CN103614474A

CN103614474A - 花生青枯病菌环介导等温扩增检测引物及检测方法

Info

Publication number: CN103614474A
Application number: CN201310609810.2A
Authority: CN
Inventors: 谢世勇; 李本金; 陈庆河; 游泳; 丁雪玲; 刘裴清
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2033-11-27
Also published as: CN103614474B

Abstract

本发明公开了一种花生青枯病菌的LAMP检测引物及其快速检测方法，可用于花生青枯病菌的特异性检测。通过设计花生青枯病菌的LAMP检测引物，包括外侧引物F3：5’-TCTTGATAAGGCGGGGGT-3’，B3：5’-AAACACCGATCTCTCGATGC-3’；内侧引物FIP：5’-CCAGTTCACGGCAAGATCGCTTTCAAGTCCTACCAGACCCA-3’，BIP：5’-ACCTGCTTTGCAAGCAGGGG-GCGTTTGGCTACCACAAGG-3’。经恒温扩增，采用SYBRgreenⅠ显色剂显色或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形带。所发明的LAMP引物及检测方法可用于生产实践中花生青枯病菌感染的植株或者发病潜伏期时花生青枯病菌的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为防治花生青枯病菌引起的病害提供可靠的技术和理论依据。

Description

花生青枯病菌环介导等温扩增检测引物及检测方法

技术领域

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种花生青枯病菌的LAMP检测引物及其快速检测方法，可用于花生青枯病菌的高灵敏度、快速的特异性分子检测，还可用于花生青枯病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

背景技术

花生青枯病是由Ralstonia solanacearu引起的一种细菌性维管束病害。该病害于1905年在印度尼西亚首次报道，随后在20多个国家和地区相继发生或出现报道。目前，主要以中国、印度尼西亚和越南危害较重。我国关于花生青枯病的报道始见于30年代后期，现在主要分布于中部和南方地区，每年全国实际病地面积在40万hm²以上，受危害程度居世界首位。花生青枯病发病率一般在10%－30%左右，减产20%以上；重病区发病率可在50%以上，甚至导致完全绝收。近年来有报道显示，花生青枯病表现出向北蔓延的趋势，给花生生产带来更大威胁。除引起减产外，青枯病的发生还会降低花生品质，并增加黄曲霉毒素的污染。同时，花生青枯病是一种土传病害，可经雨水、土壤、病残体等从发病区向未发病区传播，且其侵染能力强，在较短的时间内可造成植株枯萎死亡。随着设施农业的高度集约化生产，复种指数高，品种单一，导致该类病害的发生越来越严重。因此，开展花生青枯病菌的快速检测，对该病害的早期诊断和及时防治具有十分重要的意义。

目前，关于花生青枯菌的检测方法包括传统分离培养法、血清学和分子生物学等方法。青枯病菌的传统检测方法是采用选择性培养基对病原物进行分离纯化，然后进行一系列的生理生化实验进行诊断，该方法易受外界因素的影响且灵敏度较低。而应用血清学方法时血清的制备过程耗时耗力，且可能存在交叉反应，造成检测结果的假阳性，难以满足对花生青枯病诊断的实际需要。因此，建立一套快速、灵敏、准确的花生青枯病菌检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。

PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的新途径，然而目前PCR特异性检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了PCR检测方法的推广应用。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种链式置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒温条件下（60–65℃）保温30–90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速扩增的特点，在90分钟内可扩增10⁹–10¹⁰倍，其扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道极少，将LAMP方法应用于花生青枯病菌的检测国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供花生青枯病菌的LAMP检测引物及其快速检测方法，本方法易于操作、特异性强、灵敏度高，可得到准确可靠的实验结果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

花生青枯病菌的LAMP检测引物及其快速检测方法，其具体步骤如下：

1、LAMP引物的设计：根据花生青枯病菌的16S-23S rDNA ITS序列采用PrimerExplorer V4软件设计一种LAMP检测引物，包括一对外引物和一对内引物，引物序列如下：

外侧引物F3：5’-TCTTGATAAGGCGGGGGT-3’（SEQ ID NO:1）；

B3：5’-AAACACCGATCTCTCGATGC-3’(SEQ ID NO:2)；

内侧引物FIP：5’-CCAGTTCACGGCAAGATCGCTTTCAAGTCCTACCAGACCCA-3’(SEQ ID NO:3)；

BIP：5’-ACCTGCTTTGCAAGCAGGGG-GCGTTTGGCTACCACAAGG-3’(SEQ ID NO:4)。

2．花生青枯病菌快速检测体系的建立：

1）采用NaOH快速裂解法提取花生青枯病菌的DNA，具体步骤如下：

a. 将花生病茎用清水洗净、晾干；

b. 按1mg病茎加入10μl（0.5mol/L NaOH，0.5%PVP）计量，将组织充分磨碎成糊，12000rpm离心5min；

c. 取上清液20μl与等体积的0.1 mol/L的Tris-HCl（pH8.0）混合，所得溶液稀释10倍作为LAMP反应的DNA模板。

2）利用所设计的LAMP检测引物进行扩增，LAMP反应体系为25 μl，包括5μM外侧引物F3和B3各0.25μl，40μM内侧引物FIP和BIP各0.25μl，反应混合液18.0μl，8UBst DNA 聚合酶1μl，DNA模板25ng，用灭菌超纯水补足至25 μl；LAMP反应条件为65℃温育60 min，82℃保温10min；

所述的反应混合液中各组分的浓度为40mM Tris-HCl，20mM (NH₄)₂SO₄，20mM KCl，16 mM MgSO₄，0.2% Triton X-100，1.6M Betaine，2.8 mM dNTPs。

3、结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，在LAMP反应的最终扩增产物中加入显色剂SYBR green Ⅰ 1μl，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2μl PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

本发明可用于花生青枯病潜伏期或者发病期时的病害检测。建立针对花生青枯病菌的快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于花生青枯病菌引起病害显症之前的早期监测，及确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。

本发明有益效果：

本发明方法适用于花生青枯病菌感染的植株或发病潜伏期时花生青枯病菌的快速可靠的检测、鉴定，对于防治农业生产中花生青枯病菌引起的病害具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、特异性强：本发明所设计的LAMP检测引物是针对花生青枯病菌16S-23S rDNA ITS序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故特异性强。

2、灵敏度高：本发明所设计出的LAMP引物，对花生青枯病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg。

3、实用性好：本发明所设计出的LAMP引物，可用于花生青枯病菌感染的植株或者发病潜伏期时的高灵敏度快速检测，对花生青枯病的早期诊断和及时防治具有十分重要的意义。

4、操作简便快速：应用本发明检测方法，对花生青枯病菌感染的植株或者发病潜伏期的植株检测可在数小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。

附图说明

图1为本发明对花生青枯病菌的特异性检测结果图，图A为琼脂糖凝胶电泳结果，图B为荧光染料显色结果。

图2为本发明对花生青枯病菌的灵敏性检测结果图，图A为琼脂糖凝胶电泳结果，图B为荧光染料显色结果。

图3为本发明对人工接种花生青枯病菌植物组织的检测结果图，图A为琼脂糖凝胶电泳结果，图B为荧光染料显色结果。

具体实施方式

根据花生青枯病菌的16S-23S rDNA ITS序列设计一种LAMP检测引物，包括一对外引物和一对内引物，引物序列如下：

外侧引物F3：5’-TCTTGATAAGGCGGGGGT-3’(SEQ ID NO:1)；

B3：5’-AAACACCGATCTCTCGATGC-3’(SEQ ID NO:2)；

BIP：5’-ACCTGCTTTGCAAGCAGGGG-GCGTTTGGCTACCACAAGG-3’(SEQ ID NO:4)。

实施例1 本发明对花生青枯病菌的特异性检测

1. 花生青枯病菌的LAMP特异性检测

1）以花生青枯病菌和25株其他菌株为供试材料，采用CTAB法提取花生青枯病菌DNA。具体方法如下：将花生青枯病菌接种于NA液体培养基，28℃、200rpm过夜培养；取1.5ml培养物12000rpm离心2min，弃上清后加入567μl TE缓冲液重新悬浮菌体，加入30μl 10%SDS溶液和3μl 20mg/ml 的蛋白酶K，轻轻混匀，于37℃温育1h；加入100μl 5mol/L NaCl 溶液充分混匀，再加入80μl CTAB/NaCl 溶液，混匀后65℃温育10min；加入800μl的酚/氯仿/异戊醇溶液（三者体积比为25:24:1）混匀，12000rpm离心5min，取上清液，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀，12000rpm离心15 min收集沉淀；加入1000μl 无水乙醇，混匀，12000 rpm离心5 min；弃上清液后在超净工作台上自然晾干，加 200 μl TE溶液溶解沉淀，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/μl待用；

所述的反应混合液中各组分的浓度为40mM Tris-HCl，20mM (NH₄)₂SO₄，20mM KCl，16 mM MgSO₄，0.2% Triton X-100，1.6M Betaine，2.8 mM dNTPs；

3）在LAMP反应的最终扩增产物中加入显色剂SYBR green Ⅰ 1μl，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

2．检测结果

图1为采用本发明测定花生青枯病菌的LAMP特异性检测结果图，图A为琼脂糖凝胶电泳结果，图B为荧光染料显色结果，其中：泳道M为2000bp DNA 分子量marker，泳道1为阴性对照，泳道2为花生青枯病菌，泳道3-11为其他参试菌株。

从图1（A）可见，泳道2可观察到花生青枯病菌的特异性绿色荧光；从图1(B)可见泳道2出现LAMP特征性的梯形带，其余25株其他菌株显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳均没有出现扩增条带，说明本发明对花生青枯病菌具有很强的特异性。

实施例2 本发明对花生青枯病菌的灵敏性检测

1．花生青枯病菌的LAMP灵敏性检测

采用10倍浓度系列稀释法将提取的花生青枯病菌DNA稀释成10ng, 1ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, 1fg 和 100 ag共9个不同浓度梯度。

①按实施例1中的反应体系及条件进行扩增；

②在LAMP反应的最终扩增产物中加入显色剂SYBR green Ⅰ 1μl，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

2．检测结果：

图2为采用本发明测定花生青枯病菌的LAMP灵敏性检测结果图，图A为琼脂糖凝胶电泳结果，图B为荧光染料显色结果，其中：泳道M为2000bp DNA分子量marker，泳道1–9为不同浓度的花生青枯病菌DNA，其浓度依次为10ng, 1ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, 1 fg和 100ag/ μl泳道10为阴性对照。

由图2可见，在泳道1-7上均可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，表明本发明的检测灵敏度可达10fg。

实施例3 本发明对人工接种花生青枯病菌植物组织的检测

1. 人工接种花生青枯病菌植物组织的检测

采用浸种法接种花生青枯病菌。随机选取2株显症植株和3株尚未显症植株进行检测，同时以花生青枯病菌基因组DNA作为阳性对照，健康花生植株作为阴性对照。采用NaOH快速裂解法提取花生青枯病菌DNA。

按下述方法进行LAMP检测：

①按实施例1中的反应体系及条件进行扩增；

2．检测结果

图3为采用本发明测定人工接种花生青枯病菌植物组织的检测结果图，图A为琼脂糖凝胶电泳结果，图B为荧光染料显色结果，其中：泳道M为2000bp DNA分子量marker，泳道1为阳性对照，泳道2-3为发病植物组织，泳道4-6为发病潜伏期植物组织，泳道7为健康植物组织，泳道8为阴性对照。

由图3可见，泳道2-6均可观察到绿色荧光及LAMP特征性的梯形带，健康组织和阴性对照的显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳均无扩增条带出现。表明本发明可用于花生青枯病潜伏期或者感病初期时的病害检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>花生青枯病菌环介导等温扩增检测引物及检测方法

<130> 2013

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

tcttgataag gcgggggt 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

aaacaccgat ctctcgatgc 20

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

ccagttcacg gcaagatcgc tttcaagtcc taccagaccc a 41

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

acctgctttg caagcagggg gcgtttggct accacaagg 39

Claims

1.一种花生青枯病菌的LAMP检测引物，其特征在于：根据花生青枯病菌的16S-23S rDNA ITS序列设计一种LAMP检测引物，包括一对外引物和一对内引物，外侧引物F3序列为SEQ ID NO:1；B3序列为SEQ ID NO:2；内侧引物FIP序列为SEQ ID NO:3；BIP序列为SEQ ID NO:4。

2.权利要求1所述的花生青枯病菌的LAMP检测引物的应用方法，其特征在于：利用所设计的LAMP检测引物进行扩增，LAMP反应体系为25 μl，包括5μM外侧引物F3和B3各0.25μl，40μM内侧引物FIP和BIP各0.25μl，反应混合液18.0μl，8UBst DNA 聚合酶1μl，DNA模板25ng，用灭菌超纯水补足至25 μl；LAMP反应条件为65℃温育60 min，82℃保温10min；

3.根据权利要求2所述的花生青枯病菌的LAMP检测引物的应用方法，其特征在于：在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR green Ⅰ 1μl，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现则判断为阴性。