( Mycosphaerella sp.) 속 균주에서의 종 특이적 프라이머 선발
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 총 11종의 마이코스패렐라 속 균주와의 교차 반응성 유무를 확인하기 위한 PCR을 실시하였다.
비교 균주로 사용된 11종의 마이코스패렐라 속 균주는 다음과 같다: 마이코스패렐라 브라씨시코라(M. brassicicola) CBS 173.88(레인 3), 마이코스패렐라 브라씨시코라 CBS 228.32(레인 4), 마이코스패렐라 브라씨시코라 CBS 267.53(레인 5), 마이코스패렐라 카리캐(M. caricae) CBS 102399(레인 6), 마이코스패렐라 카리캐 CBS 248.90(레인 7), 마이코스패렐라 무지코라(M. musicola) CBS 116634(레인 8), 마이코스패렐라 포풀리코라(M. populicola) CBS 100042(레인 9), 마이코스패렐라 버베리디스(M. berberidis) CBS 324.52(레인 10), 마이코스패렐라 캅셀래(M. capsellae) CBS 112032(레인 11), 마이코스패렐라 유뮤재(M. eumusae) CBS 121381(레인 12), 마이코스패렐라 피지엔시스(M. fijiensis) CBS 120258(레인 13).
그 결과, 4개의 모든 프라이머 세트가 필로스틱타 그로술라리애에서만 밴드가 확인되었고, 11종의 마이코스패렐라 속 균주에서는 밴드가 확인되지 않아, 본 발명의 프라이머 세트가 필로스틱타 그로술라리애에 대한 특이성이 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 3).
2-4. 토양 병원균 및 무감염 기주식물에서의 종 특이적 프라이머 선발
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 복합감염을 유발하는 토양 병원균과의 교차 반응성 유무를 확인하기 위한 PCR을 실시하였다. 사용된 복합감염 병원균은 페스탈로티옵시스 아라키디스(Pestalotiopsis arachidis, CBS 115451)(레인 3), 파이토프토라 칵토룸(phytophthora cactorum, KACC 40174)(레인 4), 파이토프토라 칵토룸 KACC 40175(레인 5) 및 버티실리움 알보아툼(Verticillium alboatum, KACC 130340)(레인 6)이었고, PCR 반응 결과 본 발명의 프라이머 세트 중, 조합 4의 프라이머 세트에서만 비특이적 증폭 반응이 일어나지 않은 것으로 확인되었다(도 4).
상기 선발된 1개의 프라이머 세트가 기주식물의 게노믹 DNA에 반응하는지 알아보기 위해 병원균에 감염되지 않은 블랙커런트(black currant) 및 구스베리(gooseberry)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 상기 기주식물의 핵산 시료에 대해서 비특이적 반응이 일어나지 않음을 확인할 수 있었고(도 5), 이상의 결과를 통해, 유연관계 및 기주 유사관계에 있는 병원균, 그리고 기주식물의 게노믹 DNA에는 반응하지 않으면서 필로스틱타 그로술라리애를 효과적으로 검출할 수 있는, 1개의 프라이머 세트(조합 4)를 최종적으로 선발하였다.
실시예 3. 최종 선발된 프라이머 세트를 이용한 필로스틱타 그로술라리애 검출 감도 시험
1 ng/㎕, 1/10 ng/㎕, 1/100 ng/㎕, 1/1,000 ng/㎕, 1/10,000 ng/㎕ 및 1/100,000 ng/㎕의 농도로 희석된 필로스틱타 그로술라리애 DNA를 대상으로 상기 실시예 2에서 최종 선발된 프라이머 세트(조합 4)를 사용하여 end-point PCR(희석한계 실험)을 실시하였다.
그 결과, 조합 4의 프라이머 세트는 1/100,000 ng/㎕(0.01 pg/㎕)까지 검출 가능함을 보여주어, 본 발명의 상기 프라이머 세트는 검출 대상인 필로스틱타 그로술라리애에 대해 높은 민감도를 가진 프라이머임을 확인할 수 있었다(도 6).
실시예 4. 필로스틱타 그로술라리애 종 특이적인 프리믹스 키트에서의 프라이머의 검출능 분석
필로스틱타 그로술라리애에 대한 종 특이적인 프리믹스 키트(도 7)를 제작하여 상기 키트의 검출능을 분석하였다. 필로스틱타 그로술라리애 검출용 키트의 조성과 PCR 조건은 각각 표 4 및 표 3과 같다.
그 결과, 9종의 필로스틱타 속 균주(도 8A)와 11종의 마이코스패렐라 속 균주(도 8B)의 시료를 확인한 결과에서, 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 진단 키트가 필로스틱타 그로술라리애 균주에 대해서만 특이적으로 검출가능한 것이 확인되었다.
필로스틱타 그로술라리애 검출용 키트 조성
PCR 조성 용량(㎕)
2X PCR Master Mix 10
Template DNA 1~5
DEPC-DW 최대 10
총 용량 20
<110> REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Specific primer set for detecting Phyllosticta grossulariae and uses thereof <130> PN17461 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ttgaccttcg cgcgttgacg a 21 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcgttgacga cagctcac 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tcaggaaagc gtgtcatttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccttcaggta gtttctggtg 20

Claims (5)

  1. 서열번호 2 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트.
  2. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae)를 특이적으로 검출하기 위한 키트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
  4. 필로스틱타 속 진균병 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는 필로스틱타 그로술라리애(Phyllosticta grossulariae)를 특이적으로 검출하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
KR1020170159642A 2017-11-27 2017-11-27 필로스틱타 그로술라리애를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 KR102003919B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170159642A KR102003919B1 (ko) 2017-11-27 2017-11-27 필로스틱타 그로술라리애를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170159642A KR102003919B1 (ko) 2017-11-27 2017-11-27 필로스틱타 그로술라리애를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190061352A KR20190061352A (ko) 2019-06-05
KR102003919B1 true KR102003919B1 (ko) 2019-07-26

Family

ID=66845324

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170159642A KR102003919B1 (ko) 2017-11-27 2017-11-27 필로스틱타 그로술라리애를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102003919B1 (ko)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C. Glienke et al., Persoonia, 26, p.47-56, 2011.
Saowanee Wikee et al., Fungal Diversity, 60(1), p.91-105, 2013.
Xinghong Wang et al., Fungal Diversity, 52, p.209-224, 2012.

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190061352A (ko) 2019-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fasusi et al. Propagation and characterization of viable arbuscular mycorrhizal fungal spores within maize plant (Zea mays L.)
Li et al. Specific and sensitive detection of Phytophthora nicotianae by nested PCR and loop‐mediated isothermal amplification assays
KR101301865B1 (ko) 가지과 식물체에서 병원성 세균 및 병원성 바이러스의 표적서열 증폭을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 병원균 검출 방법
Newman et al. Molecular diagnosis of mango malformation disease and phylogeny of Fusarium mangiferae
Mehle et al. Phytoplasmas associated with declining of hazelnut (Corylus avellana) in Slovenia
Yoon et al. Genetic relationships among cultivated and wild Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi and relatives from Korea based on AFLP markers
Kunta et al. Diverse DNA extraction methods and PCR primers for detection of Huanglongbing-associated bacteria from roots of ‘Valencia’sweet orange on sour orange rootstock
KR101650986B1 (ko) 배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 분자마커
KR20190050134A (ko) 검역 식물바이러스인 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101681645B1 (ko) 무에 시들음병을 일으키는 푸자리움 옥시스포룸 라파니 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 푸자리움 옥시스포룸 라파니 검출 방법
KR102003919B1 (ko) 필로스틱타 그로술라리애를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
CN103966361A (zh) 鉴定烟草花叶病毒种属的方法及其专用条形码引物
KR101767371B1 (ko) 감나무 둥근무늬낙엽병균 검출을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102003917B1 (ko) 필로스틱타 드라코니스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101995575B1 (ko) 슈도모나스 시린개 병원체변종을 구별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102003916B1 (ko) 필로스틱타 카피탈렌시스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101695053B1 (ko) 배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트 cos0264 및 이를 포함하는 분자마커
KR100926664B1 (ko) 토마토 궤양병균을 검출하기 위한 특이 프라이머 및 이의 용도
KR101795937B1 (ko) 호접란 품종 식별을 위한 kslg-cp001 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마커용 조성물
KR20150050062A (ko) 온실가루이 진단을 위한 특이 프라이머 및 이의 용도
Roman et al. Detecting Orobanche species by using cpDNA diagnostic markers
CN106676193B (zh) 一种青霉菌鉴别用分子标记及引物和探针
KR20200075637A (ko) 박과 작물 감염 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
KR101913742B1 (ko) 딸기 위황병 병원균을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101636111B1 (ko) 배추과 작물의 종 식별을 위한 범용 프라이머 세트 cos0084 및 이를 포함하는 분자마커

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right