CN103614475B - 一种花生青枯病菌巢式pcr检测方法 - Google Patents

一种花生青枯病菌巢式pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种花生青枯病菌的巢式PCR检测方法，以样品DNA为模板，利用细菌16S-23S rDNA ITS序列通用引物L1/L2进行第一轮PCR扩增，再以第一轮PCR产物为模板，通过设计的一对鉴别花生青枯病菌的特异性引物W1/W2，进行第二轮PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，如果出现374bp的特异条带，则确定所检测的病原菌为花生青枯病菌。本发明的花生青枯病菌巢式PCR检测方法，对病菌基因组DNA的检测灵敏度为10fg，且能克服生物学鉴定、酶联免疫技术和常规PCR等方法的缺点，提供了一种快速、灵敏、特异的花生青枯病菌检测方法，可用于田间花生青枯病菌的早期诊断，对该病害的早期检测和及时防治具有十分重要的意义。

Description

一种花生青枯病菌巢式PCR检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种花生青枯病菌巢式PCR检测方法。
背景技术
花生青枯病是由Ralstonia solanacearu引起的一种细菌性维管束病害。该病害于1905年在印度尼西亚首次报道，随后在20多个国家和地区相继发生或出现报道。目前，主要以中国、印度尼西亚和越南危害较重。我国关于花生青枯病的报道始见于30年代后期，现在主要分布于中部和南方地区，每年全国实际病地面积在40万hm2以上，受危害程度居世界首位。花生青枯病发病率一般在10%－30%左右，减产20%以上；重病区发病率可在50%以上，甚至导致完全绝收。近年来有报道显示，花生青枯病表现出向北蔓延的趋势，给花生生产带来更大威胁。除引起减产外，青枯病的发生还会降低花生品质，并增加黄曲霉毒素的污染。同时，花生青枯病是一种土传病害，可经雨水、土壤、病残体等从发病区向未发病区传播，且其侵染能力强，在较短的时间内可造成植株枯萎死亡。随着设施农业的高度集约化生产，复种指数高，品种单一，导致该类病害的发生越来越严重。因此，开展花生青枯病菌的快速检测，对该病害的早期诊断和及时防治具有十分重要的意义。
目前，关于花生青枯病菌的检测方法包括传统分离培养法、血清学和分子生物学等方法。青枯病菌的传统分离培养法是采用选择性培养基对病原物进行分离纯化，然后进行一系列的生理生化实验进行诊断，该方法易受外界因素的影响且灵敏度较低。而应用血清学方法时血清的制备过程耗时耗力，且可能存在交叉反应，造成检测结果的假阳性。基于PCR原理的分子生物学技术是一种灵敏度高、特异性强的快速检测技术，已在多种植物病害的检测中得到广泛应用。在细菌基因组中，16S-23S rDNA ITS序列在物种进化过程中具有高度的保守性，目前很多病原细菌分子检测方法的建立都是基于这一位点。本发明通过比较花生青枯病菌和同属近缘种的16S-23S rDNA ITS序列选择差异位点设计特异引物，采用巢式PCR对花生青枯病菌进行检测，灵敏度高，特异性强，国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种花生青枯病菌的巢式PCR检测方法，其具有特异性强、灵敏度高的特点，可用于田间花生青枯病的早期诊断，对花生青枯病菌引起病害显症之前的早期监测和及时防治具有十分重要的意义。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：
一种花生青枯病菌的巢式PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1）、基因组DNA提取：采用CTAB法提取花生青枯病菌基因组DNA或发病植物组织DNA；
步骤2）、第一轮PCR扩增：以步骤1）得到的DNA样品为模板，采用细菌16S-23S rDNA ITS序列通用引物L1/L2经PCR扩增得到第一轮PCR产物；
引物序列：L1：5’-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3’（SEQ ID NO:1）；
          L2：5’-GTGCCAAGGCATCCACC-3’（SEQ ID NO:2）；
PCR反应体系25μl：DNA模板 1μl，10×PCR反应缓冲液 2.5μl，2.5 mmol/L dNTPs混合液 2μl，5U/μl DNA Taq聚合酶 0.5μl，10μ mol/L的L1引物1μl，10μ mol/L的L2引物1μl，灭菌超纯水补足至25μl；
PCR扩增程序：95℃预变性4min，94℃变性1 min，60℃退火30 sec，72℃延伸45sec，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保存；
步骤3）、第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增产物或扩增产物的稀释液为模板，采用花生青枯病菌特异引物W1/W2经PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物；
引物序列：W1：5’-TCCTACCAGACCCACCAAG TTACGG-3’（SEQ ID NO:3）；
          W2：5’-GTATGTCTCGCTATAGGCTGAGTTC-3’（SEQ ID NO:4）；
PCR反应体系25μl：第一轮PCR扩增产物或扩增产物的稀释液 1μl，10×PCR反应缓冲液 2.5μl，2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl，5U/μl DNA Taq聚合酶0.5μl，10μ mol/L的W1引物1μl，10μ mol/L的W2引物1μl，灭菌超纯水补足至25μl；
PCR扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性30sec，60℃退火30 sec，72℃延伸40sec，共30个循环；72℃延伸8min；4℃保存；
步骤4）、PCR扩增产物检测：取5 μl第二轮PCR扩增产物，采用1%琼脂糖凝胶，在110V 电压下电泳30min，之后置于EB内染色20min，取出，于凝胶成像系统下观察拍照，如果存在374bp的特异条带，则确定所检测的病菌为花生青枯病菌；
所述的PCR反应缓冲液中均含有Mg2+。
本发明具有以下技术优势和积极效果
1、灵敏度高：本发明检测灵敏度为10fg，较常规PCR灵敏度提高了100倍。
2、特异性强：本发明针对性的检测花生青枯病菌，能从花生青枯病菌基因组中扩增出374bp的单一目的条带，受其他菌类干扰小，准确率高。
3、实用性好：本发明可用于花生青枯病潜伏期或者感病初期时的病害检测，对花生枯病病害的早期诊断和及时防治具有十分重要的意义。
4、操作简便快速：应用本发明方法，对带花生青枯病菌的植物组织进行病菌DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切，整个检测过程一般可在8小时内完成。
附图说明
图1是花生青枯病菌特异性检测扩增结果。
图2是花生青枯病菌常规PCR灵敏性检测扩增结果。
图3是花生青枯病菌巢式PCR灵敏度检测扩增结果。
图4是人工接种花生青枯病菌植物组织的检测结果。
具体实施方式
实施例1  花生青枯病菌的巢式PCR检测
1. 样品DNA提取
1.1 提取菌体DNA
    将花生青枯病菌接种于NA液体培养基，28℃、200rpm过夜培养，用CTAB法提取细菌基因组DNA，具体操作如下：
1) 取1.5ml 培养物于2.0ml离心管中，12000rpm离心2min；
2) 弃上清液，加入567μl TE缓冲液重新悬浮菌体，加入30μl 10%SDS溶液和3μl 20mg/ml的蛋白酶K，轻轻混匀，于37℃温育1h；
3) 加入100μl 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入80μl CTAB/NaCl溶液，混匀后65℃温育10min；
4) 加入800μl的酚/氯仿/异戊醇溶液（三者体积比为25:24:1），混匀后12000rpm离心5min；
5) 取上清液转入新的1.5ml离心管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀，12000rpm离心15 min；
6) 弃上清液，加入1000μl无水乙醇，混匀，12000 rpm离心5 min；
7) 弃上清液，在超净工作台上自然晾干，加入60 μl ddH2O溶解DNA，于－20℃保存备用。
1.2 提取待检植物组织样品DNA
1) 称取花生茎部组织100mg，加入液氮研磨成粉末，转移入2.0ml离心管中；
2) 加入1000μl CTAB/NaCl溶液，于65℃水浴30min，每各10min混匀一次，12000rpm离心10min；
3) 取上清液800μl于2.0ml离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液（三者体积比为25:24:1），混匀后12000rpm离心5min；
4) 取上清液750μl于2.0ml离心管中，加入等体积的氯仿/异丙醇溶液（体积比为24:1），混匀，12000rpm离心5min；
5) 取上清液500μl于2.0ml离心管中，加入50μl预冷的3mol/L NaAC溶液(pH=5.2)，混匀，加入50μl预冷的异丙醇，混匀，于－20℃放置30min；
6) 4℃10000rpm离心5min，弃上清液，加入1000μl预冷的75%无水乙醇洗涤沉淀2次，再用无水乙醇洗涤1次，在超净工作台上自然晾干，加入60 μl ddH2O溶解DNA，于－20℃保存备用。
2. 第一轮PCR扩增
以提取的菌体DNA和植物组织DNA样品为模板，采用细菌16S-23S rDNA ITS序列通用引物L1/L2进行第一轮PCR扩增。
引物序列：L1： 5’-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3’（SEQ ID NO:1）；
          L2： 5’-GTGCCAAGGCATCCACC-3’（SEQ ID NO:2）；
PCR反应体系25μl：DNA模板 1μl，10×PCR反应缓冲液(含Mg2+) 2.5μl，2.5 mmol/L dNTPs混合液 2μl，5U/μl DNA Taq聚合酶 0.5μl，10μ mol/L的L1引物1μl，10μ mol/L的L2引物1μl，灭菌超纯水补足至25μl；
PCR扩增程序：95℃预变性3min，94℃变性1min，60℃退火30 sec，72℃延伸45sec，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保存；
3. 第二轮PCR扩增
将第一轮PCR扩增产物稀释10倍，取1μl作为DNA模板，采用花生青枯病菌特异引物W1/W2进行第二轮PCR扩增。
引物序列：W1：5’-TCCTACCAGACCCACCAAG TTACGG-3’（SEQ ID NO:3）；
          W2：5’-GTATGTCTCGCTATAGGCTGAGTTC-3’（SEQ ID NO:4）；
PCR反应体系25μl：第一轮PCR扩增产物或扩增产物的稀释液 1μl，10×PCR反应缓冲液(含Mg2+) 2.5μl，2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl，5U/μl DNA Taq聚合酶0.5μl，10μ mol/L的W1引物1μl，10μ mol/L的W2引物1μl，灭菌超纯水补足至25μl；
PCR扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性30sec，60℃退火30 sec，72℃延伸40sec，共30个循环；72℃延伸8min；4℃保存；
4. PCR扩增产物检测
取5 μl第二轮PCR扩增产物，采用1%琼脂糖凝胶，在110V电压下电泳30min，之后置于EB内染色20min，取出，于凝胶成像系统下观察拍照，如果存在374bp的特异条带，则确定所检测的病菌为花生青枯病菌。
图1是花生青枯病菌特异性检测扩增结果。其中，M为2000 bp DNA分子量 marker，1为花生青枯病菌，2-13为部分参试菌株，14为阴性对照。
巢式PCR扩增结果显示，只有泳道1即花生青枯病菌扩增出374bp的特异条带，而阴性对照和2-13泳道的其他菌株均无扩增条带出现。
实施例2 花生青枯病菌的常规PCR灵敏度试验
将花生青枯病菌基因组DNA分别稀释为10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10 fg /μl和1 fg /μl 8个浓度梯度。取各浓度的DNA 1μl作为模板，只用特异性引物W1/W2分别进行一次PCR扩增，经3次重复后均得到相同的结果。
图2是花生青枯病菌常规PCR灵敏性检测扩增结果。其中，M为2000 bp DNA分子量 marker，1-8为不同浓度的花生青枯病菌DNA，其浓度依次为10 ng、1ng、100 pg、10 pg、1pg、100 fg、10 fg、1 fg/μl，9为阴性对照。
图2结果显示，单独使用特异性引物W1/W2进行一次PCR扩增，泳道1-5均扩增出374bp特异条带，表明病原菌DNA的最低检测浓度为1pg/μl。
实施例3 花生青枯病菌的巢式PCR灵敏度试验
同实施例2，将花生青枯病菌基因组DNA分别稀释为10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10 fg /μl和1 fg /μl 8个浓度梯度。取各浓度的DNA 1μl作为模板，按实施例1的步骤2和步骤3，分别依次进行第一轮和第二轮PCR扩增。
经两轮PCR扩增所得产物的电泳结果见图3。图中，M是2000bp DNA分子量 marker，1-8为不同浓度的花生青枯病菌DNA，其浓度依次为10ng、1ng、100 pg、10 pg、1pg、100 fg、10 fg、1 fg/ μl，9是阴性对照。
图3结果显示，经过两轮PCR扩增，泳道1-7均扩增出374bp的特异条带，表明病原菌DNA的最低检测浓度为10fg/μl。与实施例2的结果相比，本发明的巢式PCR检测灵敏度是单独使用特异性引物W1/W2进行一次PCR扩增检测灵敏度的100倍。
实施例4 人工接种花生青枯病菌植物组织的检测
采用浸种法接种花生青枯病菌。随机选取2株发病植株和3株尚未显症植株进行检测，同时以花生青枯病菌基因组DNA为阳性对照，健康花生植株作为阴性对照。提取花生茎部组织DNA，按实施例1的步骤2和步骤3依次进行第一轮和第二轮PCR扩增。
两轮扩增后的产物电泳结果见图4。其中，M为2000 bp DNA 分子量marker，1为阳性对照，2-3分别为发病植物组织，4-6分别为发病潜伏期植物组织，7为健康植物组织，8为阴性对照。
图4结果可见，利用巢式PCR对5个样品进行检测时，泳道2-6均扩增出374bp的特异条带，健康花生植物组织和阴性对照均无扩增产物。这表明，本发明可用于花生青枯病潜伏期或感病初期时的病害检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
 
<110>福建省农业科学院植物保护研究所
 
<120>一种花生青枯病菌巢式PCR检测方法
 
<130> 2013
 
<160> 4    
 
<170> PatentIn version 3.3
 
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
 
<400> 1
agtcgtaaca acgtagccgt                                                 20
 
 
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213>人工序列
 
<400> 2
gtgccaaggc atccacc                                                    17
 
 
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
 
<400> 3
tcctaccaga cccaccaagt tacgg                                           25
 
 
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
 
<400> 4
gtatgtctcg ctataggctg agttc                                           25
 

Claims (1)

1.一种花生青枯病菌的巢式PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1）、基因组DNA提取：采用CTAB法提取花生青枯病菌基因组DNA或发病植物组织DNA；
步骤2）、第一轮PCR扩增：以步骤1）得到的DNA样品为模板，采用细菌16S-23S rDNA ITS序列通用引物L1/L2经PCR扩增得到第一轮PCR产物；L1序列为SEQ ID NO:1，L2序列为SEQ ID NO:2；
PCR反应体系25μl：DNA模板 1μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，2.5 mmol/L dNTPs混合液 2μl，5U/μl DNA Taq聚合酶 0.5μl，10μ mol/L的L1引物1μl，10 μ mol/L的L2引物1μl，灭菌超纯水补足至25μl；
PCR扩增程序：95℃预变性4min，94℃变性1 min，60℃退火30 sec，72℃延伸45sec，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保存；
步骤3）、第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增产物或扩增产物的稀释液为模板，采用花生青枯病菌特异引物W1/W2经PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物；W1序列为SEQ ID NO:3，W2序列为SEQ ID NO:4；
PCR反应体系25μl：第一轮PCR扩增产物或扩增产物的稀释液 1μl，10×PCR反应缓冲液 2.5μl，2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl，5U/μl DNA Taq聚合酶0.5μl，10μ mol/L的W1引物1μl，10 μ mol/L的W2引物1μl，灭菌超纯水补足至25μl；
PCR扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性30sec，60℃退火30 sec，72℃延伸40sec，共30个循环；72℃延伸8min；4℃保存；
步骤4）、PCR扩增产物检测：取5 μl第二轮PCR扩增产物，采用1%琼脂糖凝胶，在110V 电压下电泳30min，之后置于EB内染色20min，取出，于凝胶成像系统下观察拍照，如果存在374bp的特异条带，则确定所检测的病菌为花生青枯病菌；
所述的PCR反应缓冲液中均含有Mg2+。
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