CN111621590A

CN111621590A - 一种用于检测土栖腐霉菌的lamp引物组合物、试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN111621590A
Application number: CN202010604317.1A
Authority: CN
Inventors: 叶文武; 冯慧; 赵晓林; 王源超; 郑小波
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-06-29
Filing date: 2020-06-29
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2040-06-29
Also published as: CN111621590B

Abstract

本发明公开了一种用于检测土栖腐霉菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法。一种用于检测土栖腐霉菌的LAMP引物组合物：正向内引物FIP如SEQ ID NO.1所示，反向内引物BIP如SEQ ID NO.2所示，正向外引物F3如SEQ ID NO.3所示，反向外引物B3如SEQ ID NO.4所示，正向环引物LF如SEQ ID NO.5所示,反向环引物LB如SEQ ID NO.6所示。本发明具备更高的准确性、灵敏度和实效性，而且操作方便、实用性好，为土栖腐霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于土栖腐霉菌的高灵敏度快速检测。

Description

一种用于检测土栖腐霉菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测土栖腐霉菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法。

背景技术

土栖腐霉菌(Pythium terrestris)属于卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Perenosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、腐霉属(Pythium)，可引起大豆的早衰和根系腐烂、坏死，在大豆生产中造成较重的经济损失。目前对该病害还没有有效的防治措施，加强检疫、防止病原菌的传播扩散是控制该病的最有效措施。为此应加强疫情监测，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低土栖腐霉菌引起的损失。

目前，针对土栖腐霉菌的检测技术较少。传统的检测方法主要是应用平板分离法和诱饵法，依据土栖腐霉菌的形态学进行鉴定。由于腐霉生长受温度影响形态不稳定，给检测带来了巨大困难。随着分子生物学的发展，特别PCR技术的普及，越来越多的分子生物学技术被应用到土栖腐霉菌的检测中。这些技术在特异性和灵敏度上有了较大的提高，但是检测时间仍然比较长，同时依赖精密的温度循环装置，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新的核酸扩增技术，因其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物白色焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。自LAMP检测技术建立14年以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究，但在植物病原卵菌的检测报道很少，土栖腐霉的检测国内外均未见报道。

本发明通过序列比对分析土栖腐霉菌和其它腐霉菌在基因组序列上的差异，以PytM90基因序列为靶标设计了土栖腐霉菌特异性的LAMP引物组合物，在此基础上建立了土栖腐霉菌的LAMP快速检测方法。

发明内容

针对现有技术中土栖腐霉菌生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种用于检测土栖腐霉菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种用于检测土栖腐霉菌的LAMP引物组合物：正向内引物FIP如SEQ ID NO.1所示，反向内引物BIP如SEQ ID NO.2所示，正向外引物F3如SEQ ID NO.3所示，反向外引物B3如SEQ ID NO.4所示，正向环引物LF如SEQ ID NO.5所示,反向环引物LB如SEQ ID NO.6所示。

本发明所述的LAMP检测引物组合物在检测土栖腐霉菌中的应用。

本发明所述的LAMP引物组合物在制备检测终极腐霉菌的试剂中的应用。

一种检测土栖腐霉菌的LAMP试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中各试剂浓度为：0.8μM正向内引物FIP、0.8μM反向内引物BIP、0.1μM正向外引物F3、0.1μM反向外引物B3、0.1μM正向环引物LF、0.1μM反向环引物LB、0.8M甜菜碱、1.4mM dNTPs、20mM Tris-HCl、10mMKCl、10mM(NH₄)₂SO₄、6mM MgSO₄、0.1％Triton X-100、Bst DNA polymerase 8U/μl，使用超纯水配制成1mL检测溶液。

本发明所述的检测土栖腐霉菌的LAMP试剂盒在检测土栖腐霉菌中的应用。

一种终极腐霉菌的LAMP检测方法，利用所述的LAMP引物组合物或所述的LAMP试剂盒进行LAMP反应，反应结束后在扩增产物中加入SYBR Green I，观察反应溶液的颜色变化或在紫外灯下是否有荧光进而判断待检微生物是否为土栖腐霉菌。

作为本发明的一种优选，所述的终极腐霉菌的LAMP检测方法包括提取待检微生物的DNA，取4μL DNA溶液作为反应模板，加入21μL LAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP，LAMP反应程序为：62℃反应扩增70min，然后在扩增产物中加入0.25μL SYBR Green I，观察颜色变化，如果颜色由橙色变为黄绿色，或在紫外灯下有荧光，表示待检物中存在土栖腐霉菌，如果颜色没有变化仍是橙色，或在紫外灯下无荧光，则表示待检物中不存在土栖腐霉菌。

PytM90基因作为检测靶标在检测土栖腐霉菌中的应用。

PytM90基因作为检测靶标在制备土栖腐霉菌检测试剂中的应用。

3.有益效果

本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：

(1)操作方便：本发明提供的检测土栖腐霉菌的LAMP方法克服了现有技术中土栖腐霉菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测土栖腐霉菌的问题。本发明检测方法在62℃等温条件下，只需70min就能准确、快速、高效地检测到土栖腐霉菌，对实验场所的要求简单，不需要其它复杂仪器，能较好满足对土栖腐霉菌的现场检测，适合在基层和进出口检验检疫部门推广使用。

(2)准确性高：由于传统土栖腐霉菌检测方法只是依据形态特征来进行鉴定，很难准确鉴定出来。而本发明根据土栖腐霉菌的基因组序列，利用Blast软件将终极腐霉菌的基因组序列与其它腐霉的基因组序列进行比较，选取了土栖腐霉菌的PytM90基因序列为靶标来设计特异性的LAMP引物，该基因在普通PCR中未被作为靶标用于设计土栖腐霉菌的鉴定引物。LAMP反应通过4条引物(FIP、BIP、F3、B3)特异性识别靶序列上的6个独立区域，其特异性比较高。此外，正、反向环引物LF、LB能够提高反应速率，和其它四条引物一起，在确保反应准确性的情况下，使本发明能快速的进行土栖腐霉菌检测。

(3)灵敏度高：本发明建立的土栖腐霉菌的LAMP检测方法，灵敏度非常高，可以达到100pg DNA，表明该检测方法足以在DNA浓度较低情况下准确快速地检测出土栖腐霉菌。

附图说明

图1为根据土栖腐霉菌的PytM90基因序列为靶标来设计特异性的LAMP引物

图2为土栖腐霉菌LAMP检测方法的灵敏度验证：

基于反应溶液的颜色变化和紫外灯下有无荧光检测LAMP方法的灵敏度，设置土栖腐霉菌的模板浓度范围为100ng-10fg。结果显示：当土栖腐霉菌的模板浓度分别为100ng、10ng、1ng、100pg时，其对应的反应管中溶液颜色变成黄绿色(图2)，呈阳性反应；而当土栖腐霉菌的模板浓度分别为10pg、1pg、100fg、10fg时，其对应的反应管中溶液颜色仍为橙色，呈阴性反应，并进一步在紫外灯下观察验证了上述结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案更清楚明白，本发明用具体实例做进一步的说明，但并非仅限用于这些例子。

实施例1：利用LAMP方法检测土栖腐霉菌

用于检测土栖腐霉菌的LAMP引物组合物：正向内引物FIP如SEQ ID NO.1所示，反向内引物BIP如SEQ ID NO.2所示，正向外引物F3如SEQ ID NO.3所示，反向外引物B3如SEQID NO.4所示，正向环引物LF如SEQ ID NO.5所示,反向环引物LB如SEQ ID NO.6所示。

检测土栖腐霉菌的LAMP试剂盒中各试剂浓度为：0.8μM正向内引物FIP、0.8μM反向内引物BIP、0.1μM正向外引物F3、0.1μM反向外引物B3、0.1μM正向环引物LF、0.1μM反向环引物LB、0.8M甜菜碱、1.4mM dNTPs、20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、6mM MgSO₄、0.1％Triton X-100、Bst DNA polymerase 8U/μl，使用超纯水配制成1mL检测溶液。

LAMP检测方法：提取待检微生物的DNA，取4μL DNA溶液作为反应模板，加入21μLLAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP，LAMP反应程序为：62℃反应扩增70min，然后在扩增产物中加入0.25μL SYBR Green I，观察颜色变化，如果颜色由橙色变为黄绿色，或在紫外灯下有荧光，表示待检物中存在土栖腐霉菌，如果颜色没有变化仍是橙色，或在紫外灯下无荧光，则表示待检物中不存在土栖腐霉菌。

为了验证LAMP方法的特异性，以4株土栖腐霉菌和其他非目标菌株为供试材料，LAMP检测结果显示：只有以土栖腐霉菌为模板的反应管中溶液的颜色由橙色变成黄绿色，呈阳性反应；而其他非目标菌株和阴性对照的反应管中溶液颜色都没有发生变化，呈阴性反应(表1)。

表1

^a NIMR:国家微生物资源平台

^b NJAU:南京农业大学

实施例2：土栖腐霉菌LAMP反应的灵敏度试验

为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的土栖腐霉菌的DNA用分光光度计测定浓度后进行10倍比稀释，设置DNA浓度范围为100ng-10fg，分别取稀释后的各浓度DNA稀释液4μL作为模板，加入21μL试剂盒溶液进行LAMP反应，反应程序为：62℃反应扩增70min。结果表明：当土栖腐霉菌的DNA浓度达到100pg时，反应管中的溶液就能变成黄绿色，进一步在紫外灯下观察荧光得到了一致的结果(图2)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种用于检测土栖腐霉菌的LAMP引物组合物、试剂盒及其检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcgcatacgc tggctgactc ccggcaactt tcagcaga 38

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgctgtgcat ccgcatccat acccccatgg gtactttgg 39

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acaaaacgcc caggatttcc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggtgttgtt ccagtgtagt 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttcggttta gcgtgcgac 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggttttcgt ggacgtccga 20

Claims

1.一种用于检测土栖腐霉菌的LAMP引物组合物，该引物组合物包含：如SEQ ID NO.1所示的正向内引物FIP，如SEQ ID NO.2所示的反向内引物BIP，如SEQ ID NO.3所示的正向外引物F3，如SEQ ID NO.4所示的反向外引物B3，如SEQ ID NO.5所示的正向环引物LF,以及如SEQ ID NO.6所示的反向环引物LB。

2.权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测终极腐霉菌中的应用。

3.权利要求1所述的LAMP引物组合物在制备检测终极腐霉菌的试剂中的应用。

4.一种检测终极腐霉菌的LAMP试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中各试剂浓度为：0.8μM正向内引物FIP、0.8μM反向内引物BIP、0.1μM正向外引物F3、0.1μM反向外引物B3、0.1μM正向环引物LF、0.1μM反向环引物LB、0.8M甜菜碱、1.4mM dNTPs、20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、6mM MgSO₄、0.1％Triton X-100、Bst DNA polymerase 8U/μl，使用超纯水配制成1mL检测溶液；其中正向内引物FIP如SEQ ID NO.1所示，反向内引物BIP如SEQ IDNO.2所示，正向外引物F3如SEQ ID NO.3所示，反向外引物B3如SEQ ID NO.4所示，正向环引物LF如SEQ ID NO.5所示,反向环引物LB如SEQ ID NO.6所示。

5.权利要求3所述的检测土栖腐霉菌的LAMP试剂盒在检测土栖腐霉菌中的应用。

6.一种土栖腐霉菌的LAMP检测方法，其特征在于利用权利要求1所述的LAMP引物组合物或权利要求4所述的LAMP试剂盒进行LAMP反应，反应结束后在扩增产物中加入SYBRGreen I，观察反应溶液的颜色变化或在紫外灯下是否有荧光进而判断待检微生物是否为土栖腐霉菌。

7.根据权利要求6所述的LAMP检测方法，其特征在于包括提取待检微生物的DNA，取4μLDNA溶液作为反应模板，加入21μL LAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP，LAMP反应程序为：62℃反应扩增70min，然后在扩增产物中加入0.25μL SYBR Green I，观察反应溶液的颜色变化，如果颜色由橙色变为黄绿色，或在紫外灯下有荧光，表示待检物中存在土栖腐霉菌，如果颜色没有变化仍是橙色，或在紫外灯下无荧光，则表示待检物中不存在土栖腐霉菌。

8.PytM90基因作为检测靶标在检测土栖腐霉菌中的应用。

9.PytM90基因作为检测靶标在制备土栖腐霉菌检测试剂中的应用。