CN106868164A

CN106868164A - 一种用于检测樟疫霉菌的引物及巢式pcr检测方法

Info

Publication number: CN106868164A
Application number: CN201710177242.1A
Authority: CN
Inventors: 兰成忠; 姚锦爱; 阮宏椿; 吴玮
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2017-03-23
Filing date: 2017-03-23
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2037-03-23
Also published as: CN106868164B

Abstract

本发明提供了一种用于检测樟疫霉菌（Phytophthora cinnamomi）的引物及巢式PCR检测方法，所述引物组包括2对引物，第1对为疫霉菌Ypt1基因通用引物ph1F/Yph2R，第2对为鉴定樟疫霉菌的特异性引物PCINF/PCINR。本发明只要有10fg/μL病原菌微量DNA存在，即可准确检测出，本发明所提供的樟疫霉菌巢式PCR检测方法具准确性高、特异性强、灵敏度高、检测过程操作简便快速等优点，可用于樟疫霉菌引起病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，克服了传统检测和鉴定方法步骤繁琐、周期长等问题。

Description

一种用于检测樟疫霉菌的引物及巢式PCR检测方法

技术领域

本发明提供了一种用于检测樟疫霉菌的引物，同时还提供了利用该引物组进行巢式PCR扩增检测的方法，属于作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

樟疫霉菌(Phytophthora cinnamomi) 属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)，是植物重要病原菌，广泛分布于欧洲、美洲、东南亚及大洋洲等地区，其寄主广泛，包括樟属植物在内的超过3000多种花卉、林木和农业作物等。樟疫霉主要侵染植物根部，阻断水分和养分的运输，从而导致宿主植株致病，其所致植物病害的常见症状包括叶枯黄且易脱落、树干溃疡并伴有胶状物渗出、茎溃疡（可致植物猝死）、果腐、心腐及其他营养器官腐烂、幼苗及果实生长缓慢，产量锐减等，严重时可导致全株死亡等，樟疫霉已成为农、林业中植物病害防治的重要病原菌之一。据报道，樟疫霉菌已经造成澳大利亚西南地区森林发生结构和植物种群变化，已经严重威胁到当地自然生态系统以及生物多样性；樟疫霉菌引起的鳄梨疫病，是世界各地分布最广泛的病害之一，对鳄梨生产造成了严重影响，在美国加利福尼亚州，近60%-75%的鳄梨种植园被樟疫霉侵染，平均每年经济损失超过4000多万美元，占年总产值的30%。樟疫霉在我国东南沿海地区（包括上海、江苏、浙江、福建和台湾）及云南、北京等地有一定分布，严重引起鳄梨、刺槐、雪松及山茶花、杜鹃花等各种名贵植物的发病与死亡。近年来随着农业结构的调整，蔬菜、果树、花卉、中草药以及设施农业大力发展，樟疫霉对农业的威胁日趋严重。樟疫霉是一种土传病原菌，它以不同形态腐生、寄生或专性寄生于土壤及植物组织，通过地表和地下水流动、植物根系相互接触、动物移动及人类活动（修路、伐木、采矿等）传播，一般情况下，植株受樟疫霉侵染后可继续存活数年，特别是在气温较低且潮湿的环境下，但有时樟疫霉侵染可导致植株突然死亡。由于樟疫霉侵染多数发生在植物根部，经常被人们忽视，等有明显的地上部分症状出现时，樟疫霉侵染植株有可能已有数月甚至数年。目前对樟疫霉菌病害还没有有效的防治措施，因此，防止和控制樟疫霉病原体的传播将是很好的控制方法。强劲、快速、可靠的检测是及时实施遏制措施，防止或限制樟疫霉传播，避免造成严重经济和社会后果的首要条件。

樟疫霉菌传统的分类鉴定主要是基于形态学特征(菌落形态、菌丝形态、厚垣孢子的有无、孢子囊特征、孢囊梗层出方式、孢子囊的脱落性及雄器的类型等)、致病性测定、生理生化特征等。在进行形态学鉴定时需对樟疫霉进行分离，然而同一选择性培养基上，其他生长速度较快的微生物会抑制樟疫霉生长，造成分离存在一定的困难。另外，疫霉属种间的形态学性状常出现重叠现象，樟疫霉种内各菌株形态学性状存在差异，而且易受环境条件影响（宿主、培养基、温度等）而出现不稳定性状。虽然传统方法在樟疫霉菌检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。

随着分子生物学技术的发展，近年来，利用PCR扩增病原菌核糖体某一特异分子片段（internal transcribed spacer ITS转录间隔区）进行病原菌鉴定、检测及病害诊断为国际上广泛使用，应用病原菌特异引物通过PCR扩增可直接对植物组织、土壤及水体等样品中病原菌进行检测。由于这种方法特异性强、灵敏度高、简便、快速、无放射性污染、易推广等突出优势，越来越受到各国病理学家的高度重视。然而疫霉属卵菌的分子检测技术研究结果表明，rDNA/ITS在疫霉属的近缘种之间变化很小，从ITS序列上设计引物很难将两个相似高的种区分开。因此要对疫霉属病原菌进行高灵敏性和特异性检测，应从疫霉菌其它基因上设计引物进行检测。已有研究表明，疫霉属中的Ypt1基因含有多个外显子和内含子，外显子具有保守性，而这些内含子在不同种之间具有多变性，非常适合于设计引物进行疫霉属卵菌近缘种的特异性分子检测、鉴定。

本发明以Ypt1基因为樟疫霉菌检测靶点，设计特异引物并与PCR技术相结合，建立特异性强、灵敏度高、耗时短的检测方法。本发明在樟疫霉菌的鉴定、监测、病害检测与防治等方面具有一定的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测樟疫霉菌的引物及巢式PCR检测方法，针对现有技术中对樟疫霉菌检测和鉴定主要基于形态学特征，该方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有分子检测中rDNA-ITS序列差异很小，以ITS为靶标设计的引物难以将一些近缘种的病原菌区分开的技术缺欠，提供了樟疫霉菌特异性PCR检测引物对及其检测方法，利用本发明所述的PCR检测引物对和检测方法检测樟疫霉菌准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、检测时间短且结果可靠。

实现本发明的目的包括下列步骤（技术方案）：

1. 樟疫霉菌特异性引物的设计：通过测定樟疫霉菌（Phytophthora cinnamomi）和其它疫霉菌（Phytophthora spp）的Ypt1基因序列，对疫霉属不同种间Ypt1基因序列进行比对分析，设计出对樟疫霉菌具有特异性扩增作用的1对引物，即特异PCR检测引物对的序列为：

上游引物PCINF：5'- CGCTAACGTCGTTGTTGTTT -3'，

下游引物PCINR：5'- CCTATAATATCGGACGTACCTATCG -3'；

对樟疫霉菌特异性扩增出320bp的产物。

2. 樟疫霉菌巢式PCR检测方法的建立，包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组DNA。

用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB 法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合物（体积比25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min^-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1离心5min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol·L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000 r·min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L EDTA，pH 8.0）溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。

用于检测植物组织中存在樟疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µL加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增；

用于检测土壤样品中存在樟疫霉菌时，采用土壤DNA提取试剂盒，提取DNA。

（2）巢式PCR第1轮扩增：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用Ypt1基因通用引物ph1F/Yph2R（ph1F：5'-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3'和Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'）进行第1轮PCR扩增，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCRMaster Mix 12.5µL，10 µmol/L的ph1F /Yph2R引物各1.0µL，DNA模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。

（3）第2轮PCR扩增，待步骤（2）第一轮PCR扩增结束后，取1.0μl 第一轮PCR扩增产物或扩增产物的稀释液为模板与引物PCINF/PCINR组合进行第2轮PCR扩增，PCR扩增的条件为：PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5µL，10 µmol/L的 PCINF/PCINR引物各1.0µL，DNA 模板（第1轮PCR扩增产物或稀释液）1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL；扩增参数为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

（4）取步骤（2）的PCR扩增产物5.0 µL用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，4-5V/cm，电泳40min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约320bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在樟疫霉菌，否则所述的检测样品中未存在该菌。

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和有益效果：

1.特异性强、准确性高：本发明能准确地检测、鉴定出樟疫霉菌，只有樟疫霉菌的菌株能扩增出大小约为320bp的条带，而其它菌株均扩增不出条带，说明本发明的引物对具有很强的特异性。使用本发明的检测方法对不同地理来源的樟疫霉菌和携带樟疫霉菌的植物组织和土壤进行了测试验证，只有樟疫霉菌和携带该病菌的样品能特异性地扩增出一条320bp的电泳条带，说明本发明所设计的引物对能准确诊断出樟疫霉菌。

2.重复性好、灵敏度高：多次试验证实本发明具有很好的重复性，目标物DNA只需要10 pg/µL，就可以检测、鉴定出樟疫霉菌；

3.操作简便、快速：应用本发明方法，对待测样品基因组DNA进行提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，整个检测过程采用DNA快速提取方法，操作简单，无需对病原菌进行分离培养，大大缩短了检测时间，一般整个检测过程可在6小时内完成；

4. 应用性好：本发明通过设计了一对特异性引物，结合PCR检测方法可以有效地检测植物组织和土壤中的樟疫霉菌，可参考应用于樟疫霉引起病害的田间调查，对控制樟疫霉菌的传播与蔓延具有重要意义，同时，本发明体系的建立也为其它病原菌的检测提供了技术指导和理论依据。

附图说明

图1为本发明所述引物对的特异PCR扩增电泳图，图中：泳道M为2000bp Marker，泳道1-3为樟疫霉菌，泳道4-6分别为辣椒疫霉菌、芋疫霉菌和豇豆疫霉菌，泳道7为阴性对照。

图2为本发明引物对的灵敏性检测扩增电泳图，图2-a为单重PCR对樟疫霉菌的灵敏性检测结果，图2-b为巢式PCR对樟疫霉菌的灵敏性检测结果，图中泳道M为2000bpMarker，泳道1为100 ng，泳道2为10 ng，泳道3为1 ng，泳道4为100 pg，泳道5为10 pg，泳道6为1 pg，泳道7为100 fg，泳道8为10 fg，泳道9为1 fg，泳道10-11为阴性对照，泳道12为阳性对照。

图3为本发明检测方法对蓝莓根部组织和土壤样品中樟疫霉菌检测结果电泳图，图中泳道M为2000bp Marker，泳道1为阳性对照，泳道2为阴性对照，泳道3为发病的蓝莓根部组织，泳道4为健康蓝莓根部组织，泳道5-6为携带樟疫霉菌的土壤，泳道7为高压灭菌土壤。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例 1：樟疫霉菌PCR检测引物对的设计及引物对的特异性验证

1.樟疫霉菌基因组DNA的提取

采用CTAB 法提取不同地区来源的樟疫霉菌基因组 DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合物（体积比25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min^-1离心9min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol·L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH8.0）溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。

2.樟疫霉菌检测靶标Ypt1基因扩增及测序

以Ypt1基因通用引物（ph1F：5'-CGACC ATTGGCGTGGACTTT-3'和Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'）对供试樟疫霉菌（P. cinnamomi）的Ypt1基因进行扩增，PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的ph1F / Yph2R引物各1.0µL，DNA 模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。将PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

3.樟疫霉菌检测特异引物对的设计

将测序得到的樟疫霉菌（P. cinnamomi）的Ypt1基因序列与GenBank中疫霉属18个不同种的Ypt1基因序列进行同源性比较分析，根据樟疫霉菌与其它种间的差异位点（在BioEdit中比对），用Primer Primer5软件设计了樟疫霉菌（P. cinnamomi）的特异性引物，上游引物PCINF：5'- CGCTAACGTCGTTGTTGTTT -3'，下游引物PCINR：5'-CCTATAATATCGGACGTACCTATCG -3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

4.樟疫霉菌PCR检测方法的建立及引物特异性PCR验证

在已设计特异引物对的基础上，通过PCR反应体系和扩增参数的优化，建立的樟疫霉菌PCR检测方法，PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5µL，10 µmol/L的PCINF/PCINR引物各1.0µL，DNA 模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、59℃退火45S、72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃延伸10min。以供试的樟疫霉菌及其它病原菌的基因组DNA为模板，采用已建立好的樟疫霉菌PCR检测扩增体系和扩增程序对樟疫霉菌引物对（上游引物PCINF：5'- CGCTAACGTC- GTTGTTGTTT-3'，下游引物PCINR：5'- CCTATAATATCGGACGTACCTATCG -3'）的特异性进行验证。取5 µLPCR产物进行1.5%琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据DNA条带的有无及大小对樟疫霉菌引物对的特异性进行验证。

5.引物特异性验证结果

PCR扩增结果表明，引物PCINF/PCINR只能特异性地从供试的樟疫霉菌基因组DNA中扩增出大小约为320bp的条带（图1），而其它病原菌及阴性对照均无扩增条带。说明该对引物可以将樟疫霉菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于樟疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：樟疫霉菌巢式PCR检测方法的灵敏度测定

1.常规PCR扩增

用无菌超纯水对樟疫霉菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。使用本发明所述引物PCINF/PCINR对不同系列浓度的基因组DNA进行PCR扩增，评估该引物对樟疫霉菌基因组DNA检测的灵敏性，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PCINF/PCINR引物各1.0µL，DNA 模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、59℃退火45 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10min。

2.巢式PCR扩增

（1）DNA模板的稀释：用无菌超纯水对樟疫霉菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。

（2）巢式PCR第1轮扩增：以不同稀释浓度的DNA为模板，利用Ypt1基因通用引物ph1F/ph2R（ph1F：5'-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3'和Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'）进行巢式PCR第1轮扩增，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25 µL，包括2×TaqPCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的ph1F /Yph2R引物各1.0µL，DNA模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。

（3）巢式PCR第2轮扩增：待第一轮PCR扩增结束后，取1.0μl 第一轮PCR产物为模板或稀释液与引物PCINF/PCINR组合进行巢式PCR第2轮扩增。PCR反应体系25 µL，包括2×TaqPCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PCINF/PCINR引物各1.0µL，第一轮PCR产物1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、59℃退火45 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。

3.常规PCR和巢式PCR灵敏度比较：当以本发明所述引物PCINF/PCINR进行常规PCR扩增时，反应灵敏度可以达到100pg DNA 25μl^-1反应体系（图2中的a）。进一步以Ypt1基因通用引物ph1F /Yph2R进行第一轮扩增得到的PCR产物作为模板，以PCINF/PCINR作为第二轮扩增引物进行巢式PCR扩增，从电泳图可以看出套式PCR的特异性扩增条带比常规PCR要亮得多，能够使原来看不到条带的样品（10pg、1 pg、100fg、10fg/25μl反应体系）产生可见条带(图2中的b)，灵敏度达到10fg DNA 25μl^-1反应体系，比常规PCR要提高10000倍左右。

实施例3：蓝莓根腐病发病根部组织中樟疫霉菌的检测

发病根部组织基因组DNA的提取：以已经通过常规形态学和分子生物学鉴定由樟疫霉菌侵染引起的蓝莓根腐病的发病根部组织为待测样品，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µL加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。

巢式PCR扩增检测：以所提的DNA为模板，利用Ypt1基因通用引物ph1F/ph2R（ph1F：5'-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3'，Yph2R：5'-ACGTTC- TCGCAGGCGTATCT-3'）进行巢式PCR第1轮扩增，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的ph1F /Yph2R引物各1.0µL，DNA模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。待第一轮PCR扩增结束后，取1.0μl 第一轮PCR产物为模板或稀释液与引物PCINF/PCINR组合进行巢式PCR第2轮扩增。PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PCINF/PCINR引物各1.0µL，第一轮PCR产物1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、59℃退火45 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。

检测结果：取PCR扩增产物5.0 µL用1.5%琼脂糖电泳分离，电压为4-5V/cm，电泳结束经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约320bp的产物，即可判断发病组织中带有樟疫霉菌。检测结果（图3）表明，发病根部中可检测出樟疫霉菌，而健康组织及阴性对照则无特异性条带出现，说明该套技术能用于植物组织中樟疫霉菌的快速分子检测。

实施例4：土壤中樟疫霉菌的检测

带菌土壤基因组DNA的提取：取蓝莓根腐病植株根部土壤（蓝莓根腐病已被鉴定由樟疫霉菌侵染引起的），采用Sigma公司的土壤DNA提取试剂盒（Sigma,DNB100,Soil DNAIsolation Kit）提取土壤中的总DNA，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。

检测结果：取PCR扩增产物5.0 µL用1.5%琼脂糖电泳分离，电压为4-5V/cm，电泳结束经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约320bp的产物，即可判断土壤样品中存在樟疫霉菌。检测结果（图3）表明，蓝莓根腐病发病根际土壤中可检测出该菌，而高压灭菌的土壤及阴性对照则无特异性条带出现，说明该套技术能用于土壤中樟疫霉菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 种用于检测樟疫霉菌的引物及巢式PCR检测方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgctaacgtc gttgttgttt 20

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctataatat cggacgtacc tatcg 25

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgaccattgg cgtggacttt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgttctcgc aggcgtatct 20

Claims

1.一种用于检测樟疫霉菌的引物，其特征在于，所述引物为鉴定樟疫霉菌的特异性引物PCINF/PCINR，所述引物PCINF/PCINR序列如下：

PCINF：5'- CGCTAACGTCGTTGTTGTTT -3'，

PCINR：5'- CCTATAATATCGGACGTACCTATCG -3'。

2.一种使用权利要求1所述引物进行巢式PCR检测樟疫霉菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：：

（1）提取待测样品基因组DNA，低温保存备用；

（2）巢式PCR第1轮扩增：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用Ypt1基因通用引物ph1F/Yph2R进行第1轮扩增，所述巢式PCR第1轮扩增反应体系和反应程序如下：

PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5µL，10 µmol/L的ph1F /Yph2R引物各1.0µL，DNA模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL；

扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min；

（3）巢式PCR第2轮扩增，待步骤（2）第一轮PCR扩增结束后，取1.0μl 第一轮PCR扩增产物或扩增产物的稀释液为模板与樟疫霉菌特异性引物PCINF/PCINR组合进行第2轮PCR扩增，所述巢式PCR第2轮扩增反应体系和反应程序如下：

PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5µL，10 µmol/L的PCINF/PCINR引物各1.0µL，第1轮PCR扩增产物或稀释液作为DNA模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL；

扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、59℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min；

（4）凝胶电泳检测：取5.0µL步骤（3）第2轮PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，电压为4-5V/cm，电泳40 min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出320bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在樟疫霉菌，否则未检出。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的Ypt1基因通用引物ph1F/Yph2R，所述引物ph1F/Yph2R的序列如下：

ph1F：5'-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3'，

Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'。

4.如权利要求1所述的引物在樟疫霉菌引起病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。