CN104357560B - 利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法。该方法包括如下步骤：A)建立数学模型：a1)取若干已知年限人参位于芦头以下1～2cm处的样品，分别提取基因组DNA；a2)以各基因组DNA为模板，用特异于人参端粒和人参单拷贝基因的2个引物对分别进行qPCR，所得Ct值分别记为T和S；a3)针对每个人参，计算T/S；a4)以人参年限数值为横坐标，T/S为纵坐标，制作线性标准曲线，获得曲线方程；B)采用所得数学模型鉴别待测人参年限：按步骤a1)-a3)操作，获得待测人参T/S，将其代入数学模型，得待测人参的年限。该方法测定的人参年限与实际年限吻合度极高，且低成本，高通量，相比传统Southern印迹法测量人参端粒长度，本发明对DNA的需求量更少，试验周期更短。

Description

利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法，特别涉及一种利用qPCR法根据人参相对端粒长度鉴别人参年限的方法。
背景技术
人参为五加科(Araliaceae)植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根及根茎。在众多草本植物里，人参以其寿命长、价格昂贵而闻名于世，被称为百草之王。人参的最大的价值是在于它的药用功效，早在《神农本草经》中就有着对人参神奇功效的描述。而在当今社会，人参是以一种文化的象征或者作为收藏品出现在市场上。年限长、根型好的人参为人所追捧，一个小小的山参，价格可能几十到几百万元。
人参价格的高低关键在于年限的长短。传统的山参年限鉴别是根据“芦头”上的“芦碗”个数、折芦、整体根型和“堆花芦”的形态来判断人参的生活轨迹，考虑人参的休眠、损伤生长情况以后，由经验足的老药工判断个体的年限；产地栽培人参年限普遍较短(5～20年)，是根据芦碗数和参农经验来判断年限。然而，不管哪一种鉴别都具有商业夸大成分在里面，真正的将人参年限鉴别量化、数字化的研究不成系统也不能被人认可。
近年来，随着分子生物学的发展，通过分子手段用来检测人参的年限已成为了一个突破口。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于实时荧光定量PCR技术利用人参相对端粒长度鉴别人参年限的方法。
本发明所提供的鉴别人参年限的方法，具体可包括如下A和B的步骤：
A.按照包括如下步骤(a1)-(a4)的方法获得用于鉴别人参年限的数学模型：
(a1)取若干已知年限人参位于芦头以下1～2cm处的样品，分别提取基因组DNA；
在本发明中，所述若干已知年限人参具体为：年限为2-6年的人参。
(a2)以步骤(a1)获得的若干已知年限人参的基因组DNA分别作为模板，用特异于人参端粒的引物对1进行实时荧光定量PCR扩增，得到所述人参端粒的Ct值，记为T；用特异于人参单拷贝基因的引物对2进行实时荧光定量PCR扩增，得到所述人参单拷贝基因的Ct值，记为S；
其中，Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，荧光阈值设定为PCR 3-5(如4)个循环荧光信号标准差的10倍。
(a3)针对每个已知年限人参，计算所述人参端粒的Ct值与所述人参单拷贝基因的Ct值之间的比值，即T/S比值；
(a4)以所述若干已知年限人参的年限数值为横坐标(x)，以对应的所述T/S比值为纵坐标(y)，制作线性标准曲线，所得线性标准曲线方程即为所述用于鉴别人参年限的数学模型；
B.采用步骤A所得数学模型按照包括如下步骤(b1)-(b2)的方法对待测人参的年限进行鉴别：
(b1)按照步骤(a1)-(a3)进行操作，仅采用所述待测人参替代所述若干已知年限人参，获得所述待测人参的T/S比值；
(b2)将步骤(b1)获得的所述待测人参的T/S比值代入步骤A获得的所述数学模型中，从而获得所述待测人参的年限。
在所述方法中，所述引物对1具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对。
在所述方法中，所述人参单拷贝基因为PGK1基因。
进一步，所述引物对2具体为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对。
在所述方法的步骤(a1)中，所取的所述样品的量可为干重0.1～1g(如10-50mg)。
在本发明的一个实施例中，所述基因组DNA的提取方法具体为CTAB法。
在所述方法的步骤(a2)中，用所述引物对1进行实时荧光定量PCR扩增时的退火温度具体为56℃；用所述引物对2进行实时荧光定量PCR扩增时的退火温度具体为58℃。
更加具体的，用所述引物对1进行实时荧光定量PCR扩增时的反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，56℃退火及延伸34s，循环25次。用所述引物对2进行实时荧光定量PCR扩增时的反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火及延伸34s，循环40次。
在所述方法的步骤(a2)中，用所述引物对1进行实时荧光定量PCR扩增时，作为上游引物的序列表中序列1所示的单链DNA分子与作为下游引物的序列表中序列2所示的单链DNA分子的摩尔比为1:3；用所述引物对2进行实时荧光定量PCR扩增时，作为上游引物的序列表中序列3所示的单链DNA分子与作为下游引物的序列表中序列4所示的单链DNA分子的摩尔比为1:1。
进一步，用所述引物对1进行实时荧光定量PCR扩增时，作为上游引物的序列表中序列1所示的单链DNA分子在反应体系中的终浓度为0.1μmol/L，作为下游引物的序列表中序列2所示的单链DNA分子在反应体系中的终浓度为0.3μmol/L。用所述引物对2进行实时荧光定量PCR扩增时，作为上游引物的序列表中序列3所示的单链DNA分子和作为下游引物的序列表中序列4所示的单链DNA分子在反应体系中的终浓度均为0.2μmol/L。
用所述引物对1和所述引物对2进行实时荧光定量PCR扩增时，作为模板的所述基因组DNA的用量均可为5-50ng(如14ng)。
更加具体的，在本发明的一个实施例中，用所述引物对1进行实时荧光定量PCR扩增时的反应体系(10μl)为：5μl SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、0.1μl ROX Reference Dye、1pmol上游引物、3pmol下游引物、l4ng基因组DNA、水补足至10μl；用所述引物对2进行实时荧光定量PCR扩增时的反应体系(10μl)为：5μl SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、0.2μl ROX Reference Dye、2pmol上游引物、2pmol下游引物、l4ng基因组DNA、水补足至10μl。
在本发明的一个实施例中，所述方法的步骤A获得的所述数学模型具体为如下公式I：
y＝0.243x+0.407   公式I
式中，x代表人参年限，y代表所述T/S比值。
其中，所述T/S比值即可表示人参相对端粒长度。
即本发明所提供的方法，具体包括如下步骤：
(1)取待测人参位于芦头以下1～2cm处的样品，提取基因组DNA；
(2)取步骤(1)提取的基因组DNA作为模板，用特异于人参端粒的引物对1(序列1和序列2)进行实时荧光定量PCR扩增，得到所述人参端粒的Ct值，记为T；用特异于人参单拷贝基因的引物对2(序列3和序列4)进行实时荧光定量PCR扩增，得到所述人参单拷贝基因的Ct值，记为S；
(3)计算所述人参端粒的Ct值与所述人参单拷贝基因的Ct值之间的比值，即T/S比值；
(4)将步骤(3)获得的T/S比值作为y值代入公式I，所得x值即为所述待测人参的年限；
y＝0.243x+0.407   公式I
式中，x代表人参年限，y代表T/S比值。
对于本发明所提供的方法，所述待测人参需为年限在2年以上(如2-6年)的人参。
本发明根据人参端粒5′-TTTAGGG-3′重复序列，设计特异性引物，利用qPCR快速准确的优点，建立了一种SYBR Green I染料嵌合的QPCR方法，用于人参相对端粒长度的快速检测，进而建立数学模型得出人参相对端粒长度与人参年限之间的公式。结果表明该方法测定的人参年限与实际年限吻合度极高，而且该方法低成本，高通量，相比于传统的Southern印迹法测量人参端粒长度(TRF值)，此技术对DNA的需求量更少，试验周期更短。
附图说明
图1为两步qPCR的S形扩增曲线。在上方的曲线集合是表示端粒引物qPCR的扩增曲线，下方是空白对照，若干曲线是不同的重复。
图2为两步qPCR的溶解曲线。A是端粒引物qPCR的溶解曲线，若干曲线是不同重复。B是单拷贝基因qPCR的溶解曲线，若干曲线是不同重复。
图3为用于鉴定人参年限的数学模型。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到
台式高速离心机(Eppendorf公司)、Olympms荧光显微镜、WFJ Unic 7200spectrophotometer、BS2202S型电子天平(Startorius公司)、SIM-F124型制冰机(SANYO公司)、4KBTXL-75型真空冷冻干燥机(Virtis公司)；680X凝胶成像分析系统(基因有限公司)、PAGE凝胶电泳仪、CS101-2A电热干燥箱、SHZ-D循环水式真空泵(巩义市予化仪器有限公司)；Retsch MM400磨样机、5810R型低温冷冻离心机、7500实时荧光定量PCR仪(北京欧比特仪器有限公司)。
UNIQ-10柱式DNA纯化试剂盒(上海生工)、buffer3：100mM Tris-Cl、100mMNaCl、Premix Ex TaqTMII(宝生物工程)。
实施例1、利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法的建立
供试人参：来自两个地区不同年限的人参样品，详见表1。
表1两个地区不同年限的人参样品
一、人参基因组DNA的提取
采用CTAB法提取各供试人参的基因组DNA。具体如下：
取待测人参位于芦头以下1～2cm处的样品10-50mg干重(无霉变)，置于粉碎机中研磨粉碎，过40目筛。将粉末转移到2.0mL的Eppendorf管中，加入900μL已灭菌的CTAB提取液(配方：2％(2g/100ml)CTAB，100mmol/L Tris-HCl pH＝8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/L NaCl)、0.02g PVP 40000、10μLβ-巯基乙醇充分振荡混匀，65℃水浴1.5h-2h，期间轻摇2-3次。结束后取出冷却至室温，加入900μL氯仿-异戊醇(体积比24：1)，充分振荡混匀，12000g离心10min。取上清，加入等体积氯仿-异戊醇(体积比24：1)，充分振荡混匀，12000g离心10min。取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇溶液，-20℃放置2h以上。取出，12000g离心10min，弃上清，沉淀用70％(体积分数)乙醇洗涤两次，37℃挥干乙醇，加入100μL ddH2O、1％RNaseA(10mg/ml)(即加入1％体积浓度为10mg/ml的RNAaseA溶液)37℃温育30min后加入1％蛋白酶K(5mg/ml)(即加入1％体积浓度为5mg/ml的蛋白酶K溶液)，37℃温育1h；根据需要再重新用氯仿-异戊醇、70％(体积分数)乙醇参照以上步骤抽提、纯化DNA，用适量ddH2O溶解，-20℃保存。
二、实时荧光定量PCR(qPCR)扩增及数学模型建立
1、qPCR引物设计
用于扩增人参端粒的引物对(记为引物对1)序列如下：
Telomere-2.F：
5’-GGTTTTGAGGGTGTAGGGTTGAGGGTTGAGGGTTGAGGGT-3’(序列1)；
Telomere-2.R：
5’-TCCCGACTAATCCCTAATCCCTAATCCCTAATCCCTAATCCCTA-3’(序列2)。
用于扩增人参单拷贝基因PGK1的引物对(记为引物对2)序列如下：
PGK1.F：5’-CGAGAAACTGGTGGCTGG-3’(序列3)；
PGK1.R：5’-TCACGCCCTCAGTGGAAG-3’(序列4)。
2、两步法qPCR
采用引物对1对人参端粒进行实时荧光定量PCR扩增的反应体系参照SYBRPremix Ex TaqTM使用说明书配制，对各组分用量进行摸索优化。优化后的反应体系为：5μl SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、0.2μl ROX Reference Dye、0.1μl正向引物(正向引物在反应体系中的终浓度为0.1μmol/L)、0.3μl反向引物(反向引物在反应体系中的终浓度为0.3μmol/L)、lμl浓度为14ng/μl的人参基因组DNA、蒸馏水补足10μl。反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，56℃退火及延伸34s，循环25次。
采用引物对2对人参单拷贝基因PGK1进行实时荧光定量PCR扩增的反应体系也按照SYBR Premix Ex TaqTM使用说明书配制，对各组分用量进行摸索优化。优化后的反应体系为：5μl SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、0.2μl ROX Reference Dye、0.2μl正向引物(正向引物在反应体系中的终浓度为0.2μmol/L)、0.2μl反向引物(反向引物在反应体系中的终浓度为0.2μmol/L)、lμl浓度为14ng/μl的人参基因组DNA、蒸馏水补足10μl。反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火及延伸34s，循环40次。荧光阈值设定为PCR 4个循环荧光信号标准差的10倍，Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
结果发现，两步qPCR的基线平整、指数区明显、斜率大、线性范围广，是理想的扩增曲线(图1)。溶解曲线图(图2)呈较为锐利的单一的峰，没有其他杂峰出现，表明扩增产物为目的产物，获得的PCR产物特异性良好。qPCR检测生成的数据显示，几次重复实验的Ct值变异小，表明试验方法稳定，结果可靠。进一步，将获得的人参端粒的Ct值(记为T)和人参单拷贝基因PGK1的Ct值(记为S)。
3、人参相对端粒长度的计算
针对每个已知年限人参，计算人参端粒的Ct值与人参单拷贝基因PGK1的Ct值之间的比值，即T/S比值。所述T/S比值即为人参相对端粒长度。
4、用于鉴定人参年限的数学模型的建立
以表1中若干已知年限人参的年限数值为横坐标(x)，以对应的人参相对端粒长度(即T/S比值)为纵坐标(y)，制作线性标准曲线，所得线性标准曲线如图3所示。
相对端粒长度整体上随着人参年限的增加而增长，相对端粒长度与两年生及以后的人参年限呈显著正相关，建立相关数学模型用相对端粒长度预测人参的年限：
y＝0.243x+0.407
式中，x代表人参年限，y代表人参相对端粒长度(即T/S比值)。
实施例2、利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法的应用
为了进一步验证，实施例1建立的利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法的准确性，本发明的发明人采集了不同年限的栽培人参样品，利用上述建立的评价公式进行人参年限预测双盲实验。
参照实施例1中步骤一和二对已知年限的各人参样品进行人参相对端粒长度(即T/S比值)的测定。将测定结果代入y＝0.243x+0.407，所得x值即为预测年限。
结果如表2所示，表明利用该公式预测人参年限与实际年限相附。
表2人参年限预测结果
实际年限 样品 相对端粒长度 预测年限
2年 1 1 2.44年
3年 2 1.11 2.89年
4年 3 1.47 4.37
5年 1 1.71 5.36
6年 2 1.91 6.19

Claims (8)

1.一种鉴别人参年限的方法，包括如下A和B的步骤：
A.按照包括如下步骤(a1)-(a4)的方法获得用于鉴别人参年限的数学模型：
(a1)取若干已知年限人参位于芦头以下1～2cm处的样品，分别提取基因组DNA；
(a2)以步骤(a1)获得的若干已知年限人参的基因组DNA分别作为模板，用特异于人参端粒的引物对1进行实时荧光定量PCR扩增，得到所述人参端粒的Ct值，记为T；用特异于人参单拷贝基因的引物对2进行实时荧光定量PCR扩增，得到所述人参单拷贝基因的Ct值，记为S；
所述引物对1为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对；
所述人参单拷贝基因为PGK1基因；所述引物对2为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对；
(a3)针对每个已知年限人参，计算所述人参端粒的Ct值与所述人参单拷贝基因的Ct值之间的比值，即T/S比值；
(a4)以所述若干已知年限人参的年限数值为横坐标，以对应的所述T/S比值为纵坐标，制作线性标准曲线，所得线性标准曲线方程即为所述用于鉴别人参年限的数学模型；
B.采用步骤A所得数学模型按照包括如下步骤(b1)-(b2)的方法对待测人参的年限进行鉴别：
(b1)按照步骤(a1)-(a3)进行操作，仅采用所述待测人参替代所述若干已知年限人参，获得所述待测人参的T/S比值；
(b2)将步骤(b1)获得的所述待测人参的T/S比值代入步骤A获得的所述数学模型中，从而获得所述待测人参的年限。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，所取的所述样品的量为干重0.1～1g。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a2)中，用所述引物对1进行实时荧光定量PCR扩增时的退火温度为56℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a2)中，用所述引物对2进行实时荧光定量PCR扩增时的退火温度为58℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a2)中，用所述引物对1进行实时荧光定量PCR扩增时，作为上游引物的序列表中序列1所示的单链DNA分子与作为下游引物的序列表中序列2所示的单链DNA分子的摩尔比为1:3。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a2)中，用所述引物对2进行实时荧光定量PCR扩增时，作为上游引物的序列表中序列3所示的单链DNA分子与作为下游引物的序列表中序列4所示的单链DNA分子的摩尔比为1:1。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤A获得的所述数学模型为如下公式I：
y＝0.243x+0.407   公式I
式中，x代表人参年限，y代表所述T/S比值。
8.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述待测人参为年限在2年以上的人参。
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